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Titel : Verfahren zur herstellung von Stoffen mit einer +Sh2-Gruppe,
die vom polymeren Träger enzymatisch abspaltbar ist Die trfindvng betrifft ein Verfanren
zur Herstellung von aktiven Stoffen in polymerer Form und stellt ein Verfahren zur
herstellung von makromolekularen Präparaten mit enzymatisch abspaltbaren aktiven
Stoffen unter Schutz.
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bei einer eihe von aktiven Stoffen, die in biologisches Milieu eingeführt
werden, ist die hirkungsdouer durch renale Exkretion oder Inaktivation begrenzt,
was zu einer unerwünschten Erhöhung der Dosierung führt.
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um dies zu verhindern, werden diese Stoffe in Form von schwer löslichen
Verbindungen oder Komplexen mit dem Ziel ein lokales Depot zu schaffen, aus dem
der wirksame Stoff nur langsam ausgeschwemmt wird, appliziert.
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In anderen fällen wurden an olymerisate gebundene Stoffe geprüft.
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Im Falle, daß die polymere Form des wirksamen Stoffes als solcher
nicht aktiv ist, ist es notwendig, die niedermolekulare aktive Form des wirksamen
Stoffes abzuspalten, in einigen Fällen handelt es sich um die mit geeigneter Geschwindigkeit
verlaufende hydrolyse, welche aber schwierig kontrollierbar ist. Von anderen 'Autoren
wurde die enzymatische Hydrolyse vorausgesetzt, aber es wurde keine chemische, für
Enzyme spezifische Bindung bereitgestellt und selbst die enzymatische Spaltung wurde
nicht direkt nachgewiesen. in anaeren Arbeiten wurden Analysen der enzymatischen
Spaltbarkeit beschrieben, aber es wurden natürliche Polymerisate oder unlösliche
synthetische Folyrerisote verwendet.
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Jetzt wurde festgestellt, daß man in wirtschaftlich geeigneter Weise
eine chemische Bindung, welche für die Enzyme spezifisch ist, in der Seitenkette
von synthetischen Polymerisaten herstellen kann und daß mit Hilfe dieser Bindung
eine aktive Substanz, welche die NH2-Gruppe enthalt, verbunden werden kann, wodurch
sichergestellt wird, daß diese Substanz langsam in ihrer aktiven Form durch die
einwirkung von enzymen, die in biologischen Milieu anwesend sind, abgespalten wird.
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Die erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von aktiven Stoffen,
die die NH2-Gruppe in polymerer Form enthalten, die die NH2-Gruppe enthält und besteht
darin, daß die aktive Komponente durch ihre Nh2-Gruppe an die Seitenkette mit der
terminalen, fUr das erwdhlte Enzym spezifischenot- L Aminosdure gebunden wird.
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Diese Seitenkette bildet einen Teil der polymeren Einheit, welche
in der Menge von 1 bis 50 Mol besonders 1 bis 15 Mol. ,0 im vernetzten oder unvernetzten
Mischpolymerisat mit hydrophiler komponente auf der Basis von N-Alkylmethacrylamid,
h-Alkylacrylamid,
N,N-Dialkylacrylamid, enthalten wird, wobei das
alkyl 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält uno welches 1 bis 3 OH-Gruppen oder lykolmethacryiat,
bzw. Glykolacrylat enthalten kann, wobei Glykol @ethylenglykol, ropylenglykol, butylenglykol,
bidthylenglykol, Triäthylenglykol und weitere homologische C2 - C6 enthaltende Polyglykole,
an sich oder ihr Gemisch darstellt, wobei zwischen aer polyvinylischen Kette und
der aktiven Komponente eine Seitenkette mit der minimalen Länge von 6 Atomen liegt.
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Das Verfahren zur Herstellung der polymeren Form des aktiven Stoffes
nach der Erfindung besteht darin, daß Ester oder isSubstituiertes Amid der Acryl-
oder Methacrylsäure, welches in der Seitenkette mindestens drei Atome in der reihe
enthält, und welches mit dem Kohlenstoff des Carboxyls endet, mit der α -Aminogruppe
der Aminosäure der L-Konfiguration kondensiert wird, welche aus der Gruppe -Phenylalanin,
Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Arginin, Glycin, Alanin, Leucin, Zitrullin, Ornithin
gewählt wird, worauf an die Carboxylgruppe dieser Aminosdure die aktive Komponente
durch ihre kh2 -Gruppe gebunden wird und anschließend das gewonnene Monomere mit
der hydrophilen monomeren Komponente auf der Basis von Is-Alkylmethacrylamid, h-Alkylucrylamid,
k, N-Dialkylacryamid mischpolymerisiert wird, wobei Alkyl 1 bis 6 Kohlenstoffatome
trägt und welches 1 bis 3 OH-Gruppe oder Glykolmethacrylat, bzw. Glykolacrylat enthalten
kann, wobei Glykol Aethylenglykol, Propylenglykol, butylenglykol, Diäthylenglykol,
ritithylenglykol und weitere homologe - C6 enthaltende Polyglykole an sich oder
im Gemisch, vernetzte oder unvernetzte.
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Bei der Herstellung der polymeren Form des aktiven Stoffes kann man
auch so borgehen, daß man an das Carboxyl- der Seitenkette oder an das Carboxyl
der terminalen Aminosäure durch bekannte Methoden anstelle der aktiven Komponente
die Komponente, welche aktives Ester
bildet, bindet so daß man nach
aer obenerwähnten Mischpolymerisation aktiviertes Polymerisat gewinnt, an welches
man wiener ciuich bekannte Verfahren die aktive Komponente mit Hilfe ihrer NH2 -Gruppe
oaer ihr Aminoacylderivat mit den oben angeführten L- α L minosäuren bindet.
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uie .ahl des herstellungsverfahrens hängt einerseits von cer @ Art
des verwendeten Mischpolymerisats, andererseits aber besonders von der krt der aktiven
Komponente ab. Vorteilhafterweise kann man zuerst das Monomere, dessen terminales
Carboxyl, an welches die aktive komponente gebunden weraen soll, durch p-tnitrophenol,
2,3,5- Trichlorphenol, @-hydroxychim, 5-Chlor-@-hydroxychinolin, N-Hydroxysuccinimid,
N-hydroxyphthalimia esterifiziert wira. Solches Monomer wird nach dem tschechosl.
Urherberschein Nr. ......
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(PV - 2879-74j entsprechend mit substituiertem Acryl- oder Methacrylamid
mischpolymerisiert. Das resultierende Mischpolymerisat ist in der Kälte und in inerter
Atmosphäre beständig. In geeignetem Lösungsmittel reagiert es mit NH2-Gruppen der
aktiven Komponente unter Bildung der obenbeschriebenen spaltbaren Bindung, Das Verfahren
über reaktive Ester (Beispiel 2) ist im hinblick auf eine Ausnützung der aktiven
Komponente sehr wirtschaftlich und ermöglicht die Herstellung von aktiven polymeren
Trager für die Bindung von verschiedenen wirksamen Stoffen.
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Die polymere Form, welche auf die der Erfindung entsprechenden Weise
hergestellt wird, weist eine keihe von Vorteilen auf. Sie ermöglicht die Regulation
des physikalischen und biologischen Verhaltens des wirksamen Stoffes durch den Charakter
und das Molekulargewicht des polymeren Trägers. Durch die Zusammensetzung der Seitenkette
kann man die Spaltungsgeschwindigkeit regulieren (Beispiel 1,3).
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Die aktive Komponente wird durch die dindung nicht nur vor der Exkretion,
sondern auch von einer inaktivation geschützt (z. s. die windung von histamin im
Beispiel 4 verhindert einen Angriff durch die histaminase, was eine Monoaminooxidase
darstellt).
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Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen erklärt, ohne sie darauf
zu beschränken.
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beispiel 1 Durch direkte Mischpolymerisation nach dem tschechoslo.
Urheberschein Nr. ....... (PV-2879074) wurde Mischpolymerisat 1, welches 97,6 Mol.
% N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA) und 2,4 MOl % N-Methacryloylglycylphenylalanyl
von Nitroznalid (MGPN) enthält und Mischpolymerisat II, verches 98,18 Mol % HPNA
und 1,82 Mol.% Nitrophenolester des N-(Methacryloyl)glycine enthält,hergestellt,
Das Mischpolymerisat II wurde in Dimethylsul,foxid zu einer 10 %-igen Lösung aufgelöst
und es wurden ihm gleiche Mengen von 0,5 zeiger Lösung des 7-Phenylalanyl-p-nitro-anilides
(a), bzw. des Glycinnitroanilids (b) in demselben Lösungsmittel zugegeben. Es wurde
bei 37° C Uber Nacht stehen gelassen. Mischpolymerisat wurde in zehnfachen Dberschuß
des Gemisches Aceton: Aether (1:1) aufgefällt, durchgewaschen, in DMF auf 10 %-ige
Lösung gelöst und lyophilisiert (Ko IIa und Ko IIb). sie Produkte wurden als Substrat
für enzymatische Spaltung verwendet. Als Kontrolle diente N- Cc (succinyl) -# -
phenylalanyl-p-nitroanilid (SPNA). Verfahren nach Erlanger @.f., Edel F. und Cooper
A.G. (Arch. biochem. Biophys. 115, 206, 1966).
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Das Polymerisat mit angebundenmm Glycyl-p-nitroanilid wies nach 24
Stunden Inkubation keine Spaltung auf. Die Spaltungsgeschwindigkeit des an das Polymerisat
gebundenen 1-Phenylalanylnitroanilids
(SPNA = 100%), wird in der
folgenden Tabelle angegeben: Anfangsgehalt an Nitroanilid Spaltungsgeschwindigkeit
im Mischpolymerisot SPNA - 100 % Chymotr#psin Pronaza KO I 2,4 Mol.% 23 % -KO IIa
1,25 MOl.% 15 % 82 % Ko IIb 1,56 Mol.> 0 % O s Die Ergebnisse beweisen, daß die
gebildete bindung zwischen der Seitenkette und der als Modell dienenden p-Nitroanilin
für das Enzym schon bei der 6 Atomen gleichenden Länge der Seitenkette zugänglich
ist, wobei auf diese Weise geeignetes Produkt durch direkte Mischpolymerisation
und auch durch polymeranalogische Reaktion mit dem aktivierten Polynerisat entsteht.
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Beispiel 2 Durch direkte Mischpolymerisation nach dem tschechoslow.
Urherberschein Nr. ....... (PV-2879-74) wie im Beispiel 1 wurde Mischpolymerisat
IV, welches 96 Mol % HPMA und 4 MOl.% N-Methacryloylglychyl-glycyl(1-phenylalanyl)nitroanilid
enthält, hergestellt.
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Dieses Polymerisat und das im Beispiel 1 beschriebene Polymerisat
mit angebundenem 1-Phenylalanyl-p-nitroanilid (Ko I), wurden in verschiedenen Konzentrationen
(5 x 10-5 M, 10-4 M, 2 x 10-4 M, 7 x 10-4 M, 10-3 M, 5 x 10-3 M - auf Nitroanilid
berechnet)als Substrate für die Spaltung durch Chymotrypsin nach der im Beispiel
1 angeführten Methode verwendet. Bei der Konzentration 7 x 10 4 M dauerte die Inkubation
24 Stunden. Anschließend wurden die Prozente
der Spaltung gemessen
und wenn sie 100 @ nicht erreichte, wurde frisches tnzym zugegeben und wiederum
innerhalb von 2 Stunden inkubiert. Solange sich die Spaltung nicht erhöhte, wurden
die erreichten Prozente der Spaltung für den Grenzwert gehalten.
