DE2532276B2 - Verfahren zur Reinigung von Human-Antilymphozytenserum - Google Patents
Verfahren zur Reinigung von Human-AntilymphozytenserumInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Human-Antilymphozytenserum, welches durch
Verabreichen von Humanlymphozytenserum-Antigene an ein Tier und Gewinnen des Human-Antiiymphozytenserums
aus dem Tier erhalten wurde.
Human-Antilymphozytenseren sind heterologe Seren,
d. h. sie werden dadurch erhalten, daß einem Tier, im allgemeinen einem Pferd oder pferdeartigen Tier, ein
Humanlymphozyten-Antigenpräparat verabreicht wird, aus welchem sodann das Serum gewonnen wird.
Es ist auch bekannt, daß derart hergestellte Seren eine Reihe Antihumanaktivitäten und toxische bzw.
Nebenwirkungen zeigende Bestandteile enthalten, die für den behandelten menschlichen Organismus nachteilig
sind und im wesentlichen auf der heterologen Natur des Serums beruhen.
Weit das Human-Antilymphozytenserum im allgemeinen zur Verabreichung in sehr erheblichen Dosen
bestimmt ist, verhindern sehr oft die verschiedenen unerwünschten Wirkungen des Serums eine wirksame
Ausnützung seiner immunodepressiven und antilymphozytärei.
Eigenschaften.
Es ist bereits bekannt (Symposium Series immunobiologischer
Standard InL Symp. on Antilymphocyte Serum, Versailles, 1970, Bd. 16, Seiten 145-152), die
gegen die roten Blutkörperchen gerichteten Aktivitäten des Anülymphozytenserums dadurch zu beseitigen, daß
man das Serum mit frischen menschlichen roten Blutkörperchen zusammenbringt aber diese Technik ist
sehr aufwendig und führt nur zu sehr unvollständigen Ergebnissen.
Es wurde gefunden, daß bei der Passagierung von Human-Antilymphozytenserum über menschliches Plazentagewebe
diese Mangel beseitigt wurden und daß ein konzentriertes, hochgereinigtes, von Sekundär- oder
unerwünschten Aktivitäten praktisch freies Antilymphozytenserum für eine Behandlung mit Intensivdosen
gewonnen werden kann, bei welchem insbesondere die Hamolysinwerte gegenüber Standard-Antilymphozytenserum
stark herabgesetzt sind und praktisch keine Antigenaktivität und Anti-Erythrocytenaktivität mehr
gefunden wird. Daß ein derartiges Reinigungsverfahren ein verbessertes Antilymphozytenserum hervorbringt,
ist gegenüber dem Stand der Technik überraschend, weil ein praktisch blutfreies Plazentagewebe verwendet
wird, das außerdem sehr komplex aufgebaut ist, wobei ein besonders günstiger Reinigungseffekt nicht zu
erwarten war.
ίο Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung von
Human-Antilymphozytenserum, welches durch Verabreichen von Humanlymphozyten-Antigene an ein Tier
und Gewinnen des Human-Antilymphozytenserums aus dem Tier erhalten wurde, ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Serum ein- oder mehrmals über ein inaktiviertes menschliches Plazentagewebepräparat bei einem
pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 passagiert und anschließend
das gegebenenfalls aufkonzentrierte Serum isoliert wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung entfernt man das Albumin und die /»-Globuline des
Serums vor der Passage am Plazentagewebe nach üblichen Methoden, z. B. durch Fraktionierung mit
2-Äthoxy-6,9-diamino-acridin-lactaL Hierbei wird eine
Lösung mit 12 bis 15 g der Verbindung je Liter Serum
gegeben, wobei der pH auf einen Wert zwischen 7 und 8, bevorzugt etwa 7,7, unter leichtem Rühren eingestellt
wird, worauf dekantiert wird. Die überstehende Flüssigkeit wird sodann gesammelt und das überschüssige
Inaktivierungsmittel beseitigt
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Plazentagewebe vor der
Absorption verrieben oder vermählen, dann mehrmals gewaschen, worauf eine Behandlung des Gewebes mit
Hilfe z. B. von Glutaraldehydlösungen und/oder Formol
oder Bouinscher Flüssigkeit erfolgt, worauf das Gewebe auf eine Temperatur in der Größenordnung von 60° C
für eine zum Inaktivieren eventueller, im Gewebe vorhandener Virus- und Bakterienkontaminate ausreichende
Zeit, z.B. in der Größenordnung von 10
Stunden, erwärmt wird.
