NO750485L - - Google Patents

Description

FREMGANGSMÅTE FOR FLUORESCENSMARKERING.

Nærværende oppfinnelse vedrorer en fremgangsmåte for fluorecens-merking av et materiale som inneholder en primær amino-gruppe,

og fremgangsmåten består i at man behandler nevnte materiale med en forbindelse med formelen

"hvor betyr lavere alkyl, fenyl-lavere-alkyl,

R2betyr fenyl eller substituert fenyl,og

R-, er substituert eller usubstituert fenyl, naftyl eller indolyl,

i et vandig medium ved en pH-verdi mellom ca. 8,0 og 10,5.

Nærværende oppfinnelse vedrorer også nye forbindelser som er omfattet av formel I og hvilke er anvendbare i ovennevnte fremgangsmåte. Disse forbindelser har formelen

hvor R'^ betyr lavere alkyl eller fenyl-lavere-alkyl,

R'2betyr fenyl eller substituert fenyl og

R'3betyr substituert eller usubstituert fenyl, naftyl eller indolyl under den forutsetning at når R'2og R'3begge betyr fenyl, så betyr R'^lavere alkyl med mer enn ett karbonatom eller fenyl-lavere-alkyl med mer enn 7 karbonatomer.

Den hurtige identifiseringen av mikroorganismer og andre pato-gene antigener ved hjelp av fluorescerende antistoffer er et meget viktig eksempel på den diagnostiske anvendelsen av fluoro-fore, konjugerte proteiner. Den kjente prosedyre for fluorescerende merking av proteiner, f.eks. merking med fluorescein-isotiocyanat (FITC) beror på fluoroforer med reaktiv funksjons-dyktighet, og som vil forbinde seg med proteiner ved hjelp av

kovalent binding. Denne metodikk er imidlertid beheftet med alvorlige ulemper, som hovedsakelig skyldes behovet for vidt-gående renhet, hvorved man fjerner ethvert overskudd av reagens som ellers vil kunne forstyrre immunoforsok på en ikke spesifikk måte.

i Man "har nå funnet at forbindelsene med formel I er ikke-fluorescerende, men at de reagerer med materialer som inneholder primære amino-grupper, for derved å resultere i fluorescerende konjugerte forbindelser, og hvorved man unngår tids-krevende rense-operasjoner.

I beskrivelsen og i kravene skal uttrykket "lavere alkyl" bety en monovalent, mettet, rettkjedet eller forgrenet hydrokarbon-substituent med opptil 8 karbonatomer. Eksempler på lavere alkyl-grupper er metyl, etyl, n-propyl, n-butyl, heksyl, oktyl, iso-propyl, tert.-butyl osv. Uttrykket "fenyl-lavere-alkyl" betyr en lavere alkylgruppe i likhet med den som er definert ovenfor, og som er festet til en fenyl-ring, f.eks. benzyl, fenyletyl, fenylpropyl osv. Utrrykket "substituert" i forbindelse med fenyl, naftyl eller indolyl betyr at disse gruppene er substituert med en eller flere av fSigende substituenter: halogen (dvs. fluor, klor, brom eller jod), lavere alkyl, tri fluormetyl, lavere alkoksy, nitro og cyano. Uttrykket "lavere alkoksy" betyr en gruppe med en lavere alkylrest som er bundet til et eteroksygen, og som har en valensbinding fra eteroksygenet. Eksempler på lavere alkoksy-grupper er metoksy, etoksy, n-propoksy, n-butoksy, isopropoksy, tert.-butoksy osv.

Foretrukkede forbindelser med formel I er de hvor Ri betyr lavere alkyl og både R2og R^betyr fenyl. En spesielt foretrukket forbindelse med formel I er forbindelsen hvor R^betyr metyl og R^og R^betyr fenyl, dvs. 2-metoksy-2,4-difenyl-

3 (2 H)furanon.

