DE2407899B2 - Fluoreszenzmarkierung eines eine primaere aminogruppe enthaltenden materials - Google Patents

Fluoreszenzmarkierung eines eine primaere aminogruppe enthaltenden materials

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DE2407899B2 DE19742407899 DE2407899A DE2407899B2 DE 2407899 B2 DE2407899 B2 DE 2407899B2 DE 19742407899 DE19742407899 DE 19742407899 DE 2407899 A DE2407899 A DE 2407899A DE 2407899 B2 DE2407899 B2 DE 2407899B2
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F. Hoff mann-La Roche & Co AG, Basel (Schweiz)
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Description

O >= O
R2 OR1
worin
Ri ein niederer Alkyl- oder Phenyl-iuederer-alkylrest isi.
Ri ein Phenyl- oder substituierter Phenylresi ist und Ri ein substituierter oder nichtsubstituierter Phenyl-. Naphthyl- oder Indolylrest ist.
in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 8.0 und 10,5 behandelt wird, wobei »niederer Alkylresl« einen einwertigen, gesättigten, geradkeitigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffsubsiitucnten, der bis zu einschließlich 8 Kohlensioffaioine besitzt, »Phenyl-niederer-alkylrest« einen der oben delinierten niederen Alkylreste. der an einem Phenylrest gebunden ist. »substituiert«, wie er in Verbindung mit dem Phenyl-, Naphthyi- oder Indolylrest verwendet wird, diese Gruppen, wenn sie mit einem oder mehreren der folgenden Subsiituenten substituiert sind: Fhor, Chlor, Brom oder |od, niederes Alkyl, Trifluormethyl, niederes Alkoxy. Nitro und Cyano, und »niederes Alkoxy« einen Rest, der einen niederen Alkylresl. gebunden an einen Äthersauerstoff. aufweist und dessen Valenzbindung von dem Äthersauerstoff abstammt, bedeuten.
2. Verfahren nach Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung bei einem pH-Wert zwischen 9.0 und 9,5 durchgeführt wird.
J. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindung der Formel I 2-Melho\y-2.4-diphenyl-3(2 H)-furanon verwendet wird.
Die rasche Identifizierung von Mikroorganismen und anderen pathogenen Antigenen mit Hilfe von fluoreszierenden Antikörpern ist ein äußerst wichtiges Beispiel für die diagnostische Verwendbarkeit von fluorophoren Proteinkonjugalen. Vorhandene Arbeitsweisen zur Fluoreszenzmarkierung von Proleinen, z. B. Markierung mit Fluresceinisothionai (FlTC) sind auf Fluorophore mit reaktionsfähigen Funktionsgruppen angewiesen, welche sich kovaleni an Proteine binden. Diese Methode isi jedoch von schweren Nachteilen belastet, welche hauptsächlich aus der Nolwendigkeit einer ausgedehnten Reinigung herrühren, um irgendwelches überschüssiges Reagens zu entfernen, welches sonst bei immunologischen Prüfungen in nichtspezifischer Weise stören würde.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung eines eine primäre Aminogrup
>=o
R1 OR,
worin
Ri ein niederer AIk)I- oder Phen\l-niederer-alkylresi ist,
Rj ein PIiCIi)I- oder substituierter Pheii) liest ist und
R1 ein substituierter oder nichtsubstituierier Phenyl-, Naphlhyl- oder lndolylresi ist.
in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert /wischen 8.0 und 10.5 behandeil wird, wobei »niederer Alkylresl« einen einwertigen, gesättigten, gcradketiigen oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffsubstituenten. der bis zu einschließlich 8 Kohlenstoffatomen besitzt. »Phenyl-niederer-alkylrest« einen der oben definierten niederen Alkylresie. der an einem Phenylrest gebunden ist. »substituier!«, wie er in Verbindung mit dem Phenyl-, Naphthyl- oder Indolylrest verwendet wird, diese Gruppen, wenn sie mit einem oder mehreren der folgendeii Substiluenten substituiert sind: Fluor, Chlor. Brom oder )od. niederes Alkyl. Trifluormethyl.
jo niederes Alkoxy. Nitro und Cyano, und »niederes Alkoxy« einen Rest, der einen niederen Alkylrcst gebunden an einen Äthersauerstoff aufweist und dessen Valenzbindung von dem Äthersauerstoff abstammt, bedeuten.
j-, Vorzugsweise wird als Verbindung der Formel I 2-Methoxy-2.4-dipheii)1-3(2 H)-furanon verwendet und außerdem die Behandlung bei einem pH-Wert zwischen 9.0 und 9,5 durchgeführt.
