DE2402226B2 - Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus wäßrigen Lösungen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus wäßrigen LösungenInfo
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Description
55
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus wäßrigen Lösungen, in denen sie im
Gemisch mit kleineren organischen Molekülen vorliegen.
Verfahren zur Abtrennung von Enzymen aus t>o
Lösungen ohne deren Denaturierung sind zwar bekannt. So wird in dem technischen Merkblatt der Pharmacia
Chemicals AB, Uppsala, Schweden »Industrial Gel Filtration with the Sephamatic System« ein Verfahren
beschrieben, bei dem Enzyme durch Gelchromatogra- bs
phie aus Lösungen abgetrennt werden. Dieses Verfahren ist jedoch sehr teuer. Es eignet sich beispielsweise
für Forschungslabors, nicht jedoch für in technischen Betrieben anfallende größere Mengen von Flüssigkeiten,
aus denen Enzyme abgetrennt werden sollen. Aus der DE-OS 20 39 222 ist ein Verfahren zur Abtrennung
von Enzymen aus flüssigen Medien durch Druckfiltration durch eine semipermeable Wand bekannt Dieses
Verfahren ist auch unter dem Namen »Ultrafiltration« oder »umgekehrte Osmose« bekannt Es benötigt einen
hohen apparativen Aufwand und arbeitet so langsam, daß es für die Abtrennung von Enzymen aus größeren
Lösungsmengen nur schlecht geeignet ist
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Gewinnung von Enzymen aus wäßrigen Lösungen, in
denen sie im Gemisch mit kleineren organischen Molekülen vorliegen, so zu vereinfachen, daß diese auch
in einen größeren technischen Maßstab möglich ist und sich wirtschaftlich durchführen läßt
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus wäßrigen Lösungen, in
denen sie im Gemisch mit kleineren organischen Molekülen vorliegen, das dadurch geennzeichnet ist,
daß man die Lösungen bei einem vom isoelektrischen Punkt der Enzyme abweichenden pH-Wert zwischen 3
und 9 über ein mit 2 bis 8 Gew.-% Divinylbenzol vernetztes Polystyrolsulfonat-Austauscherharz in der
Gelform leitet, mit Wasser eluiert und vor Auftreten der die kleineren organischen Moleküle enthaltenden
Fraktion des Eluats eine enzymreiche Fraktion gewinnt. Nach einer Ausführungsform der Erfindung gewinnt
man so die bei der Umwandlung von Polysacchariden in Mono- oder Disaccharide. Es können sowohl die bei der
Hydrolysen von Polysacchariden zu Mono- oder Disacchariden wirksamen Hydrolasen als auch die bei
der Isomerisierung von Mono- oder Disacchariden wirksamen Isomerasen gewonnen werden. Doch lassen
sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auch beliebige andere Enzyme abtrennen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung leitet man Clucoseisomerase, Fructose und
Glucose enthaltende Lösungen über das Kationenaustauscherharz, das überwiegend mit einwertigen Metallionen
beladen ist, und gewinnt so eine an Glucoseisomerase reiche Fraktion. Dabei hat es sich als vorteilhaft
erwiesen, aus der Lösung, die Glucoseisomerase, Fructose und Glucose enthält, vor dem Aufgeben auf
das Kationenaustauscherharz mehrwertige Kationen nach bekannten Verfahren gegen Alkaliionen auszutauschen.
Die so gewonnene Enzymfraktion kann erfindungsgemäß entweder einer Verwendung als Biokatalysator
zugeführt werden oder, falls man sie nach der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens aus einer Mono- und Disaccharide enthaltenden Lösung nach Umwandlung von Polysacchariden
gewinnt, einer erneuten Verwendung für diese Umwandlung zugeführt werden.
Das Ionenausschlußverfahren wurde bisher für die Reinigung von technischen Zuckerlösungen und für die
Trennung von Monosacchariden von Kochsalz und anderen Modellsubstanzen vorgeschlagen. Es werden
hierfür handelsübliche Kationenaustauscher verwendet, doch ist unter geeigneten Bedingungen die Verwendung
von Anionenaustauschern auch möglich. Diese Kationenaustauscher bestehen aus einem vernetzten Polymeren,
z. B. Polystyrol, das von feinen Kanälen in molekularer Größe durchzogen ist. An dieses Netzwerk
von Kanälen, die mit Wasser gefüllt sind, sind ionische Gruppen wie z. B. stark saure Sulfogruppen gebunden.
Nach Versetzen mit Wasser quillt das Harz, und
innerhalb seiner feinen Kanäle kann eine freie Diffusion gelöster Substanzen erfolgen.
Das Ausmaß der Quellung und damit der Größe der Kanäle hängt sehr stark von der Art der Gegenionen zu
den Sulfogruppen ab, die beispielsweise Wasserstoff, ein Alkali-, Erdalkali- oder Ammonium Lein können. Die
Quellung des Harzes hängt weiterhin davon ab, ob das Harz einer Lösung mit verändertem osmotischem
Druck ausgesetzt wird.
Durch dieses Quellen und die damit verbundene Größenändciting der Harzkanäle wird in Verbindung
mit den aktiven ionischen Gruppen auf dem Harz das Ionenausschlußverfahren ermöglicht Hierbei dringen
1. nicht-ionisierte Substanzen geeigneter Größe in die Harzkanäle ein, während 1 j
2. ionisierte Substanzen und sperrige Moleküle vom Zutritt zum Inneren des Harzes ausgeschlossen
werden (Ionenausschluß). Dabei werden die ionisierten Substanzen, z. B. Salze organischer oder
anorganischer Säuren, durch die aktiven Gruppen vom Zutritt zum Wasser innerhalb der Harzpartikeln
ausgeschlossen, während die sperrigen Moleküle wie Polysaccharide, Farbstoffe usw. allein
wegen ihrer Größe nicht in die Harzkanäle eindringen können.
Es wurde nun überraschend gefunden, daß Enzyme ohne Denaturierung von nicht-ionisierten Verbindungen
nach dem Ionenausschlußverfahren abgetrennt werden können und dabei ihre Aktivität in so hohem
Maße erhalten bleibt, daß sie nach der Abtrennung einer w erneuten Verwendung zugeführt werden können. Es
war bekannt, daß man Eiweißstoffe durch Ionenaustauscher aus Lösungen entfernen kann, jedoch werden
dabei die Eiweißstoffe auf den Ionenaustauschern adsorbiert und häufig gleichzeitig denaturiert, wobei sie v,
sich auf den Harzen absetzen und diese dadurch bald unbrauchbar werden. Aus diesem Grund werden
Eiweißstoffe aus Lösungen im allgemeinen mit Aktivkohle oder durch Fällungsreaktionen und Filtration
entfernt.
Dagegen werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Enzyme ohne Denaturierung, ja sogar
ohne stärkeren Verlust ihrer Aktivität abgetrennt.Wegen des polaren Charakters der Enzyme ist der
pH-Wert des Harzes, mit dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, von starkem Einfluß auf
das Verfahren. So soll bei pH-Werten, die zwischen 3 und 9 liegen, gearbeitet werden. Dabei ist jedoch zu
beachten, daß das Enzym am isoelektrischen Punkt ausflocken kann. Dieser pH-Bereich muß daher r>o
gemieden werden. Es hat sich praktisch sehr bewährt, wenn man in Vorversuchen den jeweils günstigen
pH-Wert feststellt. Dies ist vom Fachmann leicht durchzuführen, indem man beispielsweise eine enzymhaltige
Lösung mit Harzproben, die zuvor mit r, Pufferlösungen von unterschiedlichem pH-Wert ins
Gleichgewicht gebracht wurden, in Kontakt bringt und nach einer bestimmten Zeit, z. B. nach 1 h, den
Proteingehalt der Lösung bestimmt. Dabei sind natürlich nur die pH-Bereiche zu berücksichtigen, in to
denen das in Frage kommende Enzym stabil ist. Beispiele für solche optimalen pH-Werte werden für
einige Enzyme in den folgenden Beispielen angegeben.
Die Temperatur zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ebenfalls von der thermischen
Stabilität der Enzyme abhängig. Das Verfahren kann bei Temperaturen zwischen 20 und 8O0C durchgeführt
werden.
Die Durchflußgeschwindigkeit beim Eluieren mit Wasser kann sehr hoch sein, ohne daß eine Verschlechterung
der Trennung eintritt. So sind je nach der gewählten Arbeitstemperatur Durchflußgeschwindigkeiten
von über 1 Harzbettvolumen pro Stunde (BV/h) möglich.
Es kann in einem Bereich von 0,2—1 BV/h, insbesondere 0,4—0,9 BV/h, gearbeitet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere zur Abtrennung von Enzymen aus Stärkehydrolyse- und
Glucoseisomerisierungssirupen, aus Kulturbrühen und ähnlichen Lösungen, bei denen Enzyme als Katalysatoren
Verwendung finden, geeignet, wobei die Enzyme nicht denaturiert werden und daher mehrmals angewandt
werden können.
Damit wird es möglich, bei enzymkatalysierten Prozessen mit höheren Enzymkonzentrationen, als es
nach dem Stand der Technik wirtschaftlich durchführbar war, zu arbeiten, und so zu erheblich kürzeren
Reaktionszeiten zu gelangen. Mit den kürzeren Reaktionszeiten ist gleichzeitig eine größere Schonung
der Enzyme verbunden. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß viele
industrielle Prozesse, in deren Verlauf enzymatische Reaktionen auftreten, kontinuierlich durchgeführt werden
können. Dies sei am Beispiel der Hydrolyse von Stärke zu Glucose näher beschrieben, ohne daß
hierdurch eine Beschränkung des Verfahrens gegeben ist.
Üblicherweise wird die Stärkehydrolyse industriell in zwei Stufen, nämlich mit Säuren und Enzymen, oder
auch ausschließlich mit Enzymen, durchgeführt. In der ersten Stufe wird die Stärke mit Säure oder einem
Enzym vorhydrolysiert. Diese Stufe wird heute überwiegend voll kontinuierlich durchgeführt. Die zweite Stufe,
bei der die vorhydrolysierte Stärke mit einem anderen Enzym, der Amyloglucosidase, vollständig hydrolysiert
wird, war dagegen bis zur Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Chargenprozeß, bei dem
wegen der niedrigen Enzymdosierungen Hydrolysezeiten von 48—72 h in Kauf genommen wenden mußten.
Der Einsatz größerer Enzymmengen, der zu kürzeren Hydrolysezeiten geführt hätte, war unwirtschaftlich, da
die teuren Enzyme in Ermangelung eines geeigneten Verfahrens zur Rückgewinnung nach einmaligem
Gebrauch vernichtet wurden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Enzymen gestattet dagegen, mit wesentlich
höheren Mengen Amyloglucosidase zu arbeiten, da diese später wieder zurückgewonnen werden. So ist es
möglich, die Hydrolyse der in der ersten Stufe vorhydrolysierten Stärke in 1 bis 6 h vollständig
durchzuführen.
So kann man z. B. zu einer mit Säure oder a-Amylase
vorhydrolysierten filtrierten Stärkelösung 1 bis 3 Gew.-% Amyloglucosidase zugeben, den pH-Wert der
Lösung auf einen Wert zwischen 4,0 und 7,0 einstellen und die Lösung bei einer Temperatur zwischen 50 und
6O0C in 1 bis 6 h durch ein Strömungsrohr pumpen. Die
Verweilzeit im Strömungsrohr ist so bemessen, daß die zu Glucose und Oligosacchariden hydrolysierte Stärkelösung
beim Verlassen des Rohres einen Ver;-uckerunpsgrad
(Dextrose Äquivalent) von über 80 DE hat. Die aus dem Strömungsrohr austretende glucosehaltige
Lösung wird auf ein System von mehreren mit in der Erfindungsdefinition angegebenen Ketionenaustauscherharzen
gefüllten Kolonne gegeben. Das Ionenaustauscherharz ist auf dH 5 bis 5.5 gepuffert, wobei als
Gegenionen für die Sulfogruppen des Harzes Alkali- und/oder Erdalkaliionen dienen. Auf jede Harzkolonne
wird ein Chargenvolumen von 5 bis 35% des Harzvolumens gegeben. Nach Einsickern der glucosehaltigen
Lösung in das Harzbett wird mit Wasser eluiert.
Der Ablauf jeder Kolonne wird vorteilhaft in mehrere Fraktionen eingeteilt. Die zuerst die Kolonnen verlassenden
Salzfraktionen enthalten die Amyloglucosidase und einen Teil der Oligosaccharide. Die nächsten
Fraktionen enthalten die Glucose und einen Anteil der Salze sowie Oligosaccharide. Die dritte Fraktion besteht
aus reiner Glucose. Da diese glucosehaltige Fraktion in der Regel nur einen geringen Trockensubstanzgehalt
besitzt, kann sie vorteilhaft zurückgenommen werden und nach dem Einsickern des Chargenvolumens in das
Harzbett erneut auf die Säule gegeben werden, bevor mit Wasser eluiert wird. Durch dieses Rücknahmeverfahren
wird der Trockensubstanzgehalt der Hauptfraktion erhöht, wodurch das Eindampfen sehr dünner
Zuckerlösungen vermieden werden kann.
Die erste Fraktion, die die Amyloglucosidase enthält, kann mit vorhydrolysierter Stärkelösung vermischt und
unter Vakuum bis auf einen Trockensubstanzgehalt von 30 bis 40° Brix eingedampft werden. Anschließend wird
die Lösung in das Strömungsrohr eingespeist, wonach sich der Kreislauf wiederholt. Dieses Verfahren ist
schematisch in F i g. 1 dargestellt.
Es ist auch möglich, die vorhydrolysierte Stärkelösung mit Ionenaustauschern vollständig zu entsalzen.
Die entsalzte Lösung wird auf einen Trockensubstanzgehalt von ungefähr 70° Brix eingedampft und mit der
ersten Fraktion der Kolonne, die die Amyloglucosidase enthält, auf einen Trockensubstanzgehalt von 30 bis 40°
Brix verdünnt. Diese Lösung wird dann durch das Strömungsrohr durchgesetzt.
Die beschriebene vollständige Entsalzung der vorhydrolysierten Stärkelösung ist besonders dann vorteilhaft,
wenn im Anschluß an die Hydrolyse der Stärke zu Glucose ein Teil der Glucose mit glucoseumwandelnden
Enzymen in Fructose isomerisiert werden soll. Die Hauptfraktionen der Kolonnen werden hierzu auf ein
Trockensubstanzgehalt von 40 bis 50° Brix eingedampft und in bekannter Weise direkt mit dem Enzym
Glucoseisomerase umgesetzt. Da die eingesetzten Glucoselösungen praktisch keine Aminosäuren und
Eiweißstoffe enthalten, kommt es bei der Umwandlung der Glucose in Fructose zu einer wesentlich geringeren
Farbbildung als bei den bekannten Verfahren.
Wenn eine an einen Träger fixierte Glucoseisomerase, wie sie z. B. durch Binden des Enzyms mit
Glutardialdehyd an Gelatine gewonnen werden kann, zur Umwandlung der Glucose in Fructose eingesetzt
wird, ist die Abtrennung des Enzyms und seine Wiederverwendung einfach.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es aber möglich, auch freie Glucoseisomerase aus Glucose und
Fructose enthaltenden Lösungen abzutrennen und einer erneuten Verwendung zuzuführen. Es ist hierfür
allerdings nötig, Glucoseisomerasen einzusetzen, bei denen das Enzym aus den Zellen in Lösung geht, da nur
der gelöste Teil, nicht aber der an den Zellen haftende Teil des Enzyms nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
zurückgewonnen werden kann.
Weiter wurde gefunden, daß das Enzym Amyloglucosidase und das Enzym Glucoseisomerase gleichzeitig
mit dem erfindungsgemäßen Verfahren von Zuckern aus Lösungen abgetrennt werden können. Dies kann
beispielsweise Anwendung finden, wenn beide Enzyme
in bekannter Weise so eingesetzt werden, daß erst die Amyloglucosidase vorhydrolysierte Stärke zu Glucose
hydrolysiert und anschließend die Glucoseisomerase einen Teil der Glucose in Fructose umwandelt.
Diese letztgenannte Arbeitsweise hat jedoch den entscheidenden Nachteil, daß das Enzym Amyloglucosidase
infolge der Verfahrensbedingungen für den Einsatz der Glucoseisomerase, der bei Temperaturen über 60° C
erfolgt, stark geschädigt und unter Umständen völlig desaktiviert wird, so daß ihre Abtrennung und erneute
Verwendung uninteressant ist. Es ist zwar möglich, bei dem bekannten Verfahren die Isomerisierung der
Glucose zu Fructose auch bei 60° C durchzuführen, da diese Temperatur für die Amyloglucosidase praktisch
unschädlich ist. Es müssen dann aber sehr lange Isomerisierungszeiten in Kauf genommen werden,
wodurch die Amyloglucosidase schließlich doch an Aktivität einbüßt.
Dagegen wurde bei der Suche nach Anwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäßen Verfahrens gefunden,
daß man Amyloglucosidase und Glucoseisomerase gleichzeitig auf vorhydrolysierte Stärke einwirken
lassen kann, wes zu fructosehaltigen Glucosesirupen führt. Die Hydrolyse der Stärke zu Glucose mit
Amyloglucosidase wird normalerweise bei einem pH von 4,5 in der Lösung vorgenommen, da das Enzym bei
diesem pH-Wert seine größte Wirksamkeit entfaltet. Das Enzym Glucoseisomerase hat sein Wirkungsoptimum
bei einem pH-Wert von etwa 7,3, wird jedoch, um die Bildung unerwünschter Zucker wie Psicose und
Mannose zu vermeiden, bei pH 6 bis 6,2 eingesetzt. Wie aus der folgenden Tabelle zu ersehen ist, arbeitet die
Amyloglucosidase in Gegenwart von Kobalt- und Magnesiumsalzen, die für die Wirkung der Glucoseisomerase
notwendig sind, auch noch bei einem pH von 6 bis 6,2 befriedigend:
DE nach 2 h
pH 4,5
pH 4,5
pH 6
Ohne Ca++-Ionen 96,4
Mit 0,04 Gew.-% CaCl2 96,2
90,7
87,8
87,8
Wie man der Tabelle entnehmen kann, ist es vorteilhaft, wenn die Lösung keine Calciumionen enthält.
Die Elution wurde in den folgenden Beispielen mit Wasser vorgenommen.
Nachweis der enzymhaltigen Fraktion des
Ionenausschlußverfahrens
Ionenausschlußverfahrens
Das Auftreten von Enzymen im Eluat der mit Ionenaustauscherharzen gefüllten Kolonnen kann durch
kontinuierliches Messen der UV-Absorption des Eluats bei bestimmten Wellenlängen erfolgen, wodurch eine
optimale Fraktionsnahme bei der Gewinnung der Enzyme möglich ist. Die hierfür notwendige Meßanordnung
ist bei technischen Kolonnen häufig zu aufwendig. Bei den Versuchen mit kleinen, mit Polystyrolsulfonatkationenaustauschern
gefüllten Säulen, deren Eluai durch eine Durchflußk'jvette eines Photometers und
eine Leitfähigkeitsmeüzelle geleitet wurde wurde gefunden, daß Enzyme bei geeignetem pH des Harzes
die Säule in der Regel zusammen mit den in der Lösung vorhandenen oder zugesetzten Salzen verlassen.
Das Auftreten der Enzyme im Eluat kann daher in einfacher Weise durch Messen der elektrolytischer
Leitfähigkeit indirekt festgestellt werden.
Aus dem Verlauf der UV-Absorption bei 254 und 280 mm, die gleichzeitig mit der Leitfähigkeit gemessen
wurde, in den F i g. 2 und 3 ist zu ersehen, daß die Handelsenzyme Amyloglucosidase (F i g. 2) und Glucose-Isomerase
(Fig. 3) unter den Verfahrensbedingungen in 2 UV-aktive Komponenten aufgetrennt wurden.
Die in den F i g. 2 und 3 wiedergegebenen Messungen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Säule: | Durchmesser 1,6 cm, |
Harzhöhe 83 cm | |
Harz: | Polystyrolsulfonat |
Gegenionen: | |
für Amyloglucosidase: | Na, K, und Ca etwa 1.1.1 |
Glucoseisomerase: | 1.1.1 Na |
pH: | |
für Amyloglucosidase: | 5,2 |
für Glucoseisomerase: | 6,0 |
für Invertase: | 5,5 |
Durchflußgeschwindigkeit: | etwa 0,01 cm/sec |
(0,45 Bettvolumen/h) | |
Probenvolumen: | 1 ml |
Beispiel 2 |
Maisstärke wurde in bekannter Weise mit Λ-Amylase
vorhydrolysiert und filtriert.
1,5 kg (352 g Trockensubstanz) der erhaltenen Dextrinlösung wurden mit 1 ml Amyloglucosidase bei pH 4,5
und 55° C weiter umgesetzt, bis die Lösung nach 24 h einen DE-Wert von 97 aufwies. Der pH der Lösung
wurde mit Natronlauge auf 5,5 eingestellt. Aus der Lösung wurde die Amyloglucosidase nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren zurückgewonnen.
Für die Rückgewinnung des Enzyms wurde Polystyrolsulfonatharz, das mit Calcium-, Natrium- und
Kaliumionen im Molverhältnis 7:1,8:1 beladen war, benutzt. Die Harzhöhe betrug 2 m, das ausgenutzte
Harzvolumen 101. Bei einer Kolonnentemperatur von 20° C wurde mit einer Geschwindigkeit von ca.
0,028 cm/sec (0,5 Bettvolumen/h) mit Wasser eluiert. Das Eluat der Kolonne wurde gemäß Fig.4 in eine
Enzym- und eine Zuckerfraktion eingeteilt. Die gewonnene Enzymfraktion wurde zu weiteren 1.5 kg
der bei der Vorhydrolyse erhaltenen Dextrinlösung gegeben, das Gemisch unter Vakuum bei 50 bis 55° C bis
auf ein Volumen von 1,5 1 eingedampft und anschließend auf 55°C gehalten. Nach 22 h betrug der DE-Wert der
Lösung 90.
40 kg Maisgrieß wurden in 100 kg Wasser von 60°C aufgeschlämmt. Nach Zusatz von 112 g CaCl2-2 H2O
wurde der pH der Aufschlämmung mit Soda auf 6,5 eingestellt, 250 ml Λ-Amylase hinzugegeben, die Temperatur
auf 85°C erhöht und 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Zur Inaktivierung der Λ-Amylase wurde
anschließend die Temperatur für 15 min auf 100° C erhöht. Der pH wurde mit Salzsäure auf 4,5 eingestellt
und die Suspension mit einer Filterpresse filtriert. Der DE-Wert der filtrierten Dextrinlösung betrug 24,5, der
Trockensubstanzgehalt 26,6° Brix.
Diese Lösung diente für die folgenden Versuche als Ausgangslösung.
Zu 1644 g (1,51) der Dextrinlösung wurden 15 ml
Amyloglucosidase gegeben und die Temperatur 4 h lang auf 55 bis 6O0C gehalten. Danach betrug der DE-Wert
der resultierenden Glucoselösung 94,1. Der pH der
Lösung wurde auf 5,5 eingestellt und das Enzym wurde nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der im
Beispiel 2 beschriebenen Harzkolonne zurückgewonnen.
Das Harz war vor Aufgabe der Lösung zunächst mit CaCI2-Lösung in die Ca-Form gebracht worden und
dann mit der Dextrinlösung, deren pH auf 5,5 eingestellt war, behandelt worden, bis die aus der Harzkolonne
austretende Dextrinlösung ebenfalls einen pH von 5,5 aufwies. Die Salzzusammensetzung auf dem Harz war
danach die im Beispiel 2 angegebene.
Auf die so vorbereitete Harzkolonne wurde die Glucoselösung aufgegeben und das Eluat in eine
Enzymfraktion und eine Glucosefraktion eingeteilt. Die Enzymfraktion, die außer dem Enzym Salze und
Oligosaccharide enthält, verließ die Kolonne im Bereich von etwa 4 bis 6,3 1, gerechnet vom Beginn der Aufgabe
der enzymhaltigen Glucoselösung. Die Glucosefraktion reichte von 6,3 bis 10,5 1.
Die Enzymfraktiop. wurde, wie es im Beispiel 2 bereits beschrieben ist, erneut mit 1644 g (1,5 1) der Dextrinlösung
umgesetzt. Die erhaltene Glucoselösung wurde zur Rückgewinnung der Amyloglucosidase erneut über die
Harzkolonne gegeben. Insgesamt wurde die gleiche Enzymmenge lOmal zur Gewinnung von Glucoselösung
aus der Dextrinlösung eingesetzt. Die nachfolgende Tabelle gibt Auskunft über die jeweils erreichten
DE-Werte der auf die Harzkolonne gegebenen Glucoselösungen und die DE-Werte der Glucosefraktionen.
Die Probenummer gibt dabei die Nummer des Zyklus an, in dem dasselbe Enzym eingesetzt wurde.
Dabei bedeutet z. B. Probe Nr. 2, daß das Enzym zum zweiten Male 1644 g der Dextrinlösung von 26,6° Brix
und einem DE-Wert.von 24,5 auf den angegebenen DE-Wert verzuckert hat und daß das Enzym einmal mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren zurückgewonnen wurde:
Probe | Nr. | DE-Wert | der | Reaktions |
Glucosefraktion | zeit | |||
der | ||||
Glucoselösung | (h) | |||
1 | 94,1 | 99,5 | 4 |
2 | 93,8 | 98,0 | 6 |
45 3 | 95,2 | 98,4 | 6 |
4 | 92,3 | 95,9 | 6 |
5 | 89,8 | 97,1 | 6 |
6 | 83,5 | 97,0 | 6 |
7 | 83 | 98,1 | 6 |
50 g | 88,2 | 95,3 | 12 |
9 | 84 | 96,6 | 12 |
10 | 78,4 | 95 | 15 |
Die Tabelle deutet an, daß das Enzym mit steigender Cyclenzahl einen gewissen Aktivitätsverlust erleidet.
Wie Versuche gezeigt haben, beruht dieser Aktivitätsverlust auch auf einer Inhibierung des Enzyms durch die
mit fortschreitender Cyclenzahl erfolgende Anreicherung von Salzen und Oligosacchariden, die von der
Amyloglucosidase nicht zu Glucose hydrolysiert werden. So stieg z. B. der Salzgehalt, ausgedrückt in meq
(Milliäquivalente) Säure von 82 meq Säure in Probe 1 auf 167,6 meq in Probe 8.
Es kann daher angebracht sein, die Enzymfraktion
bi nach einer gewissen Cyclenzahl einer Reinigung zu
unterwerfen. Im Falle der Amyloglucosidase kann dies vorteilhaft durch Ausfällen des Enzyms mit Methanol
oder Isopropanol geschehen.
Aus 40 kg Maisgrieß wurde, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, eine Dextrinlösung gewonnen. Diese
Lösung wurde in bekannter Weise mit Ionenaustauschern vollentsalzt und bis auf einen Trockensubstanzgehalt
von 73,5° Brix eingedampft. Der DE-Wert der gereinigten Dextrinlösung betrug 28,7, der Proteingehalt
0,1%.
1,837 kg dieser Dextrinlösung wurden mit 2,66 kg Wasser auf 30° Brix verdünnt und nach einer
pH-Korrektur auf 4,5 mit 4 ml Amyloglucosidase Novo 150 bei 55 bis 600C zu Glucose verzuckert. Nach 24 h
war ein DE von 96,8 erreicht. Der pH der Glucoselösung wurde mit Natronlauge auf 5,5 eingestellt und die
Amyloglucosidase zurückgewonnen.
Versuchsbedingungen:
Versuchsbedingungen:
Säule:
Harz:
Gegenion:
pH:
Temperatur:
Durchflußgeschwindigkeit:
Durchmesser 8 cm
Harzhöhe 290 cm
Polystyrolsulfonat
Na+
5,5
40° C
0,037 cm/sec
(0,45 Bettvolumen/h)
Versuchsdaten:
Säule:
Harz:
Gegenion:
pH:
Temperatur:
Durchmesser 1,6 cm Harzhöhe 83 cm
Polystyrolsulfonat
Natrium
5,9
40°C
Mit dem zurückgewonnenen Enzymgemisch wurde erneut Dextrinlösung umgesetzt. Nach 24 h betrug der
30
Der Ablauf der Kolonne wurde gemäß F i g. 5 in eine Enzym- (von 4,5—7,1 1), eine Haupt- (von 7,4—14 1) und
eine Nachfraktion (von 14—16,3 1) eingeteilt
Die Enzymfraktion wurde zur Verzuckerung von weiteren 1,837 kg Dextrinlösung eingesetzt, wobei nach
24 h bei 55—60°C ein DE von 88 erreicht wurde. Aus dieser Glucoselösung wurde das Enzym erneut zurückgewonnen.
Dabei wurde die zuerst erhaltene Nachfraktion unmittelbar nach der enzymhaltigen Glucoselösung
auf die Harzsäule zurückgeführt, bevor mit Wasser eluiert wurde. Durch diese Rückführung wurde erreicht,
daß der Trockensubstanzgehalt der Hauptfraktion von 20,9 bei der ersten Rückgewinnung auf 22,7° Brix bei der
zweiten Rückgewinnung anstieg.
40
Dextrinlösung des Beispiels 4 wurde mit Wasser auf 30° Brix verdünnt. Zu 167 g dieser verdünnten Dextrinlösung
wurden 0,1 ml Amyloglucosidase, der wäßrige Extrakt von 0,5 g Glucoseisomerase (Muster mit 5300
GIU/g), 0,33 g MgSO4 -7 H2O und 0,033 g
CoCl2 · 6 H2O gegeben. Der pH der Lösung betrug 6 bis
6,2 und wurde automatisch während der Umsetzung nachgeregelt, die Temperatur wurde auf 55 bis 6O0C
gehalten. Nach 24 h war ein DE-Wert von 79 erreicht. Der polarographisch bestimmte Anteil der Fructose an
den reduzierenden Zuckern betrug 25,6%.
Die Lösung wurde zur Entfernung der Mg- und Co-Ionen über einen Kationenaustauscher in der
Na-Form gegeben und die Amyloglusidase im Gemisch mit der Glucoseisomerase zurückgewonnen.
50
DE-Wert 75 und der Anteil der Fructose an den reduzierenden Zuckern 19,5%. Die Fig.6 zeigt das
Elutionschromatogramm.
Eine 50% wäßrige Saccharoselösung in Form von reiner Saccharose, die 0,1% Invertase enthielt, wurde
bei pH 4,5 und 55° C invertiert. Nach 16 h war die Hydrolyse der Saccharose zu Glucose und Fructose
beendet und die Invertase wurde mit der im Beispiel 5 beschriebenen Harzsäule zurückgewonnen. Mit der
Enzymfraktion wurde erneut Saccharose invertiert. Nach 16 h war die Saccharose zu 92% hydrolysiert.
Beispiel 6 wurde wiederholt, wobei jedoch statt einer reinen Saccharoselösung eine Zuckerrübenmelasse, die
50% Saccharose enthielt, eingesetzt wurde. Es wurden die gleichen Ergebnisse wie in Beispiel 6 erhalten.
In 40 g Glucoselösung, die 11,88 g Trockensubstanz
enthielt und zuvor bei 37°C durch Durchblasen von Luft mit Luft gesättigt worden war, wurden 1,5 g Glucoseoxidaseenzym,
Reinheitsgrad III, eingetragen. Die Aktivität des Enzyms betrug 3976 U/g. Während der Reaktion
wurde die Temperatur konstant auf 37° C gehalten und der pH der Lösung durch Zugabe von 0,1 n-Natronlauge
auf 5,8 bis 6,0 geregelt. Nach 21 h waren 65% der Glucose zu Gluconsäure oxidiert worden. Das Volumen
des Ansatzes betrug bei Reaktionsende 39,5 ml.
Zur Wiedergewinnung des Glucoseoxidaseenzyms wurden 5 ml mit 1,7 g Trockensubstanz des Reaktionsansatzes auf eine mit einem stark sauren Kationenaustauscher
in der Natriumform gefüllte Chromatografiesäule (Durchmesser 1,6 cm, Harzhöhe 98 cm) gegeben.
Nach Einsickern der Probe in das Harzbett wurde mit destilliertem Wasser, dessen pH auf 6,0 eingestellt
worden war, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 110 ml/h entsprechend 0,56 Bettvolumen/h eluiert. Die
Temperatur der Säule betrug 25° C. Zum Nachweis der aus der Säule austretenden Substanzen war diese mit
einem Differentialrefraktometer und einem Durchflußphotometer verbunden.
Nach 55 ml Vorlauf wurde das Enzym innerhalb der nachfolgenden 33 ml, erkennbar an der Absorption des
Eluats bei 254 und 280 nm, eluiert und als Enzymfraktion getrennt aufgefangen. Die nächsten 108 ml Eluat
wurden als Zuckerfraktion aufgefangen. Die Analyse der beiden Fraktionen ergab:
Enzymfraktion
Zuckerfraktion
Trockensubstanz in g 0,5 1,1
Spez. Drehwinkel [«]Hg-365 40 90
Glucose — 0,47 g
Gluconsäure 0,3 g 0,63 g
Aktivität »Units« 716 0
Der Gesamtansatz enthielt in 39,5 ml eine Glucoseoxidaseaktivität
von 5964 U. Auf die Chromatografiesäule waren 5 ml dieser Lösung, die also 755 U
t>5 enthielten, gegeben worden. Da die Enzymfraktion eine
Aktivität von 716 U aufwies, wurde aktive Glucoseoxidase zu 94,8% nach dem Enzymrückgewinnungsverfahren
zurückgewonnen.
Hierzu 6 Blatt Zeichnungen
Claims (9)
1. Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus wäßrigen Lösungen, in denen sie im Gemisch mit
kleineren organischen Molekülen vorliegen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösungen
bei einem vom isoelektrischen Punkt der Enzyme abweichenden pH-Wert zwischen 3 und 9
über ein mit 2 bis 8 Gew.-% Divinylbenzol vernetztes Polystyrolsulfonat-Austauscherharz in
der Gelform leitet, mit Wasser eluiert und vor Auftreten der die kleineren organischen Moelküle
enthaltenden Fraktion des Eluats eine enzymreiche Fraktion gewinnt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die bei der Umwandlung von
Polysacchariden in Mono- oder Disaccharide wirksamen Enzyme aus Lösungen der Mono- oder
Disaccharide gewinnt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die bei der Hydrolyse von
Polysacchariden zu Mono- oder Disacchariden wirksamen Amylasen aus Lösungen der Mono- oder
Disacchariden wirksamen Amylasen aus Lösungen der Mono- oder Disaccharide gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die bei der Isomerisierung von
Mono- oder Disacchariden wirksamen Isomerasen aus Lösungen von Mono- oder Disacchariden
gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Invertase aus Lösungen
von Mono- und Disacchariden gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch ir>
gekennzeichnet, daß das in der Gelform vorliegende Kationenaustauscherharz überwiegend mit Metalloder
Ammoniumionen beladen ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Glucoseisomerase, Fructose
und Glucose enthaltende Lösungen über das Kationenaustauscherharz leitet, das überwiegend
mit einwertigen Metallionen beladen ist und eine an Glucoseisomerase reiche Fraktion gewinnt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Glucoseisomerase, Fructose
und Glucose enthaltenden Lösungen mehrwertige Kationen gegen Alkaliionen austauscht, bevor man
die Lösung zur Trennung über das Kationenaustauscherharz leitet.
9. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 bis 8 erhaltenen Enzymfraktionen als Biokatalysatoren.
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1975
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8230 | Patent withdrawn |