DE2536163A1

DE2536163A1 - Vorrichtung zum auszaehlen von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2536163A1
Application number: DE19752536163
Authority: DE
Inventors: Gregory L Michaud; Anthony N Sharpe
Original assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Current assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Priority date: 1974-08-14
Filing date: 1975-08-13
Publication date: 1976-02-26
Also published as: DE2536163B2; JPS5539B2; DE2536163C3; FR2281983A1; FR2281983B1; JPS5144973A; GB1478575A; CA1032453A

Description

MÜLLER-BORE · GROBIV'IKv? · DBUuRJs - SCHÖN · HERTEL

PAT EJTTASWÄLTE

DR. WOLFGANG MÜLLER-BORE H. W. GROENING₁ DIPL.-ING. DR. P. DEUFEL, DIPL.-CHEM. DR. A. SCHÖN. DIPL.-CHEM. WERNER HERTEL, D1PL.-PHYS.

C 2923 dt/th

13. AUG. 1975

CANADIAN PATENTS AND DEVELOPMENT LIMITED Ottawa, Kanada

Vorrichtung zum Auszählen von Mikroorganismen

Priorität: USA vom 14. 8. 1974, Nr. 497 285

. Die Erfindung "betrifft eine Vorrichtung zur Erleichterung des Auszählens von Mikroorganismen.

In vielen Gebieten der Mikrobiologie ist das genaue Auszählen der Anzahl von Mikroorganismen in einer Probe von Bedeutung. Diese Information wird beispielsweise bei der Prüfung von Nahrungsmitteln oder Wasser auf pathogene oder verunreinigende Bakterien oder bei der Prüfung von Urin in Fällen eines Verdachtes auf Infektionen des Harntraktes benötigt.

Ein ge^/iöhnlich verwendetes Verfahren zum Auszählen von Mikroorganismen besteht darin, eine geeignet verdünnte Probe unter Verwendung eines Membranfilter^ zu filtrieren, durch das die Mikroorganismen nicht passieren können, und hierdurch das Filter mit den Mikroorganismen zu inokulieren. Das inokulierte

609809/0912 MC-XCHEN 80 · SIEBERTSTR. 4 · POSTFACH 86 0720 · KABEL·: MTTEBOPAT · TEL. <089) 4710 79 · TELEX 3-2-63Θ AUPHiIISEH BANK MÜNCHEN (BLZ 70030000), KTO. 1800/038 · POSTSCHECKAMT MÜNCHEN, KTO. 95493-802

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Membranfilter wird dann auf die Oberfläche eines Nährgels oder auf eine mit einer Nährlösung getränkte Unterlage in einer Petrischale gebracht. In beiden Fällen durchdringen Nährstoffe das Filter und erlauben den Mikroorganismen während der Inkubation als sichtbare Kolonien auf der Oberfläche des Filters zu wachsen, wonach sie gezählt werden können.

In der gegenwärtigen Praxis ist der mit der Durchführung einer Mikroorganismenzählung verbundene Arbeitsaufwand beträchtlich. Ein beträchtlich arbeitsaufwendiger Schritt ist das genaue Zählen der Mikrobenkolonien auf der Oberfläche des Membranfilters.

Eine Vielzahl optisch-elektronischer Hilfsmittel ist erhältlich, die ein Membranfilter abtasten und eine der Gesamtkoloniezählung entsprechende Zahl anzeigen können. Die Genauigkeit solcher Vorrichtungen ist jedoch nicht ganz zufriedenstellend, da die Anregung · eines Zählpulses von einem Wechsel der optischen Dichte des Filters zwischen einem sterilen und einem mit einer Mikrobenkolonie bedeckten Gebiet bewirkt wird und viele Fehlerquellen vorhanden sind, beispielsweise das Vorliegen Defekten wie Zellbruchstücken, Oberflächenunregelmäßigkeiten oder Variationen der Kolonien in ihrer optischen Dichte, Größe, Schärfe und der Gleichmäßigkeit ihrer Radien. Eine Kolonie kann beispielsweise als diffuser Fleck mit geringer optischer Dichte und wenig Änderung der optischen Dichte an seinen Grenzen vorkommen. Eine solche Kolonie ist optischelektronisch schwierig zu erfassen. Wenn die Empfindlichkeit eines automatischen Zählers erhöht wird, so daß er auf solche Kolonien anspricht, wird er außerdem auch empfindlicher für andere oben beschriebene Fehlerquellen. Es ist im Augenblick nötig, daß eine Person jedes von einem optisch-elektronischen Instrument gezählte Filter prüft, da solche Instrumente unfähig

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sind, zwischen dem Fall des Wachsens weniger oder keiner Kolonien auf dem Filter und dem einer großen Zahl als einförmige, zusammenfließende Masse wachsender Kolonien zu unterscheiden. Dieser letztere Fall könnte ohne die vorherige Prüfung des Filters durch die Aufsichtsperson gefährlich sein.

Ein weiterer Schritt, der "beträchtlichen Arbeitsaufwand bedingt, ist die Herstellung einiger Lösungen der Probe, um einen Bereich von Koloniedichten zu erzielen, wenn die Konzentration von Mikroorganismen auf der Probe nicht näherungsweise vorhergesagt werden kann. Dieses Vorgehen ist notwendig, da das Vorliegen von nur sehr wenigen Kolonien auf dem Filter keine statistisch signifikante Antwort ergäbe. Wenn andererseits zu viele Kolonien auf dem Filter vorliegen, überlappen sie sichund ihre visuelle Trennung in einzelne Kolonien kann schwierig oder gar unmöglich sein.

Mit üblichen Filtern deckt die maximale Koloniedichte, die optisch-elektronisch zuverlässig gezählt werden kann, immer noch nur einen kleinen Bruchteil der gesamten abgetasteten Fläche. Wenn daher, wie in der gegenwärtigen Praxis üblich, Kolonien in statistisch verteilten Positionen wachsen, muß die gesamte Fläche abgetastet werden, und da das Verhältnis der nicht von Kolonien besetzten Fläche zur von Kolonien besetzten groß ist, neigt die Zahl von falschen Zählungen, die auf Schäden oder Verschmutzungen auf dem Filter, ebenfalls dazu groß zu sein, da sie diesem Verhältnis proportional ist.

Ziel der Erfindung ist eine Vorrichtung, die das Auszählen von Mikroorganismen erleichtert, insbesondere eine Vorrichtung, die das Auszählen von Mikrobenkolonien, die auf einem Membranfilter wachsen, erleichtert, sowie sicherzustellen, daß Größe, Form und optische Dichte von Mikrobenkolonien, die auf einer Membranfilteroberfläche wachsen, verhältnismäßig

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gleichmäßig sind. Weiteres Ziel ist ein Membranfilter, das das Überlappen oder Zusammenfließen von Mikrobenkolonien verhindert, außerdem die Zählung eines breiten Bereiches von Mikrobenkonzentrationen ermöglicht und die Zahl der erforderlichen Verdünnungen, um eine geeignete Koloniedichte auf einem Membranfilter zu erzielen, vermindert, sowie Zählungen hoher Dichte auf dem Membranfilter erleichtert, hohen optischen Kontrast zwischen Mikrobenkolonien und der Oberfläche eines Membranfilters gewährleistet, sowie eine Vorrichtung, die das automatische Auszählen von Mikroorganismen erleichtert. Außerdem soll ermöglicht werden, daß bestehende Kolonien auf einem Membranfilter an vorbestimmte Stellen oder in regelmäßigen Mustern angeordnet werden, um die optisch-elektronische Zählung zu erleichtern.

Die vorliegende Erfindung liefert eine Vorrichtung zur Erleichterung des Auszahlens von Mikroorganismen, die ein Membranfilterelement umfaßt, auf dessen einer Oberfläche die in einer fließfähigen, durch das Filter gefilterten Probe vorliegenden Mikroorganismen zurückgehalten werden, wobei das Filterelement auf dieser Oberfläche ein Trennmaterial aufgedruckt hat.

in einem Muster, das eine größere Zahl regelmäßig angeordneter, Mikrobenkolonien isolierender Zellen abgrenzt, in -denen die Zellen von kleinerer Fläche als die normalen Kolonieflächen

Die Erfindung wird im folgenden anhand der beiliegenden Abbildungen erläutert, die bevorzugte Ausführungsformen zeigen.

