CN115232783B - 抗人t细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘 - Google Patents

抗人t细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘 Download PDF

Info

Publication number
CN115232783B
CN115232783B CN202210924288.6A CN202210924288A CN115232783B CN 115232783 B CN115232783 B CN 115232783B CN 202210924288 A CN202210924288 A CN 202210924288A CN 115232783 B CN115232783 B CN 115232783B
Authority
CN
China
Prior art keywords
human
hydroformylation
placenta
solution
plasma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210924288.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115232783A (zh
Inventor
杨帆
张智
邹浩勇
郭晓东
王智
吴笛
闫新业
黄梦
黄云霞
罗志
王杰
童凌峰
余健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Zhongsheng Yujin Biological Medicine Co ltd
Original Assignee
Wuhan Zhongsheng Yujin Biological Medicine Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Zhongsheng Yujin Biological Medicine Co ltd filed Critical Wuhan Zhongsheng Yujin Biological Medicine Co ltd
Priority to CN202210924288.6A priority Critical patent/CN115232783B/zh
Publication of CN115232783A publication Critical patent/CN115232783A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115232783B publication Critical patent/CN115232783B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，同时提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白杂抗体吸收工艺用醛化胎盘的制备方法。本发明制备方法改进了常规抗人T细胞猪免疫球蛋白的提纯步骤，尤其改进了杂抗体吸收工艺顺序、免疫球蛋白沉淀剂用量、成品保存条件等的工艺步骤，并创新的增加了对杂抗体吸收后制品的精制处理工艺，整体上能够获得制品得率明显提升，杂质显著降低，同时可以大幅提升制品稳定性。

Description

抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法及其杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法。
背景技术
抗人T细胞猪免疫球蛋白(P-ATG)是一种疗效确切的免疫抑制剂，为历版国家《生物制品规程》、《中华人民共和国药典》收载的品种，主要用于临床器官移植的免疫排斥预防及治疗、骨髓移植的移植物抗宿主反应预防以及再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、原发性血小板减少性紫癜及其它免疫性疾病等的治疗。
专利文献CN101311191A公开了一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法，该方法存在如下问题：
1、乙醇用量较大，且使用温度一般为不低于-25℃，生产过程中能耗较高，且废液中含有大量乙醇，存在一定的安全隐患和潜在的污染风险。
2、杂抗体吸收工艺后缺少进一步纯化步骤，无法去除因加入醛化人红细、醛化胎盘、健康人血浆引入的纤维蛋白、脂蛋白等杂质成分，致使成品长期存放过程中，可能会出现蛋白轻微析出等现象，影响制品品质。
3、存在多次收集沉淀的步骤，收集后需对沉淀进行溶解即相应处理，方能进行后续操作，无法实现连续生产。