Erfindungsgemäß beträgt die Zahl der Absorptionspassagen des Serums am Gewebe 1 bis 5, bevorzugt 3
oder 4. Jede Passage erfolgt durch Inberührungbringen des Serums mit dem Plazentagewebe über eine
Zeitspanne zwischen 30 Minuten und 2 Stunden, vorzugsweise in der Größenordnung von 1 Stunde, bei
einer Temperatur zwischen 4 und 40° C, bevorzugt in der Größenordnung von 37° C, vorzugsweise unter
so mäßigem Rühren. Die jeweiligen Mengen an Serum und
Gewebe, die zusammengebracht werden, bestimmen sich in Abhängigkeit von der Konzentration des zu
absorbierenden Serums, wobei diese Mengen bevorzugt bei etwa 2 bis 10 Volumina Serum pro Volumen
gepreßten Gewebes liegen.
Am Ende der Passage wird das Serum vom Plazentagewebe durch Pressen des Gewebes abgetrennt,
wobei das passagierte Serum gewonnen wird.
Erfindungsgemäß liegt der pH bei den Passagen zwischen 63 und 74. vorzugsweise bei etwa 7 ± 0,2.
Erfindungsgemäß liegt der pH bei den Passagen zwischen 63 und 74. vorzugsweise bei etwa 7 ± 0,2.
Vorzugsweise wird nach der Passage am Plazentagewebe eine Konzentrierung durchgeführt, die bevorzugt
durch Fällung mit Äthanol erfolgen kann.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird nach der Passage am Plazentagewebe und bevorzugt nach der Konzentrierung eine Reinigung mit Hilfe eines Absorptionsmittels, wie z. B. Aluminiumoxidgel, durchgeführt.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird nach der Passage am Plazentagewebe und bevorzugt nach der Konzentrierung eine Reinigung mit Hilfe eines Absorptionsmittels, wie z. B. Aluminiumoxidgel, durchgeführt.
Die Konzentrierung mit Äthanol erfolgt bei einer Temperatur unter -5°C und einem pH zwischen 6,5
und 7A vorzugsweise bei etwa 7 ±0,2, über eine
Zeitspanne von 8 bis 16 Stunden, worauf die erhaltene Fällung, bevorzugt durch Zentrifugieren, abgetrennt,
dann wieder in Lösung gebracht und diese Lösung darauf in Wasser dialysiert wird.
Bei einer Abwandlung der Erfindung kann man in gleicher Weise eine zusätzliche Reinigungsstufe nach
Chromatographietechniken durchführen, beispielsweise Durchläufe durch Ionenaustauscherharze, die die
Trennung der y-GlobuIine IgG2 von den y-GlobuIinen
IgGi ermöglichen.
Die abschließende Reinigungsbehandlung kann z. B. durch Zusatz des Aluminiumoxidgels zum konzentrier- ι
ten Serum erfolgen, wobei der pH-Wert auf 6,5 bis 7,5,
bevorzugt auf etwa 6,8 ±0,2, eingestellt und mäßig erwärmt wird, worauf zentrifugiert und die überstehende
Flüssigkeit einer oder mehreren Sterilfiltrationen unterworfen wird
Diese Behandlung mit Aluminiumoxidgel ermöglicht
die Entfernung eines Teils der Spuren der unerwünschten Proteinverunreinigungen (Hämoglobin, ^-Globuline),
aber ebenso auch der pyrogenen Verunreinigungen.