2-Melhoxy-2.4-diphenyl-3-(2 H)-I'uranon wird in the
«ι journal of the American Chemical Society. Band 94 (1972), 5927-29 mit der Angabe publiziert, daß es in nichtwäßrigen Lösungen mit primären Aminen zu fluoreszierenden Pyrolinonen führt. In dieser Literatursteile wird weiter darauf hingewiesen, daß 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3-(2 H)-furanon nicht in wäßrigem Medium verwendet werden kann und sich daher nicht für diagnostische Zwecke eignet.
Gemäß der Erfindung wurde jedoch festgestellt, daß diese bekannte Verbindung sich trotzdem für diagnostisehe Zwecke und insbesondere zur Fluoreszenzmarkierung von primären Aminen in wäßrigem Medium besonders eignet und die dafür notwendigen Bedingungen herausgefunden.
Die Verbindungen der Formel I sind selbst nicht fluoreszierend, können jedoch mit primäre Aminogruppen enthaltenden Materialien unter Bildung von fluoreszierenden Verbindungen (Konjugaten) reagieren, wodurch eine mühselige Reinigung vermieden wird. Der Ausdruck »niederer Alkylresl« bedeutet beispielsweise den Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, n-Butyl-, Hcxyl-, Octyl-, Isopropyl-, tert.-Butylrest. Der Ausdruck »Phenyl-nicderer-alkylre.si« bezeichnet z. B. den Benzyl-, Phenyläthyl-, Phcnylpropylrest. Beispiele niederer Alkoxyreste sind der Methoxy-, Äthoxy-, n-Propoxy-, n-Butoxy-, Isopropoxy-, tert.-Butoxyrest.
Sehr gut eignen sich Verbindungen der Formel I, in denen der Rest Ri ein niederer Alkylrest und beide Reste R 2 und R1 Phcnylreste sind. Eine bevorzugie
Verbindung der Formel I isi die Verbindung, in der Ri der Methylrest und R.> und Ri Phenylresie sind. d.h. 2-Mcthoxy-2.4-diphenyl-3(2 H)-fiirunon.
Die Herstellung der Verbindungen der Formel I wird im folgenden näher beschrieben.
Verbindungen der Formel I können über eine vielslufige .Synthesefolge hergestellt werden, welche von leicht zugänglichen Ausgangsmatcrialien der folgenden Formel ausgeht:
anteil des Alkalimetallalkoxides auf. Die Öffnungsreaklion wird zwischen etwa 40'C und etwa 1000C. insbesondere beim Siedepunkt des Reaktionsmediums, durchgeführt.
In der nächsten Stufe wird das Diketon der Formel IV zu einem Enamin der folgenden Formel umgewandelt:
R-,
(H)
worin Rj und R1 dir oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Verbindungen der Formel II. in denen Rj und Ri Phenyl oder substituiertes Phenyl sind, «erden im allgemeinen als Benzalacetophenone oder substituierte Benzalacetophenone bezeichnet.
In der ersten Stufe wird das Ausgangsmaterial der Formel Il unter basischen Bedingungen unter Lieferung eines Epoxykctons der folgenden Formel:
O R,
worin Rj und Rj die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, epoxidiert.
Die Epoxidationsreaktion wird durch Behandlung einer Verbindung der Formel Il mit einem Überschuß von Wasserstoffperoxid in Anwesenheit einer starken Base durchgeführt. Geeignete starke Basen für diese Reaktion umfassen Alkalimetallhydroxide, z. B. Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, sowie Alkalimetallcarbonate, z. B. Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat. Geeignete Lösungsmittel für die Epoxidationsreaktion sind Alkohole, insbesondere Methanol und Äthanol, sowie wäßrige Alkoholgemische. Die Reaktion wird bei Temperaturen von etwa 10"C bis etwa 400C, insbesondere von etwa 201C bis etwa 30"C durchgeführt.
In der nächsten Stufe wird die Verbindung der Formel III mit einer starken, wasserfreien Base behandelt, um den Epoxidring zu öffnen und ein Diketon der folgenden Formel:
(IV)
worin Rj und Rj die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, zu liefern.