4、配制过程中，采用麦芽糖作为稳定剂，而成品中则采用甘氨酸作为稳定剂，需通过透析方式去除麦芽糖，增加了操作步骤，且残留的麦芽糖可能对糖尿病患者产生一定的影响。
5、成品pH值为中性，较接近免疫球蛋白的等电点(pI)，此条件下P-ATG的溶解度较低，长期存放可能会出现蛋白凝集或析出现象，进而影响制品品质。
6、原工艺制品内包材采用低硼硅西林瓶。药用玻璃包装的首要质量标准是其耐水侵蚀的化学性能(耐水解性)。当与水或酸接触时，溶液中的一些氢离子会与玻璃中的钠离子进行交换。低硼硅玻璃具有较高的钠含量，从而导致较高的钠提取率和较低的耐水解性，对制品长时间保存存在潜在的风险。
7、工艺得率相对较低，100ml免疫猪血浆约可收获P-ATG仅为375mg。
发明内容
基于此，有必要提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法及其杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法，可以显著提升制品的P-ATG得率，并可提升制品稳定性。
本发明采用如下技术方案：
一种杂抗体吸收用醛化胎盘，其为采用甲醛含量0.8％～3％的醛化液醛化反应3～7h所制备的醛化人胎盘渣。所述杂抗体吸收用醛化胎盘的制备方法，包括如下步骤：
S1，获取内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻；
S2，将解冻后的人胎盘渣置于胎盘醛化液中进行醛化反应3～7h，所述胎盘醛化液为含0.8％～3％甲醛的磷酸盐缓冲液；
S3，将醛化反应完毕的胎盘转移至生理氯化钠溶液中洗涤，再转入中和液中进行中和反应1～3h，所述中和液为含0.5％～2％甘氨酸的氯化钠溶液；中和反应完毕后，将胎盘转移至生理氯化钠溶液中再次洗涤，控干，即得醛化人胎盘。
优选地，所述甲醛醛化液为含1％甲醛的磷酸盐缓冲液。
本发明还提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1，制备免疫猪血浆：经人胸腺细胞或健康人血液分离的人淋巴细胞免疫健康猪，经检验合格后采集、分离出免疫猪血浆。
S2，血浆合并及融浆：将解冻的免疫猪血浆按投浆所需进行混合，并置于不高于37℃条件下融浆，得混合猪血浆。
S3，健康人血浆吸收杂抗体：向混合猪血浆中加入健康人血浆，得料液A；
S4，低温乙醇初分离：向料液A中加入-15℃以下的50％乙醇至其终浓度为8wt％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在0～5℃，搅拌不短于1h，静置后分离，沉淀为组分I废弃，收集上清液B；向上清液B中加入-15℃以下的50％乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在-5～-10℃，搅拌不短于1h，静置后分离，上液废弃清，收集沉淀为组分Ⅱ+Ⅱ；用0～4℃注射用水溶解组分Ⅱ+Ⅱ沉淀，加入固体氯化钠至终浓度为生理氯化钠溶液浓度，加入-15℃以下的50％乙醇至其终浓度为17wt％，调整pH至5.0±0.5，保持反应温度在0～-5℃，搅拌不短于1h，静置后分离，沉淀为组分Ⅱ废弃，收集上清液C；用生理氯化钠溶液对上清液C超滤脱醇并进行浓缩，得浓缩液D。
S5，醛化人红细胞和醛化人胎盘杂抗体吸收：向浓缩液D中加入醛化人红细胞，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在0℃～8℃，搅拌不短于6h，分离红细胞，收集上清液E。向上清液E中加入醛化人胎盘，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在0℃～8℃，搅拌不短于6h，分离胎盘渣，收上清液F；将上清液F超滤浓缩，得浓缩液G。
S6，低温乙醇精制：用注射用水稀释浓缩液G，加入固体氯化钠至终浓度为生理氯化钠溶液浓度，加入-15℃以下的95％乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在-5～-10℃，搅拌不短于1h，静置后分离，上液废弃清，收集沉淀为组分Ⅱ，即得包含抗人T细胞猪免疫球蛋白的沉淀。
S7，中间品配制：将沉淀组分Ⅱ溶解，调整pH至4.0±0.2，用生理氯化钠溶液进行超滤浓缩，并加入甘氨酸，得蛋白浓度为3.5％～5％、甘氨酸含量为10～30g/L的中间品。
S8，病毒灭活和去除：将中间品溶液过滤除菌，置于24±2℃孵育24天，采用20nm除病毒滤膜过滤除病毒，复测调整pH4.0±0.2，过滤除菌，得半成品。
S9，检定及分装：取样做半成品检定，将半成品分装至中硼硅西林瓶，分装装量为5ml/瓶，即得P-ATG成品。
在其中一些实施例中，健康人血浆的添加量为投浆量的1％～5％，醛化人红细胞的添加量为投浆量15％～30％，醛化人胎盘的添加量为投浆量15％～30％。
