DE2622180C3 - Verfahren zur Bestimmung des fibrinstabilisierenden Faktors (Fakt XIID, insbesondere im menschlichen Blut - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des fibrinstabilisierenden Faktors (Fakt. XIII), insbesondere im menschlichen Blut

Im menschlichen Blut ist die Bestimmung des Fakt.-XIII-GehaItes besonders wichtig, z. B. bei Patienten mit angeborenen und erworbenen Fakt-XIII-Mangelblutungen, bei Patienten mit Wandheilstörungen oder bei bösartigen Bluterkrankungen.

Bekanntlich wird bei der Blutgerinnung durch Thrombin das lösliche Fibrinogen in das längsvernetzte, unlösliche Fibrin umgewandelt Fakt. XIII bewirkt eine fibrinstabilisierende Quer vernetzung, wodurch das Fibrin seine Festigkeit ei hält. Ist der Fakt. XIII vermindert oder fehlt er, dann komr. t es zu therapiebedürftigen Blutungen. In den letzten Jahren ist es auf dieser Grundlage beispielsweise gelungen, mit Fakt-XIII-Konzentraten bis zur Blutstillung zu substituieren. Diese Therapie konnte bisher aber keine breite Anwendung finden, da es keine geeignete schnelle und genaue Meßmethode zur routinemäßigen Diagnostik und zur Steuerung der Substitution gibt.

Es sind verschiedene Verfahren zur Messung des Fakt.-XIII-Gehaltes bereits bekannt, die auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen, unterschiedlich empfindlich sind und für die Bestimmung mehr oder weniger Zeitaufwand erfordern. Bekannt ist es insbesondere, den Fakt. XIII über das Prinzip der Antikörperhemmung (Fakt.-XIII-Testbesteck der Behringwerke AG) in einer Verdünnungsreihe in 4x11 Reaktionsschritten zu bestimmen; dieses Verfahren liefert aber nur ein semiquantitatives Ergebnis und dauert 4 bis 5 Stunden. In einem bekannten immunologischen Verfahren dauert die Bestimmung mindestens 12 Stunden. Bei Absorption eines Farbstoffes an den Fakt. XIII kompliziert die langdauernde und nicht immer konstante Farbstoffabsorption die Bestimmungstechnik.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Messung des Faktor-XIII-Gehaltes zu schaffen, das erheblich schneller und einfacher zu den gewünschten Meßergebnissen führt und sich daher für die routinemäßige Fakt.-Xlll-Bestimmung eignet.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine Blutplasmaprobe mit Thrombin und Plasmin inkubiert und im Überstand des Inkubationsgemisches nach Zuführung von weiterem Thrombin die Gerinnungszeit gemessen wird.

Bekanntlich entstehen vom Fakt XIII abhängige unterschiedliche Fibrinspaltprodukte, Es wurde nun gefunden, daß das Lysat erneut mit Thrombin zur Gerinnung gebracht werden kann und daß die unterschiedlichen Spaltprodukte zu unterschiedlichen Gerinnungszeiten führen.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert.
Ein früheres Lysat wird durch Inkubation des

ίο Blutplasmas mit einem Reagenz, bestehend aus Thrombin und Plasmin, hergestellt Thrombin führt dabei zur Fibrinbildung, der in der Probe zu messende FaktXIII zur Quervernetzung des Fibrins. Das proteolytische Enzym Plasmin spaltet Fibrin zu einem

is Lysat Durch Zusatz eines Katalysators, z. B. DithioerytHrol, kann die Fakt.-XIII-Aktivität beschleunigt werden.

Die Gerinnnungszeit wird erfindungsgemäß in einer Lösung aus einem früheren Lysat unter Beifügen von

so Thrombin verzögert und der Fakt-XIII-Gehalt durch die Bestimmung der Verzögerung des Gerinnungszeitpunktes bestimmt Tatsächlich hat es sich gezeigt, daß eine Beziehung zwischen der vorhandenen Menge an Fakt. XIII und der in einem Gerinnungsansatz gemessenen Gerinnungszeit herzustellen ist.

