DE2551431A1

DE2551431A1 - Anti-embryoserum und schwangerschafts- bzw. traechtigkeits-diagnoseverfahren

Info

Publication number: DE2551431A1
Application number: DE19752551431
Authority: DE
Inventors: Mildred Elsie Duncan; Sen John Kerr Findlay; Robin Alwxander Selkirk Lawson
Original assignee: University of Melbourne; State of Victoria
Current assignee: University of Melbourne; State of Victoria
Priority date: 1974-11-18
Filing date: 1975-11-15
Publication date: 1976-05-26
Also published as: BR7507642A; AR211696A1; IE42036L; FR2291497A1; GB1492689A; JPS5191323A; IE42036B1

Description

Grattan Street, Parkville, Victoria / Australien

The Department of Agriculture, 3 Treasury Place, — Melbourne, Victoria / Australien

Anti-Embryoserum und Schwangerschafts- bzw. Trächtigkeits-Diagnoseverfahren

Die Erfindung betrifft ein spezifisches SehwangerSchafts- bzw, Trächtigkeits-Antigen und ein Schwangerschafts- bzw, Trächtigkeits-Diagnoseverfahren für Säugetiere.

Das spezifische Schwangerschafts- bzw. Trächtigkeits-Antigen enthält ein Serum, das hergestellt wird, indem man Tiere mit einem aus Embryos,ausgewählten Embryoteilen, Embryoextrakten, gereinigten Embryofraktionen oder aus Blut von dem schwangeren bzw. trächtigen Säugetier, das geprüft werden soll, hergestellten Homogenat (homogene Masse) immunisiert, dem Tier Blut abzieht, das Serum abtrennt und es selektiv an homogenen Massen,von Geweben, ausgenommen Embryos, Uteri, Ovarien und Blut von den trächtigen Tieren, absorbiert. Das Schwangerschafts- bzw. Trächtigkeits-Diagnoseverfahren wird durchgeführt, indem man Blut von dem zu untersuchenden Tier zu dem Serum zugibt und die Anwesenheit oder Abwesenheit der Antigene nach bekannten Verfahren feststellt.

Die Erfindung betrifft Schwangerschafts- bzw. trächtigkeitsspezifische Antigene und insbesondere solche Antigene, die für eine frühe Diagnose der Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit bei Säugetieren verwendet werden können.

Für Menschen sind immunologische Tests für die Schwangerschaft bekannt. Bei diesen Tests erhält man eine positive

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Reaktion mit Antisera gegenüber dem menschlichen chorionischen gonadotrophischen Hormon (HCG). Das HCG ist im Blut oder Urin vorhanden. Diese Versuchsergebnisse basieren auf der Agglutination der Antikörper von Schaf-Erythrocyten oder Latexteilchen in Anwesenheit von HCG.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Antisera und ein Verfahren zur frühen Diagnose von Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit in Säugetieren zu schaffen, bei dem diese Antisera und immunologische Verfahren verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Anti-Embryo serum, hergestellt durch Immunisierung von einem oder mehreren Tieren mit einem Homogenat aus der Gruppe Embryos, ausgewählte Embryoteile, Embryoextrakte, gereinigte Embryofraktionen und Blut von trächtigen Tieren und aus dem die für das Serum unerheblichen Antikörper durch selektive Absorption ah Gewebehomogenaten, ausgenommen Embryos, Uteri, Ovarien und Blut von trächtigen Tieren, entfernt sind.

Die für bestimmte Arten spezifischen und andere unerheblichen Antikörper werden bevorzugt durch nachfolgende Absorption mit Gewebehomogenaten, ausgenommen Embryos, Uteri, Ovarien und Blut von trächtigen Tieren, entfernt.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Schwangerschaftsbzw. Trächtigkeits-Diagnoaeverfahren für Säugetiere, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem Blut des Tieres bzw. des Menschen ein Anti-Snbryoserum zugibt, hergestellt durch Immunisierung von einem oder mehreren Tieren mit einem Homogenat aus der Gruppe von Embryos, ausgewählten Esbryoteilen, Embryoextrakten, gereinigten Embryo fraktionen «nd Blut von trächtigen. Tieren, aus dem die für das Serum unwichtigen Antikörper durch selektive Absorption mit Gewebenomogenate außer denen von Embryos, Uteri, Ovarien und Blut von trächtigen Tieren entfernt wurden, und Antigene auf

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übliche Weise feststellt.

Die bevorzugten Verfahren für die Feststellung der Antigene sind Agglutinations- oder Agglutinations-Inhibitionsverfahren, Präzipitationsverfahren und radio-immunologische Untersuchungsverfahren.

Die bevorzugten Antisera sind solche, die gegenüber den Embryos der Art, die geprüft werden soll, gezogen bzw. entwickelt wurden.

In der vorliegenden Anmeldung soll der Ausdruck "Blut" umfassen: Blutfraktionen, Erythrocyten, Serum und Plasma, und der Ausdruck "Embryo" bzw. "Embryos" soll alle Konzeptionsprodukte bzw. Empfängnisprodukte einschließlich extra-embryonischer Membranen bis zum Geburtszeitpunkt umfassen.