在其中一些实施例中，抗人T细胞猪免疫球蛋白制剂成品具有如下特征：蛋白质含量为35～55g/L，pH值为4.0±0.2，P-ATG的纯度不低于蛋白质总量的95％，IgG单体与二聚体含量之和不低于95.0％，多聚体含量应不高于5.0％，E玫瑰花环形成抑制试验效价不低于1:4000，淋巴细胞毒试验效价不低于1:1000，抗A、抗B血凝素不高于1:64，人血小板抗体不高于1:4，人血浆蛋白抗体与人血浆无沉淀线，乙醇残留不不高于0.025％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、醛化胎盘的制备方法的优势：
(1)醛化处理后可保持胎盘细胞骨架的完整性，增加细胞膜的刚性，使细胞不易破裂，增加了细胞对因搅拌产生的剪切力的抗性，不易使胞内基质等物质释放至料液中，大幅度降低此类杂质对制品的影响。
(2)醛化处理可使细胞表面抗原的结构固化，不易发生变性及降解，能够保持与特定蛋白类物质的结合能力。
(3)醛化处理可对潜在病原体(细菌或病毒)进行灭活，可有效降低感染性传染源的潜在风险。
(4)醛化后的胎盘细胞可长期保存，可以消除不同个体间细胞的差异，重复性好，并可批量制备，便于大规模应用。
2、抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法的优势：
(1)初分离阶段乙醇用量缩减为原工艺的85％，且乙醇预冷温度由-25℃变为-15℃，大大降低了生产能耗。
(2)杂抗体吸收工艺优化：将健康人血浆杂抗吸收工艺前置于融浆过程中，并将人红细胞杂抗吸收和人胎盘吸收前置于免疫球蛋白初分离后，增加了杂抗吸收用生物原料与料液接触时长，有利于充分发挥各杂抗吸收原料的吸收功效。
(3)杂抗体吸收后增加乙醇精制步骤，可进一步去除醛化人红细、醛化胎盘、健康人血浆引入的杂质等成分，有利于保持制品良好的外观。同时，乙醇具有一定的将病毒与蛋白质分离的作用，可进一步降低因人源成分可能引入的感染性传染源的潜在风险，有利于提升制品的安全性。
(4)分离过程中，多采用收集上清的方式，尽量避免的溶解等二次操作，可进一步实现连续生产，有利于自动化控制的实施。
(5)配制过程中，采用甘氨酸作为稳定剂，避免了添加麦芽糖而引入新的化学物质及其残留对P-ATG制品可能造成的影响，也进一步减少了操作步骤，协同提升了制品的得率。
(6)在生产过程中pH不回调，成品pH值保持为4.0±0.2，可进一步增加最终制品的稳定性，减少生产中制品二次暴露风险，并有效避免因此而带入外来污染的可能，协同提升制品得率。
(7)成品内包材材质由低硼硅玻璃升级为中硼硅玻璃，低硼硅西林瓶的内表面耐水性国家标准是2.6mm，中硼硅西林瓶内表面耐水性国家标准是1.3mm；采用中硼硅玻璃材质，可降低西林瓶对制品pH、澄明度、稳定性等各种指标影响；同时，中硼西林瓶尺寸公差小，强度好，不易破损，且与生产设备匹配性更好。
(8)本工艺得率相对较高，100ml免疫猪血浆约可收获P-ATG 500mg，为原工艺的1.33倍。
附图说明
图1为醛化人胎盘的制备工艺流程图。
图2为低渗条件下醛化人胎盘细胞显微镜观察结果对比图(400×)。
图3为抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备工艺流程图。
图4为兔耳血管病理切片(HE染色，×400)；其中，(a)末次药后72h(±2h)兔左耳耳缘静脉(阴性对照品：生理盐水)；(b)末次药后72h(±2h)兔右耳耳缘静脉(供试品：P-ATG)；(c)末次药后14天兔左耳耳缘静脉(阴性对照品：生理盐水)；(d)末次药后14天兔右耳耳缘静脉(供试品：P-ATG)。
图5为兔红细胞的体外溶血试验最终(3h)结果照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
首先，值得说明的是，在人胎盘保存过程中，由于保存条件的不同和随着保存时间的变化，细胞表面会发生一系列结构性与功能性的变化，从而致使新鲜细胞发生破裂，导致吸收杂抗体效能发生明显降低。且新鲜胎盘细胞在大规模生产过程中，因外部搅拌的剪切力影响，易导致细胞破裂，致使胞内基质等物质释放至料液中，增大了细胞内含杂质对生物制品的影响。因此，需要对生物制品制备用的胎盘进行处理。
试验例1
如图1所示，本试验例提供一种醛化胎盘，其制备方法包括如下步骤：
S1，获取经处理且内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻。
S2，将解冻后的人胎盘渣沥干，置于胎盘醛化液中，胎盘醛化液为含0.8％～3％甲醛的磷酸盐缓冲液，料液比为1:2～1:5，进行醛化反应3～7h。
S3，将醛化反应完毕的胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中，搅拌10～30min，控干。
S4，将清洗完毕的醛化后胎盘转入中和液中，中和液为含0.5％～2％甘氨酸的氯化钠溶液，料液比为1:2～1:5，进行中和反应1～3h。
S5，将中和后的胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中，搅拌10～30min，控干，即得醛化胎盘。