Nachfolgend wird ein praktisches Beispiel für das erfindungsgemäße Meßverfahren beschrieben:

Zunächst wird durch Zusatz von einem Reagenz, welches z. B. 15 E Thrombin/ml und 0,5 E Plasmin/ml und Ca⁺+-Ionen (Testthrombin Behringwerke AG, Forschungsplasmin human Kabi GmbH) enthält, zum Plasma das Lysat hergestellt:

0,4 ml Plasma
_ri +0,1 ml Fakt.-Xlll-Reagenz

Inkubation bei 37°C 15 Min.

Der eigentliche Meßvorgang geschieht dann wie folgt:

0,1 ml Lysat
+ 0,2 ml Thrombin (3 E/nvl)

Messung der Gerinnungszeit.

Die Messung der Gerinnungszeit stellt kein Problem dar, weil hierfür Mechaniken in Form der sogenannten Koagulometer (z. B. nach S c h i t g e r und Gross) zur Verfugung stehen.

Eine Eichkurve erhält man, wenn man die Meßzeiten, die durch Zusatz unterschiedlicher Mengen von Fakt-XIII-Antikörpern oder auch Fakt.-XIII-Konzentraten (Behringwerke AG), gewonnen werden, auf einem Millimeterpapier gegen den durch Fakt.-XIII-Antikörperzusatz bzw. Fakt-Xlll-Konzentrat variierten Fakt-XIII-Gehalt aufträgt und die Punkte zu einer Geraden approximiert

Die Zeichnung zeigt die Eichkurve: Auf der Ordinate sind die Gerinnungszeiten in see. aufgetragen, auf der Abszisse die unterschiedlichen Fakt-XIII-Mengen. Der Fakt-XIII-Gehalt kann in % der Norm angegeben werden.

W) Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erzielbaren Vorteile bestehen vor allem darin, daß die in den meisten Kliniken vorhandenen üblichen Koagulometer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens genutzt werden können. Der Test ist auch sehr einfach

hi in der Handhabung, so daß er in den Labors von auf Koagulometer geschulten medizinisch technischen Assistentinnen durchgeführt werden kann. Die Verkürzung der Meßzeit gegenüber den eingang!, als bekannt

vorausgesetzten Verfahren macht das erfindungsgemü-Qe Verfahren für Routinezwecke geeignet. Das erfindungsgemäOe Verfahren ist außerdem nennenswertbilliger.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich, den Test in der klinischen Diagnostik, z. B. in Form käuflicherTestsets,bestehend aus Fakt.-Xtll-Reagenz und Thrombin, einzuführen. Das Fakt.-XIII-Reagenz kann dabei das Thrombin und Plasmin, gepuffert, stabilisiert und lyophilisiert oder nur aus Plasmin, gepuffert, stabilisiert und lyophilisiert, bestehen, wobei dann Thrombin kurz vor der Verwendung zum Plasmin hinzugefügt wird. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird es möglich, z. B. Faku-Xlll-Mangelzuständezu erkennen und die Dosierung einer Substitutionstherapie überwachen zu können.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

1. Patentansprüche;

   t. Verfahren zur Bestimmung des fibrinstabilisierenden Faktors (Fakt. XIII), insbesondere im menschlichen Blut, dadurch gekennzeichnet, daß eine Blutplasmaprobe mit Thrombin und Plasmin inkubiert und im Oberstand des Inkubationsgemisches nach Zuführung von weiterem Thrombin die Gerinnungszeit gemessen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Fakt-XIll-Reagenz, enthaltend Plasmin und Thrombin, gepuffert, stabilisiert und lyophilisiert verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das FakL-XIII-Reagenz einen Katalysator zur Beschleunigung der Reaktion enthält.