Forbindelser med formel II kan fremstilles ved hjelp av en flertrinns-syntese, hvorved man utgår fra lett tilgjengelige utgangsmaterialer med formel

hvor R'2og R'^har foran angitte betydning. 1 Forbindelser med formel III, hvor R'2og R'3betyr fenyl eller substiturrt fenyl, vil vanligvis være benzalacetofenoner eller substituerte benzalacetofenoner. I det forste trinnet epoksyderes utgangsmaterialet med formel III under alkaliske betingelser, og man får herved et epoksy-keton med formel

hvor R'2og R13 har oven angitte betydning. Epoksyderings-réaksjonen utfores ved å behandle en forbindelse med formel III med et overskudd av hydrogenperoksyd i nærvær av en sterk base. Egnede sterke baser ved nærværende reaksjon omfatter alkalimetallhydroksyder, f.eks. natriumhydroksyd og kaliumhydroksyd5og alkalimetallkarbonater, f.eks. natriumkarbonat og kaliumkarbonat. Egnede løsningsmidler for epoksy derings-réaksjonen er alkoholer, og da spesielt metanol og etanol, samt vandige alkohol-blandinger. Reaksjonen utfores vanligvis ved temperaturer fra ca. 10 til ca. 40°C, hvorved 20 til ca. 30°C er mest foretrukket. I det neste trinnet blir forbindelsen med formel IV behandlet med en sterk vannfri base for å spalte epoksyd-ringen og for å gi et diketon med formel

hvor R'2og R'3har oven angitte betydning. 'Egnede, sterke, vannfrie baser for denne spaltnings-reaksj onen omfatter alkalimetallalkoksyder, såsom natriummetoksyd, natriumetoksyd, natriumisopropoksyd, kalium-tert.-butoksyd osv. Som egnede losningsmidler for spaltnings-reaksjonen kan man nevne vannfrie alkoholer, f.eks. metanol, etanol, isopropanol og tert.-butanol. Man foretrekker vanligvis å anvende den samme alkohol som alkoksyd-basen er avledet fra, men dette er imidlertid ikke kritisk, og hvis en annen alkohol anvendes som løsningsmiddel vil det være en utveksling mellom alkohol-losningsmidlet og alkohol-andelen i alkalimetallalkoksydet. Spaltnings-reaksjonen utfores vanligvis ved hoyere temperatur, fortrinnsvis mellom ca. 40 og ca. 100°C, hvorved kokepunktet til reaksjonsmediet er mest foretrukket. I neste trinn blir diketon med formel V omdannet til et enamin med formel

hvor R<1>2og R'^ har oven angitte betydning, og R^og R,-, uavhengig av hverandre, hver betyr lavere alkyl, og hvor de sammen med nitrogenatomet danner en 5- eller 6-leddet, heterocyklisk ring, som i de fleste tilfeller oppviser ett ytterligere heteroatom utvalgt fra gruppen som består av

nitrogen og oksygen.

I denne reaksjon reagerer diketonet med formel V med et amino-metenyleringsmiddel for å gi enaminet.

Egnede amino-metylerings-midler omfatter lavere alkyl-acetaler av et N,N-disubstituert formamid, f.eks. dimetylformamid-dimetylacetal5tris(sekundært amino)metaner, f.eks. tris(dimetyl-amino)metan og tris(piperidino)metan^og bis(sekundært amino) lavere alkoksymetaner, f.eks. bis(dimetylamino)t-butoksymetan.

Amino-delen

som er vist i strukturformelen for forbindelse VI, er innfort fra aminometenyleringsmidlet. Acetaler av N,N-disubstituerte formamider har den generelle formelen hvor Rg og R^hver betyr lavere alkyl$ tris(sekundært amino)metaner har den generelle formelen og bis(sekundært amino)lavere alkoksymetaner har den generelle formelen hvor RQbetyr lavere alkyl. Eksempler på amino-deler

omfatter de hvor R^og R,.

hver, uavhengig av hverandre,betyr lavere alkyl, f.eks. dimetyl-amino og dietylamino, og de hvor R^og R^sammen med nitrogenet danner en 5- eller 6-leddet, heterocyklisk ring, f.eks. piperidino, morfolino, pyrrolidino, piperazino, imidazolino, pyrazolidino osv. Eksempler på lavere alkoksy-deler OR^og OR^er metoksy, etoksy, propoksy, n-butoksy osv. Eksempler på lavere alkoksy-deler ORg er metoksy, etoksy, tert.-butoksy osv.

Denne reaksjon kan utfores i et inert organisk løsningsmiddel.

iForetrukkede løsningsmidler omfatter formamider, og sa spesielt dimetylformamid. Et overskudd av aminometenylerings-middel kan også anvendes som løsningsmiddel.