S6，进一步对醛化胎盘进行内毒素检测，阴性，冻存醛化胎盘渣。
将上述工艺步骤制备的醛化胎盘渣加入注射用水后，显微镜观察，细胞完整未破裂。且醛化胎盘渣经异常毒性检测(豚鼠试验和小鼠试验)评价吸收效果，均符合规定要求。
异常毒性检测方法：根据《中国药典》2020年版三部各论“抗人T细胞猪免疫球蛋白”所规定的成品质量标准，采用异常毒性检测的方法(通则1141)进行豚鼠试验和小鼠试验。
(1)豚鼠试验：取豚鼠2只，注射前每只豚鼠称体重，应为250～350g。将豚鼠固定，缓慢注入成品溶液5ml后观察7天。
结果判定：观察期内，豚鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，判定供试品符合规定。
(2)小鼠试验：取小鼠5只，注射前每只小鼠称体重，应为18～22g。将小鼠固定，缓慢注入成品溶液0.5ml后观察7天。
结果判定：观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应；到期时每只小鼠体重应增加，判定供试品符合规定。
另外，值得说明的是参照上述工艺步骤，发明人团队还探究了不同醛化剂(甲醛和戊二醛，用量均为1％)对所制备的醛化胎盘的效果影响，通过显微镜观察发现：采用戊二醛作为醛化剂会导致细胞破碎。因此，本申请优选采用甲醛作为胎盘醛化用醛化剂。
发明人团队还探究了甲醛用量(0.5％、0.8％、1％、3％、5％)对所制备的醛化胎盘的效果影响，观察统计结果见下表：
Figure BDA0003778950800000081
上表结果表明，采用甲醛含量0.8％～3％的醛化液所制备的醛化胎盘渣均符合规定，考虑甲醛对人体的毒性，故实际生产中优选1％的用量。
发明人团队还探究了采用甲醛含量1％的醛化液经不同醛化时间(1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h)对所制备的醛化胎盘的效果影响，观察统计结果见下表：
Figure BDA0003778950800000091
上表结果表明，醛化反应时间低于3h，胎盘醛化程度不充分，达不到相应的效果；醛化反应时间高于8h，胎盘醛化过度，使细胞表面抗原被遮掩或者变性，导致凝集活性(杂抗体吸收)受到影响，甚至消失。
如图2所示：①醛化反应不充分时，细胞骨架刚性较差，在低渗条件下细胞大多破裂；②随醛化反应时长增加，细胞醛化程度得以提高，在低渗条件下虽然仍有部分细胞破裂，但仍有部分细胞可维持正常完整的形态；③醛化反应及过度醛化时，细胞骨架刚性得以加强，在低渗条件下细胞大多可维持正常完整的形态。
综上所述，采用甲醛含量0.8～3％的醛化液醛化反3～7h所制备的醛化胎盘的效果更好，可以用于大规模制备P-ATG产品过程中的杂抗体吸收。
试验例2
如图3所示，本试验例提供一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，制备免疫猪血浆：获取经人胸腺细胞或健康人血液分离的人淋巴细胞免疫健康猪，经检验合格后采集、分离出免疫猪血浆。
S2，血浆合并及融浆：将解冻的免疫猪血浆按投浆所需进行混合，并置于不高于37℃条件下融浆，得混合猪血浆。
S3，健康人血浆吸收：向混合猪血浆中加入健康人血浆，健康人血浆的添加量为投浆量的1％～5％，得料液A。
S4，低温乙醇初分离：
向料液A中加入-15℃以下的50％乙醇至其终浓度为8wt％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在0～5℃，搅拌不短于1h，静置后分离，沉淀为组分I废弃，收集上清液B。
向上清液B中加入-15℃以下的50％乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在-5～-10℃，搅拌不短于1h，静置后分离，上液废弃清，收集沉淀为组分Ⅱ+Ⅱ。
用0～4℃注射用水溶解组分Ⅱ+Ⅱ沉淀，加入固体氯化钠至终浓度为生理氯化钠溶液浓度，加入-15℃以下的50％乙醇至其终浓度为17wt％，调整pH至5.0±0.5，保持反应温度在0～-5℃，搅拌不短于1h，静置后分离，沉淀为组分Ⅱ废弃，收集上清液C。
用生理氯化钠溶液对上清液C超滤脱醇并进行浓缩，得浓缩液D。
S5，醛化人红细胞和醛化人胎盘杂抗体吸收：
向浓缩液E中加入醛化人红细胞，醛化人红细胞的添加量为猪血浆投浆量15％～30％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在0℃～8℃，搅拌不短于6h，分离红细胞，收集上清液E。
向上清液E中加入醛化人胎盘(试验例1制备)，醛化人胎盘的添加量为猪血浆投浆量15％～30％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在0℃～8℃，搅拌不短于6h，分离胎盘渣，收上清液F。
将上清液F超滤浓缩，得浓缩液G。