Das erfindungsgemäß hergestellte Human-Antilyrriphozytenserum
ist aufgrund seiner immuno-depressiven und antilymphozytären Eigenschaften bemerkenswert
und findet beim Menschen Anwendung bei krankhaften Zuständen und bei Behandlungen, die eine Immuno-Depression
erfordern, insbesondere bei Organverpflanzuri- jo
gen.
Das erfindungsgemäß hergestellte Serum zeichnet sich insbesondere durch die !tilgenden, in vitro
bestimmten Eigenschaften aus:
J5
erhöhte Spezifität in bezug auf andere AntilympVio- 4η
zytenseren, die sich insbesondere bei Inhibieren einer Mischkultur kundtut,
geringer Proteingehalt
Das Serum ist auch durch die folgenden in vivo 4-, bestimmten Eigenschaften bemerkenswert (vgl. Brendel
in Münchner med. Wochenschrift, Bd. 115 [1973], Nr. 7,
Seite 241-248):
Verlängerung des Überlebens von Fremdhautvcrpflanzungen,
z. B. beim Affen bei einer viel kleineren Dosis und für eine wesentlich verlängerte Zeitspanne.
Deutlich gesteigerte Verträglichkeit in bezug auf vorhandene Antilymphozytenseren aufgrund einer
deutlich verminderten Toxizität, was es ermöglicht, die verabreichte Dosis mehrfach zu erhöhen. v.
Ve/gleichbare Aktivität, aber geringere Nebenwirkung
aufgrund der Eliminierung der Antigenkonkurrenz dank der Eliminierung der Antispezies- Antikörper.
Das erfindungsgemäß hergestellte Serum wird bevorzugt, wenn nötig, auf eine Aktivität in der *>ο
Größenordnung von 850 Lymphozytotoxie-Einheitett pro ml eingestellt, wobei diese Titereinstellung z. B.
nach der Engelfriet-Technik erfolgt (vgl. »Histocompsitibility
testing«, Munksgaard Edition, Kopenhagen, 1975, Seite 245).
Die für die intravenöse oder intramuskuläre Behandlung
verabreichten Dosen können zwisciien 200 und 1000 mg pro Tag liegen.
Beispiel
A. Herstellung des Rohsefums
A. Herstellung des Rohsefums
Das Serum wird erhalten, indem einem Pferd eine Lymphozyten-Antigenpräparation (wobei die ganzen
Lymphozyten aus der Abnahme aus dem Ductus thoracicus oder aus der Thymus-Exstirpation oder den
entsprechenden Zellunterfraktionen stammen) nach einem wöchentlich sich wiederholenden Schema verabreicht
und das; Plasma des Pferdes über eine Zeitspanne von 45 Tagerii bis zu 6 Monaten nach dem Beginn der
Immunisation durch Plasmapherese gewonnen wird.
Dieses Plasma kann vorteilhafterweise bei -20° C gelagert werden, wobei die sonstigen Operationen
al gewartet werden.
Das Plazentagewebe besteht aus menschlichem Plazentagewebe, das bereits eine Reihe von Behandlungen
der Extraktion der plazentaren y-GIobuline nach
bekannten Methoden, wie z. B. der Cohnschen, erfahren
hat
Das Plazentagewebe wird zuallererst verrieben oder vermählen, dann bei verhältnismäßig tiefer Temperatur
mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Gewebe wird sodann durch Pressen zum Entfernen der Waschlösung
getrocknet Vorzugsweise werden die Wasch- und Preßvorgänge mehrmals nacheinander, z.B. zweimal,
wiederholt
Nach dem letzten Waschen wird das getrocknete Gewebe in physiologischer Salzlösung in etwa gleicher
Menge wieder aufgenommen, z. B. in der Größenordnung von 1 Liter Salzwasser (9°/co NaCl) auf 1 kg
Gewebe.
