DE2334067A1

DE2334067A1 - Kieselgelduennschichtplatten

Info

Publication number: DE2334067A1
Application number: DE19732334067
Authority: DE
Inventors: Hans-Hinrich Althaus; Volker Prof Dr Neuhoff
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1973-07-04
Filing date: 1973-07-04
Publication date: 1975-01-23

Description

Patentanwälte Dipl.-Ino. F.¥eick^ann, 2334067

Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr. K. Fincke Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

Case 6J 192/HtM

Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.T., 34 Göttingen, Bunsenstraße 10

Kieselgeldünnschxchtplatten

Die Erfindung betrifft Kieselgeldunnschichtplatten, d.h. für die Dünnschichtchromatographie geeignete Platten, die mit einer dünnen Schicht aus Kieselgel (Silicagel) versehen sind, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung.

In der Regel werden Kieselgeldünnschxchtplatten mit Gipszusätzen hergestellt, um eine Haftung des Kieselgels auf der Unterlage, die aus Glas, Kunststoff, Aluminium oder dergleichen bestehen kann, zu erreichen. Eine besondere Haftfähigkeit des Kieselgels auf der Unterlage ist dann erforderlich, wenn für die Mikrochromatographie Mikroplatten auf Deckgläschen hergestellt werden sollen, die Abmessungen von 24 χ 32 mm oder 24 χ 48 mm besitzen. Diese Mikroplatten sind äußerst empfindlich und in der Praxis und bei Routineuntersuchungen von Nachteil. Die dünne Kieselgelschicht kann beim Auftragen der Probe mit Mikropipetten sehr leicht beschädigt werden, so daß die Probe nicht ausreichend an der Platte anhaftet. Demzufolge ist bei der Handhabung derartiger Mikroplättchen besondere Vorsicht geboten. Auch führt die Verwendung von Gips als Bindemittel zu

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Nachteilen, da das Verhalten der Kieselgelschicht durch die Gipszu tze verändert wird und erst bei hohen Gipszusätzen wirklich haftfeste Schichten erhalten werden.

Aus dem Artikel von M. Kates, "Techniques of Lipidology Isolation, analysis and identification of lipids" in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", North-Holland Publishing Co., Inc., New York, Seite 412 (1972) ist es bereits bekannt, Papier mit Natriumsilicatlösungen zu behandeln, um diesem besondere Trenneigenschaften zu verleihen, wodurch die papierchromatographische Trennung von Idpiden verbessert werden sollte.

Aufgabe der Erfindung ist es, die genannten Nachteile zu überwinden und insbesondere Kieselgeldunnschichtplatten bereitzustellen, die auch für die Mikrodünnschichtchromatographie geeignet sind und deren Kieselgelschicht ohne Beeinträchtigung der Trennqualität so fest an dem Substrat anhaftet, daß die Platten ohne besondere Vorsicht gehandhabt werden können.

Es wurde nunmehr gefunden, daß Kieselgeldunnschichtplatten mit wäßrigen Alkalimetallsilicatlösungen, vorzugsweise Natriumsilicatlösungen, in hervorragender Weise imprägniert und fixiert werden können, ohne daß dadurch die chromatographischen Eigenschaften der Kieselgelschicht beeinträchtigt werden.

Die Erfindung betrifft demzufolge Kieselgeldunnschichtplatten, die durch eine Imprägnier- und Fixier-Schicht aus einem Alkalimetallsilicat gekennzeichnet sind. Vorzugsweise verwendet man als Alkalimetallsilicat wasserlösliches Natrium- oder Kaliumsilicat, noch bevorzugter Wasserglas, einem aus einem Schmelzfluß glasig erstarrten wasserlöslichen Silicat mit 2 bis 4 Mol-% SiOp auf 1 Mol Na-O bzw. KpO. Als bevorzugtestes Material dieser Art setzt man wasserlösliches Natriumsilicat ein.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Kieselgeldunnschichtplatten, das darin besteht, daß man

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in üblicher Weise mit Kieselgel beschichtete Dünnschichtplatten durch Besprühen oder durch chromatographischen Vorlauf mit einer Alkalimetallsilicatlösuhg, vorzugsweise einer Wasserglaslösung, behandelt und trocknet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die in üblicher Weise mit Kieselgel beschichteten Dünnschichtplatten mit einer Lösung von etwa 1 Volumenteil Wasserglas in etwa 20 Volumenteilen Wasser vorchrornatographiert und getrocknet. Einer weiteren bevorzugten Ausführungsform entsprechend werden die in üblicher Weise mit Kieselgel beschichteten Dünnschichtplatten mit einer Lösung aus etwa 15 Volumenteilen Wasserglas, etwa 70 Volumenteilen Wasser und etwa 0,8 bis 1 VoIumenteil konzentrierter Chlorwasserstoffsäure besprüht und getrocknet.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Kieselgeldünnschichtplatten zur dünnschichtchromatographischen Trennung von Phospholipiden und neutralen Lipiden (Neutralfette).

Wenn man die in üblicher Weise hergestellten Kieselplatten erfindungsgemäß mit einem Alkalimetallsilicat behandelt, erhält man Kieselgeldünnschichtplatten mit ideal anhaftender Kiesel— gelschicht, die selbst dann haften bleibt, wenn die Platten auf den Boden fallen. Überraschenderweise wird die Trennung an mit Natriumsilicat in erfindungsgemäßer Weise imprägnierten Platten nicht beeinträchtigt, sondern, wie es aus dem Beispiel für die Trennung von Phospholipiden ersichtlich ist, eher verbessert.

Erfindungsgemäß sind Alkalimetallsilicatlösungen,vorzugsweise Wasserglaslösungen, auch hervorragend als inerte Sprühmittel für die Fixierung von Kieselgelplatten geeignet. Dafür verwendet man beispielsweise eine Lösung aus etwa 15 Volumenteilen Wasserglas, 70 Volumenteilen Wasser und 0,8 bis 1 Volumenteil konzentrierter Chlorwasserstoffsäure. Nach dem Besprühen und Trocknen erhält man Kieselgeldünnschichtplatten mit einer

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äußerst gut anhaftenden Kieselgelschicht. Im Gegensatz zu Sprühmitteln auf Kunststoffbasis (z.B. das von der Firma Merck erhaltene Material Neatan), die sich bei der Darstellung von Lipiden mit Joddampf homogen braun färben, bleibt der Untergrund der erfindungsgemäßen, mit Alkalimetallsxlicatlosung besprühten oder imprägnierten Platten völlig klar. Die in der erfindungsgemäßen Weise mit Natriumsilicat behandelten Platten sind darüber hinaus auch gegen aggressive Nachweisreagentien, wie 50%-ige HpSO₄ oder Hanes-Reagens, stabil. Wegen ihrer homogenen und stabilen Oberfläche können die erfindungsgemäß imprägnierten oder fixierten Platten im Mikro- oder im Makromaßstab auch für die Herstellung von Autoradiogrammen eingesetzt werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung der Mikrochromatoqraphxeplatten

30 g Kieselgel (Silicagel Camag D-O) wurden in 130 ml einer Chloroform/Methanol-Mischung (2/1) suspendiert. Normale Deckgläschen mit einer Größe von 24 χ 48 mm wurden mit Aceton gereinigt. Durch Eintauchen dieser Deckgläschen in die Kieselgel-Suspension wurde eine dünne Kieselgelschicht auf die Glasplatte aufgetragen und dann an der Luft getrocknet. Anschließend wurde diese äußerst empfindliche Kieselgel-Schicht mit Wasserglas imprägniert. Dazu wurde das Deckgläschen in ein 50 ml-Becherglas eingebracht, dessen Boden mit einer eiskalten Wasserglaslösung (1 Volumenteil Wasserglas in 20 Volumenteilen Wasser) bedeckt war. Durch aufsteigende Chromatographie ließ man die Lösung die Oberkante des Deckgläschens erreichen, das anschließend an der Luft getrocknet wurde. Vor der eigentlichen Verwendung wurden die imprägnierten beschichteten Plättchen durch Chromatographie in umgekehrter Richtung mit einer Mischung aus 6 Volumenteilen Chloroform mit 3 Volumenteilen Methanol und 3 Volumenteilen Essigsäure vorgereinigt. Anschließend wurden die obersten 4 mm der Schicht abgekratzt. In dieser Weise wurden Verunreini-

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gungen entfernt, die den Nachweis aufgetrennter Materialien in der Nähe der Lösungsmittelfront durch Joddämpfe beeinträchtigen könnten. Nach der letzten Trocknung an der Luft können die Plättchen mehrere Tage an der Luft gelagert werden, ohne daß sie ihre Trenneigenschaften verlieren.

Beispiel 2 Chromatographie von Phospholipiden und Neutrallipiden

Auf die in dieser Weise behandelten Kieselgeldünnschichtmikroplättchen wurden geringe Volumen von Phospholipide und neutrale Lipide enthaltenden Chloroform/Methanol—Extrakten in der von H.G. Schiefer und V. Neuhoff ("Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem.", 352, Seite 913 bis 926) beschriebenen Verfahrensweise aufgebracht. Das Auftragen der zu untersuchenden Lösungen auf die erfindungsgemäßen, mit Natriumsilicat imprägnierten Platten erfolgte viel leichter und daher schneller, als es bei den üblichen Mikroplättchen der Fall ist. Zur eindimensionalen Trennung von Phospholipiden und neutralen LIpiden wurde eine stufenweise Entwicklungstechnik angewandt. Die erste Entwicklung erfolgte mit einer Lösungsmittelmischung aus 65 Volumenteilen Chloroform, 35 Volumenteilen Methanol, 3,6 Volumenteilen Wasser und 2 Volumenteilen Essigsäure, bis die Lösungsmittelfront 2O mm weit gewandert war. Nach Trocknen mit Hilfe eines Stickstoffstroms erfolgte eine zweite Entwicklung in der gleichen Richtung mit einer Chloroform/Methanol/Wasser/Essigsäure/Aceton-Mischung (6O/25/5,3/lo/5 Volumenteile) bis zu einer Wanderungsstrecke der Lösungsmittelfront von 30 mm. Anschließend wurde die Platte erneut getrocknet, und es erfolgte eine dritte Entwicklung zur Trennung der Neutralfette bis zur oberen Kante der Platte mit einer n-Hexan/Diäthyläther/Essigsäure-Mischung (7O/3O/l). Die aufgetrennten Flecken konnten dann entweder mit Joddampf, Hanes-Reagens [C.S. Hanes und F.A. Isherwood, "Nature", 16_4, Seite 1107 bis 1112 (1949)] oder anderen Sprühreagentien, wie Schwefelsäure oder Fluoreszenzfarbstoffen, sichtbar gemacht werden.

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Die erfindungsgemäß mit Alkalimetallsilicat behandelten Kieselgeldünnschichtplatten besitzen eine hervorragende Stabilität, die sie zur Herstellung von Autoradiogrammen von Chromatogrammen nach der Trennung radioaktiv markierter Extrakte geeignet macht. In der beigefügten Fig. 1 ist ein Mikrochromatogramm eines Chloroform/Methanol-Extraktes (2/Ί Volumen/Volumen) eines Zellmaterials von Neurospora crassa (mutant), das mit 32_p inkubiert worden war, dargestellt. Die Fig. 1 zeigt das Mikrochro-

in Originalgröße , _x

matogramm/nach flem Färben mit Jod (a) und das durch 6—stündi-

' in Originalgröße

ges Belichten erhaltene Autoradiogramm/Xb) des Mikrochromatogramms. An der mit I bezeichneten Stelle wurde eine Mischung aus reinen Phospholipiden aufgetragen, die zu den mit 1 bis 6 bezeichneten Flecken getrennt wurde, nämlich

1. Sphingomyelin

2. PhosphatLdylcholin

3. Phosphatidylinositid

4. Phosphatidylserin

5. Phosphatidyläthanolamin

6. Cardiolipin.

An der mit II bezeichneten Stelle wurde der genannte Zellex— trakt aufgetragen.

Beispiel 3

In der Fig. 2 ist das durch eindimensionale Chromatographie auf einem gemäß Beispiel 1 mit Natriumsilicat imprägnierten Mikrodünnschichtplättchen erhaltene Mikrochromatogramm einzelner Phospholipide angegeben, die durch Besprühen mit Hanes-Reagens sichtbar gemacht wurden. Die angegebenen Flecken stehen für

1. Sphingomyelin

2. Phosphatidylcholin

3. Phosphatidylinositid

4. Phosphatidylserin

5. Phsophatidyläthanolamin

6. Cardiolipin und

7. Mischung aus den Substanzen 1 bis 6.

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Es ist ersichtlich, daß selbst Phosphatidylinositid und Phosphatidylserin, die normalerweise auf einer Mikroplatte sehr schwierig zu trennen sind, mit der erfindungsgemäßen Mikrokie— selgeldünnschichtplatte ohne weiteres getrennt werden können.

Beispiel 4

Die Fig. 3 stellt das durch eindimensionale MikroChromatographie mit Hilfe eines gemäß Beispiel 1 hergestellten Kieselgeldünn schichtplättch ens erhaltene Mikrochromatogramm von neutralen Lipiden und Phospholipiden dar, das mit Joddampf gefärbt wurde. An den mit den römischen Ziffern I bis V angegebenen Stellen wurden folgende Produkte aufgetragen:

I· Mischung aus reinen Phospholipiden II. Gehirnextrakt
III. Herzextrakt
IV. Leberextrakt
V. Nierenextrakt.

Die aufgelösten Flecken 1 bis 7 und NL stehen für

1. Sphingomyelin

2. Phosphatidylcholin

3. Phosphatidylinositid

4. Phosphatidylserin

5. Phosphatidyläthanolamin

6. Cerebroside

7. Cardiolipin

NL Neutrale Lipide.

Aus den vorhergehenden Beispielen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Imprägnierung und Fixierung von Kieseigeldünnschichtplatten mit Natriumsilicat besonders vorteilhaft zur Herstellung von Mikrodünnschichtchromatogrammplatten ist. Die ■ Stabilität der Platten wird dadurch so weit verbessert, daß diese so leicht wie die üblicherweise eingesetzten Makroplatten gehandhabt werden können. In dieser Weise können die großen Vorteile des Mikrotrennverfahrens, d.h. die hohe Empfindlichkeit und die sehr kurze Trennzeit (10 bis 15 Minuten) nutzbar

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gemacht werden. Das Auftragen einer Probe ist nicht schwierig, da die in dieser Weise stabilisierte Schicht nicht so leicht beschädigt wird und da die Kieselgelkristalle die Spitze der zum Auftragen der Materialien verwendeten Kapillare nicht verstopfen können, da das Kieselgel fest an der Glasplatte anhafttet. Weiterhin ergibt sich auch hier für Mikrodünnschichtplatten die Möglichkeit zur Herstellung von Autoradiogrammen.

Die erfindungsgemäße Imprägnierung oder Fixierung der Kieselgeldünnschichtplatten hat keinen Einfluß auf die quantitative Bestimmung der zu chromatographierenden Materialien, da das verwendete Alkalimetallsilicat ein relativ inertes Imprägniermittel und Fixativ ist. Das Material ist farblos und gegenüber den verwendeten Nachweis-Reagentien, z.B. Schwefelsäure, inert. Die erfindungsgemäß mit Alkalimetallsilicat imprägnierte oder besprühte Kxeselgeldunnschichtplatte kann in gleicher Weise wie eine nicht-fixierte Platte zum Nachweis mit Joddampf behandelt werden, was im Fall von Dünnschichtplatten, die mit organischen Fixierlösungen besprüht wurden, nicht möglich ist, da hier der Joddampf die gesamte Dünnschichtplatte gleichmäßig braun färbt.

Im übrigen wird die Trennqualität der erfindungsgemäß mit Natriumsilicat behandelten Kxeselgeldunnschichtplatten nicht beeinträchtigt, sondern, wie aus den Beispielen 2 bis 4 ersichtlich, eher verbessert.

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Claims

Patentansprüche

Kieselgeldünnschichtplatte, gekennzeichnet durch eine Imprägnier- und Fixierschicht aus Alkalimetallsilicat.
2.) Kieselgeldünnschichtplatte gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Alkalimetallsilicat ein wasserlösliches Natrium- oder Kaliumsilicat ist.
3.) Kieselgeldünnschichtplatte gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Alkalimetallsilicat Wasserglas ist.
4.) Verfahren zur Herstellung der Kieselgeldünnschichtplatte gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine in üblicher Weise mit Kieselgel beschichtete Dünnschichtplatte durch Besprühen oder durch chromatographischen Vorlauf mit einer wäßrigen Alkalimetallsilicatlösung behandelt und trocknet.
5.) Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkalimetallsilicatlösung eine Lösung von Natrium- oder Kaliumsilicat in Wasser verwendet.
6.) Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkalimetallsilicatlösung eine Wasserglaslösung verwendet.
7.) Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die in üblicher Weise mit Kieselgel beschichtete Dünnschichtplatte mit einer Lösung von etwa 1 Volumenteil Wasserglas (DAB 6 Qualität) in etwa 20 Gewichtsteilen Wasser vorchromatographiert und trocknet.
8.) Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die in üblicher Weise mit Kieselgel beschichtete Dünnschichtplatte mit einer Lösung aus etwa

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15 Volumenteilen Wasserglas, etwa 70 Volumenteilen Wasser und etwa 0,8 bis 1 Teil konzentrierter Chlorwasserstoffsäure besprüht und trocknet.
9. ) Verwendung der Kieselgeldünnschichtplatte gemäß Anspruch zur dünnschichtchromatographischen Trennung von Phospholipiden und neutralen Lipiden.

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