Bei der Verwendung der Agglutinationstests werden üblicherweise das Gesamtblut, die Erythrocyten, das Serum oder das Plasma von dem zu Untersuchungen Tier bzw. Menschen geprüft. Bei der Verwendung der Agglutinateonsinhibitationstests werden Serum oder Plasma verwendet, und der Test wird an Erythrocyten von einem anderen Tier oder an Latexteilchen, an denen die Antigene oder Antikörper absorbiert werden, durchgeführt. Bei dem Präzipitationsversuch und dem radio-immunologischen Verfahren werden entweder Serum oder Plasma verwendet.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Untersuchung, ob ein Tier bzw. Mensch trächtig bzw. schwanger ist mit mehreren Nachkommen. Dazu führt man das erfindungsgemäße Verfahren durch und stellt fest, ob eine stärkere Reaktion auftritt oder nicht, wie- eine stärkere Agglutination, oder man führt die Umsetzung nach Reihenverdünnungen des Serums quantitativ durch, und stellt fest, ob mehr Antigen gebildet 'wird als man es.bei einem einzigen Nachkommen bzw. Ab-

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kömmling erwarten würde·

In vielen Säugetierearten wird die funktioneile Lebensspanne des Corpus luteum während der Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit verlängert. Die Stimulierung für diese Verlängerung wird durch die Anwesenheit des Embryos in dem Uterus hervorgerufen sein. Die Art der Stimulierung ist jedoch nicht bekannt. Wenn diese Stimulierung leicht identifiziert werden könnte, wäre dies ein einfacher Test für frühe Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit.

Die folgende Erläuterung der vorliegenden Erfindung erfolgt im Zusammenhang mit Schafen. Die spezifischen Anti-Embryosera können jedoch für andere Säugetiere auf gleiche ¥eise wie die Sera für Schafe hergestellt werden.

In des Schaf suS ein Embryo im. Uterus an oder vor den Tagen 12 bis 13 nach der Paarung vorhanden sein, wenn die Regression des Corpus luteum verhindert werden soll« Im folgenden werden Versuche beschrieben, mit denen geprüft wird, ob Antigene im Mutterschaf vorhanden sind, die für die Trächtigkeit spezifisch sind und die bei der Stimulierung für die Erhaltung des Corpus lutema wirken könnten«

Anti-Eabryosera werden durch Immunisierung von Kaninchen mit einem Homogenat aus Schaf embryos von 12 bis 14 Tagen hergestellt. Die Embryos werden aus trächtigen Mutterschafen unter Anästhesie, die durch intravenöse Injektion von Natriua-pentabarbiton. induziert wird und die durch eine Sauerstoff-Fluothan-Mischung aufrechterhalten wird, gesammelt. Der Uterus und die Ovarien werden durch einen sittel-ventralen Schnitt freigelegt bzw« nach außen gelegt. Die Embryos werden mit einer sterilen 0,154 M HaCl-iösung heraus gespült, die in die Spitze von einem Uterushorn injiziert wird Tand durch eine ölaskanüle, die in die Spitze des entgegengesetzten Uterusiiorns eingesteckt ist, wieder entnommen wird. Die normalen Embryos werden entweder bei

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-1O⁰C gefroren, bis sie für die Inokulierungen verwendet werden, oder für die histologischen Untersuchungen in 1Obiges, mit Phosphat gepuffertes Formalin gegeben. 8 bis 15 Tage nach dem Oestrus wurden Gewebeuntersuchungen mit dem Endometrium, den Ovarien, Skelettmuskeln, Leber und Nieren von nichtträchtigen Schafen durchgeführt. Am 8. bis 17. Tag der Trächtigkeit wurden Endometrium, Ovarien und Skelettmuskeln von den trächtigen Schafen entnommen. Unmittelbar nach der Entfernung wurden diese Gewebe in 10%igem, mit Phosphat gepuffertem Formalin fixiert.

ErwachsenenNeuseeland-Kaninchen wurden intramuskulär · Homogenate der ganzen Schaftembryos, emulgiert mit einem gleichen Volumen an Freunds vollständigem Adjuvans (C.S.L., Melbourne), injiziert. Die Inokulation wurde 4 Wochen später wiederholt. Anschließend erhielten die Kaninchen in wöchentlichen Intervallen Injektionen des Embryohomogenats allein«, 6 Tage nach jeder Injektion wurde ihnen Blut abgenommen. Artspezifische und andere irrelevante Antikörper werden aus den Antisera durch nacheinanderfolgende Absorptionen an Homogenaten der Leber und der Niere aus normalen, nichtträchtigen Schafen entfernt.