S6，低温乙醇精制：用注射用水稀释浓缩液G，加入固体氯化钠至终浓度为生理氯化钠溶液浓度，加入-15℃以下的95％乙醇至其终浓度为25wt％，调整pH至7.0±0.5，保持反应温度在-5～-10℃，搅拌不短于1h，静置后分离，上液废弃清，收集沉淀为组分Ⅱ，即得包含抗人T细胞猪免疫球蛋白的沉淀。
S7，中间品配制：将沉淀组分Ⅱ溶解，调整pH至4.0±0.2，用生理氯化钠溶液进行超滤浓缩，并加入甘氨酸，得蛋白浓度为3.5％～5％、甘氨酸含量为10～30g/L的中间品。
S8，病毒灭活和去除：将中间品溶液过滤除菌，置于24±2℃孵育24天，采用20nm除病毒滤膜过滤除病毒，复测调整pH4.0±0.2，过滤除菌，得半成品。
S9，检定及分装：取样做半成品检定，将半成品分装至中硼硅西林瓶，分装装量为5ml/瓶，即得P-ATG成品。
1.成品检定
采用本发明提供的低温乙醇工艺制备3批次商业化规模P-ATG制品，并对成品进行检定。
检定项目包括：蛋白质含量、pH值、纯度、分子大小分布(IgG单体+二聚体含量、多聚体含量)、效价(E玫瑰花环形成抑制试验效价、淋巴细胞毒试验效价)、抗A、抗B血凝素、人血小板抗体、人血浆蛋白抗体、异常毒性检查(豚鼠试验、小鼠试验)，共12项。
根据我公司自检结果以及中国食品药品检定研究院(以下简称：中检院)复核检定结果，结果见下表。
Figure BDA0003778950800000111
Figure BDA0003778950800000121
上述工艺规模化制备的P-ATG成品的各项自检结果均符合《中国药典》2020年版三部各论“抗人T细胞猪免疫球蛋白”所规定的质量标准，且与中检院复核检定结果较为一致。表明本工艺对P-ATG制品的有效性、安全性符合要求。
2.除病毒工艺研究
本发明提供额低温乙醇工艺中，除病毒工艺分为两大工艺步骤：低pH孵放病毒灭活、纳米膜过滤病毒去除。为考察该工艺对病毒去除/灭活效能，我公司委托中检院进行相关验证。
2.1低pH孵放法灭活病毒验证
低pH孵放法的指示病毒为伪狂犬病毒(PRV)、辛德毕斯病毒(Sindbis)、水疱性口炎病毒(VSV)和艾滋病病毒(HIV)，验证结果见下表：
Figure BDA0003778950800000131
结果表明，三批样品经低pH孵放病毒灭活工艺(pH值3.8～4.2，蛋白质含量35～55g/L，甘氨酸含量10～30g/L，24±2℃孵放24天)后，能有效灭活病毒，指示病毒滴度下降值均大于4Log。
2.2纳米膜过滤工艺病毒去除验证
分别采用两种不同公司的纳米膜过滤器(滤膜A和滤膜B)进行纳米膜过滤法验证，指示病毒为猪细小病毒(PPV)和脑心肌炎病毒(EMCV)，验证结果见下表：
Figure BDA0003778950800000132
Figure BDA0003778950800000141
结果表明，三批样品经纳米膜过滤病毒去除工艺(pH值3.8～4.2，蛋白质含量35～55g/L，甘氨酸含量10～30g/L)均可有效去除指示病毒，指示病毒滴度下降值均大于4Log，属于有效灭活病毒步骤，不会影响制品的安全性。
综上所述，根据国药监注[2002]160号文《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》及2020年版《中国药典》三部“生物制品通则”中《生物制品病毒安全性控制》的规定，该除病毒工艺属于有效灭活/去除病毒步骤，不会影响制品的安全性，可用于实际生产。
3.成品pH值
成品pH值选择为酸性条件(3.8～4.2)，而非中性条件(6.4～7.4)，主要基于以下几方面因素：
(1)免疫球蛋白的等电点一般为7.0～8.0，在酸性条件下免疫球蛋白分子完全电离为带正电荷的阳离子，分子间同性电荷的相互排斥作用较强，同时促使免疫球蛋白分子与水分子的结合，增强了分子间的相互隔离作用。酸性条件较之中性条件，表现出溶解度增大，性状更加稳定，可有效减少多聚体的产生的现象，进一步提升P-ATG成品的稳定性。
(2)人体血浆中含有NaHCO3/H2CO3、Na2HPO4/NaH2PO4、蛋白质钠盐/蛋白质等多种缓冲对体系，对制品pH具有较强的缓冲作用，因此，P-ATG制剂中的酸性成分对人体的影响可被降低至较低水平。
(3)生产过程中pH不回调，可以减少制品的二次暴露风险，并有效避免因此而带入外来污染的可能。
为考察成品pH值对制品安全性的影响，我公司委托昭衍(苏州)新药研究中心有限公司和湖北天勤生物科技有限公司进行相关的安全性评估中：
1)兔血管局部刺激试验：本试验中，所有动物均存活至计划安乐死，给药局部大体和显微镜观察均未见异常病理改变，如图4所示：(a)末次药后72h(±2h)兔左耳耳缘静脉(阴性对照品：生理盐水)未见明显异常改变；(b)末次药后72h(±2h)兔右耳耳缘静脉(供试品：P-ATG)未见明显异常改变；(c)末次药后14天兔左耳耳缘静脉(阴性对照品：生理盐水)未见明显异常改变；(d)末次药后14天兔右耳耳缘静脉(供试品：P-ATG)未见明显异常改变。上述结果表明：酸性条件下的P-ATG不会对血管造成不利损伤。