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aus den Ergebnissen wurden die konstanten km (Michaelis-Konstante)die
die Affinität des enzyms zum Substrat angibt) und Vmax (maximale Spaltungsgeschwindigkeit,
welche den @erfall des Komplexes Enzym-Substrat in cnzym und rrodukt angibt berechnet.
Die trgenisse in der labelle zeigen, daß man durch die Länge der Seitenkette die
Spaltungsgeschwindigkeit und auch die brenzwertspaltung regulieren kann.
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Sobstrat Km(nM) Vamx Gtenzwertspaltung SPNa 0,086 1,00 100% Ru 1 2,0
0,7 Ko IV 2,22 8,7 100% beispiel 3 hach der von h.Arold und L. kietschel beschriebenen
Methode (-. Chem.
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9, 144, 1969) wurde N-Phenylalanyl-histamin hergestelltund in polymeranaloger
Reaktion, die im Beispiel 1 beschrieben wird, mit Ko II verwendet. Es wurde Mischpolymerisat
(Ko V), welches 1,1 % Einheiten von N-/N'-(Methacrylotyl)glycyl/-1-phenylalanylhistamin
enthält, gewonnen. Auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise wurde es mit Chymotrypsin
inkubiert. In Freiheit gesetztes Histamin wurde nach P.A. Shore, A. burkhalter und
V.H. Cohn, Jr. bestimmt (Pharmacol.
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exp. theor. 127, 182, 1959). Die Ausgangskonzentration des gebundenen
Histamins betrug 1x10-3 3 M, die Konzentration des Chymotrypsin
0,5
mgiml. Die Anfangsgeschwindigkeit der spaltung war bis zu Minuten linear mit der
Steigung K = 1,2x10-6 Nol. Min. -1 @-1 Die Grenzwertspaltung betrung 28 @.
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Beispiel 4 Dem tschechoslowakischen Brheberschein Nr. ..... (PV-2879-74)
entsprechend hergestelltes aktiviertes Mischpolymerisat von N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid
mit Nitrophenylester des friethacryloylglycylglycins, welches mit 1rimethylolpropantri
methacrylat vernetzt wurde, wurde in Dimethylformamid (5 % w/w) suspendiert. Zu
2 ml Suspension wurden unter schonendem Kühren 2 ml 0,5 %-ige Lösung von N-Phenylalanyl-N'-isonicotinylhydrazidhydrochlorid
und 0,1 ml 3 %-ige Lösung von Triäthylamin in Dimethylformamid zugegeben. Es wurde
Uber Nacht bei 370 C stehen gelassen. Das Polymerisat wurde mit Hilfe einer Zentrifuge
separiert, und mit Wasser bis zum Verschwinden der reaktion auf Chloride durchgewaschen.
Die Suspension des Produktes wurde mit Chymotrypsin entsprechend den Bedingungen
im Beispiel 1 inkubiert.
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Nach 2 Stunden wurde nach dem Zentrifugieren im Supernatant abgespaltete
Hydrazid der Isonicotinsäure spektrophotometrisch bestimmt.
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Die abgespaltete Menge innerhalb dieser Zeit - auf die Gesamtmenge
des Polymerisat berechnet - betrug 1,8 mg.
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beispiel 5 Nach dem tschechosl. Urherberschein Nr. ..... (PV 2879-72)
wurden folgende Mischpolymerisate hergestellt, ungefällt und ausgereinigt: N-Aethylacrylamid
(93,2 Mol %) mit MGPN (6,8 Mol /u; siehe Beispiel 2), N-Acryloylmorpholin (97,3
Mol % mit MgPN (2,7 Mol >) und Triäthylenglykolmonomethacrylat (92 Mol%) mit
PGPN (8 MOl%). In analoger
eise wie im Beispiel 1 wurde die enzymatische
Abspaltbarkeit von p-Nitroanilid textiert. Die Abspaltung wurde 15 Minuten bei 370
C verfolgt und im Verhältnis zu Spaltung von SPNA ausgedrückt. Es wurden festgestellt
15,2 %. 23,5 % und 1S,7 s.