DE2317680A1 - Glucose-isomerase enthaltendes praeparat - Google Patents

Description

DipL-Phys. CLAUS PÖHLAU ^ O 1 7 C O Λ

DipUeg.FRANZ LOHRENTZ ^O I / 0 O U

8500 NORNBERQ KESSLERPLATZ 1

Novo Terapeutisk Laboratorium A/S, DK-2880 Bagsvard, Dänemark

Glucose-Isomerase enthaltendes Präparat

Die Erfindung betrifft eine enzymatisch^ Umwandlung von Glucose in Fruktose, d.h. die Isomerisierung von Glucose unter Verwendung eines fein zerteilten, Glucose-Isomerase enthaltenden Präparats.

Das erfindungsgemäße Präparat wird durch ein Träger-Gel aus einem vernetzten Polymerisat eines wasserlöslichen Acryl-Monomeren gebildet und erhält hierin etwa 1 bis 50 % w/v (w/v = Gewicht in Volumenkonzentration), bezogen auf das Gel-Volumen, hitzebehandelte, mit Kobelat aktivierte, ganze Zellen von einem Glucose-Isomerase enthaltenden Mikroorganismus.

Es ist bekannt, daß Glucose-Isomerase Mais-Sirupe mit hohem Gehalt an Pruktose erzeugt. Das kommerzielle Interesse an isomerisierten Sirupen wäre weit größer, wenn die Kosten für das Enzym herabgesetzt werden könnten und für die Herstellung eines Präparats für die Glucose Isomerisierung besonders wirtschaftliche Verfahren zur Verfügung stünden.

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Gewisse Wege zur Senkung der Kosten für das Enzym und das Verfahren (je Einheit an isomerisiertem Sirup) legen sich fast selbst nahe: so

a) Wiederverwendung des Enzyms,

b)- Ausschaltung der Bildung von Nebenprodukten, z.B. Farbe, Acidität, , .

c) Höchstmögliche Reaktionsgeschwindigkeit. -

Alle diese Wege lassen sieh in der Theorie beschreiten, zumindest, wenn die Glucose-Isomerase immobilisiert und zu einem Teil eines festen, wasserunlöslichen Trägers gemacht werden kann. Große Teilchen des enzymhaltigen Trägers oder Gels können zur Isomerisierung in Form einer Kolonne für kontinuierlichen Betrieb oder als fein zerteilte Suspension oder als Bett von fein zerteilten Teilchen im Batch-Betrieb zur Anwendung gelangen. Bemühungen in dieser Richtung wurden bereits beispielsweise von »Strandberg et al., "Applied Microbiology", Bd. 21, Seiten 588-5951 unternommen, die aber vom freien, löslichen Enzym ausgingen. Werden die löslichen Enzyme immobilisiert, dann erleidet man aber erhebliche Verluste an enzymatischem Wirksamkeit, vielleicht wegen der Unzugänglichkeit des Substrats, vielleicht wegen des Verlustes an Enzym im Träger während der sich an die Herstellung des Trägers anschließenden Behandlung. In Bezug auf die Glucose-Isomerase tritt zur Immobilisierung noch ein weiterer Nachteil hinzu, weil Glucose-Isomerasen aus mikroorganischen Quellen eine umfangreiche Behandlung zur Gewin-mng des freien, löslichen Enzyms erfordern. Tatsächlich sind an mikrobielle Zellen gebundene Glucose-Isomerasen anfänglich in einem teilweise

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immobilen Zustand zugänglich. Daher besteht das Ziel der Erfindung in einem Verfahren zur Immobilisierung der ganzen Zelle innerhalb eines Träger-Gels, derart, daß sich eine hohe Wirksamkeit je Gramm Gel-Produkt ergibt. Direkt immobilisierte Zellen stellen zumindest potentiell ein verhältnismäßig billiges Enzym dar, w&il die Reinigung entfällt und weil die .- gegenüber dem freien Enzym - verhältnismäßig großen Zellen der Mikroorganismen die Immobilisierung in einem lockeren Träger-Gel mit nur wenig Träger-Material ermöglichen.