2)兔红细胞的体外溶血试验：如图5所示，各检测时间节点(0～3h)，均无溶血和凝聚发生，表明酸性条件下的P-ATG不会破坏兔红细胞造成溶血现象。
3)食蟹猴药代动力学研究：在最大剂量180mg/kg的条件下，试验期间无动物死亡，试验期间未见给药相关的异常临床表现。
4)大鼠单次给药毒性研究：在累计剂量1560mg/kg的条件下，试验期间无动物死亡，未对大鼠的外观、行为、对刺激的反应和排泄物等造成明显影响，大鼠体重及增重均保持增长趋势，观察期结束，对所有存活动物进行大体解剖，均未见异常病理改变。
5)大鼠重读给药毒性研究：在最大每日剂量780mg/kg的条件下，连续给药4周并恢复观察4周，试验期间无动物死亡，给药期结束和恢复期结束大鼠一般状况观察、体重、摄食量、眼科指标、尿液指标、凝血指标、血液生化、电解质和各主要脏器以及给药局部镜下组织结构，均未见异常病理改变。
综上所述，P-ATG成品(pH3.8～4.2)在多种不同种属的动物(食蟹猴、大鼠、新西兰兔)体内或体外实验中均显示出良好的安全性。
4.杂抗体吸收工艺优化
原专利文献CN101311191A公开了一种抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法中，杂抗体吸收工艺分为：①人红细胞吸收；②健康人血浆吸收；③人胎盘吸收；均在免疫球蛋白精制完成后的上清中依次加入，其各步吸收用途详见下表。
Figure BDA0003778950800000161
考虑到上述三种杂抗体吸收用生物原料添加时，会引入额外的杂蛋白(如人纤维蛋白、脂蛋白等)，且在杂抗体吸收后无任何纯化精制操作，对上述杂蛋白无去除能力等情况。尽管此部分杂蛋白为人源性组分，来自健康人供者，在临床上不会影响制品的安全性。但通过该工艺制备的成品于2～8℃长期存放过程中，可能会对制品的物理外观产生较严重的影响(如可能会出现蛋白轻微析出等现象)。
鉴于此种情况，本申请将健康人血浆杂抗吸收工艺前置于融浆过程，并将人红细胞杂抗吸收和人胎盘吸收前置于免疫球蛋白初分离后。一方面有利于充分发挥各杂抗吸收原料的吸收功效，另一方面也便于更有效地将可能引入的杂蛋白在制品的纯化过程中一并去除，有利于保持制品良好的外观，不至于出现蛋白析出等异常现象，更不会影响到制品的安全性。
商业化规模低温乙醇工艺多批次成品质量检定结果及24个月的长期稳定性研究结果显示：①各批次成品外观良好；②均与人血浆无沉淀线产生；③抗A、抗B血凝素和人血小板抗体检定结果，均显著低于《中国药典》2020年版三部各论“抗人T细胞猪免疫球蛋白”所规定的的质量标准。
Figure BDA0003778950800000162
Figure BDA0003778950800000171
试验例3
参照试验例2，本试验例探究不同低温醇沉工艺条件对产物得率的影响，试验分组及得率统计结果见下表：
Figure BDA0003778950800000172
因此，由上表可以明显看出，本发明改进的抗人T细胞猪免疫球蛋白制备方法能够获得更高得率的P-ATG。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，获取经人外周血T淋巴细胞或者人胸腺细胞免疫的猪血浆；
S2，置于37℃条件下，融浆；
S3，向融浆后的猪血浆中加入健康人血浆，健康人血浆的添加量为猪血浆投浆量的1%～5%，得料液A；
S4，向料液A中加入乙醇至其终浓度为8wt%，调整pH至7.0±0.5，置于0～5℃环境下反应，静置并分离，沉淀为组分I废弃，得上清液B；向上清液B中加入乙醇至其终浓度为25 wt%，调整pH至7.0±0.5，置于-5～-10℃环境下反应，静置并分离，得沉淀为组分Ⅱ+Ⅲ；将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀用注射用水溶解，加入乙醇至其终浓度为17 wt %，调整pH至5.0±0.5，置于0～-5℃环境下反应，静置并分离，沉淀为组分Ⅲ废弃，得上清液C；对所述上清液C超滤脱醇并浓缩，得浓缩液D；
S5，向浓缩液D中加入醛化人红细胞，醛化人红细胞的添加量为投浆量15%～30%，进一步吸收杂抗体，分离红细胞，收集上清液E；再加入醛化人胎盘，醛化人胎盘的添加量为投浆量15%～30%，进行一步吸收杂抗体，分离胎盘，收集上清液F；超滤浓缩，得浓缩液G；
S6，向浓缩液G中加入乙醇至其终浓度为25 wt %，调整pH至7.0±0.5，置于-5～-10℃环境下反应，静置并分离，得沉淀为组分Ⅱ，即得包含抗人T细胞猪免疫球蛋白的产物。
2.根据权利要求1所述的抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
S7，将沉淀组分Ⅱ溶解，调整pH至4.0±0.2，用生理氯化钠溶液进行超滤浓缩，并加入甘氨酸，得蛋白浓度为3.5%～5%、甘氨酸含量为10～30g/L的中间品；