Fremstillingen av enaminet kan utfores i et temperaturområde fra ca. 0 til ca. 100°C, hvorved et temperaturområde fra ca. 10 til ca. 40°C foretrekkes. Spesielt foretrekkes romtemperatur. I det neste trinnet omdannes enaminet med formel VI til hydrok-sy-furanon med formel

hvor R'^og R'3har foran angitte betydning. Denne omdannelse omfatter en basisk, vandig hydrolyse. Egnede baser for denne hydrolyse omfatter alkalimetallhydroksyder f.eks. natriumhydroksyd og kaliumhydroksyd5og alkalimetallkarbonater, f.eks. natriumkarbonat og kaliumkarbonat. Egnede temperaturer for utforelse av ovenstående reaksjon er fra ca.

0 til ca. 40°C, hvorved romtemperatur er den mest foretrukkede. Etter hydrolysen er fullfort blir den alkaliske løsningen nøy-tralisert, og herved får man hydroksyfuranon med formel VII. Forbindelser med formel VI og VII, hvor R'^°9R<l>3ikke begge betyr fenyl, er nye.

Hydroksyfuranonet med formel VII kan deretter omdannes til furanon med formel II ved reaksjon med den egnede alkohol, dvs. en alkohol med formel R'^0H, hvor R<1>^har samme betydning som angitt i forbindelsen med ovenstående formel II. Denne alkohol kan enten være en lavere alkanol eller fenyl-lavere-alkanol, såsom metanol, etanol, benzylalkohol, fenyletylalkohol osv. Som løsningsmidler for denne reaksjon kan man anvende alkoholen selv eller en blanding av alkoholen og et inert organisk løs-ningsmiddel. Mest foretrukket er det å utfore reaksjonen i den i onskede alkoholen. Reaksjonen kan hensiktsmessig utfores ved temperaturer fra ca. romtemperatur til ca. losningsmidlets

kokepunkt. Mest foretrukket er det å utfore reaksjonen ved en temperatur mellom ca. 40 og ca. 80 oC.

Forbindelser med formel I kan omdannes ("interconverted") ,

dvs. alkoksy-gruppen OR^kan byttes ved reaksjon av forbindelsen med formel I med en egnet lavere alkanol eller fenyl-lavere-alkanol. Således kan f.eks. forbindelsen med formel I, hvor R^ betyr metyl, omdannes til den tilsvarende forbindelse hvor R^ betyr benzyl ved oppvarming av den førstnevnte forbindelse med et overskudd av benzylalkohol.

"Fluorogenene" (fluorescensfremkallende stoffer) med formel I er relativt uloselige i vann og reagerer langsomt med vann under dannelse av dekomponerings-produkter som er ikke-fluorescerende. Fluorogenene med formel I er lett loselige i organiske løs-ningsmidler, og er spesielt loselige i løsningsmidler, såsom aceton og diklormetan. Da forbindelsene har lav vann-loselighet, og det er ønskelig å la disse reagere med materialer som forekommer i vandige media enten i form av en lbsning eller en suspensjon, så foretrekkes det å tilsette de nevnte forbindelser enten som en losning i et organisk løsningsmiddel, og da fortrinnsvis i et med vann blandbart organisk løsningsmiddel, såsom aceton, eller å utfore reaksjonen ved å ha forbindelsen med formel I adsorbert på et fast underlag. Denne sistnevnte teknikk med adsorpsjon på et fast underlag er spesielt foretrukket når fluorogen reagerer med materialer som er loselige i det vandige mediet, slik at eventuelt ureagert fluorogen med formel I, som er adsorbert på det faste underlaget,- kan fjernes ved

filtrering eller sentrif ugering. Egnede faste underlag omfatter nøytrale, inerte materialer, såsom diatoméjord, polysakkarider osv. Et spesielt foretrukket, fast underlag er diatoméjord. Adsorpsjon av forbindelsen med formel I på det faste underlaget kan fortrinnsvis utfores ved hjelp av i og for seg kjente metoder, f.eks. ved å suspendere det faste underlaget i en losning som inneholder forbindelsen med formel I, f.eks. losning i aceton eller metylenklorid, og fordampning av los-ningsmidlet fra nevnte suspensjon, etterfulgt av omhyggelig

! lufttSrking eller tSrking i vakuum. Det er meget fordelaktig

å fremstille de faste underlagene med innhold på fra ca. 0,1

til ca. 5,0 vekts-% forbindelser ..med formel I, og aller helst med 1 til ca. 2 vekts-%.'