Geeignete starke, wasserfreie Basen für diese Öffnungsreaktion umfassen Alkalimetallalkoxide wie Natriummethoxid, Natriumäthoxid, Natriumisopropoxid, Kalium-iert.-butoxid usw. Als geeignete Lösungsmittel für die Öffnungsreaktion können wasserfreie Alkohole, z. B. Methanol, Äthanol, Isopropanol und tert.-Bulanol genannt werden. Im allgemeinen wird die Verwendung desselben Alkohols, von welchem die Alkoxidbase abstammt, eingesetzt. Jedoch ist dies nicht wesentlich, und falls ein hiervon verschiedener Alkohol als Lösungsmittel verwendet wird, tritt ein Austausch zwischen dem Alkohollösungsmittel und dem Alkoholworin Ri und Ri die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und R4 und R^, falls sie unabhängig voneinander sind, jeweils niedere Alkylreste sind, und falls sie zusammenhängen, mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6gliedrigen, heterocyclischen Ring bilden, welcher höchstens ein susälzliches Heteroatom aus der aus Stickstoff und Sauerstoff bestehenden Gruppe enthält.
Bei dieser Reaktion wird das Diketon der Formel IV mit einem Aminomclhenylierungsmittel zur Bildung des Enamins umgesetzt.
Geeignete Aminomethenylierungsmittel umfassen (III) niedere Alkylacetale eines Ν,Ν-disubstituierten Form-
amids, z. B.
Dimethylformamiddimethylacetal,
Tris-(sec.-amino)-methane, z. B.
Tris-(dimeihylainino)-meihan und
Tris-(piperidi no)-methan, sowie
Bis-(see.-amino)-niedere-alkoxymethane. /. B.
Bis-(diiiiethylamino)-i-butoxymeihan.
Die Aminoeinheil
— n:
wie sie in der Strukturformel für die Verbindung V gezeigt ist. wird aus dem Aminometheiiylicrungsmiiiel eingeführt. Acetale von N,N-disubstiluierten l'ormamiden besitzen die· allgemeine Formel:
-,o O O R4
C-N / \
Π l>_5
v,
worin Kh Lind R; jeweils ein niederer Alkylrest sind: Tris-(sec.-amino)-melhane besitzen die folgende allgemeinen Formel:
H—C--N
und Bis-(see.-amino)-niedere-alkoxymethane
die folgende allgemeinen Formel:
besitzen
C-N
worin Rt ein niederer Alkylrest ist.
Beispiele von Aminoeinheiten
— N
umfassen solche, in denen R4 und R-,. falls sie unabhängig voneinander sind, jeweils niedere Alkylreste sind. z. B. Dimethylamine) und Diälhylamino. und solche, in denen R.i und R-, zusammen mit dem Stickstoff einen 5- oder bgliedrigen. heterocyclischen Ring bilden. /.. B. den Piperidino-. Morpholino-, Pyrrolidino-, Pipcrn/.ino-. Imida/.olidino-. Pyrazolidinones! usw. Beispiele von niederen Alkoxycinheitcn OR1, und OR7 sind der Melhoxy-, Äthoxy-. Propoxy-, n-Butoxyrest usw. Bei: spiele von niederen Alkoxyeinheitcn OR« sind der Melhoxy-. Äthoxy-. tert.-Butoxyrest usw.
Diese Reaktion kann in einem beliebigen inerten, organischen Lösungsmittel durchgeführt werden. Gute Lösungsmittel sind Formamide, insbesondere Dimethylformamid. ΕΞιη Überschuß von Aminomcthenylierungsmiitcl kann ebenfalls als Lösungsmittel angewandt werden.
Die Herstellung des Enamins kann in einem Temperaturbereich von etwa 0c'C bis etwa IOOCC durchgeführt werden; ein Temperaturbereich von etwa IO"C bis etwa 40°C ist günstig.
In der nächsten Stufe wird das Enamin der Formel V in das I lydroxyfuranon der folgenden Formel:
>=O
(VI)
worin R2 und Ri die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, umgewandelt.
Diese Umwandlung schließt eine basische, wäßrige Hydrolyse ein. Geeignete Basen für cüese Hydrolyse umfassen Alkalimetallhydroxide, z. B. Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid, sowie Alkalimetallcarbonate, /.. B. Natriumcarbonat und Kaliumcarbonat. Geeignete Temperaturen zur Durchführung dieser Reaktion betragen von etwa O'C bis etwa 400C. Wenn die Hydrolyse abgeschlossen ist, wird die basische Lösung neutralisiert, um das Hydroxyfuranon der Formel Vl zu liefern.