Das in Salzwasser wiederaufgenommene Gewebe wird sodann mit einer Glutaraldehyd-Fixierlösung
gemischt, gerührt, dann gepreßt Diese Glutaraldehydlösung
kann z. B. durch Mischen von 40 ml 50%iger
Glutaraidchydlösung ir. Wasser mit 2i>
üter Wasser mit 90/00 Kochsalz gewonnen werden, wobei das Gemisch durch Mischen von 20 Liter dieser Fixierlösung mit
10 kg Gewebe, enthalten in 10 Liter Salzwasser, hergestellt werden kann. Nach dem Auspressen des
Gewebes zur Beseitigung der überstehenden Glutaraldehydlösung wird das feuchte Gewebe erneut in
salzhaltigem Wasser zu beispielsweise 1 kg pro Liter Salzwasser aufgenommen.
Das so aufgenommene Gewebe wird sodann mit einer Formol-Fixieriösung gemischt die z. B. durch
Mischen von 100 ml 30%iger Formollösung mit 20 Liter Wasser mit 9%o NaCl erhalten wurde. Bevorzugt mischt
man 20 Liter dieser formolhaltigen Lösung mit 10 kg des in 10 Liter Salzlösung aufgenommenen Gewebes. Das
Gemisch wird eine Stunde lang bewegt oder gerührt, dann eine Nacht lang in der Kältekammer bei +4°C
belassen.
Danach wird das Gewebe abgepreßt, sodann in der dreifachen Gewichtsmenge Salzlösung wieder aufgenommen
und etwa 10 Stunden auf eine Temperatur in der Größenordnung von 6O0C unter leichter Bewegung
erwärmt, um die möglicherweise gefährlich werdenden Antigene zu inaktivieren.
Nach dem Erwärmen wird das Gewebe abgepreßt, sodann mehrmals gewaschen, worauf das behandelte
und ausgepreßte Gewebe schließlich in der gleichen Gewichtsmeng* salzhaltigen Wassers, bevorzugt von
9%o, wieder aufgenommen wird. Dann ist das Gewebe zur Absorption des Serums ausreichend vorbereitet
Das von roten Blutkörperchen befreite, aus dem Tier stammende Plasma wird mit der Lösung eines
Inaktivierungsmittels gemischt, z. B. einer Lösung vom
dreifachen Volumen des Plasmavolumens mit einem Gehalt von 4,5 g 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridin-lactat
pro Liter. Der pH w'rd auf 7,7 eingestellt Diese Mischung wird mehrere Stunden bei Raumtemperatur
unter leichter Bewegung gehalten, und während dieser Zeit wird der pH kontrolliert und gegebenenfalls neu
eingestellt Dann IaBt man die Mischung eine Nacht bei verhältnismäßig niederer Temperatur in der Größenordnung
von +4"C abklären.
Nach diesem Abklären hebt man die überstehende klare Flüssigkeit durch Ansaugen ab und zentrifugiert
den Rest der überstehenden Flüssigkeit und die Fällung. Die zentrifugierte Fällung wird eliminiert, und die durch
Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit der abgesaugten überstehenden Flüssigkeit vereinigt
Das überschüssige Inaktivierungsmittd wird sodann durch Zugabe einer ausreichenden Menge Natriumchlorid
eliminiert woraufhin man erneut die Mischung 48 Stunden bei +40C abklären läßt
Wiederum nimmt man die klare überstehende Flüssigkeit durch Absaugen ab und Filtriert den Rest der
überstehenden Flüssigkeit um die Fällung zu entfernen, worauf das Filtrat mit der abgesaugten überstehenden
Flüssigkeit vermischt und der pH, wenn nötig, auf 7 eingestellt wird.
Die Absorption erfolgt durch Mische» von 1 Liter der
gemäß C erhaltenen Plasmapräparation mit etwa 'h kg
der gemäß B erhaltenen Plazentagewebepräparation. Der pH wird auf 7 ±0,2 eingestellt und das Gewebe mit
dem Plasma für eine Zeitspanne in der Größenordnung von ! Stunde bei 37° C in Berührung gelassen, bevorzugt
unter mäßigem Rühren.
