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Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus wässrigen Lösungen (Zusatz
zu Patent/Patentanmeldung P 24 o2 226.2-41) Gegenstand des Hauptpatents/Patentanmeldung
P 24 o2 226.2-41 ist ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus wässrigen Lösungen,
in denen sie im Gemisch mit kleineren organischen Molekülen vorliegen, wobei man
die Lösung über ein Ionenaustauscherharz in der Gelform leitet, mit Wasser eluiert
und vor Auftreten der die kleineren organischen Moleküle enthaltenen Fraktionen
des Eluats eine enzymreiche Fraktion gewinnt.
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Das Verfahren nach dem Hauptpatent/Patentanmeldung P 24 o2 226.2-41
ist weitester Anwendung fähig und erlaubt die Aufarbeitung wässriger Lösungen beliebiger
Enzyme. Besondere Bedeutung hat es für die in der Stärkeindustrie verwendeten Enzyme.
Hierbei können sowohl die bei der Hydrolyse von Polysacchariden zu Mono- oder Disacchariden
wirksamen Hydrolasen, wie Amylase, Maltase, Lactåse, Saccharasee als auch die bei
der Isomerisierung von Mono-oder Disacchariden wirksamen Isomerasen, wie Glucose-
und Mannoseisomerase, in einer enzymreichen Fraktion erfasst werden.
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Als Ionenaustauscherharze kommen sowohl Anionen- als auch Kationenaustauscherharze
infrage. Letztere werden bevorzugt verwendet und sind überwiegend mit Metall- und/oder
Ammoniumionen beladen. Die Beladung des Austauscherharzes erfolgt soweit, bis sein
pH-Wert dem der eingesetzten Lösung angeglichen ist. In jedem Fall wird bei pH-Werten
von 3 bis 9 gearbeitet. Es ist jedoch zu beachten, daß das Enzym am isoelektrischen
Punkt ausflocken kann. Dieser pH-Bereich muß daher gemieden werden. In Vorversuchen
kann der jeweils günstige pH-Wert festgestellt werden. Dabei sind natürlich nur
die pH-Bereche zu berücksichtigen, in denen das infrage kommende Enzym stabil ist.
Bei der Wahl der Arbeitstemperatur, die im allgemeinen zwischen 20 und 80°C liegen
kann, spielt die thermische Stabilität des Enzyms eine entscheidende Rolle. Eluiert
wird vorzugsweise mit entmineralisiertem Wasser, dessen pH-Wert ebenfalls dem des
Austauscherharzes bzw. dem der wässrigen Ausgangslösung möglichst weitgehend angeglichen
ist. Die Durchflussgeschwindigkeit beim Eluieren mit Wasser ist für die Durchführbarkeit
des Verfahrens nicht entscheidend wichtig. Sie kann sehr hoch liegen, ohne daß eine
Verschlechterung der Trennung eintritt. So sind je nach der gewählten Arbeitstemperatur
Durchflussgeschwindigkeiten von über einem Harzbettvolumen pro Stunde (BV/h) möglich.
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Nach der beschriebenen Verfahrensweise gelingt es enzymreiche Fraktionen,
die zwecks Gewinnung der Enzyme als solche unter milden Bedingungen bis zur Trockne
eingeengt werden können, ohne Denaturierung und sogar ohne stärkeren Verlust ihre
Aktivität aufzufangen.
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In dem Hauptpatent/Patentanmeldung P 24 o2 226.2-41 wird
ausgeführt,
daß es für den speziellen Fall des Enzyms Glucoseisomerase zweckmäßig ist, ein überwiegend
mit einwertigen Metallionen beladenes und auf einen pH-Wert von 6,o eingestelltes
Kationenaustauscherharz zur Gewinnung einer enzymreichen Fraktion einzusetzen. In
weiteren Versuchen hat es sich nun gezeigt, daß bei Einhaltung der vorstehend genannten
Versuchsbedingungen zwar eine erfolgreiche Abtrennung des EnzymsGlucoseisomerase
von Fructose und Glucose aus einer wässrigen Lösung möglich ist, aber in einem gewissen
Umfang bereits Ausfällungen des Enzyms auf dem Harz zu beobachten sind. Diese Tendenz
zum Ausflocken wird durch die Anwesenheit mehrwertiger Metallionen verstärkt.