So bilden gemäß der Erfindung Zellen und Zellen-Fragmente 1 bis 50 5*> ^w/v <js Volumen des Träger-Gels^ der Rest ist ein vernetztes Polymerisat aus einem wasserlöslichen Acrylmonomeren. Es existiert eine große Reihe von Gel-Systemen und viele sind zur Immobilisierung von mikroorganischen Zellen, ihren Fragmenten und sogar löslichen, freien Enzymen vorgeschlagen worden. Die im Rahmen der Erfindung in Betracht gezogenen Gel-Systeme basieren auf einem Träger aus einem vernetzten Polymerisat eines wasserlöslichen Acrylmonomeren. Diese Träger-Systeme werden nachfolgend beschrieben:

1· Monomere; Alle wasserlöslichen Monomeren der Acrylsäure oder. deren Salzen, allein oder in Kombinationen, können eingesetzt worden.· Beispiele für solche Monomeren sind: Acrylsäure, Methacrylsäure, 2-Chloracrylsäure, Acrylnitril, Äthylacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, N-Methy1-, Methylol-, Isopropyl- oder Diäthylacrylamid und dergleichen. Das bevorzugte Monomere ist aber Acrylamid.
?. Vernetzungsmittel; Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, N,N*-Diallyl-

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w.einsäure-diamid, Ä'thylen-diacrylat und andere wasserlösliche Diallyl-Derivate können verwendet werden j bevorzugt wird Η,Ν¹-Methylen-bis-acrylamid..

3· Katalysatoren: Eine große Anzahl an Katalysator-Systemen steht, für die Zwecke: der Erfindung zur Verfugung. Nur wenige seien genanntr 1) Ionisierende Strahlung, wie X- und ^-Strahlen, 2) Ultra-Schallwellen, 3) Photosensibilisatoren, wie Riboflavin, H₂O₂, Fe⁺⁺⁺, Azo-Farbstoffe usw., 4) Thermische Initiatoren, wie Peroxide, Persulfate, Perborate, Chlorate, Percarbonate usw., 5) Redox-Systeme mit Oxidationsmitteln, wie Bromaten, Ohioraten, Perchloraten, Persulfaten, Pe⁺"¹"¹", Ce⁺⁺⁺ usw., und Reduktionsmitteln, wie Sulfiten, Metabisulfiten, Thiosulfaten, Aminen, Alkoholen usw.. Das bevorzugte System ist aber Persulfat und Ν,Ν,Ν¹,N'-Tetramethyläthylen-diamin»

4. pH: Er ist nicht kritisch und zwischen etwa 4 und etwa 10 kann Jeder pH-Wert eingestellt werden. Bevorzugt ist aber ein pH-Wert im Bereich von 6 bis 8. Andere Bereiche können bei ande-

' ren Katalysator-Systemen notwendig werden_o

5. Temperatur: Sie beeinflußt hauptsächlich die Gelier-Zeit (siehe Tabelle 1) und ist gleichfalls nicht kritische Sie kann irgendwo zwischen 0 und 100⁰O gehalten werden. Die bevorzugte obere Grenze liegt jedoch etwa bei 80⁰O₀

6. Konzentration des Monomeren; Sie wirkt sich hauptsächlich auf die Porengröße aus und kann sich über einen weiten Bereich von etwa 2 bis 60 % bewegen» Der bevorzugte Bereich beträgt aber 5 bis 20 % w/v, bezogen auf das Gel-Volumen.,

7. Konzentration des Vernetzungsmittel s Ihr Einfluß erstreckt sich in der Hauptsache auf die Härte des GeIs₅ sie variiert zwi™

30 9844/1044 . ■

scnen etwa 1 bis etwa 20 % w/w (w/w = Gewicht in Gewichtskonzentration), bezogen auf das Monomere· Der bevorzugte Anteil ist jedoch 5 #·

8. Konzentration der Zellen: Diese kann vorteilhaft zwischen etwa 1 bis etwa 50 # w/v, bezogen auf das Gel-Volumen, schwanken. Bevorzugt ist der Bereich von 10 bis 3Q % w/v. 9· Konzentration des Katalysators; Sie ist hauptsächlich auf die Gelier-Zeit von Einfluß und sollte entsprechend der Temperatur, der Monomeren-Konzentration und der gewünschten Polymerisations-

zeit ausgewählt werden. Tabellen 2 und 3 geben die Erläuterung.