S8，将中间品溶液过滤除菌，置于24±2℃孵育24天，过滤除病毒，复测调整pH4.0±0.2，过滤除菌，得半成品；
S9，将半成品分装，即得。
3.根据权利要求1或2所述的抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述醛化人胎盘为采用甲醛含量0.8%~3%的醛化液醛化反应3~7h所制备的醛化人胎盘。
4.根据权利要求3所述的抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述醛化人胎盘的制备步骤为：获取内毒素检测为阴性的人胎盘渣，解冻；将解冻后的人胎盘渣置于胎盘醛化液中进行醛化反应3~7h，所述胎盘醛化液为含0.8%~3%甲醛的磷酸盐缓冲液；将醛化胎盘转移至生理浓度的氯化钠溶液中洗涤，再转入中和液中进行中和反应，所述中和液为含甘氨酸的氯化钠溶液，再次洗涤，控干，即得。
5.根据权利要求4所述的抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述胎盘醛化液为含1% 甲醛的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S4中，调整乙醇终浓度采用-15℃以下的50%乙醇。
7.根据权利要求2所述的抗人T细胞猪免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，所述半成品分装采用中硼硅西林瓶包装。
8.一种由权利要求1至7任一项所述的制备方法制备获得的抗人T细胞猪免疫球蛋白制剂，其特征在于，蛋白质含量为35～55g/L，pH值为3.8～4.2，抗人T细胞猪免疫球蛋白的纯度不低于蛋白质总量的95%，IgG单体与二聚体含量之和不低于95.0%，多聚体含量应不高于5.0%，E玫瑰花环形成抑制试验效价不低于1:4000，淋巴细胞毒试验效价不低于1:1000，抗A、抗B血凝素不高于1:64，人血小板抗体不高于1:4，人血浆蛋白抗体与人血浆无沉淀线。
CN202210924288.6A 2022-08-03 2022-08-03 抗人t细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘 Active CN115232783B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210924288.6A CN115232783B (zh) 2022-08-03 2022-08-03 抗人t细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210924288.6A CN115232783B (zh) 2022-08-03 2022-08-03 抗人t细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115232783A CN115232783A (zh) 2022-10-25
CN115232783B true CN115232783B (zh) 2023-03-10

Family

ID=83677462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210924288.6A Active CN115232783B (zh) 2022-08-03 2022-08-03 抗人t细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115232783B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069836A (zh) * 2023-09-22 2023-11-17 武汉中生毓晋生物医药有限责任公司 一种抗人t细胞兔免疫球蛋白的制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1494853A (en) * 1974-07-19 1977-12-14 Inst Francais D Immunologie Preparation of antilymphocytic serum
CN1257874A (zh) * 1998-12-21 2000-06-28 蒋盘宏 抗人淋巴细胞球蛋白制备方法
CN101311191A (zh) * 2007-05-24 2008-11-26 武汉生物制品研究所 抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1494853A (en) * 1974-07-19 1977-12-14 Inst Francais D Immunologie Preparation of antilymphocytic serum
CN1257874A (zh) * 1998-12-21 2000-06-28 蒋盘宏 抗人淋巴细胞球蛋白制备方法