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Es wurde nun gefunden, daß die vorgenannten Schwierigkeiten vollständig
vermieden werden, wenn das Kationenaustauscherharz auf einen Wert zwischen 6 und
8 eingestellt wird. Dieser pH-Bereich wird vorzugsweise auch bei der Gewinnung anderer
infrage kommender Enzyme eingehalten.
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Vorzugsweise wird als in Gelform vorliegendes Ionenaustauscherharz
ein Kationenaustauscherharz, beispielsweise ein mit 2 bis 8 Gew.% Divinylbenzol
vernetztes Polystyrolsulfonat-Austauscherharz, verwendet, das zur Angleichung des
pH-Wertes an den der eingesetzten enzymhaltigen wässrigen Lösung mehr oder weniger
umfangreich mit Metall- und/oder Ammoniumionen beladen worden ist.
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Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung leitet man
Glucoseisomerase,
Fructose und Glucose enthaltende wässrige Lösungen über ein derartiges Kationenaustauscherharz.
Dabei spielt es keine Rolle, ob neben den genannten Monosacchariden noch Di- oder
Oligosaccharide vorliegen, wie Saccharose, Maltose, Lactose, Cellobiose, Raffinose.
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Entscheidend ist, daß die nicht ionisierten, kleineren organischen
Moleküle in die Harzkanäle eindringen, während die sperrigen+), kolloidal gelösten
Enzymmoleküle vom Zutritt ins Innere des Harzes ausgeschlossen werden.
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Letzteres gilt im übrigen auch für die sperrigen Moleküle von Polysacchariden,
Farbstoffen sowie ionisierte Substanzen. Durch die beschriebenen Vorgänge wird die
Wanderungsgeschwindigkeit der kleineren organischen Moleküle während des Eluierens
verzögert, während die nicht in die Harzkanäle eindringenden Moleküle in den größeren
Hohlräumen zwischen den Austauscherharzkörnern praktisch ungehemmt vorangetragen
werden.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch möglich zur Gewinnung
von an Glucoseisomerase reichen Enzymfraktionen von Lösungen auszugehen, die nicht
Fructose und Glucose enthalten. Bekanntlich beschränkt sich die Isomerisierungswirkung
der Glucoseisomerase nicht nur auf Glucose. Vielmehr kommen noch andere Kohlehydrate
infrage, insbesondere das Monosaccharid Xylose.
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Schließlich kann das Enzym Glucoseisomerase auch gleichzeitig mit
dem EnzymAmyloglucosidase, einerHy4rolase, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
von Zuckern aus +) unter Umständen auch
wässrigen Lösungen abgetrennt
werden. Das ist beispielsweise dann der Fall, wenn diese beiden Enzyme in bekannter
Weise so eingesetzt werden, daß erst die Amyloglucosidase vorhydrolysierte Stärke
zu Glucose hydrolysiert und anschließend die Glucoseisomerase einen Teil der Glucose
In Fructose umwandelt. Auch kann man die Amyloglucosidase und Glucoseisomerase gleichzeitig
auf vorhydrolysierte Stärke einwirken lassen, was zu fructosehaltigen Glucosesirupen
führt.
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Vorzugsweise wird zur Gewinnung einer an Glucoseisomerase reichen
Enzymfraktion von einer im wesentlichen Fructose und Glucose enthaltenen wässrigen-Lösung
ausgegangen, wobei die Einhaltung eines pH-Bereichs von 6,8 bis 7,2 zu besonders
guten Trennergebnissen führt, zumal die im stärker alkalischen Bereich ablaufende
Umwandlung der Fructose und Glucose in unerwünschte Produkte praktisch vollständig
ausgeschlossen wird.
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Für den zuletzt genannten Anwendungsfall des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es von besonderer Bedeutung, daß das verwendete Kationenaustauscherharz nicht
mehr überliegend mit einwertigen Metallionen beladen sein muß, wenn bei einem pH-Wert
von 6 bis 8, insbesondere 6,8 bis 7,2, gearbeitet wird. So wurde gefunden., daß
mehrwertige Kationen, wie beispielsweise Calcium-, Magnesium- oder Kobaltionen,in
dem genannten pH-Bereich bei der Gewinnung einzahn Glucoseisomerase reichen Fraktion
aus Fructose und Glucose enthaltenden wässrigen Lösungen
nicht stören.
Mit besonderem Vorteil wird ein mit Calciumionen beladenes Kationenaustauscherharz
eingesetzt.