Tabelle 1

Wirkung der Temperatur auf die Gelier-Zeit. Anfangstemperatur ⁰O .Höchsttemperatur ⁰G ■Gelier-Zeit in Sek.

2 6 1250

22 71 90

35 : 76 30

45 88 17

55 98 15

Block-Polymerisation von 10 ml Gel, das 20 % Acrylamid, 1 % Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 0,5 % N,N,N¹,N'-Tetramethyläthylendiamin, 0,25 # Ammoniumpersulfat und 10 % Zellen bei pH = 7_?2 enthält.

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Tabelle- 2
Wirkung der Persulfat-Konzentration auf die Gelier-Zeit.

Ausgangs-Teurperatur

2⁰G

22⁰C

35

55°G

Persulfat

Höchst- Gelier- Höchst- Gelier- Höchst- Gelier- Höchst- Gelier- Höchst- Gelier-Temp. Zeit Temp. Zeit Temp. Zeit

Temp.

Sek.

Sek.

Zeit
Sek.

Temp. ο,

Zeit Sek.

0,05
0,1

0,4
0,5

12

17

3900

3000

1960

960

630

62 70 71 73 74

340

325

130

50

40

63 74

75 16 11

75
4Q

25
15
10

83 90

95 98

99

35 30

15 8

Bedingungen wie in Tabelle

IM

CD OO O

Tabelle 3 Wirkung: der. Konzentration von N,N,N' ,N^Tetramethyläthylen-diamin auf die Gelier-Zeit.

Ausgangs- _{0 0 Op} .,-O_n ,,O_n Tetroeratur 2C 22 C 35 O 45 O 55 O

j,- Höchst- Gelier- Höchst- Gelier- Höchst- Gelier- Höchst- Gelier- Höchst- Geliermethyläthylen- Temp. Zeit Temp. Zeit Temp. Zeit Temp. Zeit Temp. Zeit diamin % °_{Q Sek#} O_{0 ßeke} O_{0 gek#} o_{Q gek%} o_{c Sq}^

o> 0.1 ο

<° 0.2

ί 0.3

Ü 0.4

^ 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Bedingungen wie in Tabelle

3	10.800	68
3	5.400 .	71
4	3.000	72
7	1.800	73
7	1.200	73
12	780	73
15	480 ·	70
10	420	71
12	300	70
12	300	71

660.	61	150	80	45	97	35	I -<*	231,
320	66	70	82	35	97	15	I	CT) OO O
170	73	55	86	20	97	12
105	74	30	85	15	95	10
75	73	25	86	12	93	10
60	73	30	73	12	76	10
60	66	30	77	10	94	10
45	70	25	75 '	10	86	8
40	74	20	72	10	90	- 8
40	68	15	68	10	92	7

Wenn auch nach der Erfindung die Zelle eines Glucose-Isomerase enthaltenden Mikroorganismus wie ein geeigneter Träger für das Enzym mit der Größe von 1 bis 10 Mikron behandelt wird, so ist die Zelle doch kein inerter Träger. Die mit ganzen Zellen bewirkte Glucose-Isomerisation steht unter dem Einfluß verschiedener konkurrierender Reaktionen.. Beispielsweise entsteht Säure und der Sirup verfärbt sich. Darüber hinaus ist die Stabilität des Enzyms gering. Gemäß der Erfindung besteht weiter die Notwendigkeit, daß die Zellen vor ihrer Immobilisierung im Gel-Träger hitzebehandelt "und mit Kobalt aktiviert werden« Insbesondere wird eine ein Kobalt-Ion enthaltende wässerige Suspension der Zeilen einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur im Bereich von etwa 50 bis 100, vorzugsweise 60 bis 80°C, unterzogen. Der Gehalt an Kobalt-Ion, z.B. CoSO^, kann im Medium etwa 0_?001 bis 0,1 Mol betragen. ' Die Beziehung zwischen Behandlungs-Dauer und Behandlungs-Temperatur ist nicht bekannt, ausgenommen, daß sie sieh in qualitativer Hinsicht grob ;umgek:ehrt zur Behandlungstemperatur verhalt und in eine Zeitspanne von etwa 1 Sekunde bis 3 Stunden fällt. Dia Hitzebehandlung für den Bacillus sp. NRRL B-5351 beträgt z_eB. bei 70⁰O 60 Minuten.