CN101311191A (zh) * 2007-05-24 2008-11-26 武汉生物制品研究所 抗人淋巴细胞免疫球蛋白的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
人红细胞膜固定相在抗人胸腺细胞免疫球蛋白生产中的应用;刘宇;《湘南学院学报(医学版)》;20101225(第04期);"1.2.2"部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115232783A (zh) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100617648B1 (ko) 혈장 또는 혈청을 함유하는 아벨리노 각막 이영양증 치료용약학 조성물
EP4292585A2 (en) Methods for isolating umbilical cord blood plasma products, tissue and cellular exosomes, and compositions and methods of use thereof
KR100609262B1 (ko) 정용 여과로 안정화된 혈액 생성물의 제조 방법
CN115232783B (zh) 抗人t细胞猪免疫球蛋白的制备方法及醛化胎盘
Ts' ao Rough endoplasmic reticulum and ribosomes in blood platelets
Archer et al. Formation of Charcot-Leyden crystals in human eosinophils and basophils and study of the composition of isolated crystals
US9241959B2 (en) Kits and methods for processing stem cells from bone marrow or umbilical cord blood
CN101074962B (zh) Abo血型反定型试剂
CN105601735B (zh) 一种静注巨细胞人免疫球蛋白及其制备方法
Murphy et al. In vitro aspects of erythropoiesis
Rebulla Blood transfusion in beta thalassaemia major
CN105669860B (zh) 一种抗手足口病人免疫球蛋白及其制备方法
CN107028982A (zh) 人胎盘乙型肝炎特异免疫活性多肽
Pisciotto et al. In vitro characteristics of white cell‐reduced single‐unit platelet concentrates stored in syringes
Rothstein et al. Acute hemolytic anemia, autoagglutination, toxic hepatitis and renal damage following sulfathiazole therapy; case report
CN111471101A (zh) 一种去除人免疫球蛋白类制品中残留的IgA的方法
AU2006231531A1 (en) Methods and precipitating reagents for isolating proteins from proteinaceous material
CN110804578A (zh) 一种牛血清去除IgG的生产方法
CN110840915A (zh) 一种靶向间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
US20070166821A1 (en) Serum production system
RU2188654C1 (ru) Препараты крови для трансфузии и способ их получения
US4791191A (en) Depyrogenation of clinical albumin
Weiber et al. Use of Antilymphocyte Globulin Prepared by Precipitation with Rivanol® and Reduced Dose of Azathioprine in Allogenic Renal Transplantation in the Dog
RU2128514C1 (ru) Способ получения противовоспалительного средства
CN117069836A (zh) 一种抗人t细胞兔免疫球蛋白的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant