DE2337605A1

DE2337605A1 - Verfahren und vorrichtung zur erzeugung von kollag aterial zum verschliessen von verletzungen

Info

Publication number: DE2337605A1
Application number: DE19732337605
Authority: DE
Inventors: Cesar Aurelio Romero-Sierra; Joseph A Tanner
Original assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Current assignee: Canadian Patents and Development Ltd
Priority date: 1972-08-14
Filing date: 1973-07-24
Publication date: 1975-02-20
Also published as: JPS533199B2; CA992616A; JPS4952491A; US3799162A

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Erzeugung von Kollagenmaterial zum Verschließen von Verletzungen

In einem mit "Effect of an Electromagnetic Field on the · Sciatic Nerve of the Rat¹¹ uberschriebenen Artikel von G. Romero-Sierra, Susan Halter und J. A. Tanner in "The Nervous System and Electric Currents¹¹, Band 2, herausgegeben von N> L, Wulfsohn und A. Sances Jr., Plenum Press, 1971» Seite 84, Zeilen 9 bis 16 wurde bereits darauf hingewiesen, daß abseits vom Zentrum eines elektromagnetischen Feldes in Versuchsratten, die nur kurzzeitig einer elektromagnetischen Strahlung ausgesetzt waren, die Menge an Kollagen zunahm und kollagenähnliche Fibrillen auftraten, die sich von den in Versuchsratten, die keiner elektromagnetischen Strahlung unterworfen worden waren, gefundenen Fibrillen unterschieden und aus dem Schwann-Zellcytoplasma in den endoneuralen Raum hineinragten. Diese Tests wurden am freigelegten Ischiasnerv eines rechten Beins der Versuchsratten durchgeführt.

Obwohl diese Tests erkennen ließen, daß sich bei Verwendung kleiner Dosen von elektromagnetischer Energie geringer Intensität die Menge an Kollagen erhöht, war die gefundene Kollagenzunahme unzureichend, um einen Hinweis darauf zu geben, daß die Verwendung von elektromagnetischer Strahlung für den Verschluß von Läsionen oder Verletzungen für praktische Zwecke von Bedeutung sein könnte.

Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und Wege anzugeben, mit deren Hilfe Kollagenmaterial erzeugbar ist, das in der Praxis zum Verschluß von Verletzungen verwendet werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Erzeugung von Kollagenmaterial zum Verschließen von Verletzungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man auf die Verletzung Histamin aufbringt und die die Verletzung begrenzenden Gfewebezellen mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt, welche im nicht-ionisierenden Frequenzbereich liegt und eine Intensität von unter 1 Milliwatt hat, zur Förderung der Bildung von Kollagenmaterial

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durch die Gewebezellen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, die gekennzeichnet ist durch Mittel zum Aufbringen von Histamin auf die Verletzung, Mittel zur Bestrahlung der die Verletzung begrenzenden Gewebezellen mit elektromagnetischer Strahlung und einen an die Mittel zur Bestrahlung der Gewebezellen mit Strahlung im nicht-ionisierenden Frequenzbereich und einer Intensität von unter 1 Milliwatt angeschlossenen Generator für elektromagnetische Energie.

Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher veranschaulicht, in der darstellen:

Fig. 1 eine schaubildliche Ansicht einer erwachsenen Ratte mit einer mit Histamin bedeckten Verletzung, die elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt wird zur Erzeugung von Kollagenmaterial,

Fig. 2 eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht des die Schnittwunde tragenden Bereichs einer Vergleichsratte, wobei der Schnitt nur mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurde,

Fig. 3 eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht einer Versuchsratte, wobei der Schnitt mit Kochsalzlösung behandelt und mit einem elektromagnetischen Feld bestrahlt wurde,

Fig. 4 eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht des einen Schnitt tragenden Bereichs einer Ratte, die nur mit Histamin behandelt wurde und

Fig. 5 eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht des den Schnitt tragenden Bereichs einer Ratte, die mit Histamin

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behandelt und rait einem elektromagnetischen Feld bestrahlt wurde.

In Figur 1 ist eine erwachsene Ratte 1 dargestellt, die mit Äther und Nembutal anästhetisiert wurde. Der Rücken der Ratte wurde rasiert und es wurde mit Hilfe einer (nicht gezeigten) Schere direkt unterhalb des Schulterblatts eine Läsion oder Schnittwunde 2 angebracht.

Eine Stabelektrode 4 wurde mit Hilfe eines Kabels 6 an einen elektromagnetische Energie erzeugenden Generator 8 angeschlossen zur Erzeugung eines 27 MHz-Feldes elektromagnetischer Strahlung. Der Generator 8 war über ein Kabel 10 an eine Kraftquelle 12 angeschlossen.

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Tests wurden Ratten 1 nach deren Anästhesierung mit dem Einschnitt 2 versehen, worauf auf die Schnittwunden 2 Histamin aufgebracht wurde. Die Schnittwunden 2 wurden sodann mit elektromagnetischer Energie der Elektrode 4 bestrahlt, wobei die Elektrode 4 längs des Einschnitts 2 angeordnet und nahe an diesem gehalten wurde. Die bei diesen Tests erhaltenen Ergebnisse wurden mit Testergebnissen verglichen, zu deren Durchführung die Einschnitte 2 in anderen Ratten 1 mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt und nicht bestrahlt, bzw. mit Histamin behandelt und nicht bestrahlt wurden.

Zur Durchführung der Tests wurden 12 erwachsene Ratten 1 mit einem Gewicht von 200 bis 300 g verwendet. Die Ratten wurden in 4 Gruppen eingeteilt, nämlich (a) Kontrollratten, die nur mit Kochsalzlösung behandelt wurden, die lokal auf den Einschnitt 2 aufgebracht wurde; (b) Testratten 1, die mit 2 Tropfen physiologischer Kochsalzlösung, aufgebracht auf den Einschnitt 2, behandelt und 15 Minuten lang einem VHF-FeId (27 MHz) mit Hilfe der Elektrode 4» die von der Wunde 0 bis 5 mm ent fernt gehalten wurde, ausgesetzt wurden; (c) Kontrollratten 1,

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die mit 2 Tropfen Histamindiphosphatlösung (i_f0 mg/ml), aufgebracht auf den Einschnitt 2, behandelt wurden und (d) Testratten 1, die mit 2 Tropfen Histamindiphosphatlösung (1,0 mg/ml), aufgebracht auf den Einschnitt 2, behandelt und 15 Minuten lang einem VHF-PeId (27 MHz) mit Hilfe der Elektrode 4, die im Abstand von O bis 5 mm über dem Einschnitt 2 gehalten wurde, ausgesetzt wurden.

Nach der Anästhesierung der Ratten mit Äther und Nembutal wurden die Rücken der Test- und Kontrollratten 1 rasiert, worauf ein

1 bis 1,5 cm langer horizontaler Einschnitt 2 direkt unterhalb des Schulterblatts mit Hilfe einer Schere angebracht wurde. Im Wundbezirk nahe dem Einschnitt 2 gegebenenfalls auftretendes Blut wurde mit Hilfe von Gaze entfernt und die Spitze einer 20-Gauge-Nadel wurde verwendet, um die Kanten des Einschnitts

2 zu adjustieren und zusammenzubringen. Nach Aufbringung der Kochsalzlösung oder des Histamine auf den Einschnitt 2 wurden sowohl bei den Test- als auch bei den Kontrollieren die Kanten der Schnittwunden nahe den Einschnitten 2 sorgfältig aneinander gelegt und fest zusammengehalten. Bei den Testratten 1 wurde die Elektrode in einem Abstand von O bis 5 mm über dem Einschnitt 2 gehalten. Nach 15 Minuten wurden sowohl die Kontrollais auch die Testratten 1 in ihre einzelnen Käfige 24 Stunden lang zurückgebracht. Es wurde versucht, die Behandlungsoperationen so gleichförmig wie möglich durchzuführen und jede Behandlungsoperation auf eine Zeitspanne von maximal 25 Minuten zu begrenzen.

Nach 24 Stunden wurden die von den Einschnitten 2 herrührenden Wunden sorgfältig untersucht und die Ratten 1 mit Äther getötet. Ein den Einschnitt 2 umgebender Hautbezirk von etwa 2,5 x 3,8 cm wurde herausgeschnitten und in Bouin's-Flüssigkeit eingebracht. Es wurden I^affinsegmente geschnitten und mit Haemotoxylin und Eosin sowie van Gieson¹s-Farbstoff angefärbt.

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Die erhaltenen Ergebnisse wurden nach einer Grob- und einer lichtmikroskopischen Beobachtung beurteilt. Die Grobbeurteilung ließ folgendes erkennen.

Kontrollgruppe Nr. 1 mit Kochsalzbehandlungί

In allen Ratten 1 trat während der Behandlungsoperation eine geringe Menge Blut auf zwischen den beiden zusammengehaltenen Kanten der Einschnitte 2. Die Kanten des Einschnitts 2 schienen nicht gut zusammenzuhalten und eine der Ratten 1 schüttelte die Wundkanten nach 15 Minuten auseinander. Nach 24 Stunden hielten in keinem der Einschnitte 2 die Wundkanten gut zusammen und der Heilungsprozeß war unvollständig.

Testgruppe Nr. 1 mit Kochsalz- und elektromagnetischer Feldbehandlung:

Vor der Einwirkung der Elektrode 4 waren die Kanten der Einschnitte 2 der Testratten ähnlich denjenigen der Einschnitte 2 der mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollratten 1. Nach Einwirkung des elektromagnetischen Peldes waren jedoch die Kanten der Einschnitte 2 offensichtlich besser haftend und ließen sich leichter aneinander halten. Nach 15 Minuten langer Bestrahlung erschienen die Einschnitte 2 verbunden und verfestigt. Innerhalb von 24 Stunden war der Heilprozeß im großen und ganzen vollständig und in 2 der Ratten 1 wurden die Kanten der Einschnitte 2 sehr sauber und einwandfrei zusammengehalten.

Kontrollgruppe Nr. 2 mit Histaminbehandlung:

Die mit Histamin behandelten Kanten der Einschnitte 2 hielten offensichtlich viel fester zusammen und waren viel biegsamer und geschmeidiger als diejenigen in den mit Kochsalzlösung behandelten Versuchstieren. Nachdem die Seitenteile 15 Minuten lang fest zusammengehalten worden waren, schienen die Wundkan-

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ten besser zusammenzuhaften als die Schnittkanten 2 der mit Kochsalzlösung behandelten Versuchsratten. Nach 24. Stunden waren die Kanten nicht so gut beisammenliegend, wie dies ursprünglich der Fall war und auseinanderklaffende Spalte waren sichtbar·

Testgruppe Nr. 2 mit Histamin- und elektromagnetischer Feldbehandlung:

Die Kanten der Einschnitte 2 hafteten ebenso zusammen wie diejenigen der mit Histamin behandelten Kontrollgruppe und nach Einwirkung des elektromagnetischen Feldes waren sie noch besser zu handhaben. Nach 15 Minuten langer Bestrahlung war nur noch ein dünner Haarlinieneinschnitt 2 sichtbar. Nach 24 Stunden heilten die Einschnitte 2 offensichtlich sehr gut im Vergleich zu allen übrigen Gruppen einschließlich der lediglich mit Histamin behandelten Kontrollgruppe Nr. 2.

Die lichtmikroskopischen Beobachtungen nach 24 Stunden ergaben folgende Ergebnisse.

Beim Vergleich der Testgruppe Nr. 1, wo die Ratten mit Kochsalzlösung und elektromagnetischem Feld behandelt worden waren, und den Kontrolltieren, die nur mit Kochsalzlösung behandelt worden waren, zeigte es sich bei der lichtmikroskopischen Untersuchung, daß der Einschnittsspalt bei der Testgruppe kleiner war. Im Schnittbereich lag weniger Infiltrat an weißen Blutkörperchen vor und offensichtlich war mehr Fibringrundsubstanz im Einschnitt 2. Es waren auch mehr Fibroblasten und Macrophagen im Schnittspalt der Testratten 1 als im Wundbezirk der Kontrollratten. Eine aktive Phagocytose durch Macrophagen war in den Einschnitten 2 der Testratten 1 feststellbar, wohingegen eine solche in der Kontrollgruppe nur gelegentlich zu beobachten war (vgl. die Figuren 2 und 3)·

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In Figur 2 ist eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht des Schnitfbezirks einer Kontrollratte 1 gezeigt, die nur einer Kochsalzbehandlung unterworfen war (Kontrollgruppe 1 mit Kochsalzbehandlung). Die vergleichsweise große Infiltration von Zellen, vorwiegend polymorphonucleare leukocyten, und deren vergleichsweise großer Mangel an Fibringrundsubstanz ist aus der Aufnahme ersichtlich.

In Figur 3 wird eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht des Schnittbezirks gezeigt, die das Überwiegen von mononuclearen Zellen im Filtrat erkennen läßt, wobei die Dichte der Fibringrundsubstanz zu beachten ist in der Testgruppe 1, die mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt und mit einem elektromagnetischen Feld bestrahlt wurde.

Die Blutgefäße im Bezirk um die Einschnitte 2 sowohl der Testgruppe 2 als auch der Kontrollgruppe 2 der mit Histamin behandelten Ratten 1 erschienen mehr erweitert als diejenigen der Ratten 1, die nur mit Kochsalzlösung behandelt oder sowohl mit Kochsalzlösung als auch dem elektromagnetischen Feld behandelt worden waren. Es war mehr Fibrin in der Basis des Schnittbezirks der mit Histamin behandelten Kontrolltiere als dies bei den nur mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollratten der Fall war, wobei jedoch weniger Fibrin vorlag als im Schnittbezirk der Testratten 1, die sowohl mit Histamin als auch dem elektromagnetischen Feld behandelt worden waren. Es lagen nicht so viele weiße Blutkörperchen im Schnittspalt 2 der mit Histamin behandelten Kontrolltiere vor wie in den mit Kochsalzlösung behandelten Kontrolltieren. Noch weniger waren in den Einschnitten 2 der sowohl mit Histamin als auch einem elektromagnetischen Feld behandelten Testratten 1. Ferner lag eine größere Zahl an Fibroblasten in den Einschnitten 2 der mit Histamin behandelten Kontrolltiere als in denjenigen der mit Kochsalzlösung behandelten Kontrolltiere vor.

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Die Testgruppe Nr. 2 der mit Histamin und dem elektromagnetischen Feld behandelten Ratten 1 hatte eine vergleichbare Zahl an Fibroblasten wie die mit Histamin behandelten Kontrolltiere (vgl. die Figuren 3 und 4)·

In Figur 4 wird eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht des Schnittbezirks einer Ratte 1 der Testgruppe Nr · 2 gezeigt, die mit Histamin behandelt, jedoch nicht mit einem elektromagnetischen Feld bestrahlt wurde. Der Schnittbezirk enthält eine annähernd gleiche Zahl an polymorphonuclearen Zellen und mononuclearen Zellen.

In Figur 5 wird eine 450-fach vergrößerte Querschnittsansicht des Schnittbezirks einer Ratte 1 der Testgruppe Nr. 2 gezeigt, die mit Histamin behandelt und mit einem elektromagnetischen Feld bestrahlt wurde, wobei die Aufnahme eine große Menge an Fibrin und nur einige wenige verstreute mononucleare Zellen erkennen läßt.

Um die mit Hilfe eines elektromagnetischen Feldes bewirkten Effekte bei der Wundheilung zu verstehen, muß man sich die genaue Folge der bei der normalen Wundheilung auftretenden Stadien vergegenwärtigen. Obwohl die Wundheilung ein ausgiebiges Forschungsfeld über hunderte von Jahren war, ist die tatsächliche Folge der eintretenden Stadien erst seit den letzten 15 bis 20 Jahren bekannt. Es bleibt auch noch viel zu lernen übrig in bezug auf die funktionellen Prozesse, die dabei ablaufen.

L. J. Ordman und T. aillman (1966) beschreiben unter der Überschrift "Studies in the healing of cutaneous wounds", 1. "The Healing of incisions through the skin of pigs" in Arch. Surg. 93 (6), Seiten 857 bis 882, Untersuchungen über die normale Folge von Prozessen, die bei der Heilung von Hautwunden in jungen Schweinen auftreten. Sie fanden, daß am ersten Tage polymorphonucleare Leukocyten vorlagen über die gesamte Länge und

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Tiefe des Einschnitts und kontinuierlich mit dem Blut- und Fibringerinnsel, das die Oberfläche des Einschnitts bildete· Epithelbögen begannen den Schnittspalt zu überbrücken. Am zweiten Tag hatten mononucleare Zellen die polymorphonuclearen Zellen ersetzt und es waren phagocytierende Zellen und Bruchstücke im Schnittbereich. Am dritten Tage wurden vertikal orientierte, spindelförmige, mononucleare Zellen und argyrophile Fibrillen zum ersten Mal beobachtet zusammen mit runden Zellen im Einschnitt. Vertikal orientierte Fibroblaste wurden am vierten Tag beobachtet und Mitosen waren maximal innerhalb de3 intra-inzisionalen neuen Bindegewebes.

Die Ergebnisse der angegebenen erfindungsgemäßen Tests werden in der folgenden Tabelle aufgeführt, wobei mit ^H+^H Werte von minimal (+) bis maximal (++++) bezeichnet werden.

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weiße Handhabungs-

Blut- Fibro- Macro- fähigkext der

zellen blaste phagen Fibrin Wundkanten

Kontrollvers· + Kochsalz

Kontrollvers. + Histamin

oo EM—Feld + Kochsalz

O I

° EM-Feld + Histamin co

NJ

CD CD

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Die Ergebnisse zeigen, daß eine geringere Infiltration von polymorphonuclearen weißen Blutzellen in die Einschnitte beider Testgruppen erfolgte im Vergleich zu den Kontrollgruppen· Andererseits lagen sehr viel mehr Pibroblaste und Macrophagen in den Einschnitten der Testgruppen vor als in den Kontrollgruppen. Dies legt die Annahme nahe, daß die Wunden der Testtiere denen der Kontrollgruppen im Heilungsprozeß einen ganzen Tag voraus waren, wenn diese Befunde verglichen werden mit der von Ordman und Gillman in der angegebenen Druckschrift beschriebenen Folge von Stadien in der normalen Wundheilung. Außerdem bildet die in den Schnittwunden der Testtiere vorhandene größere Fibrinmenge möglicherweise eine stärkere Stützstruktur für den künftigen Heilungsprozeß.

Es zeigt sich, daß Histamin für die normale Wundheilung wesentlich ist. Obwohl dessen Funktion im Heilungsprozeß noch nicht völlig aufgeklärt ist, ist doch bereits bekannt, daß Histamin eine Erweiterung der Kapillaren im Körper und eine Erhöhung der Permeabilität der feinen Gefäße auf der Venenseite des Kapillarbettes bewirkt. Es kann nicht gesagt werden, wie der genaue Mechanismus ist, in dem Histamin bei der erfindungsgemäßen Beeinflussung der Wundheilung wirkt. Ein besonderer Vorteil, der durch die erfindungsgemäße Behandlung mit Histamin erzielt wird, ist die erhöhte Handhabungsfähigkeit der Wundkanten. Da eine falsche örtliche Lage eingeschnittener Haut einer der Gründe für verzögerte Wundheilung ist, stellt die Möglichkeit, dies zu verhindern, einen zusätzlichen Vorteil in der Wundbehandlung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, wobei die Tatsache, daß die Behandlung mit einem elektromagnetischen Feld und Histamin den übrigen Wundbehandlungen, einschließlich der Testwundbehandlung, bei der nur mit einem elektromagnetischen Feld und einer physiologischen Kochsalzlösung behandelt wird, überlegen ist, bedeutet einen weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.

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Obwohl das Verfahren der Erfindung anhand von Tests erläutert wurde, in denen die Erzeugung von Kollagenmaterial zur Schließung von Läsionen in Ratten gezeigt wurde, ist es selbstverständlich auch zur Erzeugung von Kollagenmaterial zur Schließung von Läsionen in anderen Lebewesen, insbesondere bei Menschen, anwendbar.

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Claims

Patentansprüche

1 .y Verfahren zur Erzeugung von Kollagenmaterial zum Verschließen von Verletzungen, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Verletzung Histamin aufbringt und die die Verletzung begrenzenden Gewebezellen mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt, welche im nicht—ionisierenden Frequenzbereich liegt und eine Intensität/uS^er 1 Milliwatt hat, zur Förderung der Bildung von Kollagenmaterial durch die Gewebezellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Histamin, in Form von Histamindiphosphat verwendet,
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gewebezellen mit einer 27 MHz-elektromagnetischen Strahlung einer Elektrode, die 15 Minuten lang nahe an die Gewebezellen gehalten wird, bestrahlt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das elektromagnetische Feld von einer Elektrode ausstrahlen läßt, bei der es sich um eine Stabelektrode handelt, und daß man die Elektrode längs der Läsion anordnet.
5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Ansprüchen 1 bis 4> gekennzeichnet durch Mittel zum Aufbringen von Histamin auf die Verletzung, Mittel zur Bestrahlung der die Verletzung begrenzenden Gewebezellen mit elektromagnetischer Strahlung und einen an die Mittel zur Bestrahlung der Gewebe-^ gellen mit Strahlung im nicht-ionisierenden Frequenzbereich und einer Intensität von unter 1 Milliwatt angeschlossenen Generator für elektromagnetische Energie·
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel Ztum Aufbringen von Histamin die Aufbringung von Hista*

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mindipho sphat e rmö gli cht ·
7· Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Bestrahlung der Gewebezellen eine Elektrode ist und der Generator für elektromagnetische Energie eine elektromagnetische Strahlung von 27 MHz erzeugt zur Aussendung aus der Elektrode,
8. Vorrichtung nach Anspruch 5_V dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zur Bestrahlung der Gewebezellen eine Stabelektrode ist·

9· Mittel zur Erzeugung von Kollagenmaterial zum Verschließen von Verletzungen bei Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4-, bestehend aus einer Lösung von Histamin bzw« einer löslichen Histaminverbindung, insbesondere Histamindiphosphat, insbesondere in einer Konzentration von 0,5 bis 2 mg/ml.

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