Die mit Kobalt aktivierten, hitzebehandelten Zellen sind den unbehandelten überlegen, weil sie zu einer beschränkten Wiederverwendung bei der Glucose-Isomerisation befähigt sindξ aber die Zellen geben immer noch Farbstoff und Säure in den Sirup abo Ein höherer Grad von Überlegenheit zeigt sich bei den Zellen, die im Gel immobilisiert, mit Kobalt aktiviert und hitzebehandelt wurden. Gel^Teilchen isomerisieren einen Glucose~£irup unter verhältnis-

:■■ ■"■ ■ ' 30 9 8 44/1044 '. " .. .

mäßig geringer Erzeugung von Farbstoff und praktisch keiner Abgabe von Säu^e. Die Gel-Teilchen können wiederverwendet werden. Vorteilhafter Weise behalten die im Gel immobilisierten Zellen einen ansehnlichen Teil ihrer Enzym-Aktivität, d.h. etwa 50 #» zurück. »

Das erfindun^sgemäße Präparat kann nunmehr klarer in der Weise gekennzeichnet werden, daß es aus Teilchen eines Träger-Gels aus einem vernetzten Polymerisat aus einem wasserlöslichen Acryl-Monomeren besteht, das etwa 1 bis 50» vorzugsweise 10 bis $0 # w/v, bezogen auf das Gel-Volumen, an hitzebehandelten, mit Kobalt aktivierten, ganzen Zellen eines Glucose-Isomerase enthaltenden Mikroorganismus auf v/eist. Acrylamid ist das bevorzugte Acryl-Monomere. Mir eine Glucose-Isoraerisation im Batch liegen die bevorzugten Teilchen-Größen im Bereich von etwa 100 bis 15OO Mikron. Die Vorteile dieses Enzym-Produkts können wie folgt zusammengefasst werden:

1) Geringe Kosten, weil ein großer Teil dex Anfangs-Enzym- ' Aktivität der Zelle zurückbleibt,

2) Hohe Aktivität der Gel-Teilchen,

3) Geringe Bildung von Nebenprodukten während der Isomerisation der Glucose,

4) Das Gel ermöglicht die Anwendung hoher Isomerisations-Te.mperatur en, z.B. 70 - 80⁰G. Ein bevorzugter. Bereich für die Isomerisation ist 55 - 75°C·

5) Es können Teilchen fast Jeder Größe hergestellt werden, z.B. Größen für Kolonnen-Betrieb oder leicht suspendierbare, sich schnell absetzende Teilchen für den Batch-

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Betrieb.

Die Erfindung ist nicht auf besondere Arten von Mikroorganismen beschränkt. Praktisch alle zur Zeit bekannten mikrobiellen GIucose-Isomerasen sind zellgebunden, d.h. die Isomerase befindet sich in oder auf der Zelle (z.B. intrazellular). Die enzymatische Aktivität haftet an der Zellfraktion, wenn die Zellen des Mikroorganismus aus ihrem Nährmedium abgetrennt werden. Alle zellgebundenen Isomerasen werden als für die Erfindung geeignet angesehen. Es werden aber bestimmte mikrobielle Quellen bevorzugt, so die Bacillus species von NRRL B-5351. Andere bevorzugte Species sind Bacillus sp. NRRL B-5350 und Anthrobacter sp. NRRL B-3726.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 Herstellung des Gels.

Isomerasehaltige Zellen des Bacillus sp. NRRL B-5351 werden 60 Hinuten bei 7O⁰C in einer wässerigen Suspension, die 10 g/Liter GoSO..7 HpO gelöst enthält, hitzebehandelt. Die Zeil-Suspension (mit 85 bis 87 % Wasser) werden bei 70⁰O Ausgangstemperatur sprühgetrocknet. Das Präparat hat eine Isomerase-Aktivität von etwa 3000 Glucose-Isomerase-Einheiten/Gramm und einen Kobalt-Gehalt von 1,6 ^.

Bestandteile zur Herstellung des Gels:
.A. Behandelte Glucose-Isomerase-Zellen 1»9 kg

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B. Entionisiertes Wasser ' 8,5 Liter

C. Acrylamid 2,4 kg

D. Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid . 0,12 kg

E. N,N,N¹,N'-Tetramethyläthylen-diamin

(10-prozentige Lösung in Wasser) 0,6 Liter

F. Ammonpersulfat (10-prozentige Lösung in Wasser) 0,3 Liter

Beim Vermischen ergeben die Bestandteile A-E ein Gesamtvolumen von 13 Litern. Das pH wird mit NaOH auf etwa 7,2 eingestellt. Zu eiriem Liter des Gemisches werden 25 ml F hinzugefügt; dann wird die Mischung in eine Schale (30 χ 50 χ 50 cm) gegossen und bei etwa 25°0 gehalten. Die restlichen 12 Liter werden auf 0 bis 4 0 abgekühlt. Dann wird der Rest von F zugegeben und die Mischung in die Schale gegossen. Die Tiefe der Schicht beträgt etwa 8 cm. Die Polymerisation beginnt und die Temperatur steigt auf 66°C.

i<ach einer Reaktionszeit von etwa 20 Minuten wird das G_el mit einem Messer aufgeschnitten und zum Abkühlen auf 23°C über Nacht stehen gelassen. In diesem Zeitpunkt beträgt das Gewicht 12 kg. Der Zell-Gehalt ist etwa 15 # w/v.

Das Gel wird dann durch ein Sieb mit 0,6 mm Maschen gepresst. Die so entstandenen Teilchen werden durch Suspendierung in V/asser in in eine Grob- und eine Fein-Fraktion unterteilt. Die Grob-Fraktion mit einem Volumen von 12 Litern und 15 # Trockensubstanz wird aufgenommen; ihre Aufteilung nach Teilchengröße ergab:

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Teilchengröße in Mikron Über 707 707 - 5OO 5OO - 297 297 - 149 149 - 88 88 und darunter

Gehalt in Gewichtsprozent

. - 3 . 33 39 22

3-

Spuren

Herstellung des trockenen Gels. - .

8 Liter des oben beschriebenen Gels werden in einer Schale in einem Vakuumofen bei einer Temperatur von 35 "bis 40 G und einem Wasserdruck von 5 ^mm getrocknet; man erhält 1 kg trockenes Produkt . . ' ..-■■■.

J3eispiel 2

Isomerisation mit einem Zeil-Produkt und einem im GgI eingebetteten Produkt.
Reaktionsgefäß:

Ein 1-Liter Dreihalskolben mit Rührer wird in ein Wasserbad mit konstanter Temperatur gestellt. Der Kolben besitzt Vorrichtungen zum Einstellen des pH-Wertes und zum Aufrechterhalten einer Stickstoff-Atmosphäre oberhalb der Flüssigkeit _o Glucose-Sirup:

670 g

1g" 0,4 g 3 0 9844/1044

Dextrose.Hp MgSO₄.7 H₂O

GoSO₄.7 H₂O 0,1 g

Entionisiortes Wasser 550 ml.

Der pH-Wert wird mit HOl auf 6,7 eingestellt.-Gegebenenfalls wird der pH-Wert mit einer 1r-molaren Lösung von

NaSO_x aufrechterhalten.

Analysen-Methoden:

Der Umwandlungsgrad (oder die Umwandlung in #) wird definiert als die Konzentration von Fruktose dividiert durch die Anfangs-Konzentration von Dextrose multipliziert mit 100. Ji'ruktose und Dextrose werden polarimetrisch bestimmt. Die Farbbildung wird durch Ermittelung der optischen Dichte bei 400 nm ausgewertet.

Ergebnisse:

Versuch 1: Das . zellgebundene Produkt, hergestellt nach Beispiel

1 bei 67 G und einem pH-Wert von 6,7·

Enzym-Aktivität des Präparats: 5000 Glucose-Isomerase-Einheiten

je Gramm.

% Umwandlung

Enzym-Konzentration Reaktionszeit/Stunden

f: Zollen/p; Dextrose'

A 0,004

B 0,006

G 0,008

5	10	15	20
8	16	25	51
11	25	52	40
16	55	41	45

309844/1044

8	17	25	33
14	30	42	48
20	36	47	50

Versuch Zi In Acrylamid eingebettetes Enzym, hergestellt nach Beispiel 1. Nasse Form, bei 67°0, pH =6,7.