Das Hydroxyfuranon der Formel Vl kann dann in das Furanon der Formel I durch Reaktion mit einem treeigncien Alkohol umgewandelt werden, d. h. einem Alkohol der Formel Ri OH, worin Ri die im Zusammenhang mit der obengenannten Formel I angegebene Bedeutung besitzt. Dieser Alkohol kann entweder ein niederes Alkanol oder ein Phenyl-niederes-alkanol sein. /. B. Methanol. Äthanol. Benzylalkohol, Pln-nylathylalkoholusu. Als Lösungsmittel für diese Reaktion können der Alkohol selbst oder ein Gemisch des Alkohols und eines inerten, organischen Lösungsmittels verwendet werden. Die Reaktion wird insbesondere bei einer Temperatur zwischen etwa 40 C und etwa 80 C ausgeführt.
Verbindungen der Formel I können ineinander umgewandelt werden, d. h. die A!ko:.ygruppe OR1 kann durch Reaktion der Verbindung der Formel I mit einem iü geeigneten, niederen Alkanol oder l'henyl-niederen-alkanol ausgewechselt werden. So kann beispielsweise die Verbindung der Formel i, worin Ri den Methylrest bedeutet, in die entsprechende Verbindung umgewandelt werden, in welcher Ri der Benzylrest ist. indem die erstgenannte Verbindung mit einem Überschuß von Benzylalkohol erhitzt wird.
Die Fliiorogenc der Formel I sind in Wasser relativ unlöslich und reagieren langsam mit Wasser unter Bildung von Zersctzungsprodukten. welche nicht fluoreszierend sind. Die Fluorogene der Formel I sind in organischen Lösungsmitteln leicht löslich, und sie sind in Lösungsmitteln wie Aceton und Diehlormethan besonders löslich. Da die Verbindungen nur eine geringe Wasserlöslichkeit aufweisen, werden sie. falls sie mit Materialien umgesetzt werden sollen, die in wäßrigen Medium entweder als Lösung oder als Suspension vorliegen, entweder als Lösung in einem organischen •Lösungsmittel, insbesondere einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel wie Aceton, zugesetzt, oder die Reaktion wird durchgeführt, wobei die Verbindung der Formel I auf einem festen Träger adsorbiert vorliegt. Diese letztgenannte Arbeitsweise der Adsorption auf einen festen Träger ist günstig, wenn das Fluorogen mit Materialien umgesetzt wird, die in jj dem wäßrigen Medium löslich sind, so daß alles nichuimgesetzte Fluorogen der Formel I. welches auf dem festen Träger adsorbiert ist, durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt werden kann. Geeignete feste Träger sind neutrale, inerte Materialien wie Diatomeenerde, Polysaccharide usw. Die Adsorption der Verbindung der Formel I auf dem festen Träger kann nach üblichen Methoden durchgeführt werden, z. B. durch Suspendieren des festen Trägers in einer die Verbindung der Formel 1 enthaltenden Lösung, z. B. einer Lösung in Aceton oder Methylenchlorid, und durch Verdampfen des Lösungsmittels aus dieser Suspension mit anschließendem gründlichen Trocknen mittels Luft oder Trocknen unter Vakuum. Günstig ist die Herstellung fester Träger, welche etwa von 0,1 bis etwa 5,0 Gew.-% der Verbindungen der Formel I, insbesondere von etwa 1 bis etwa 2 Gew.-% enthalten.
Fluorogene der Formel 1 reagieren mit primäre Aminogruppen enthaltenden Materialien unter Bildung von fluoreszierenden Produkten. Materialien, welche mit den Fluorogencn der Formel I umgesetzt werden können, umfassen also primäre Amine, Aminosäuren. Peptide, Proteine, insbesondere solche von biologischer Signifikanz wie Immunoglobuline (Antikörper), Virusarten, einzellige Organismen wie Bakterien, Protozoen, Algen und Pilze, sowie vielzellige Organismen, z. B. Würmer wie Bandwürmer. Die Wirkung der Umsetzung einer Verbindung der Formel I mit einem der zuvor genannten Materialien besteht darin, in diesem Material eine fluoreszierende Markierung einzuführen. Die b5 Einführung der fluoreszierenden Markierung erlaubt die rasche Identifizierung eines solchen Materials unter Verwendung von Fluoreszenz-Technologien, insbesondere der Fluoreszenzmikroskopie. Die Verwendung der
l'luoreszenzmarkieriiug ist besonders ;ιιιί dem Gebiet der Markierung von Proteinen wichtig, insbesondere für solche mit biologischer Wichtigkeit wie Antikörper, Fin llauptvorteil der erfindnngsgemäß eingesetzten Verbindungen liegt chirin. d;iß sie selbst nicht fkiores/ieren. jedoch bei Reaktion mit primäre Aminogruppen einhüllenden Materialien ein fluoreszierendes Material liefern. Darüber hinaus zersetzen sich die Verbindungen der Formel I bei Reaktion mit in dem Reaklionsmedmm enthaltenen Wasser in Materialien, welche ebenfalls nicht fluoreszierend sind. Auf diese Weise wird die Reinigung und Isolierung tier fluoreszierend markierten Materialien in starkem Ausmaß vereinfacht, da es nicht erforderlich ist. diese Materialien von irgendwelchen nicht umgesetzten, fkiorogenen Reagentien oder Zersetzungsprodukten hiervon abzutrennen, wie dies im Rill der vorbekannten Markienmgsarbeitsweisen wie mittels Fluoresceinisoihiocyanai der Rill ist.
Materialien, welche mit den Verbindungen der Formel I markiert werden können, sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt:
Tabelle I
I. Mikroorganismen
Bakterien
1. Gram-positive Kokken
Streptokokken (pyogene. fäcalis und
viridans)
Staphylokokken (mircus und albus)
Pncumokokken (D. pneumoniae)
2. Gram-negative Kokken
Neisscria (gonorrhoeae und meningilidis)
3. Gram-positive, aerobe Bazillen
Bacillus anthracis
Corynebactcrium diphtheriae
Frysipelothrix
l.istcria raonocytogenes
4. Gram-posiüve. anaerobe Bazillen
Closiridia (botulinum. pcrfringen:·,
welchii und tetani)
ϊ. Gram-negative, anaerobe Bazillen
Baclcroidcs
6. Gram-negative, intcstinale Bazillen
Escheriehia
Klcbsiclla
fjnerobacter
Proleus
l'seudomoniis
Salmonella
Shigclla
7. Gram-negative, nicht intcstinale Bazillen
Pasteurella (pestis und tularensis)
I iamophilus influenzae
Brucella (melitensis. abortus uiiil suis)
Bordetella pertussis
Malleomyccs
H. Spirot-heten
Ireponcma pallidum
l.eptospira
Borrelia
4. Mycoplasma
Mycobakleneii
11. Vibrio
12. Act I
Protozoen
Iniestinale Protozoen Amöben
Flagellates Trichomonas l.eishmania Trypanosomes Toxoplasma Sporozoen Plasmodia (vivax. lalciparum.
malariae und ovale) lines ti na Ie Neinatoden Madenwurm Hükenwurm Peitschenwurm
Gcwebcncmaiodcn Trichinen Fadenwurm (wuchereria bancroftii) Draeunculus Trematoden Schistosomes Intestinale Saugwürmer Ge webesaug würmer Cestoden Bandwürmer Toxoplasma (T. G ο η d i i)
Pilze
1.
2.
3.
4.
5.
b.