Fluorogener med formel I reagerer med primæraminholdige materialer under dannelse av fluorescerende produkter. Materialtypene som får reagere med fluorogenene med formel I omfatter primære aminer, aminosyrer, peptider, proteiner, og da spesielt de med biologisk karakteristikk, såsom immunoglobuliner (antistoffer), viruser, en-cellede organismer, såsom bakterier, protozoa, alger og sopper samt flercellede organismer som f.eks. helminter,

såsom bendelormer. Effekten av reaksjonen av en forbindelse med formel I med ett av de forannevnte materialer er innfSringen av et fluorescerende merke i nevnte materialer. Innforingen av det fluorescerende merke tillater hurtig identifisering av et slikt materiale ved anvendelse av fluorescens-teknologi og da spesielt fluorescens-mikroskopi. Anvendelsen av fluorescerende merking er. spesielt viktig når det gjelder merking av proteiner, og da spesielt slike med biologisk betydning, som f.eks. antistoffer. En vesentlig fordel med forbindelsene ifSlge nærværende oppfinnelse er at de i seg selv ikke er fluorescerende, men at de etter reaksjon med materialer, som inneholder primære amino-grupper, fremstiller fluorescerende materiale. Videre etter reaksjone med vann, som forekommer i reaksjonsmediet,

vil forbindelsene med formel I dekomponere til materialer som også er ikke-fluorescerende. Således blir rensing og isolering av fluorescens-merkede materialer betydelig forenklet, da det ikke er nSdvendig å separere disse materialer fra eventuelle ureagerte fluorogenholdige reagenser eller fra dekomponerings-produkter av disse, og som er tilfellet når det gjelder tidligere merkingsteknikk, såsom fluorescein-isotio-cyanat.

Foretrukkede materialer som kan merkes med forbindelsene med formel I er angitt i den fSigende tabell I:

Tabell I

■ ■ - ■ v

I. Mikroorganismer

Bacteria

1. Gram-positive cocci

Streptococci (pyogenes, fecalis og viridans) Staphylococci (aureus og albus) Pneumococci (D. pneumoniae)

2. Gram-negative cocci

Neisseria (gonorrhoeae og meningitidis)

3. Gram-positive aerobe bacilli

Bacillus anthracis

Corynebacterium diphtheriae Erysipelothrix

Listeria monocytogenes

4. Gram-positive anaerobe bacilli

Clostridia (botulinum, perfringens, welchii og tetani) 5. Gram—negative anaerobe bacilli Bacteroides 6. Gram-negative intestinal bacilli Escherichia

Klebsiella

Enterobacter

Proteus

Pseudomonas

Salmonella

Shigella

7. Gram—negative nonintestinal bacilli Pasteurella (pestis og tularensis) Hemophilus influenzae

Brucella (melitensis, abortus og suis) Bordetella pertussis

Malleomyces

8. Spirochetes Treponema pallidum Leptospira Borrelia

9. Mycoplasma

10. Mycobacteria

11. Vibrio

12. Actinorayces Protozoa 1. Intestinal Protozoa Amebae 2. Flagellater Trichomonas Leishmania Trypanosomes Toxoplasma

3. Sporozoa

Plasmodia (vivax, falciparum, malariae og ovale)

4. Intestinal nematodes Barneormer Hakeormer Piskeormer 5. Ve v—nema t ode r Trichinella Filaria (Wuchereria bancroftii) Dracunculus 6. Trematoder Schistosomer Intestinale ikter

Vev-ikter

7. Cestoder Bendelormer 8. Toxoplasma (T. gondii)

Sopp

1. Sporotrichum

2. Cryptococcus

3. Blastomyces

4. Histoplasma

5. Coccidioider

6. Candida Viruser og Richettsia

1. Richettsia

2. Viruser Hund-hepatitis Shope papilloma Influenza A & B Honsepest

Herpes simplex Adenoviruser Polyoma

Rous sarcoma Vaccinia MeslingerValpesyke Leukemia

Kusma Newcastle-syke

Sendai

"ECHO"

Munn- og klov-syke Psittacosis

Rabies

Ectromelia

Tre-viruser

II. Fremmede antigener Polysakkarider Hyaluronidase

Tetanus toxin Egg-ovalbumin Serum-albumin fra sau Human plasma-y-globulin Human serum-albumin

III. Naturlige antigener 1. Hormoner

Pi tui tari a-hormoner Insulin

Glucagon

Thyroid hormon

Chorionisk gonadotrophin Chorionisk vekst-hormon - prolactin

2. Enzymer

Pankreatisk chymotrypsinogen Prokarboksypeptidase Deoksyribonuklease "Ribonuklease Glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase Catalase

3. Organ-spesifikke antigener Nyre

Lever

Hud

Hjerte Gastrointestinal tractus

Prostata

Embryoniske antigener

Tumor-antigener.

4. Bindevevs-komponenter

Muskel

Kollagen

Amyloid

5. Bl°^cellez5ntigeneri_blodgruppe-stoffer_og_andre isoantigener

Blodplater

Megakaryocytter

Leucocytter

Erythrocytter

Blod-gruppe-substanser

Forssman antigen

Histocompatible antigener

6. Plasma-proteiner

Fibrin og fibrinoid

Plasminogen og plasmin

7. Patologiske globuliner

Myeloma, makroglobulinaemiske og dysglobulinaemia-proteiner

RTieumatoid faktor

C-reaktivt protein

IV Naturlige antigener

1. Naturlig gamma-globulin

Naturlige antistoffer - nephrotoksiske antistoffer Complement

2. Auto-antistoffer

Antinukleær faktor

Thyrojde autoanti stoff er

Adrenale autoantistoffer Autoantistoffer til gastriske parietal-celler ved pernisios anemi

I

Anti-koli

Anti-lever

Anti-nyre

Autoantistoffer for spermatozoa

Anti-hjerte

Muskel-autoantistoffer ved myasthenia gravis Autoantistoffer for nervost vev

Autoantistoffer mot fiber-vev og vaskulære komponenter Autoantistoffer mot blodplater og megakaryocytter Antistoffer mot "trophoblasts"

3. Kunstig_f£emkalte_antistoffer_for: Immunoglobulin-klassene Igb, IgM, IgA av forskjellige arter.

Spesielt foretrukkede materialer som kan merkes med forbindelsene med formel I er Hymenolepis nana, Escherichia coli, antistoffer for pneumococcus type II og gammaglobulin.

Man har funnet at den fluorescerende merkings-reaksjonen, som anvender forbindelser med formel I, i hoy grad er avhengig av pH. Merkingen finner i betydelig utstrekning sted mellom pH-^verdier på ca. 8,0 og 10,5. Et optimalt pH-område for merkingen er mellom ca. 9,0 og ca. 9,5. pH kan reguleres ved hjelp av en i og for seg kjent teknikk, som også omfatter bruk av buffer. Bruken av buffer som inneholder primære amino-grupper bor unngås.

Graden av merking av et spesielt substrat vil variere avhengig av konsentrasjoner til fluorogenet som anvendes samt av kon-takten mellom fluorogenet og substratet.

Graden av den merkingen som er onsket for et spesielt substrat og et spesielt formål vil naturligvis variere fra gang til gang. Man har funnet at en tilstrekkelig merking for de fleste formål vil oppnås ved den kohtakttid som ligger mellom 2 min. og 2 timer, og da fortrinnsvis mellom ca. 5 min. og 30 min.

Fluorescens-eksiteringen og emisjons-spektra for de merkede'materialene vil også variere avhengig av typen materiale. Som et eksempel kan man nevne et typisk fluorescens-spektrum for en gamma-globulin-fraksjon som er merket med en forbindelse

med formel I, hvor man har to eksiterings-maksima ved 290 og 390 nm samt et emisjons-maksimum ved 480 nm.

Man har videre funnet at merkingen av levende substrater, såsom bakterier eller bendelormer med fluorogener med formel I har liten, hvis overhodet noen, effekt på deres levedyktighet. Således gir nærværende prosedyre en effektiv metode for merking av levende organismer. Man har også funnet at merking av biologisk viktige proteiner, såsom antistoffer, har liten, hvis overhodet noen, effekt på deres biologiske egenskaper. Hvis f.eks. antistoffer mot pneumococcus type II blir fluorescerende merket i henhold til ovennevnte teknikk, så vil antistoffet forbli stort sett upåvirket, og hva som er enda viktigere, anti-stoffets spesifikke egenskap forblir uforandret. I dette tilfellet forble f.eks. antistoffene spesifikke overfor pneumococcus type II, og de binder ikke pneumococcus type I.

Et ytterligere trekk ved de merkede materialene, som er fremstilt ifblge ovennevnte teknikk, er at de er uvanlig stabile

i lengre tidsperioder selv ved romtemperatur og i nærvær av. lys. Således får man en liten odeleggelse av fluorescens-merkingen, som er foretatt med forskjellige substrater inklusiv både levende og ikke-levende substrater i tidsperioder så lange som en måned.