Es wurde ein schichtweises, fluoreszierendes Anfärben verwendet, um die Antigene zu lokalisieren. Gefrorene Teile (6/u) der fixierten Embryos werden bei -20°C geschnitten, mit absorbierten oder nichtabsorbierten Sera während 30 Minuten behandelt und in phosphatgepufferter Salzlösung (0,145 M NaCl, 0,01 M Phosphat bei pH 7,1) während 20 Minuten mit zwei Pufferänderungen gewaschen,, Die Teile bzw. Proben werden mit Schaf-Anti-Kaninchen-Globulin, vermischt mit Fluorescin-isothiocyanat (Wellcome Reagents Ltd., England), während 30 Minuten angefärbt, wieder 20 Minuten gewaschen und anschließend mit phosphatgepuffertem Glycerin für die Untersuchung unter einem Fluoreszenzmikroskop befestigt. Gewebe, die mit normalem (Prä-Immunisierungs)Kaninchenserum und immunem Serum, das durch Absorption mit

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·■ Ό *

Embryohomogenaten vollständig neutralisiert ist, ergeben Spezifizitätsversuche.

In Tabelle I sind die untersuchten Gewebearten, das Stadium der Trächtigkeit der Tiere, von denen diese Gewebe entnommen wurden, und die Ergebnisse bei der immunologischen Fluoreszenzfärbung angegeben. Vom Tag 8 bis zum Tag 17 der Trächtigkeit verfärben sich sowohl das Cytoplasma als auch die Zellmembranen der Embryogewebe sehr stark, was die Anwesenheit eines Antigens, das für die Trächtigkeit spezifisch ist, anzeigt. Die Fluoreszenz der anderen Gewebeproben ist: (a) intensiv bei den endothelialen Membranen der Blutgefäße und bei den Zellen, die die Geweberäume in dem Myometrium des trächtigen Uterus begrenzen; (b) weniger intensiv in dem Cytoplasma von einigen Lutealzellen im Corpus luteum; (c) intensiv bei den Membranen von Erytrhocyten, die in allen diesen Geweben an den Tagen 8 bis 17 der Trächtigkeit vorhanden sind. In Teilen bzw. Schnitten von Skelettmuskeln zeigen nur die Erythrocytes und gelegentlich die endothelialen Membranen der Blutgefäße eine Fluoreszenz. Diese Verfärbung des Embryogewebes, der Uteri, der Corpora lutea und der Erythrocyten wird die Absorption des Antiserums mit einem Homogenat vom Embryo oder Uterus oder von Erythrocyten von einem 14 Tage trächtigen Schaf oder durch Neutralisation des Antiserums mit Plasma von trächtigen Mutterschafen inhibiert. Wiederholte Absorptionen an Homogenaten der Leber oder der Niere oder an Erythrocyten von einem nichtträchtigen Schaf oder die Behandlung des Antiserums mit Plasma von nichtträchtigen Mutterschafen inhibiert die Fluoreszenz nicht. Dies zeigt an, daß das Antigen bzw. die Antigene für die Trächtigkeit charakteristisch ist bzw. sind und in dem Uterus, Corpus luteum und Blut von Mutterschafen so früh wie am 8. Tag der Trächtigkeit vorhanden ist bzw. sind und im Embryo vorhanden ist bzw. sind.

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Die Anwesenheit des Antigens bzw. der Antigene an Erythrocyten wird durch einen einfachen Hämagglutinationsversuch gezeigt, bei dem Erythrocyten von Mutterschafen zwischen dem Tag 8 und dem Tag 17 der Trächtigkeit mit Anti-Trächtigkeitsserum agglutiniert werden, wie es im folgenden näher erläutert wird.

Es wurde beobachtet, daß das Antigen bzw. die Antigene, das (die) im Plasma von Mutterschafen am 14. Tag der Trächtigkeit vorhanden ist (sind), die Erythrocyten von kastrierten männlichen Schafen (Hammeln) bindet (binden), und daß diese überzogenen Erythrocyten in Anwesenheit des Antiserums agglutiniert werden. So wurde ein direkter Hämagglutinationstest entwickelt, um den Antigen-Titer zu verfolgen, und dies wird im folgenden näher erläutert. Diese Antisera gehören dem Nicht-Präzipitationstyp an, und bei der Geldiffusion mit entweder Embryohomogenaten oder Plasma von trächtigen Mutterschafen wird keine Reaktion beobachtet.

Dann wurde durch Immunofluoreszenz gefunden, daß Antisera, die durch Immunisierung von acht Kaninchen und zwei Kälbern mit Schafembryo-Homogenaten hergestellt wurden, nach einer Reihe von Absorptionen an Geweben von nichtträchtigen Mutterschafen auf ähnliche Weise wie die ursprünglichen Antisera reagieren und sich im Uterus und dem Corpus luteum und dem Embryo ansammeln. Jedoch gehörten die in den Kälbern und in fünf der Kaninchen hergestellten Antisera dem Präzipitationstyp an bzw. bildeten einen Niederschlag, und nach der Absorption an Geweben von nichtträchtigen Schafen beobachtete man, daß sie in Agargelen mit einem Homogenat von einem 14 Tage alten .Schafembryo ausfallen. Diese Antisera wurden bis. jetzt noch nicht in einem Hämagglutinationssystem verwendet.

Eine vorläufige CharakterisJe rung des Antigens bzw. der Antigene wird unter Verwendung von Uterusvenen und peripherem Plasma und in einigen Fällen von Erythrocyten, Uterus und

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Corpus luteum aus Mutterschafen am 14. Tag der Trächtigkeit durchgeführt. Die Immunofluoreszenz wird verwendet, um die Anwesenheit des Antigens bzw. der Antigene im Uterus und im Corpus luteum festzustellen, wohingegen ein einfacher Hämagglutinationstest und ein direkter Hämagglutinationstest verwendet werden, um die Anwesenheit des Antigens bzw. der Antigene an den Erythrocyten bzw. im Plasma festzustellen.

Das Antigen bzw. die Antigene im Plasma ist bzw. sind bei 37⁰C während mindestens 4 Stunden, bei 4⁰C während mindestens 1 Woche und bei -15⁰C mindestens 12 Wochen stabil. Die Aktivität wird beim Erwärmen auf 56°C während 30 Minuten etwas vermindert, und beim Erwärmen bei 80⁰C während 30 Minuten zerstört. Nach der Dialyse (MW-Abschaltung bzw. "MW Cut Off" 6000 bis 8000) gegenüber phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,1) über Nacht bei 4°C verbleibt der Titer des Antigens im dialysierten Plasma unverändert. Die Filtration des Plasmas von Mutterschafen am 14. Tag der Trächtigkeit an Sephadex G-25 (Fraktionierungsbereich 100 bis 5000 MW) zeigt, daß das Antigen bzw. die Antigene in der Hauptproteinfraktion vorhanden ist bzw. sind, die in dem Ausschlußvolumen der Säule gesammelt wird. Dies zeigt an, daB das Antigen bzw. die Antigene ein Molekulargewicht über 5000 besitzt bzw. besitzen«, Weitere Chromatographie an Sephadex G-100 (Fraktionierungsbereich 5000 bis 100 000 MW) zeigt, daß das Antigen bzw. die Antigene von der Säule in eine Bande getrennt wird bzw» werden, die nach dem Ausschlußvolumen der Säule herauskommt, was ein Molekulargewicht zwischen 5000 und 100 000 anzeigt. Die Ammoniumsulfat-Präzipitation zeigt, daß eine 45^ige Sättigung die niedrigste wirksame Konzentration ist, bei der das Antigen bzw. die Antigene aus der Lösung entfernt wird bzw. werden. Die Elektrophorese an Celluloseacetat« mesrtsraneri bei pH 8,5 zeigt, daß das Antigen bzw. die Antigene eine elektrophoretische Mobilität in dem a-Globulin-Bereich besitzt bzw, besitzen. Durch die Behandlung des

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Trächtigkeitsplasmas mit M-TriChloressigsäure wird das Antigen bzw. werden die Antigene vollständig aus der Lösung entfernt, was anzeigt, daß eine Proteinkomponente in dem Antigen bzw. in den Antigenen für die Umsetzung mit dem Antiserum erforderlich ist. Im Plasma, das man mit Natriummeta-perjodat bei Konzentrationen von 0,05 bis 0,20 M behandelt hat, wird kein Antigen bzw. werden keine Antigene festgestellt. Nach der Behandlung mit Perjodat in Konzentrationen zwischen 0,00125 und 0,02 M agglutinieren Erythrocyten nicht mehr mit dem Antiserum. Das Antigen bzw. die Antigene scheint bzw. scheinen daher einen Kohlenhydrat-Molekülteil zu enthalten, der für die Umsetzung des Antigens bzw. der Antigene mit dem spezifischen Anti-Trächtigkeitsserum erforderlich ist.

Man hat daher das Plasma, die Erythrocyten, den Uterus und Corpus luteum von Mutterschafen am Tag 14 der Trächtigkeit verschiedenen Enzymbehandlungen unterworfen. Nach der Behandlung des Plasmas, der Erythrocyten, des Uterus und des Corpus luteum mit Papain oder Trypsin zeigen diese Gewebe mit dem Antiserum keinerlei Reaktionen, was anzeigt, daß das Antigen bzw. die Antigene eine Proteinkomponente enthält bzw. enthalten. Die Behandlung mit Neuraminidase verhindert ebenfalls eine Reaktion mit dem Antiserum, und dies zeigt an, daß das Antigen bzw. die Antigene ein Kohlenhydrat mit Sialsäure-Molekülteilen (N-Acylneuraminsäure-Molekülteilen) enthält bzw. enthalten. Im Gegensatz dazu sind nach der Behandlung mit cc-Amylase das Antigen bzw. die Antigene mit dem Antiserum noch feststellbar, was anzeigt, daß das Antigen bzw. die Antigene kein cc-1——■> 4 gebundendes Glucosepolymer enthält bzw. enthalten.

Diese Voruntersuchungen des trächtigkeitsspezifischen Antigens bzw«, Antigene, das (die) immunologisch in den Geweben trächtiger Schafe festgestellt wurde(n), zeigen, daß es bzw. sie ein Molekulargewicht von 5000 bis 100 000 besitzt (besitzen) und daß eine Protein- und Kohlenhydratkomponente

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vorhanden ist. Es wurde weiterhin gezeigt, daß das Antigen bzw. die Antigene aus einem 14 Tage alten Embryo durch Einweichen des Embryos in V/asser extrahiert werden kann (können). Nach dem Einweichen über Nacht in destilliertem Wasser sind die Zellen des Embryos gequollen und enthalten viele Vacuolen, aber sie sind nicht aufgelöst, -und das Antiserum ist nicht langer an den Zellen lokalisiert. Mach des Einweichen In phosphatgepufferter Salzlösung über Nacht beobachtet man, daß sich das Antiserum an den Zellen des Embryos lokalisiert, was anzeigt, daß das Antigen bzw. die Antigene nicht durch gepufferte Salzlösung entfernt wird (werden) und das mikroskopische Aussehen ist ähnlich wie das des nichtbehandelten Embryos·

Der EinfluB des Antigens bzw. der Antigene im Verlauf der Zeit auf Schafterythrooyten wurde untersucht, wozu man die ursprünglichen Antisera und einfache Hamagglutinationsversuche und Blut verwendete, das von Schafen zu verschiedenen Zeitpunkten ihrer Oestrus-Zyklen und während der Trächtigkeit (Tabelle II) entnommen wurde. Eine 5%±ge (Yol/Vol) Suspension aus Erythrocyten in phosphatgepufferter Salzlösung (0,145 M NaCl, 0,01 M Phosphat bei pH 7,1) wird hergestellt und tropfenweise in Blut-Agglutinationsschalen pipettiert. Ein Tropfen einer 1 in 16 Verdünnung von

(a) dem Antiserum, welches durch wiederholte Absorption an Geweben, ausgenommen dem Konzeptionsgewebe, spezifisch für das Trächtigkeits-Antigen gemacht wurde,

(b) dem Antiserum, absorbiert an einem Homogenat von 12 Tage altem Konzeptionsgewebe (Conceptus) für die Entfernung der Antikörper, die für die Trachtigkeit spezifisch sind, oder

(c) prä-immunisiertes Serum von dem Kaninchen wird zugegeben, dann wird vermischt und 30 Minuten stehengelassen.

Erythrocyte, die von Mutterschafen zwischen dem 6. und. 50» Tag der Trachtigkeit entnommen werden, zeigen Agglutination

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mit Antiserum, das an Geweben, außer den Konzeptionsgeweben, absorbiert ist, und zeigen somit die Anwesenheit von den für die Trächtigkeit spezifischen Antigenen im Blut an (Tabelle II). Keine Agglutination der Erythrocyten tritt mit prä-immunisiertem Serum oder Serum, das an Embryogeweben absorbiert ist, auf. Es tritt keine Agglutination mit Erythrocyten von zwei Schafböcken, vier Hammeln oder zwölf nichtträchtigen Mutterschafen zu irgendeinem Zeitpunkt des untersuchten Östrus-Zyklus auf. Die Erythrocyten von Schweinen, Kühen und Pferden agglutinieren mit dem Antiserum, das gegenüber Schafembryos entwickelt wurde, zum frühen TrächtigkeitsZeitpunkt nicht«, Der Antikörper scheint somit für trächtige Mutterschafe spezifisch zu sein.

Die Bestimmung des für die Trächtigkeit spezifischen Antigens ermöglicht ein einfaches Versuchsverfahren für die Trächtigkeitsdiagnose ab dem Tag 6 bei Mutterschafen.

Um die Genauigkeit dieses einfachen Hämagglutinationstests zu bestimmen, wurden in einem weiteren Versuch 330 Mutterschafe, die bis zu 55 Tagen früher gepaart worden waren, untersucht, und die Trächtigkeit wurde beim Schlachten bestätigt. Eine nichtgepaarte Vergleichsherde wurde ebenfalls in monatlichen Abständen während 4 Monaten über den gleichen Zeitraum untersucht. Bei den gepaarten Mutterschafen wurden 6490 richtig diagnostiziert, nämlich positiv (¹²⁵/330) und negativ ( /330) im Verlaufe der Beobachtung. In der gepaarten Herde gab es /330 (19%) falsche positive Tests, wovon 55% Mutterschafen zuzuschreiben sind, bei denen ein Tod des Embryos und eine Resorption nach dem Testen stattfand. Die restlichen 45% der falschen Ergebnisse sind auf Fehler der Arbeiter bei der Isolierung der Embryos aus dem geschlachteten Material und auf Fehler beim Ablesen der Tests zurückzuführen. In der gepaarten Herde gab es

/330 (17%) falsche negative Tests. Wurden diese im Zusammenhang mit dem Zustand der Trächtigkeit geprüft, so stellt man fest, daß das Auftreten der falschen negativen Ergeb-

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nisse in den Tagen 41 bis 50 erhöht ist. Man kann daher annehmen, daß die Anwesenheit von überschüssigem, nichtgebundenem Antigen im Plasma die Hämagglutination gestört hat. Die Genauigkeit des Hämagglutinationstests zu verschiedenen Zeitpunkten der Trächtigkeif ist die folgende: 6 bis 12 Tage Trächtigkeit bzw. Gestation - 61% richtige positive Ergebnisse; 13 bis 30 Tage - 72%; 21 bis 30 Tage - 78%; 31 bis 40 Tage - 85%; 41 bis 50 Tage - 44%. In der nichtgepaarten Kontrollherde treten nur sehr wenig falsche positive Tests auf (6%).

Da es mit dem einfachen Hämagglutinationstest nicht möglich ist, zwischen hohen und niedrigen Titern an Antigen zu unterscheiden, muß ein anderes Hämagglutinationsverfahren verwendet werden, um die Genauigkeit der Diagnose zu erhöhen.

Das andere Verfahren ist der direkte Hämagglutinationstest, von dem zuvor gezeigt wurde, daß mit ihm das Antigen bzw. die Antigene im Plasma von Mutterschafen am 14. Tag der Trächtigkeit festgestellt werden kann (können). Plasmaproben von 81 Mutterschafen werden im Verlauf von 62 Tagen nach der Paarung gesammelt. Plasma (50 1) wird bei 37⁰C mit 50 1 einer Verdünnung (z.B. 1/16) von Kaninchen-AntiSchaf-Embryo serum inkubiert. Nach 1 Stunde werden 50 1 einer 2,5%igen (Vol/Vol)Suspension der Erythrocyten von kastrierten männlichen Schafen (Hammeln) zugegeben und die Mischung wird bei 4⁰C 30 Minuten inkubiert. Dann werden die Erythrocyten durch Agglutination bestimmt. Mit diesem Biiidungs-Hämagglutinationstest werden nach 62 Tagen Trächtigkeit 89% der Tiere richtig diagnostiziert (60/81 positiv und 12/81 negativ), und es gibt 5 falsche positive Tests und 4 falsche negative Tests.

Von den Schafen> von denen beim Schlachten bestätigt wurde, daß sie 62 Tage nach der Paarung trächtig sind, wurden nur 10% zwischen den Tagen 0 bis 6, 29% zwischen den Tagen 7 bis

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13» 4-796 zwischen den Tagen 14 bis 20, 75% zwischen den Tagen 21 bis 27, 76% zwischen den Tagen 28 bis 34, 93% zwischen den Tagen 35 bis 41, 71% zwischen den Tagen 42 bis 48, 100% zwischen den Tagen 4-9 bis 55 und 85% zwischen den Tagen 56 bis 62 diagnostiziert. Die schlechte Genauigkeit vor 20 Tagen der Trächtigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß der Antigen-Titer für die Bindung an die Erythrocyten, damit die Agglutination stattfinden kann, nicht reicht. Andererseits ist dieser Bindungs-Hämagglutinationstest viel genauer als der einfache Test 40 Tage nach der Gestation.

Von vier der fünf Mutterschafe mit falschem positivem Test nach 62 Tagen Trächtigkeit wird angenommen, daß sie ihre Embroys verloren haben, da sie noch restliche Mengen an Antigen in ihrem Blut hatten. Im Hinblick auf die Komplikationen der Embryoresorption, die hauptsächlich in den ersten 25 Tagen der Trächtigkeit auftritt, ist der Bindungs-Hämagglutinationstest besser geeignet, um eine Trächtigkeit zwischen den Tagen 30 und 65 zu diagnostizieren.

Antisera, von denen durch Immunofluoreszenz und Geldiffusion gezeigt wurde, daß sie mit dem Antigen bzw. den Antigenen von Embryos von Kühen reagieren, werden hergestellt, indem man Kaninchen mit einem Homogenat eines Kuhembryos, der 30 bis 40 Tage alt ist, immunisiert. Nach der Absorption an Homogenaten der Leber und der Niere von nichtträchtigen Kühen reagieren die Antisera noch mit einem Homogenat von einem Kuhembryo (30 bis 40 Tage) durch Präzipitation in Agargels.

Bei einem weiteren Versuch wird ein Antiserum, das für die Trächtigkeit in Pferden spezifisch ist, entwickelt, indem man Kaninchen mit Blut einer trächtigen Stute immunisiert. Nach den Absorptionsverfahren, die ähnlich wie die zuvor beschriebenen sind, stellt man fest, daß das Antiserum aktiv

ist.

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Die schnelle Feststellung der Trächtigkeit in Tieren ist von großem Wert, wobei dieser Wert von der Art der zu untersuchenden Tiere abhängt. Wenn beispielsweise die trächtigen Mutterschafe aus einer Herde schnell identifiziert werden können, ist es möglich, diese sofort von der Herde zu trennen, und dadurch kann die Vermehrungswirksamkeit der Herde als Ganzes erhöht werden. Wenn Mutterschafe, die mehr als einen Fötus tragen, identifiziert werden können, ist es möglich, diese Mutterschafe abzutrennen, so daß sie getrennt von dem Rest der Herde gehalten werden können, was erneut eine Verbesserung in der Fortpflanzungswirksamkeit ergibt.

Die Antisera, die spezifisch für die Trächtigkeit bei Kühen sind, sind von großem Wert» da in vielen Fällen die Kühe künstlich und nicht natürlich oesamt werden. Verwendet man ein solches Antiserum, so weiß man frühzeitig, ob eine Befruchtung stattgefunden hat, und -wenn dies nicht der Fall ist, kann das Tier wieder behandelt werden_f so daß eine künstliche Besamung erneut innerhalb von 3 Wochen durchgeführt werden kann. Die frühe Erkennung von trächtigen Kühen ermöglicht,die Fortpflanzungswirksamkeit der Herde durch spezielle Haltung zu erhöhen. Bei Mähen ist die Erkenntnis, <ia8 eine besondere Kuh Zwillinge trägt, ebenfalls von Bedeutung, da dadurch eine spezielle Haltung möglich wird, um die Gesundheit der Zwillinge und der Kuh zu erhalten,

Wird die vorliegende Erfindung bei Pferden verwendet, so ist der erste Vorteil der, daß, wie bei den Kühen, die Besamung wiederholt werden kann, -wewn. keine Trächtigkeit festgestellt wird· Bei Pferden ist das Züchten von Zwillingen nicht wünschenswert, und werm es Anzeichen dafür gibt, daß.eine Stute „Zwillinge trägt, kann man eine Bätscheidung treffen, ob man sie austragen lassen will oder oo eine Abtreibung durchgeführt werden soll.

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Die gleichen Vorteile wie bei Schafen und Kühen gelten für Schweine, Hunde und Ziegen.

Beim Menschen scheint der Versuch alle die Vorteile bekannter Schwangerschaftstests zu haben. Er ist auch gegenüber anderen immunologischen Versuchen fortschrittlich, bei denen HCG gemessen wird und bei denen man positive Ergebnisse in nicht-schwangerem Zustand erhalten kann, wenn eine hydatinenförmige Mole, ein Choreoadenom oder ein Choriokarzinom vorhanden sind.

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Relative Intensität der immunologischen Fluoresssenzfärbung in Geweben aus trächtigen und nicht trächtigen Mutterschafen, die mit Anti-Schaferabryosera behandelt sind

^^ ■ ·, .·..■-■ : ■ ■■■ ■·. ..- P^ä-Immunisierungs-

■nicht- absorbiert. _w„ , «-ΐτ,τίτ

Gewebe absor- nur L^blr^TeBeH ^ίΐ" i^s?^S^!^rt

biert Leber Miere Embryo gjj^" ^{an Leber}

Trächtige, Schaf e,

Tag d·Trächtigkeit: Embryo und Membranen ή-+

12^\i3^²',14^²V Corpus luteum ₁₅(3)_y16(1)_>17(2) Skelettmuskel

⁺ Die Zahlen in Klammern bedeuten die Zahl der Tiere» die an dem angegebenen Tag untersucht wurden* Tag O t* Tag des östrus

o> 8^V*·' _#9^{V ;}.10^v ' Uterus

cd 12^\i3^²'.i4^²^ Corpus luteum +++

OO
KJ
KJ

Nlchttrachtige Schafe ' ' -*■

ο Tag d.Zyklus: Uterus + *.*.-- - ,

8^V '_t9^K \t1^Q Corpus luteum

Skelettmuskel

Niere Leber

Tabelle II

Agglutination mit Anti-Schafembryosera von Erythrocyten aus trächtigen und nichtträchtigen Mutterschafen, Schafböcken und Hammeln

Ursprung der Erythrocyten

Immunserum R5

nichtabsor- biert

absorbiert an

Prä-Iramuni s ations serum R5

nurLeber&
Leber Niere

Leber& Embryo

nichtabsorbiert

	Mutterschafe	⁺: 4
	Tag der Trächtigkeit	6
	(n=3)
O		9
CD		12
CX) KJ		16
N)		18
_*		22-50
O		12
-ο	Tag des Zyklus:	14
	(n=6)
	Schafböcke (n=2)
	Hammel (n=4)

+ Die Trächtigkeit wird an den Tagen 26 und 50 durch Laparotomie bestimmt

Tag 0 = Tag des Östrus

η = Anzahl der in jedem Fall untersuchten Tiere

Claims

- 18 Patentansprüche

1 · Anti-Embryoserum, hergestellt durch Immunisierung von einem oder mehreren Tieren mit einem Homogenat aus der Gruppe Embryos, ausgewählte Embryoteile, Extrakte von Embryos, gereinigte Fraktionen von Embryos und Blut aus trächtigen Tieren, wobei unwichtige Antikörper durch selektive Absorption an Gewebehomogenaten, ausgenommen Embryos, Uteri, Ovarien und Blut von trächtigen Tieren, entfernt wurden.
2. Anti-Embryo serum nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das homogeniserte Gewebe, das für die Absorption verwendet wird, von nichtträchtigen Tieren stammt.
3. Anti-Embryoserum gemäß einem oder mehreren der Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet , daß die selektive Absorption aufeinanderfolgende Absorptionen von verschiedenen unwichtigen Antikörpern umfaßt.
4. Anti-Embryoserum gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, für die Verwendung bei einer besonderen Species, dadurch gekennzeichnet , daß das Serum gegenüber Embryos, ausgewählten Embryoteilen, Embryoextrakten, gereinigten Embryofraktionen und Blut von trächtigen Tieren der besonderen Species entwickelt wurde,
5* Anti-finbryoserum gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß die selektive Absorption aufeinander folgende Absorptionen von verschiedenen unwichtigen Antikörpern umfaßt·
6« Anti-Embryoserus gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 Ms 5» dadurch gekennzeichnet , daß die Embryos» ausgewählten Embryoteile, Embryoextrakte, gereinigten Embryofraktionen oder das Blut von trachtigen

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- 19 Tieren mit einem Adjuvans emulgiert werden.
7. Anti-Embryoserum gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 Ms 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Adjuvans Freund'sehes Adjuvans verwendet wird.
8. Anti-Embryoserum gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die nachfolgenden Absorptionen mit Homogenaten »us der Leber und/oder der Niere der besonderen Species und/oder mit Erythrocyten von nichtträchtigen Tieren der besonderen Species durchgeführt werden.
9. Anti-Embryoserum gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wiederholten Absorptionen mit irgendeinem der Homogenate durchgeführt werden.
10. Anti-Embryoserum gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Homogenat in Tiere injiziert wird, denen anschließend Blut entnommen wird, und daß das Serum von dem Rest des Bluts vor der Entfernung der unwichtigen Antikörper abgetrennt wird.
11. Verfahren für die Schwangerschafts- bzw. Trächtigkeitsdiagnose in Säugetieren, dadurch gekennzeichnet, daß zu dem Tier- bzw. Menschenblut ein Anti-Embryoserum zugegeben wird, hergestellt durch Immunisierung von einem oder mehreren Tieren mit einem Homogenat, ausgewählt . aus der Gruppe Embryos, ausgewählte Embryoteile, Embryoextrakte, gereinigte Embryofraktionen und Blut von trächtigen Tieren, aus dem die unwichtigen Antikörper durch die selektive Absorption an Gewebehomogenaten, ausgenommen von Embryos, Uteri, Ovarien und Blut von trächtigen Tieren, entfernt wurden, und daß man das Blut mit Verfahren prüft, mit

' denen sich Antigene feststellen lassen.

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12. Verfahren für die Schwangerschafts- bzw. Trächtigkeitsdiagnose in Säugetieren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Antigene durch Agglutinationsverfahren, Agglutinationsinhibierungsverfahren, Präzipitationsreaktionen und/oder radio-immunologische Untersuchungsverfahren feststellt.
13* Verfahren für die Schwangerschafts- bzw» Trächtigkeitsdiagnose in Säugetieren gesiäß einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 12₅ dadurch gekennzeichnet, daß das Serum gegenüber Embryos, ausgewählten Bnbryoteilen, Embryoextrakten, gereinigten Embryofraktionen oder Blut aus trächtigen Tieren der Species, die diagnostiziert werden soll, gezüchtet wird,
1^·* Verfahren für die Schwangers chafts- bzw· Trächtigkeitsdiagnose in Säugetieren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung des Antigens keine Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit, eine einfache Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit oder eine mehrfache Schwangerschaft oder Trächtigkeit anzeigt,
15« Verfahren für die Schwangerschafts- bzw« Trächtigkeitsdiagnose in Säugetieren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet , daß man zu dem Blut von Menschen bzw* Tieren ein AntiEmbryo serum zugibt, das man durch Immunisierung von einem oder mehreren Tieren mit einem Homogenat aus der Gruppe Embryos, ausgewählten Embryoteilen, Embryoextrakten, gereinigten Embryofraktionen und Blut von trächtigen Tieren hergestellt hat, wobei aus dem Serum-unwichtige Antikörper diarch selektive Absorption an Gewebehomogenaten, ausgenommen Embryos, Uteri, Ovarien und Blut von trächtigen Tieren, entfernt wurden und wobei das Serum zu reihenweise verdünnten Blutproben gegeben wird und wobei das Blut ait solchen Verfahren geprüft wird, mit denen sich Antigene

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feststellen lassen, wobei die Verdünnung des Serums, bei dem die Feststellung erfolgt, ein Anzeichen dafür ist, ob keine Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit, eine einfache Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit oder eine mehrfache Schwangerschaft bzw. Trächtigkeit vorliegt.
16. Verfahren für die Schwangerschafts- bzw. Trächtigkeitsdiagnose in Säugetieren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 14 bis 15, dadurch gekennzeichnet , daß das Serum gegenüber Embryos, ausgewählten Embryoteilen, Embryoextrakten, gereinigten Embryofraktionen oder Blut von trächtigen Tieren der Species, die diagnostiziert werden soll, gezüchtet wird.

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