Fig. 1 ist eine Aufsicht eines Membranfilters, das mit einem Trennmaterial in einem rechtwinkligen, gitterförmigen Muster bedruckt ist und eine Anzahl von Mikrobenkolonien zeigt.

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Fig. 2 ist ein vergrößerter Schnitt entlang der Linie 2-2 in Fig. 1.

Fig. 3 ist eine Aufsicht eines Membranfilters, das mit einem Trennmaterial in einem gitterförmigen Spiralmuster bedruckt ist.

Fig. 4 ist die Aufsicht eines Membranfilters, das mit einem Trennmaterial in einem Muster bedruckt ist, das kreisförmige Zellen für die Kolonie abgrenzt.

Fig. 5 ist eine Teilaufsicht eines gitterförmig bedruckten, in einem Benälter montierten Membranfilters.

Fig. 6 ist die vergrößerte Teilansich't eines Schnitts entlang der Linie 6-6 von Fig. 5·

Fig. 7 stellt grafisch den experimentell bestimmten Unterschied bei der Koloniezählung zwischen einem erfindungsgemäßen, gitterförmig bedruckten Membranfilter und einem üblichen Membranfilter dar.

In Fig. 1 und 2 hat ein Membranfilterelement 1 auf seiner Oberfläche in einem rechtwinkligen, gitterförmigen Muster sich schneidender Linien ein Trennmaterial 2 aufgedruckt, das eine größere Zahl von Zellen 3 abgrenzt, die einzelne Mikrobenkolonien bildende Einheiten/voneinander trennen. Das Trennmaterial 2 begrenzt das laterale Wachstum und verhindert Ausbreitung und Zusammenfließen der Kolonien 4.

Die Zellen 3 sind mit einer Fläche versehen, die kleiner als die üblicherweise für die Mikrobenkolonien 4 erwartete Fläche ist, so daß die Kolonien 4 zum senkrechten Wachstum zur Oberfläche des Membranfilters neigen, an Dicke zunehmen

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und daher den optischen Kontrast zwischen Kolonie und Filter vergrößern. Gleichzeitig wird das überlappende und zusammenfließende Wachstum von Kolonien vermieden, das ihre Zählbarkeit auf üblichen Membranfiltern herabsetzt. Da jede Kolonie gezwungen ist, mit einer flächenmäßig kleineren Oberfläche zu wachsen, kann man auch eine viel größere Koloniedichte auf der Oberfläche des Membranfilters wachsen lassen. Daher ist für eine Probe, die eine hohe Mikrobenkonzentration enthält, eine geringere Zahl von Verdünnungen erforderlich.

Das Trennmaterial kann in jedem passenden Muster aufgedruckt werden, welches das Zählen erleichtert. In einer bevorzugten Ausführungsform der Fig. 1 ist das Muster ein rechtwinkliges Gitter. In einem rechtwinkligen Gitter kann die Position jeder Zelle durch zwei Koordinaten beschrieben werden, so daß die Position des Zentrums einer Zelle genau und leicht vorgegeben werden kann. Daher braucht eine Abtast- und Zählvorrichtung nur einen zentralen Punkt jeder Zelle prüfen, so daß die Notwendigkeit entfällt, alle Flächen des Filters abzutasten, und Fehler beträchtlich vermindert werden.

Die Fig. 3 und 4- stellen Beispiele alternativer Trennmuster dar. In Fig. 3 sind die Zellen 11 auf dem Membranfilter 12 in einer Spirale angeordnet. In Fig. 4- umgrenzt das Trennmaterial 15 runde Zellen 16 auf dem Membranfilter 17.

Das Trennmaterial kann jedes Material sein, das befähigt ist, auf irgendeine Art auf der Oberfläche angebracht zu werden oder die Oberfläche des Membranfilters so zu modifizieren, daß die Ausbreitung von Organismen gehemmt wird, es darf jedoch kein Material sein, das befähigt ist, das Wachstum von Mikroorganismen auf der freien Oberfläche des Membranfilters durch Austreten von löslichen Hemmstoffen zu inhibieren. Daher muß das Trennmaterial befähigt sein, die Ausbreitung von Kolonien

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durch, seine physikalischen oder mechanischen Eigenschaften zu "beschränken. Die Anforderungen an das Trennmaterial sind Unbenetzbarkeit, Undurchlässigkeit für Nährstoffe oder Mikroorganismen, geringe Toxizität für Mikroorganismen, Unlöslichkeit sowie physikalische oder chemische Eigenschaften, die erlauben, es an der Membran zu befestigen. Das Trennmaterial kann z. B. Kohlenwasserstoffwachs, Petrolatum, Silikonwachs oder -öl, Epoxyharz, Polytetrafluoräthylen- oder Polystyrollösungen, Kautschuk, Acrylharze und Bienenwachs umfassen.

Geeignete Methoden zum Aufdrucken des gewählten Musters auf das Membranfilter werden dem Fachmann für Druck auf Papier oder Kunststoffen bekannt sein, jedoch sollten vernünftige Vorkehrungen getroffen werden, um die Kontamination des Membranfilters mit Mikroorganismen zu vermeiden. Alternativ hierzu können die bedruckten Membranfilter vor der Verwendung mit jeder normalerweise verwendbaren Sterilisationseinrichtung, wie mit Gammabestrahlung oder Äthylenoxidgasbehandlung, sterilisiert werden.

Vorzugsweise wird beim Druckvorgang genügend Trennmaterial abgeschieden, daß die gesamte Dicke der Membran, wie in Fig. dargestellt, durchdrungen wird, so daß die der Kolonie bildenden Einheit einer einzelnen Zelle zur Verfügung stehenden Nährstoffe begrenzt sind und hierdurch die Möglichkeit der Kolonieausbreitung in andere Zellen herabgesetzt wird. Der Druckvorgang wird vorzugsweise auch dafür sorgen, daß das Trennmaterial auf dem Filter, eine erhabene Oberfläche hinterläßt, die als zusätzliche mechanische Barriere oder Wand wirkt.

Obwohl die optimale Zellgröße von der Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus oder von der Zählmethode abhängen wird, scheint es, daß die Zellfläche im Bereich zwischen ungefähr

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25 mm und 0,05 mm liegen sollte. 25 mm scheint die obere

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Grenze zu sein, da die meisten Bakterienkolonien zu nicht viel mehr als dieser Größe wachsen. Die untere Grenze wird von der Fähigkeit des Druckverfahrens bestimmt, das gewünschte Muster zu reproduzieren, ohne die Poren der Membran vollständig zu verschließen.

Es scheint, daß die Breite der Barriere mindestens 0,025 sein sollte, da feinere Linien schwer zuverlässig zu reproduzieren sind oder Kolonien schwer vom Darüberwachsen abhalten. Die Fähigkeit, Kolonien zu trennen, wird jedoch durch die Verwendung eines Trennmaterials verbessert, das erhabene Oberflächen bildet. Vergrößerung der Liniendicke über das zur zuverlässigen Trennung von Kolonien notwendige Maß verkleinert die verwendbare Fläche des Membranfilters, jedoch können breite Linien, z. B. 2,5 mm oder breiter, nützlich sein, wenn es beispielsweise erwünscht ist, Kolonien für Unterkolonien auszusondern.

Das Membranfilter wird vorzugsweise von der normalerweise in der Mikrobiologie verwendeten Art sein, bekannt als absolutes Filter, das ist ein Filter, dessen Poren kleiner als die zu filtrierenden Mikroorganismen sind, so daß alle Mikroorganismen auf seiner Oberfläche zurückgehalten werden.