Nærværende oppfinnelse vil bedre kunne forstås og vurderes ved hjelp av folgende eksempler.

i EKSEMPEL 1

Til en mekanisk omrort blanding av 83,2 g benzalacetofenon

(0,3 M), 100 ml metanol og 120 ml 15%'ig hydrogenperoksyd

ble det tilsatt 100 ml 2 N natriumhydroksydopplosning, mens man holdt temperaturen under 30° ved utvendig kjoling. Etter at tilsetningen var avsluttet fikk blandingen stå ved romtemperatur i 20 minutter. Det krystallinske presipitåtet ble filtrert fra, vasket med vann og omkrystallisert fra metanol. Det ble erholdt 59,6 g 1,3-difenyl-2,3-epoksy-l-propanon$

smp. 90°C.

EKSEMPEL 2

Til en kokende opplosning av 30 g 1,3-difenyl-2,3-epoksy-l-propanon i 500 ml etanol ble det hurtig tilsatt en varm opplosning av 30 g kalium-t-butoksyd i 500 ml etanol. Blandingen ble holdt kokende på et dampbad i 2 minutter. Den ble deretter fortynnet med 3 1 vann. Den vandige losningen ble mettet med karbon-dioksyd ved tilsetning av små stykker tbrris. Den resulterende emulsjonen ble ekstrahert med eter. Eterekstrak-tene ble fortynnet med benzen, tbrket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk. Den gjenværende morke oljen ble destillert i hoyvakuum for å gi 19,5 g 1, 3-difenyl-1,2-propandion; kp. 136 - 138°/0,1 mm.

EKSEMPEL 3

En opplosning av 44,8 g 1,3-difenyl-1,2-propandion i 90 ml N,N-dimetylformamid-dimetylacetal fikk stå ved romtemperatur -i 2 timer. Den ble deretter helt ill is/vann. Den vandige•blandingen ble ekstrahert tre ganger med eter. De forente ekstraktene ble vasket med vann, fortynnet med benzen, torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk. Den oljeaktige resten ble krystallisert fra eter/petroleter for å gi 40,2 g av det onskede produktet. Et andre utbytte på 3,1 g fikk man fra moderluten ved konsentrasjon og tilsetning av petroleter. Totalt fikk man 43,3 g l-dimetylamino-2,4-di-fenyl-l-buten-3,4-dion^smp. 108°C.

EKSEMPEL 4

Til en opplosning av 43,3 g l-dimetylamino-2,4-difenyl-l-buten- j3,4-dion i 500 ml etanol ble det tilsatt 500 ml 2%'ig vandig kalium<hy>dr.oksyd. Blandingen ble omrort ved romtemperatur i 2

timer. Den ble deretter fortynnet med 3 1 vann og surgjort med 10%'ig saltsyre. Det faste 2-hydroksy-2,4-difenyl-3(2 H)-furanon som ble utfelt, ble filtrert fra ved sugning. Filter-kaken ble vasket med vann og opplost (uten ytterligere rensning)

i 500 ml metanol. Den metanolholdige losningen ble tilbakelops-behandlet i 20 timer, deretter ukonsentrert på dampbad til ca.

350 ml. Krystallinsk produkt ble erholdt ved avkjoling. Dette ble ytterligere renset ved omkrystallisasjon to ganger fra metanol, og ga 2 5,5 g av det onskede materiale 5 smp. 93 - 95°C. Modervæskene ble forenet og inndampet. Resten ble gjenopplost

i kloroform og filtrert gjennom 200 g silikagel. Eluatet ble inndampet og resten ble omkrystallisert fra etanol, og ga 5,8 g ytterligere produkt- smp. 93 - 95°C. Totalt ble det erholdt 31,3 g 2-metoksy-2,4-difenyl-3 (2 H)-furanon, smp. 93 - 95°C.

EKSEMPEL 5

Ved å folge fremgangsmåtene fra eksemplene 1-4 ble de

folgende forbindelser, inklusiv respektive mellomprodukter, fremstilt.

2-etoksy-2,4-difenyl-3 (2 H)-furanon, smp. 87°C$

2-benzyloksy-2,4-difenyl-3(2 H)-furanon, smp. 140°C$2-metoksy-2-fenyl-4-(4-nitrofenyl)-3-(2 H)-furanon, smp. 115 - 117°C.

EKSEMPEL 6

Ved å folge fremgangsmåtene fra eksemplene 1-4 kan folgende forbindelser fremstilles: 2-metoksy-2-fenyl-4-(2-naftyl)-3(2 H)-furanon5

2-metoksy-2-(4-klorfenyl)-4-fenyl-3 (2H)-furanon$

2-etoksy-2- (2 ,4-dimetoksyf enyl)-4- (3-indolyl)-3 (2 H)-furanon-, 2-metoksy-2-fenyl-4(2-trifluormetylfenyl)-3(2 H)-furanon.

EKSEMPEL 7

Muse-bendelormer (Hymenolepis nana) i 9 ml vandig buffer,

pH 9,5, ble farget i 10 minutter ved 22 - 26°C ved tilsetning av 1 ml av en acetonopplosning (med forskjellige konsentrasjoner)

av 2-metoksy-2,4-difenyl-3 (2 H)-furanon. Overskudd av farge-

i stoff ble fjernet ved vasking av ormene i BME (ornens basal-medium) dyrknings-medium. Intensiteten av fluorescens, som ble bedbmt etter en tilnærmet skala, fra ingen (0) til maksimal farging (1,00), ble bestemt ved anvendelse av et amerikansk optisk fluorescens-mikroskop etter 1 time, 22 timer og 8 dager etter fargingen. Disse resultatene vises nedenfor. Både morfologi og aktivitet til ormene synes å forbli upåvirket ved fargeprosedyren.

EKSEMPEL 8

Escherichia coli ble suspendert i 9 ml borat-buffret saltlosning, pH 9,5, og ble farget i 30 - 60 minutter ved romtemperatur ved tilsetning av 1 ml av en aceton-opplosning (forskjellige konsentrasjoner) av 2-metoksy-2,4-difenyl-3-(2 H)-furanon. Overskudd av fargestoff ble fjernet ved sentrifugering, bakteriene ble resuspendert i saltlosning, lagret ved 4°C,

og provene ble undersokt med hensyn til fluorescens etter 24 timer, 8 dager og 16 dager etter fargingen. Cellenes levedyktighet ble bedbmt 22 timer etter fargingen ved hjelp av en standard-plate-telleteknikk. Farge-intensiteten ble bedbmt ved hjelp av en skjbnnsmessig skala, som strekker seg fra ingen farging (0) til maksimal farging (1,00). Resultatene vises nedenfor:

EKSEMPEL 9

Spesifikk type II kanin-antipneumococcal-serum ble fortynnet i buffer, pH 9,0, og fikk reagere i 10 minutter ved romtemperatur med celitt (diatoméjord) som inneholdt 1 eller 2 vekts-% 2-metoksy-2,4-difenyl-3(2 H)-furanon. Celitten ble deretter fjernet ved filtrering eller sentrifugering, og det merkede serum ble lagret ved 4°C. Salt-suspensjonen av type II pneumococci ble anbrakt på mikroskopiske objektglass. Bakteriene ble etter lufttorking fiksert til objektglassene ved oppvarming, og de ble farget med merket type II-antiserum i 10 - 30 minutter ved romtemperatur. Overskudd av anti-serum ble fjernet ved å vaske objektglassene med saltlosning, og fluorescensen ble bestemt under direkte olje-immersjon. Farge-intensiteten ble målt 10, 25 og 31 dager etter merkingen og ble bedbmt ved hjelp av en skjønnsmessig skala, som dekker om-rådet ingen farging (0) til maksimal farging (1,00). Resultatene vises nedenfor.

Ingen fluorescens kunne iakttas når type I-pneumococci ble

anvendt som antigen, og dette indikerte at den immunologiske spesifikkiteten var beholdt.

Effekt av merking av antistoff-titer ble bestemt ved standard-immunologiske prover. Resultatene vises nedenfor. Titer-lbsningen er uttrykt som den resiproke verdi av den siste serum- i fortynningen som gir en positiv reaksjon.

EKSEMPEL 10 '

50 mg y-globulin (hest, ^> 98% renhet) ble opplost i 500 ml 0,05 M buffer med forskjellig pH. 200 mg celitt, som inneholdt 2 vekts-% 2-metoksy-2,4-difenyl-3 (2 H)-furanon (fremstilt ved behandling av 10 g celitt med en opplosning av 200 mg furanon i aceton og fordampning til torrhet) ble tilsatt. Etter 15 minutters magnetisk roring ved romtemperatur ble blandingen filtrert gjennom en fin trakt, og filtratet ble frosset i torr-is-aceton og lagret i en fryser. Fluorescensen ble målt etter sentrifugering. Relativ fluorescens er angitt i skjbnnsmessige enheter.