Sporotrichum Cryptococcus Blastomyccs Histoplasma Coccidioides
Candida
Viren und Rickettsien
1. Rickettsia
2. Viren
Hundehepatitis Shope papilloma Influenza A & B Hühnerpest Herpes simplex Adenoviren Polyoma Rous sarcoma Vaccinia Poliovirus Röteln
Hundestaupe Leukemia Mumps
Newcastle-Krankheit (Haushuhnkrankheit) Sendai
FCHO
Maul- und Klauenseuche Psittacosis Rabis
Fclromelia Arborviren
Fremde Antigene
Polysaccharide lyaluronidasc Tetanus-toxin
Eiovalbiiinin
Scha f se Mima lbu mi η Menschliches Plasma-gamma-globiilin Menschliches Scrum-albumin
III. Natürliche Antigene
1. Hormone
Pituitäre Hormone Insulin
Glucagon
Thyroid-Hormone Choriongonadotropin η Chorion-Wachstumshormon — Prolactin
2. Enzyme
Pancreas-chymotrypsinogen Procarboxypeptidase Deoxyribonuclease Ribonuclease Glyzerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase Catalase
3. Organspezifische Antigene Niere
Leber
Haut
Herz
Gastrointestinaler Trakt Prostata
Embryo-Antigene Tuiru.r-Antigene
4. Bindegewebekomponenten Muskel
Collagen
Amyloid
5. Blutzellenantigene, Blutgruppensubstanzen und andere Isoantigene Plättchen
Megakaryocyten Leucocyten
Erythrocyten Blutgruppensubstanzen Forssman-Antigen H istoverträglichkeits-Antigene
6. Plasmaproteine Fibrin und Fibrinoid Plasminogen und Plasmin
7. Pathologische Globuline Myeloma, makroglobulinaemische und dysglobulinaemische Proteine Rhcumatoidfaktor C-reaktionsfähiges Protein
IV. Natürliche Antikörper
1. Natürliches Gammaglobulin Natürliche Antikörper ncphrotoxischc Antikörper Komplement
2. Auto-Antikörper Anlinuclearcr Faktor Thyroidautoantikörper Adrcnalauloantikörper Autoantikörper für gasirisch-parietale Zellen bei perniziöser Anämie Anti-Dickdarm
Anti-Leber
Anti-Niere
Autoantikörper für Spermatozoon
Anti-Herz
Muskel-Aiitoaniikörper bei
Myastenia gravis
Autoantikörper für Nervengewebe
Autoantikörper gegen faserartiges Gewebe
und Vaskularkomponenten
Autoantikörper gegen Plättchen und
Mcgakaryocylcn
Antikörper gegen Trophoblasten
Induzierte Antikörper gegen: Inimunoglobulinklassen Igb, IgM, IgA oder unterschiedliche Spczien
Es wurde gefunden, daß die die Verbindungen de Formel I verwendende Reaktion zur Fluoreszenzmar kierung in starkem Maße von dem pH-Wert abhängij ist. Die Markierung tritt mit nennenswerter Geschwin digkeit zwischen pH-Werten von 8,0 und 10,5 auf. Eii optimaler pH-Wertbereich zur Durchführung de Markierung liegt zwischen pH = 9,0 und etwa 9,5. De pH-Wert kann durch übliche Arbeitsweisen zu Einstellung des pH-Wertes kontrolliert werden, ein schließlich der Verwendung von Puffern. Jedoch sollt( die Verwendung von Puffern, welche freie Aminogrup pen enthalten, vermieden werden.
Das Ausmaß der Markierung eines bestimmtet Substrates hängt sehr stark von der Konzentration de verwendeten Fluorogens und der Gesamtkontaktzci zwischen dem Fluorogcn und dem Substrat ab.
Das für irgendein bestimmtes Substrat und l'ü irgendeinen bestimmten Zweck gewünschte Markic rungsausmaß variiert natürlich von Fall zu Fall. E wurde gefunden, daß eine ausgedehnte Markierung fü die meisten Zwecke mit einer Kontaktzeit zwischci etwa 2 Minuten und 2 Stunden, insbesondere zwischet etwa 5 Minuten und 30 Minuten, erreicht werden kann.
Die Fluoreszcnzanregungs- und -emissionsspektrei der markierten Materialien variieren ebenfalls ii Abhängigkeit von der Art des Materials. Als Beispiel se ein typisches Fluoreszenzspektrum für eine mit eine Verbindung der Formel I markierten Gammaglobulin fraktion genannt, bei welchem zwei Anregungsmaxim; bei 290 und 390 nm und ein Emissionsmaximuni be 480 mn vorhanden sind.
Weiterhin wurde gefunden, daß das Markieren voi lebenden Substraten wie von Bakterien oder Bandwür mern mit Fluorogenen der Formel I, falls überhaupt, nu einen geringen Einfluß auf ihre Lebensfähigkeit bzw Entwicklungsfähigkeit besitzt. Daher liefert das erfin dungsgemäße Verfahren eine leistungsfähige Methodi zum Markieren lebender Organismen. Ferner wurdi gefunden, daß das Markieren von biologisch wichtige! Proteinen wie Antikörpern, falls überhaupt, nur einei geringen Einfluß auf ihre biologischen Eigenschaftei besitzt. Falls z. B. Antikörper gegen Pneumococcus Ty| Il gemäß der oben angegebenen Verfahrensweisi fluoreszierend markiert werden, bleibt der Antikörper titer in weitem Maße unbeeinflußt, und was nocl wichtiger ist, die Spezifität des Antikörpers bleib unverändert. In diesem Falle waren z. B. die Antikörpe immer noch spezifisch gegenüber Pneumococcus Typ I und vereinigten sich nicht mit Pneumococcus Typ I.