Die bedruckte Membran der vorliegenden Erfindung kann in der gleichen Weise wie ein übliches Membranfilter zum Auszählen von Mikroorganismen inokuliert und inkubiert werden. Insbesondere wird eine geeignet verdünnte Probe durch das Membranfilter geschickt, welche die Mikroorganismen auf der bedruckten Oberfläche läßt. Ein Nährstoff wird beispielsweise durch Aufbringen eines Nährstoffgels auf die entgegengesetzte Oberfläche des Filters geliefert, oder indem man das Filter auf einen Nährgel oder auf einer mit einer Nährlösung getränkten

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Unterlage plaziert. Nach der Inkubation kann die Zahl von Kolonien durch visuelle Betrachtung wie bei üblichen Membranfiltern gezählt werden. Jedoch erleichtert die regelmäßige Größe, Form, optische Dichte und geordnete Anordnung der Kolonien als Ergebnis des gitterförmigen Musters des Trennmaterials den manuellen Zählprozeß beträchtlich und spart dadurch Zeit und vermindert Fehler. Alternativ kann das bedruckte Membranfilter automatisch durch eine geeignete optisch-elektronische Abtastvorrichtung ausgezählt werden. Die mit üblichen automatischen Zähleinrichtungen erhaltenen Koloniezählungen gitterförmig "bedruckter Filter werden ebenfalls genauer als die unter Verwendung üblicher Membranfilter erhaltenen sein. Darüber hinaus schließen die bedruckten Filter, wenn ein optisch-elektronisches Element beispielsweise zur Bestimmung des Grades der mikrobiellen Kontamination von Nahrungsmitteln verwendet wird, die Gefahr der Aufzeichnung fälschlich niedriger Werte aus, wie sie gegeben ist, wenn die Konzentration von Kolonien sehr groß ist und Zusammenfließen der Kolonien eintritt.

Bei den Ausführungsformen der Fig. 5 und 6 ist ein mit einem geeigneten gitterförmigen Muster des Trennmaterials 22, wie vorher beschrieben, bedrucktes Membranfilter 21 in einem starren oder halbstarren Behälter 25 montiert. Bei einem rechtwinkligen Gittermuster wie in Fig. 5 weist der Behälter vorzugsweise auch eine entsprechende rechtwinklige Form auf. Der Behälter enthält einen Rahmenteil 26 und einen Bodenteil 27 in. Form eines Gitters, das öffnungen 28 abgrenzt, die den den Durchtritt von Fluiden gestatten. Zwischen dem Membranfilter 21 und dem Bodenteil 27 liegt eine Unterlage 29 aus absorbierendem Material, das eine Nährlösung enthält.

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Der Rahmenteil 26 ist so geformt, daß das Stapeln einer größeren Zahl ähnlicher Behälter erleichtert wird. Zum automatischen optisch-elektronischen Auszählen kann das Membranfilter jedes Behälters in eine genaue Lage zum Behälter gebracht und an diesem befestigt werden, so daß das aufgedruckte Muster sich relativ zum Rahmen des Behälters in einer vorbestimmten Lage befindet, die eine Einstellung der Abtastvorrichtung bezüglich des Musters unnötig macht.

Zum automatischen Betrieb kann ein Stapel oder Magazin solcher Behälter in eine geeignete Vorrichtung eingeführt werden, aus welcher die Behälter nacheinander abgegeben und durch eine Folge von Stationen transportiert werden, die Einrichtungen zur Filtration, Nährstoffzugabe, Inkubation und Koloniezählung umfassen. Auf diese Weise kann fast jeder Einsatz menschlicher Arbeit beim Auszählen von Mikroorganismen ausgeschlossen werden.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

Celluloseester-Membranfilter, HAWP 04-700, Porengröße 0,4-5 Ai (Millipore Filter Corp.) oder Metrical GA-6 (Gelman Instrument Company), wurden mit einem rechteckigen Gittermuster aus Paraffinkohlenwasserstoffwachs (Schmelzpunkt 55 °C) in Linien von 0,125 nun. Breite im Abstand von 0,5 mm unter Verwendung einer Zinkplattendruckform bedruckt, die von einem Klischee hergestellt war. Die Platte wurde unter Verwendung einer Walze mit geschmolzenem Wachs in geeigneter Dicke beschichtet. Ein Membranfilter wurde auf die Fläche der Platte gelegt und durch leichten Druck einer zweiten, sterilen Walze in Kontakt mit der Platte gepreßt und das Wachs so übertragen. +) Jeweils zwischen dem Bedrucken aufeinander folgender Filter +) Das Filter wurde unter Verwendung einer sterilen Pinzette entfernt und bis zur Verwendung in einem sterilen Behälter aufbewahrt.