Lignende resultater ble erholdt etter at losningen fikk stå 3 dager ved romtemperatur.

EKSEMPE1 11

20 ml av 1%'ige losninger av y-globulin (hest ^> 98%) i buffer

I (enten pH 9,00 eller 9,50) ble merket ved behandling med 200 mg celitt som inneholdt 2 vekts-% 2-metoksy-2,4-difenyl-3 (2 H)-furanon ved romtemperatur i 10 minutter. Losningene ble nøy-tralisert umiddelbart til pH 7,00 med 1 N HC1, sentrifugert og det som flyter ovenpå ble lagret ved romtemperatur. Relativ fluorescens ble målt (aktivering 390 nm, emmisjon 484 nm) ved forskjellige tidsintervaller, og bedomt etter skjSnnsmessige enheter.

Claims (19)

1. Fremgangsmåte for fluorescerende merking av materiale som inneholder en primær amino-gruppe, karakterisert ved at man behandler nevnte materialer med en forbindelse med formel

hvori betyr lavere alkyl eller fenyl-lavere-alkyl , R^ fenyl eller substituert fenyl og R^ substituert eller usubstituert fenyl, naftyl eller indolyl-, i et vandig medium ved en pH mellom ca. 8,0 og 10,5.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at pH er mellom 9,0 og 9,5.

3. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at materialet som merkes er et protein.

4. Fremgangsmåte ifolge krav 3, karakterisert ved at proteinet er et antistoff.

5. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at materialet. som merkes, er en encellet eller flercellet organisme.

6. Fremgangsmåte ifolge krav 4 eller 5, karakterisert ved at materialet som skal merkes er I Hymenolepis nana.

7. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at materialet som skal merkes er Escherischia coli.

8. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at materialet som skal merkes er et antistoff for pneumococcus type II.

9. Fremgangsmåte ifolge krav 1 eller 2, karakterisert ved at materialet som skal merkes er gammaglobulin.

10. Fremgangsmåte ifolge krav 1-9, karakterisert ved at forbindelsen med formel I blir adsorbert på et inert, fast underlag.

11. Fremgangsmåte ifolge krav 10, karakterisert ved at det faste underlaget er diatoméjord.

12. Fremgangsmåte ifolge ett av kravene 1-11, karakterisert ved at forbindelsen med formel I er 2-metoksy-2,4-difenyl-3(2H)-furanon.

13. Fremgangsmåte ifolge ett av kravene 1-11, karakterisert ved at forbindelsen med formel I er 2-benzyloksy-2,4-difenyl-3-(2H)-furanon.

14. Fremgangsmåte ifolge ett av kravene 1-11, karakterisert ved at materialet som inneholder en primær aminogruppe blir behandlet med en forbindelse med formelen

hvori R <1>^ betyr lavere alkyl eller fenyl-lavere-alkyl , R'2 betyr fenyl eller substituert fenyl og R'2 er substituert eller usubstituert fenyl, naftyl eller indolyl under den forutsetning at når R12 og R'3 begge er fenyl så er R'^ lavere alkyl med mer enn ett karbonatom eller fenyl-lavere-alkyl med mer enn 7 karbonatomer.

15. Middel for utforelse av fremgangsmåten ifolge kravene 1-14, karakterisert ved at det er en forbindelse med formel

hvori R'^ betyr lavere alkyl eller fenyl-lavere-alkyl , R <1>2 betyr fenyl eller substituert fenyl og R'2 betyr substituert eller usubstituert fenyl, naftyl eller indolyl under den forutsetning at når R'2 og R'3 begge betyr fenyl så er R'^ lavere alkyl med mer enn ett karbonatom eller fenyl-lavere-alkyl med mer enn 7 karbonatomer. j 16. En forbindelse ifolge krav 15, karakteri sert ved at R <1>^ betyr lavere alkyl..

17. En forbindelse ifolge krav 15 eller 16, karakterisert ved at R'2 og begge betyr fenyl.

18. En forbindelse ifolge krav 15, karakterisert ved at forbindelsen er 2-etoksy-2,4-difenyl-3(2H)-furanon.

19. En forbindelse ifolge krav 15, karakterisert ved at forbindelsen er 2-metoksy-2-fenyl-4-(4-nitrofenyl)-3(2H)-furanon.