DE2408379C3

DE2408379C3 - Verfahren zur Herstellung eines lipasereichen Enzympräparates aus Pankreasgewebe

Info

Publication number: DE2408379C3
Application number: DE19742408379
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. 5158 Horrem; Lekim Dac Dr. 5000Köln Betzing
Original assignee: A. Nattermann & Cie GmbH, 5000Köln
Filing date: 1974-02-21
Publication date: 1976-07-29

Description

Es ist seit langem bekannt, Vipasehaiuge Pankreaspräparate zur fermentativen Spaltung von Fetten zu verwenden. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die Anreicherung der LJpase in derartigen Enzympräparaten. Diese finden Verwendung unter anderem bei der Behandlung von Verdauungsstörungen und ihren Folgeerscheinungen, deren Ursachen in erster Linie in der fehlenden Sekretion der Bauchspeicheldrüse und der Magenschleimhäute oder im Ausfall der Produktion 3c der betreffenden Enzyme in diesen Organen begründet sind.

Die bis jetzt im Handel sich befindlichen Enzympräparate zeigen in der Regel Lipaseaktivitäten von 40 bis 60 Willstätter-Einheiten (WE)Zg. Dabei ist eine WE diejenige Enzymmenge, die unter festgelegten Bedingungen in einer Stunde von 2$ g Olivenöl 24% des Öls spaltet Die Aktivitätswerte dieser Präparate sind jedoch unbefriedigend, da mit den üblichen Dosierungen dieser Präparate der Mangel an Lipase nicht ausgeglichen werden kann.

Aus der britischen Patentschrift 13 28 202 ist bereits ein Verfahren zur Herstellung eines Pankreatin-Präparates mit einer Aktivität größer als 3NF bekannt, wobei unter NF die nach der National Formulary, XIUh Ediuuii, vuii der Amerikanischen Pharmazeutischen Gesellschaft, Washington, D. C, USA, veröffentlichte minimale Pankreatinaktivität solcher Präparate gegenüber Stärke und Kasein gemeint ist Bei diesem Verfahren werden in einem wäßrig alkalischen Milieu die zerkleinerten Pankreasdrüsen bei einer Temperatur von 20 bis 30° C vor dem Entwässern und Entfetten mit Propyl- bzw. Butylalkohol zunächst einer Autolyse unterworfen. Das aus dem nach dem Entfetten des tutolysierten Gcwebemateriais erhaltene Enzympräparat zeigte jedoch immmer noch eine relativ geringe Lipaseaktivität

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung eines lipasereichen Enzympräparates durch Zerkleinern von Pakreasgewebe, Autolysieren, Entfet- 6c ten und wäßrigem Extrahieren des zerkleinerten Gewebes sowie Ausfällung des Enzyms aus dem wäßrigen Extrakt durch Aceton und Trocknen der Fällung, dadurch gekennzeichnet, daß man das zerkleinerte Pankreasgewebe mit einer Mischung aus 9 Volumenteilen Chloroform und 1 Volumenteil Butanol behandelt, dann das so partiell entfettete zerkleinerte Gewcbemateriai bei 0 bis 4° C 24 bis 96 Stunden lang stehen läßt, anschließend mit Aceton entfettet und entwässert, worauf man mit 5%iger wäßriger Äthanollösung extrahiert und aus dem Extrakt das trockene Enzympräparat gewinnt

Nach der Autolyse wird das schon weitgehend entfettete Gewebematerial noch zweimal mit Aceton durchgerührt und das Lösungsmittel dann jeweils abgetrennt Zur Isolierung des üpasereichen Enzymmaterials wird dann das trockene Gewebepulver wiederholt mit einer Wasser-Äthanol-Mischung {Volumenverhältnis 95 :5) gerührt, die vom Gewebe abgetrennten Lösungen vereinigt und durch Zugabe von Aceton und anschließendem Zentrifugieren der entstandenen Suspension die Fällung abgetrennt die dann mit Aceton behandelt und anschließend im Vakuum getrocknet wird Das erhaltene Präparat ist ein feines grauweißes Pulver mit hoher Lipaseaktivität

Beispiel 1

5,0 kg tiefgekühltes Schweinepankreas werden nach dem Auftauen vom anhaftenden Fett befreit, grob zerkleinert und mit 51 einer Mischung von Chloroform-Butanol 9:1 in einem Mixgerät oder Fleischwolf homogenisiert Der entstandene Organbrei wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt, die chloroformhaltige flüssige Phase abdekantiert und dann der Rückstand noch zweimal mit je 51 Chloroform-Butanol 9 :1 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und jedesmal das Lösungsmittel abdekantiert Der noch feuchte Rückstand wird dann 48 Stunden bei 0 bis 4° C sich selbst überlassen. Anschließend wird das auf diese Weise weitgehend entfette Organ noch zweimal mit je 241 Aceton 15 Minuten ausgerührt und jedesmal die überstehende Lösung abdekantiert