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wurden sowohl die Zinkplatte als auch das geschmolzene Paraffinwachs auf einer elektrischen Heizplatte warmgehalten. Eine Kultur Serratia marcescens wurde über Nacht in einer Nährbrühe gezogen und mit 0,1 %iger Peptonlösung verdünnt, so daß sie 200 ml Suspensionen ergab, die ungefähr 50, 250, 1250, 6300, 313OO und 156000 Kolonie bildende Einheiten pro 100 ml enthielten. 100 ml der Suspension wurden durch ein entsprechend der oben beschriebenen Methode vorbereitetes

filtriert
Membranfilter / und das Filter wurde auf die Oberfläche von sterilem ITähragar in eine Petrischale gelegt. Die verbleibenden 100 ml wurden durch ein übliches Membranfilter filtriert und in der gleichen Weise auf Agar gelegt. Die anderen Suspensionen wurden auf genau die gleiche Weise behandelt. Nach 24-stündiger Inkubation bei 20 C wurden rote Kolonien von Serratia marcescens ausgezählt, außer wenn das Zusammenfließen von Kolonien bei hohen Konzentrationen auf den üblichen Membranfiltern das Auszählen unmöglich machte. Koloniezählungen auf den beiden Arten von Filtern sind in der Fig. 7 gezeigt. Man kann daraus ersehen, daß die Zählung auf üblichen Membranfiltern bei etwa 400 Kolonie bildenden Einheiten ein Maximum erreichte, und danach als Ergebnis des Zusammenfließens rasch nicht mehr durchführbar war. Im Gegensatz dazu ergaben die gitterförmig bedruckten Membranfilter bei 10000 Kolonie bildenden Einheiten immer noch ein zunehmendes Zählergebnis und das Ergebnis fiel bei höheren Werten als diesem nicht ab. Daher gewährleistet die Erfindung die Auszählung von Serratia marcescens oder anderenMikroorganxsmen in einem Bereich, der mindestens 25-mal größer als der mit üblichen Membranfiltern erzielbare ist,und dies kann eine beträchtliche Menge Zeit bei der Analyse ersparen, wo es andernfalls notwendig sein könnte, Verdünnungen der zu analysierenden Proben anzufertigen.

- Patentansprüche b ü 9 8 ü 9 / 0 9 1 2

Claims

Patentansprüche

Λ. Vorrichtung zur Erleichterung des Auszählens von Mikroorganismen, umfassend ein Membranfilterelement, das auf ρ , einer seiner Oberflächen die in einer durchgefilterte fluide/ vorliegenden Mikroorganismen zurückhält, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Filterelement auf dieser Oberfläche ein Trennmaterial in einem Muster aufgedruckt hat, das eine größere Zahl geordneter, Mikrobenkolonien isolierender Zellen abgrenzt, worin die Zellen kleiner an Fläche als die normalen Kolonieflächen sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Muster ein rechtwinkliges Gitter ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die

p Fläche jeder Zelle kleiner als 25 mm ist.
4-, Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Breite des Trennmaterials zur Teilung der Zellen größer als 0,025 nim ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Muster die gesamte Dicke des Membranfilters durchdringt.
6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennmaterial Kohlenwasserstoffwachs, Petrolatum oder Silikonwachs ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fluide Probe eine Flüssigkeit ist.

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COPY
8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Membranfilter in einem Behälter montiert ist, der
einen ihn umgreifenden Rahmenteil und einen mit Öffnungen versehenen Bodenteil umfaßt.
9· Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie vreiterhin eine zwischen dem Membranfilter und dem
Bodenteil angebrachte, Nährstoff speichernde Einrichtung enthält.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Eahmenteil so geformt ist, daß er mit anderen entsprechende! Behältern ineinandergreift.

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