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Ein derartig vorbehandeltes Harz gestattet es, nach der Enzymfraktion
eine Glucose-, Isomerasesirup- und Fructosefraktion aufzufangen. Es fällt demnach
nicht nur eine enzymreiche Fraktion an, sondern es ist gleichzeitig die vorteilhafte
Gewinnung von fructose- und glucosereichen Fraktionen möglich, die mit verringertem
Aufwand zu den Rein-substanzen aufgearbeitet oder auch, gegebenenfalls nach Einengung
der Lösungen, schon verschiedenen Gebrauchszwecken zugeführt werden können. Die
Isomerasesirupfraktion, die neben Glucose aus dieser durch Isomerisierung gebildete
Fructose enthält, wird den üblichen Reinigungs-bzw. Trennverfahren unterworfen.
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Schließlich zeigt sich die allgemeine Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen
Verfahrens des-weiteren darin, daß auch die in Milch gelösten Enzyme von kleineren
organischen Molekülen, d.h. unter anderem von Lactose, abtrennbar sind. So enthält
Kuhmilch mehr als 19 Enzyme, beispielsweise Esterasen, wie Lipase Phosphortase,
Hydrolasen, wie Amylase, Aldolasen, Catalasen, Peroxidasen und Proteasen im Gemisch
mit Milchproteinen, wie Kasein, Lactalbumin, Lactglobulin und Serumalbumin, Kohlenhydraten,
wie Lactose, Mineralstoffe, wie Calciumcitrat, Vitamine, wie Vitamin A, B, E und
K sowie Carotin, Milchfett und Hormone. (K.M. Shahani et al. "Enzymes in Bovine
Milk: a Review" in Journal Dairy Science Vol. 56, 1973, Seite 531 bis 543.
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Die Abtrennung der Enzyme und der weiteren Bestandteile
von
der Lactose hat erhebliche Bedeutung, da sehr viele Menschen normale Kuhmilch nicht
vertragen. Nach Ansicht von Fachleuten ist die Unverträglichkeit auf die in der
Milch enthaltene Lactose zurückzuführen, da die typischen Symptome, wie Magenbeschwerden
und Diarrhoe, nur bei Menschen auftreten, die einen Mangel oder ein Fehlen des die
Lactose hydrolysierenden Enzyms ß-Galactosidase im Darm aufweisen. Nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren wird die störende Lactose weitgehend entfernt und eine hochwertige Diätmilch
gewonnen, deren Trockensubstanzanteil etwa die Hälfte des der- eingesetzten Milch
beträgt.
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Der ursprüngliche Trockensubstanzanteil kann ohne weiteres durch schonendes
Einengen unter Vakuum und geringfügig erhöhten Temperaturen wieder hergestellt werden.
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Im Falle der Aufbereitung von Kuhmilch wird bei einem pH-Wert von
6,5 bis 7 gearbeitet. Dieser Bereich erfasst den bei Kuhmilch normalerweise vorliegenden
pH-Bereich von 6,6 bis 6,8. Es versteht sich von selbst, daß nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren auch Milch anderer Warmblüter, wie Ziegen und Schafe, zwecks Abtrennung
des Milchzuckers behandelt werden kann. Die enzymreiche Fraktion enthält in jedem
Fall sämtliche wertvollen Bestandteile, d.h. Milchprotein ! Mineralstoffe, .Milchfett,
Hormone und Vitamine.
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Vorzugsweise wird Milch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Raumtemperatur'
oder niedrigeren Temperaturen behandelt, um den vollständigen Erhalt der Wertvollen
Bestandteile zu gewährleisten, insbesondere der Vitamine.
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In keinem Fall darf die Temperatur so hoch gewählt werden, daß die
Eiweißanteile der Milch ausflocken. Die entstehenden Koagulate würden die vorgesehene
Trennwirkung des Austauscherharzes aufheben, indem sie sich auf dessen Oberfläche
niederschlagen.
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Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
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Beispiel 1 Um Glucose enzymatisch zu Fructose zu isomerisieren, wurden
5 kg einer wässrigen Lösung, die 2200 g Glucosemonohydrat, 1 g Kobalt-II-chlorid-hexahydrat
und 8 g Glucose-Isomerase-Enzym (Miles Kali Chemie, Muster mit 3000 TGIU/g) enthielt,
bei 70°C gerührt. Zur Bereitung der Lösung diente Leitungswasser, dessen Ca -Ionen
mittels Ionenaustauscher gegen Mg++-Ionen ausgetauscht worden waren. Der pH-Wert
der Lösung betrug 7,o und wurde während der Umsetzung automatisch mit Natronlauge
nachgeregelt.