Zur Extraktion der lipasereichen Fermente wird das völlig entfettete Material zweimal mit je 21 einer Mischung von Wasser-Äthanol 95 :5 jeweils 30 Minuten lang gerührt und anschließend die Lösung abfiltriert Die einzelnen Wasser-Äthanol-Extrakte werden vereinigt und zur Ausfällung der Pankreasfermente mit 51 Aceton 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt Nach dem Zentrifugieren wird der Niederschlag noch dreimal mit je 1,61 Aceton nachgewaschen, dann im Vakuum getrocknet und zerkleinert

Ausbeute: 450 g (9% bezogen auf Naßorgan) eines grauweißen Pulvers mit einer Lipase-Aktivität von 270 WE/g.

Beispiel 2

Tsbeüe2

2 kg gefriergetrocknetes zerkleinertes Schweinepaskreas werden dreimal 30 Minuten mit je 51 CMorofonn-Butanoi 9:1 unter Rühren extrahiert und jedesmal vom Lösungsmittel abdekantiert Dei feuchte Rückstand wird dann 60 Stunden bei Q bis 4° C sich selbst SbcäiasäcO. Zu/ Vcjvoüsiämiigung der Entfettung wird noch zweimal je 15 Minuten mit jeweils 2J51 Aceton gerührt und jedesmal vom Lösungsmittel abfiltriert

Zur Extraktion der Pankreasfermente wird der entfettete Organruckstand zweimal mit je 21 einer Mischung von Wasser-Äthanol 95 :5 30 Minuten unter Rühren behandelt, wobei jedesmal die Lösung vom Reckstand abfiltriert wird. Die vereinigten Wasser-Äthanol-Extrakte werden mit 51 Aceton 15 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt die ausgefallenen lipasereichen Fermente abzentrifugiert Der Niederschlag wird noch dreimal mit je 1,61 Aceton gewaschen, im Vakuum getrocknet und anschließend zerkleinert

Wie ein Vergleich des nach den Beispielen der britischen Patentschrift 13 28 202 hergestellten Pankreatins mit einem Produkt, hergestellt nach dem Verfahren Erfindung, zeigt, erhält man durch die erfindungsgemäße schonende Autolyse ohne Zusatz von Basen oder Säuren, nämlich durch einfaches Stehenlassen wenigstens 24 Stunden bei 0 bis 4° C und mit der modifizierten Aufarbeitungsmethode, ein Pankreatinpräparat mit einer wesentlichen wesentlich höherern Lipaseaktivität.

Pankreat-n-Präparat

Lipaseaktivität
in WE/g

hergestellt nach Beispiel 1 der

brit Patentschrift 1 28 202 95

hergestellt nach dem Verfahren
vorliegender Erfindung 240

Das hierbei die Temperatur, bei der die Autolyse abläuft, eine entscheidende Rolle spielt, geht aus der nachstehend aufgeführt«»?^ Tg^eUe deutlich hervor.

Tabelle 1
Aktivität

Dauer der Autolyse Autolyse bei Autolyse bei

in Stunden Zimmertemperatur 0 bis 4°C

0	100%	100%
24	97%	110%
48	52%	150%
96		140%

Produkt

Upase nach Upase nach
Wilktätter Lazo-Wasetn (in

Wilson-Einheiten)

4-NF-Produkt des
Handels

5/6-NF-Produkt des
■ο Handels

Erfindungsgemäß

hergestelltes

Produkt

45 E/g
56 E/g

2060 E/g
2450 E/g

239,6 E/g 8000 E/g

Die folgende Tabelle 2 zeigt die nach der Methode von Willstätter und Lazo-Wasem in Willstätter- bzw. Wilson-Einheiten bestimmten Lipaseaktivitäten von zwei Pankreatin-Präparaten des Handels im Vergleich zu den entstandenen Aktivitäten der lipasereichen Produkte, wie sie nach dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung erhalten werden.