Darauf wird die Mischung ausgepreßt und die Preßflüssigkeit aufgefangen.
Nach dieser ersten Absorption prüft man vorzugsweise, ob die Absorption ausreichend war oder nicht und
zwar mit Hilfe der Hämagglutinin-, Hämolysin- und a;
COOMBS-Tests.
Wenn diese Tests positiv bleiben, nimmt man anschließend wenigstens eine neue Passage der
abgepreßten Flüssigkeit an einer frischen Gewebepräparation gemäß B vor. Die Zahl dieser Absorptionspassagen
hängt von den erhaltenen Kontrollergebnissen
nach jeder Absorption ab. Die Absorptionen werden fortgesetzt, bis die direkten und indirekten hämolysierenden
und hämagglutinierenden Aktivitäten der
Preßflüssigkeiten verschwinden.
Sind diese Aktivitäten verschwunden, wird die schließlich erhaltene Preßflüssigkeit vorzugsweise filtriert.
60
Die gemäß D erhaltene Flüssigkeit wird auf eine Temperatur um etwa 0°C herum abgekühlt und stets bei
tiefer Temperatur langsam mit auf zwischen —4 und -100C abgekühltem Äthanol (4,25 Liter 95%iges
Äthanol auf 10 Liter Flüssigkeit) versetzt. Die Temperatur der Gemisches wird während der Zugabe
des Alkohols bevorzugt stets unter 250C gehalten.
z.B. in der Größenordnung von 7±0,2, bei dem die
Fällung mit Äthanol möglich ist
Nach einem Dekantieren in der Kältekammer wird in der Kälte zentrifugiert z. B. bei -80C, um die Fällung
von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Die abgetrennte Fällung wird dann rasch in entionisiertes
Eiswasser, und zwar zu etwa 1 kg Fällung pro Lker Eiswasser, wieder aufgenommen. Das Lösen wird durch
leichtes Rühren und Zugabe eines Puffers, z. B. eines
Acetatpuffers, erleichtert, wobei der pH auf einen Wert zwischen vorzugsweise 5 und 6 gebracht wird.
Die angefallene Lösung wird dann in Dialysebeutel gebracht, die für etwa 48 Stunden in gewöhnliches
Wasser von tiefer Temperatur, z.B. +20C, gehängt
werden, wobei das Dialysewasser ständig erneuert wird. Das Dialysat wird bei Bedarf auf etwa 80 g Proteingehalt
pro Liter Lösung eingestellt
In die gemäß E erhaltene Lösung bringt man unter Rühren eine Menge konzertierten, pastenartigen
Aluminiumoxidgels ein, deren Gewicht etwa das Doppelte des Gewichts der in der Lösung erhaltenen
Proteine beträgt Der pH wird, wenn nötig, auf einen Wert in der Größenordnung von 6,8 ± 0,2 eingestellt
dar,n wird das Gemisch auf einem Wasserbad für einige
Stunden erwärmt
Die so erhaltene Präparation wird sodann bei niederer Temperatur, z. B. +4"C, zentrifugiert und die
überstehende Flüssigkeit gewonnen, deren pH, wenn nötig, erneut eingestellt wird.
Dann gibt man langsam in die fiberstehende Flüssigkeit etwa 1 g pro Liter kristallisiertes Natriumchlorid
und 20 g pro Liter Glykokoll in Pulverform. Wenn nötig, wird der pH auf etwa 6,8 ±0,2 erneut
eingestellt.
Darauf wird eine Mehrfachfiltration dieser Mischung durchgeführt wobei zumindest die letzte Filtration
unter rigorosen Sterilitätsbedingungen durchgeführt wird.
So e.'hält man eine erfindungsgemäße lose Antilymphozytenserumlösung.
Die in diesem Stadium durchgeführte Kontrollprüfung ergibt normalerweise die folgenden Ergebnisse:
Proteingehalt unter oder gleich 'M g/l
zufriedenstellende Sterilität
zufriedenstellender Pyrogengehalt
Lymphozytotoxizität:
zufriedenstellende Sterilität
zufriedenstellender Pyrogengehalt
Lymphozytotoxizität:
über oder gleich 1Ai 2 (Verdünnungswert)
Hämolysin:
Hämolysin:
unter octer gleich Ve des Werts von
Standard-Antilymphozytenserum
COOMBS-Test unter oder gleich '/β
COOMBS-Test unter oder gleich '/β
(Verdünnungswert)
Abwandlungen des Verfahrens könne? z. B. dadurch
erfolgen, daß Inaktivierungsmittel in der Stufe C die Fraktionierung durch andere Methoden zum Eliminieren
der Albumine und ^-Globuline ersetzt werden, wie z. B. durch eine selektive Alkoholfällung oder eine
Absorption an kolloidalem Siliziumdioxid.
Die Stufe B der Zubereitung des Plazcntagewebes
kann modifiziert werden, und es ist insbesondere möglich, das Formol und den Glutaraldehyd durch
andere Fixierlösungen zu ersetzen, wie z. B. die Bouinsche Flüssigkeit (250cm3/l 10%iges Formol,
2,5cmVI n-Trichloressigsäure, lOcmVl n-Essigsäure,
10 g/l Krist. Picrinsäure).
Die Stufe E der Konzentrierung kann durchgeführt werden, indem die Alkoholfällung durch andere
Methoden der Konzentrierung, z. B. durch chromatographische Methoden, ersetzt wird. Um hierfür nur ein
Beispiel zu geben, kann eine solche chromatographische Methode wie folgt durchgeführt werden:
Ein Ionenaustauschern?, z. B. »vorgequollene«
Diäthylaminoäthylcellulose (vgl. Firmenschrift VV. R. Baiston Ltd, Maidstone, England, »Whatman advanced
ion exchange celluloses IV2«. 1972). wird bei tiefer
Temperatur mit Hilfe eines 0,002-m Phosphatpuffers auf einen pH-Wert 6,8 eingestellt. Der Harzsuspension setzt
man eine 0,002-m Hydrogen-phosphatpiifferlösung zu,
bis man einen pH-Wert 6,8 erhält. Das Han; wird sodann durch Zentrifugieren gewonnen, und ihm setzt
man erneut einen 0,002molaren Phosphatpuffer vom pH 6,8 zu; nun wird erneut zentrifugiert und das Ganze
nochmals wiederholt.
Schließlich fügt man dem zentrifugierten und ins Gleichgewicht gebrachten Harz 0,002molaren Phosphatpuffer
vom pH 6,8 zu.
Die aus der Stufe D kommende Serurnpräparaiion
wird auf einem anderen Wege gegen den 0,002molaren Phosphatpuffer vom pH 6,8 dialysiert, dann wird das
dialysierte Serum für eine Zeitspanne von etwa 30 Minuten bei +4°C mit dem ins Gleichgewicht
gebrachten Harz in Berührung gebracht; darauf wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit, die
y-Globuline lgG2 enthält, gesammelt.
Dem Bodensatz des Harzes setzt man erneut unter Rühren Puffer zu, zentrifugiert, gewinnt die überstehende
Flüssigkeit, die man mit der vorherigen überstehenden Flüssigkeit vereint, wodurch man die γ2- Fraktion
erhält.
Der Bodensatz des Harzes wird sodann aufgenommen und mit neuem 0,002molarem Phosphatpuffer vom
pH 6,8 bei +4°C unter Rühren versetzt, worauf zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gewonnen
wird. Der Bodensatz des Harzes wird erneut mit dem gleichen Puffer wieder aufgenommen, und eine
erneute Zentrifugation läßt eine zweite überstehende Flüssigkeit anfallen, wobei diese Mischung die Fraktion
IgG, enthält.
Die Fraktionen IgG2 und IgGi v/erden sodann steril
filtriert.
Versuchsbericht
Es wurden Pferde mit lO'-menschlichen Thymozyten
bzw. Lymphozyten in Freundscher Lösung intradermal immunisiert, wobei 3 Wochen nach der ersten Injektion
3 intravenöse Injektionen von 109 Zellen wöchentlich weiter verabreich* wurden. Von der 4. Woche bis zum 6.
Monat der Immunisation wurde das gewonnene Plasma aufgearbeitet und gereinigt, und zwar einmal nach dem
Stand der Technik über Human-Erythrozyten und andererseits erfindungsgemäß durch Entfernen der
Titrinogene durch Fällen mit Rivanol-Äthanol, Dialyse in Essigsäurepuffer beim pH-Wert 5 gegen destilliertes
Wasser, Absorption an zerkleinertem, gewaschenen, 10 Stunden bei 60° C mit 03% Formaldehyd- und 0,2%
Glutaraldehydlösung fixierten und mit 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschenen Humanplazentagewebe mit
anschließender Entfernung von «- und ß-Globulinen
durch Fällung mit 28,5%igem Äthanol und Dialyse in Essigsäurepuffer (pH 5,5) und Chromatographie an
QAE Sephadex A 50 (Phosphatpuffer 0,015molar, pH 6,8) und erneuter Äthanolfällung und Dialyse.
Es wurden in vitro folgende Versuchsergebnisse erhalten
| f: iu/p i (I Ii nn7pn trat ion | Vergieichs- | F.rfindungs- | |
| Lympho-Toxi/itiit | serum | gemäßes | |
| I "> | (F.ngelfriet-Methnde.i | Anlilympho- | |
| ^. ~-,·^0 _t\""!uüp.aijor; | /ytenscrum | ||
| in it Aniiglobulinen | SO mu/rm' | 30 mg/rm' | |
| (Του raine-Methode) | »•1:1024 | >l: 1024 | |
| r> 50% Rosetteninhibierung | |||
| E (Pang-Test) | |||
| IiA (F-oland-Test) | |||
| LAC (Shcvach-Tesi) | |||
| =» I : 2048 | J* I : 2048 | ||
| »1: 512 | I : 256 | ||
| 1: 32 | >I : 2 |
In vivo wurden nach Injektion beim Rhesusaffen folgende Ergebnisse erhalten
Antikörper
Vergleichs-
Erfind'ingsgemäßes
Ar.tilymphozvtenserum
Ar.tilymphozvtenserum
Human-An ti proteine
Anti-Erythrozyten
Anti-Erythrozyten
a) Direktagglutination
b) Agglutination mit
Antiglobulin
Antiglobulin
Antiblutpiättchen
(Agglutination)
(Agglutination)
Antifibroblasten
(Wi-38-Lyse)
(Wi-38-Lyse)
«1:4 <1:4
«1:512 «1:64
I :64
! (A
! (A
Es wurde auch bei klinischen Versucher, gefunden,
daß das erfindungsgemäße Antilymphozytenserum niedrigere Antikörpertiter bei Blutplättchen, Fibroblasten
und Erythrozyten (COOMSS-Test) des Menschen zeigt und somit geringere Nebenwirkungen z. B. bei
Transplantationen. Die Hypersensibilisierung war drastisch
herabgesetzt und die Verträglichkeit verbessert
Claims (3)
1. Verfahren zur Reinigung von Human-Antilymphozytenserum,
welches durch Verabreichen von Humanlymphozyten-Antigene an ein Tier und
Gewinnen des Human-Antilymphozytenserums aus dem Tier erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet,
daß das Serum ein- oder mehrmals über ein inaktiviertes menschliches Plazentagewebepräparat
bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 passagiert und anschließend das gegebenenfalls
aufkonzentrierte Serum isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Plazentagewebepräparat verwendet, das vor dem Inaktivieren mit Glutaraldehyd-
oder Formollösung oder Bouinscher Flüssigkeit behandelt worden ist
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Human-Antiiymphozytenserum
abschließend an Aiuminiumoxidgel bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 unter
mäßigem Erwärmen gereinigt wird.
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