Ein weiteres Merkmal der markierten Materialien welche nach der oben angegebenen Arbeitsweisi
hergestellt wurden, liegt darin, daß sie für lange Zeitspannen, selbst bei Zimmertemperatur und in Anwesenheit von Licht, außergewöhnlich stabil sind. Daher tritt nur eine geringe Zerstörung der Fluoreszen/.markicrung, welche in eine Vielzahl von Substraten einschließlich sowohl lebender als auch nicht lebender Substrate eingeführt wurden, während so langer Zeitspannen wie einem Monat auf.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert:
Ii e i s ρ i e I 1
Bandwürmer von Mäusen (Hynienolepis nana) in 9 ml wäßrigem Puffer mit einem pi I-Wert von 9,5 wurden IO Minuten bei 22 bis 26"C durch Zugabe von I ml einer Acclonlösung (mit verschiedenen Konzentrationen) von 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2 H)-furanon gefärbt. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Waschen der Würmer in BME-Kulturmcdium (Eagle-Gmndmcdium) entfernt. Die Fluoreszenzintensität, welche mittels einer Skala von Niehianfärben (0) bis maximalem Anfärben (1.00) beurteilt wurde, wurde unter Verwendung eines Fluores/.enzmikroskops nach I h, 22 h und 8 Tagen nach dem Anfärben bestimmt. Diese Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt. Sowohl die Gesamtmorphologie als auch die Aktivität der Würmer schien durch den Anfärbungsvorgang unbeeinflußt geblieben zu sein.
Beispiel 3
Spezifisches Typ Il Kaninchen Antipneumokokken-Serum wurde in Puffer verdünnt, pH = 9,0, und 10 Minuten bei Zimmertemperatur mit Diatomeenerde umgesetzt, welche 1% oder 2% Gew./Gew. an 2-Methoxy-2,4-diphenyl-3(2 H)-furanon enthielt. Die Diatomeenerde wurde dann durch Filtrieren oder Zentrifugieren entfernt, und das markierte Serum wurde bei 4"C aufbewahrt. Die Salzlösungssuspension des Typs 11 der Pncumococcen wurde auf Mikroskopobjektträgern angeordnet. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Bakterien auf den Objektträgern mittels Wärme fixiert und mit markiertem Typ Il Antiserum 10 bis 30 Minuten bei Zimmertemperatur angefärbt. Überschüssiges Antiserum wurde durch Waschen der Objektträger mit Salzlösung entfernt, und die Fluoreszenz wurde bei direkter Ölimmersion bestimmt. Die Anfärbungsintensität wurde 10, 25 und 31 Tage nach dem Markieren gemessen, und sie wurde auf einer Skala eingestuft, die von Nichtanfärben (0) bis maximalem Anfärben (1,00) reichte. Die Ergebnisse sind im folgenden zusammengestellt:
Zeit nach dem Verdünnung des markierten Serums
Markieren 1 : 10 1 : 100
(Tage) Anfarbungsintensität
Konzentration Zeit
mg/ml 1 h
0,0 0,06
0,5 0,37
0,1 0,67
0,2 0,75
Zeit nach dem Anfärben
22 h
8 Tage
0,06
0,37
0,67
0,75
0,06
0,50
0,67
Beispiel 2
Escherichia coli wurde in 9 ml mit Borat gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 9,5 suspendiert, und 30 bis 60 Minuten bei Zimmertemperatur durch Zugabe von 1 ml einer Acetonlösung (verschiedener Konzentration) von 2 Methoxy-2,4-diphenyl-3(2 H)-furanon angefärbt. Überschüssiger Farbstoff wurde durch Zentrifugieren entfernt, die Bakterien wurden erneut in Salzlösung suspendiert, bei 4°C aufbewahrt und Proben wurden auf Fluoreszenz nach 24 Stunden, 8 Tagen und 16 Tagen nach dem Anfärben untersucht. Die Zeil-Lebensfähigkeit wurde 22 Stunden nach dem Anfärben nach einer standardmäßigen Plattenauszähltechnik abgeschätzt. Die Anfärbungsintensität wurde mittels einer Skala von Nichtanfärben (0) bis maximalem Anfärben (1,00) beurteilt. Die Ergebnisse sind im folgenden zusammengestellt:
Konzentration Zeil nach dem Anfärben Zellcnlebensmg/ml I Tag 8 lage 16 Tage llih|Skc"
0,00
0,67
1,00
1.00
0,00
0,67
0,87
1,00
0,00
0,67
0,87
0,87
7 · 10''
4,5 · 105
0,87
0,75
0,75
0,87
1,00
1,00
i5 Es konnte keine Fluoreszenz beobachtet werden, wenn der Pneumokokkcntyp I als Antigen verwendet wurde. Dies zeigt an, daß die immunologische Spczifiläl beibehalten wurde.