Bei diesen Versuchen wurde die Lipaseaktivität nach Willstätter (Hoppe-Seylers 125 [1923] 193) modifiziert nach Vogel und Laeverenz (Hoppe-Seylers 234 [1935] 176) bestimmt, indem 2 bis 3 mg des Pankreas-Priparstes in 5 ml Wasser und 2 mi ΝΉ3-NHiO-Puffer vom pH 9,2 aufgeschäumt wurde, dann mit je 2 ml Eieralbuminlösung (2,4%ig), CaCb-Lösung (1.6%ig) und Natriumoleat-Lösung (l,6%ig) versetzt und zum Schluß 24 g Olivenöl zugefügt wurde. Der Ansatz wurde einige Sekunden kräftig geschüttelt und

2s anschließend 60 Minuten bei 30° C mit einem Magnetruhrer gut durchgemischt Hiernach wurde die Spaltung durch Zufügen von 100 ml Äthanol unterbrochen und nach Zusatz von 20 ml Äther und 12 Tropfen l%iger alkoholischer Thyrnolphthaleinlösung mit 0_r5 η alkohoü-

scher KOH bis ium oiauen Farbton titriert Von dem so ermittelten Laugenverbrauch wird der Verbrauch des Leerversuches, der gleichzeitig mit dem Hauptversuch angesetzt wird, mit dem Unterschied, daß das Olivenöl erst nach Zugabe von Alkohol und Äther, also kurz vor der Titration zugegeben wird, abgezogen. Aus dem so erhaltenen Wert Prozentspaltung gelangt man mit Hilfe einer empirisch aufgestellten Eichkurve zu den entsprechenden Ljpase-Einheiten, die durch Multiplikation mit dem Faktor

HKK)

mg Einwaage

Willstätter-Einheiten/g ergeben.
Bei der Bestimmung der Lipase EA. Lazo-Was e m (J. of Pharm. Sciences 50[1961]999) wird Olivenöl bc: 27° C and einem pH-Wert von 7,8 unter Zufügen von Rindergalle 30 Minuten mit dem Enzympräparat behandelt Nach dem Ansäuern werden die abgespaltenen Fettsäuren mit Benzol extrahiert und mit Phenol-

so phthalein als Indikator titriert

Es zeigt sich, daß nach beiden Bestimmungsmethoden die Lipaseaktivitäten der erfindungsgemäß erhaltenen Pankreatine weit über den Werten der im Handel befindlichen Produkte liegen. Stabilitätsuntersuchungen

ss haben gezeigt, daß die hohen Lipaseaktivitäten, die den neuen Enzympräparaten dieser Erfindung zugrunde liegen, bei einer Lagerung bei Zimmertemperatur über

mehrere Monate praktisch keine Änderung zeigen.

Von besonderer Bedeutung ist auch die Tatsache, daß

die neuen Pankreationpräparate dieser Anmeldung nicht nur an üpolytischen Enzymen stark angereichert sind, sondern - wenn auch im geringerem Maße — eine Zunahme an Protease- und Amylase-Aktivität gegenüber der üblichen Pankreationen des Handels aufweisen. In der nachfolgenden Tabelle 3 sind die Protease-, Amylase- und Esterase-Aktivitäten der erfindungsgemäß hergestellten Pankreatine noch einmal gegenübergestellt einem handelsüblichen 5/6-NF-Produkt

Tabelle

Produkt

5/6-NF-Produkt des Handels

Erfindungsgemäß herge^lltes Präparat

Protease nach N. Hennrich.F.LB J. Mond Phinn. 1968. 3. S. 337 bis

Amyiase nach N. Hennricb, F.I.B

(Hydrolyse lösL Stärke

bei dH 6.8} I Mn™! Phann

3. a 337 bis 354

IE*)

1,57 - 2,1 ii E 11 FIB-E/mg

12-13 FIB-E/mg

Fsterase nach EA. Lazo-Wasem und J. M e 1 c e r et al. US-Paten; 3168448 {Substrat Tnacc::n)

1500 Wilson-E/g

4800 bis

. 6000 Wilson-E/g

) Wälkfirfeeiif Festlegung: entspricht 5,0* μΜοΙ Äquivalente freigesetzes Tyrosin durch 8Oy Pankreatiis beim pH 7^.

Es ist ersichtlich, daß durch das erfindungügemäße Verfahren speziell die Lipaseaktivität angereichert worden ist

Claims

Patentansprüche:

L Verfahren zur Herstellung eines lipasereichen Enzympräparates durch Zerkleinern von Pankreas- > gewebe, Autolysieren, Entfetten und wäßrigem Extrahieren des zerkleinern Gewehss sowie Ausfällung des Enzyms aus dem wäßrigen Extrakt durch Aceton und Trocknen der Fällung, dadurch gekennzeichnet, daß man das zerkleinerte Pankreasgewebe mit einer Mischung aus 9 Volumenteilen Chloroform und 1 Volumenteii Butanol behandelt, dann das so partiell entfettete zerkleinerte Gewebematerial bei 0 bis 4° C 24 bis 96 Stunden lang stehen läßt, anschließend mit Aceton entfettet und entwässert worauf man mit 5%iger wäßriger Äthanollösung extrahiert und aus dem Extrakt das trockene Enzympräparat gewinnt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das partiell entfettete Gewebe 48 Stunden lang stehen läßt