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Nach 18 h betrug der Antei»ler Fructose an der Trockensubstanz 40,2
Gew.%. Die Lösung wurde dann auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert und zur Rückgewinnung
des Glucose-Isomerase-Enzyms auf eine mit Polystyrolsulfonatharz Bayer TSW 40 gefüllte
Trennsäle von 8 cm Durchmesser und 290 cm Harzhöhe gegeben. Bei einer Säulentemperatur
von 250C wurde mit einer Geschwindigkeit von o,o4 amXsec Qo,5 Bettvolumen/h) mit
Wasser eluiert. Das Eluat der Kolonne wurde in die folgenden Fraktionen unterteilt:
Vorlauffraktion
(Wasser) von o,o - 5,0 1 Enzymfraktion von 5,o - lo,o 1 Glucosefraktion von lo,o-
ll,o 1 (90,6 % Glu, 9,4 % Fru) Isomerasesirupfraktion von ll,o- l9,o 1 (56,1 % Glu,
43,9% Fru) Fructosefraktion vonl9,o- 21,5 1 (8,2 % Glu, 91,8 % Fru) Die Enzymfraktion
wurde, um Ca++- gegen Mg++-Ionen aus zutauschen, über einen mit Mg++-Ionen beladenen
Kationenaustauscher geleitet. Zur weiteren Umwandlung von Glucose in Fructose wurden
dann in der umgesalzten Enzymfraktion 2200 g Glucose-monohydrat und 1 g Kobalt-II-chlorid-hexahydrat
gelöst, die Lösung im Vakuum auf 5 kg eingedampft und wie zuvor bei 70°C gerührt.
Nach 30 h enthielt die Lösung 35 Gew.% Fructose.
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Die Lösung wurde zur Rückgewinnung des Glucose-Isomerase-Enzyms erneut
über die Trennsäule gegeben und das Eluat wie zuvor in Fraktionen aufgeteilt. Die
dabei gewonnene Enzymfraktion wurde noch ein drittes Mal zur Isomerisierung von
2200 g Glucose-monohydrat eingesetzt. Insgesamt wurden aus 6000 g Glucose (6600
g Glucose-monohydrat) 2104 g Fructose erhalten.
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Beispiel 2 Polystyrolsulfonatharz Bayer TSW 4o wurde mit Natriumchloridlösung
vom pH-Wert 7 in die Natriumform gebracht und auf den pH-Wert 7 eingestellt. Die
Harzhöhe betrug 2,9 m, das ausgenutzte Harzvolumen 14 1. Bei einer Kolonnentemperatur
von
20°C wurde die Harzkolonne zunächst mit 1 Bettvolumen (sV) Milch (Durchfluss o,5
BV/h) gespült, um auf dem Harz eine Kationenzusammensetzung einzustellen, wie sie
in der Milch gegeben ist. Das Harz wurde dann mit destilliertem Wasser milchfrei
gewaschen.
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Auf die so vorbereitete Harzkolonne wurden 2 1 Milch mit 45,1 % Lactose
und 28,8 % Protein in der Trockensubstanz und anschließend destilliertes Wasser
aufgegeben.
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Das Eluat wurde in eine enzymreiche Milchproteinfraktion und eine
lactosereiche Fraktion eingeteilt. Die enzymreiche Milchproteinfraktion verließ
die Kolonne im Bereich von 4,9 bis 7,3 1, gerechnet vom Beginn der Aufgabe der Milch.
In der Trockensubstanz dieser Fraktion waren nur noch 6,6 % Lactose. Die lactosereiche
Fraktion reichte von 7,3- bis 10,5 1.
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Die enzymreiche Milchproteinfraktion mit vermindertem Lactosegehalt
wurde anschließend auf den normalen Trockensubstanzgehalt von Milch (ca. 10,2 %)
konzentriert. Die Diätmilch war visuell von normaler Milch nicht zu unterscheiden.
Ihr Geschmack war neutral. Die ihr gegenüber normaler Milch fehlende "Süße" konnte
leicht durch Zugabe geringer Mengen verträglicher Zucker wie Saccharose, Fructose
und/oder Glucose zurückgewonnen werden.