4(i Der Einfluß des Markierens auf den Antikörpcrtiter wurde mittels standardmäßiger, immunologischer Untersuchungen bestimmt. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt. Der Titer wird in Form ties reziproken Wortes der letzten Serumverdi'mnung ausgedrückt, welcher eine positive Reaktion ergibt.
Immunologischer Test
Titer
markiertes nicht
Serum markiertes
Serum
Quellungsreaktion
Latex-Objektträgeragglutination
Fluoreszenzmikroskop:
14 Tage nach dem
Markieren 31 Tage nach dem
Markieren
100
400
80
320-640
640-1280 0
400-800 0
Beispiel 4
50 mg gamma-Globulin (Pferd, >
in 500 ml eines 0,05-M-Puffers
98"/(i rein) wurden mit variierendem
pH-Wert
Relative Fluoreszenz
8,00
8,35
8,50
8,83
9,00
9,31
9,50
9,75
10,06
9,5 16 33 46 75 80,5 84 89
pH-Wert aufgelöst. 200 mg Diiitomeenerdc. welche 2% Gcw./Gcw. 2-Methoxy-2.4-dipheny 1-3(2 H)-furanon enthielten (hergestellt durch Behandlung von 10 g Dkitomcencrdc mit einer Lösung von 200 mg des Furanons in Aceton und Eindampfen bis zur Trockene) wurden hinzugesetzt. Nach 15 Minuten Behandlung in einem Magnctrührer bei Zimmertemperatur wurde das Gemisch durch einen feinen Trichter filtriert, das Filtrat wurde in Trockeneis-Aceton gefroren und in einer Gefriereinrichlung aufbewahrt. Nach dem Zentrifugieren wurde die Fluoreszenz gemessen. Die relative Fluoreszenz ist in (willkürlichen) Einheiten angegeben: 200 mg Diatomeenerde, welche 2 Gew./Gcw.-% 2-Meihoxy-2,4-diphenyl-3(2 H)-furanon enthielten, während 10 Minuten bei Zimmertemperatur markiert. Die Lösungen wurden unmittelbar auf einen pH-Wert von 7,00 mit 1 N-HCI neutralisiert, zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Die relative Fluoreszenz wurde in verschiedenen Zeitiniervallcn gemessen (Aktivierung = 390 mn. Emission = 484 mn), und ist im folgenden in (willkürlichen) Einheiten angegeben.
pH-Wert = 9.00
15
20
Identische Ergebnisse wurden erhalten, nachdem die Lösungen 3 Tage bei Zimmertemperatur stehcngclas- jo sen worden waren.
Beispiel 5
20 ml von l%igcn Lösungen von gamma-Globulin (Pferd, > 98%) in Puffer, entweder mil einem pH-Wert von 9,00 oder 9,50. wurden durch Behandlung mit
Tage nach dem Relative
Markieren Fluoreszenz
0 56,0
I 56,0
2 55,5
4 56,0
6 57.0
8 _
11 55,0
pH-Wert = 9,50
Tilge nach dem Relative
Markieren Fluoreszenz
2
4
6
8
11
89,5 89,0 88,0 88.0 89.0
86,0

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verführen /.ur Fhioieszenzmarkierung eines eine primäre Aminogruppe enthaltenden Materials, d a d u r e h g e k e η η /: e i c h η e t. daß dieses Material mil einer Verbindung der folgenden allgemeinen Formel
J'
pe enthaltenden Materials, welches dadurch gekennzeichnet ist. daß dieses Material mit einer Verbindung der folgendeii allgemeinen Formel
DE2407899A 1973-03-05 1974-02-19 Fluoreszenzmarkierung eines eine primäre Aminogruppe enthaltenden Materials Expired DE2407899C3 (de)

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