# Umwandlung

g Präparat (trocken) Reaktionszeit/Sfunden

.je Gramm Dextrose 5 10 15 20

0,019 0,038 0,048

Versuch J: In Acrylamid eingebettetes Enzym, hergestellt nach Beispiel 1. Trockene Form. Grobe Teilchen, bei 67°C, pH = 6,7«

°fc Umwandlung

g Präparat (trocken) Reaktionszeit/Stunden

.je- Gramm Dextrose 5 .10 15 20

0,020 0,039 0,049

Auswertung der Aktivität des eingebetteten Enzyms; Die Versuche 1-3 zeigen, daß 0,008 g zellgebundenes Enzym 0,038 g (Trockensubstanz) eingebettetem Enzym (Naß-Form) und diese 0,039 g trockenem, eingebettetem Enzym entsprechen. Da die Zellen etwa 40 Gew.% des trockenen Gels ausmachen, sind etwa 50 % der enzymatischen Aktivität der Zelle im Gel-Präparat nachgewiesen. ·

Beispiel 3a Very/encamp; des in Acrylamid eingebetteten Enz7/m-Pr.^::p£irate· nach Beispiel 1 in einer Kolonne.

900 g (Trockensubstanz) eingebettetes Enzym (Naß-Präparat) wer-

3098 4 4/1044

8	17	24 .	32
15	29	42	48
20	36	48	50

cten in eine Glas-Säule von 10 cm Durchmesser bis auf eine Höhe von etwa 85 cm gepackt. Die Kolonne wird ummantelt und konstant bei 61°0 gehalten.

Dextrose-Sirup der unten beschriebenen Zusammensetzung wird mit einer Geschwindigkeit von 880 ml/Stunde durch die Säule gepumpt; die Zusammensetzung des Ausfließenden wird periodisch untersucht.

Zusammensetzung des Dextrose-Sirups: Dextrose 220 g

KaSO 0,15 g

CoS0₄.7 H₂O 0,04 g

MgSO^.7 H₂O 0,4 g

Entionisiertes Wasser 180 ml pH 7,0

Stunden Gesamtvolumen des. Ausfließen den in Liter

Umwandlungsgrad des Aus fließenden #

Farbe des
Ausfließenden OD₄₀₀ nm

pH des

Ausflies-

senden

24	21	45	0,03	6,6
48·	42	^7	0,01	6,6
72	63	49	0,01	6,6
96	84	49	0,01	6,6
120	105	47	0,01	6,6
240	210	46	0,01	6,6

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•Beispiel 3b

Verwendung des in Acrylamid eingebetteten Enzym-Präparats nach Beispiel 1 in einer Kolonne.

27 g (Trockensubstanz) eingebettetes Enzym (Naß-Präparat) werden in eine Glas-Säule auf eine Betthöhe von 40 cm bei einem Kolonnendurchmesser von 2,6 cm gepackt; die Temperatur wird konstant bei 66,8 G gehalten.

Dextrose-Sirup der unten beschriebenen Zusammensetzung wird mit einer Geschwindigkeit .von 26,3 ml/Stunde durch die Säule gepumpt; die Zusammensetzung des Ausfließenden wird periodisch untersucht.

Zusammensetzung des Dextrose-Sirups: Dextrose . 220 g

Na₂SO₅ 0,15 g

_r7 H₂O' 0,04 g

.7 H₂O ' 0,4 g ■■

Entionisiertes Wasser 180 ml

pH * 6,5

309 844/1044

stunden Gesamtvolumen Umwandlungs- Farbe des pH des

des Ausfließen- grad des Aus- Ausfließen- Ausfliesden in Liter fließenden % den OD^₀Q nm senden

24	0,65	Beispiel 4	46	0,015	6,5
48	1,26	Wiederverwendung des	48	0,010	6,2
72	1,09	49	0,016	' 6,2
96	2,52	50	0,010	6,1
120	3,15	48	0,010	6,1
240	6,30	47	0,010	6,2
560	9,45	44	0,010	6,2
eingebetteten	Enzyms.

Isomerisationsbedingungen und Ausrüstung entsprechen Beispiel 2. Zwischen jeder Isomerisation wurde das Enzym-Präparat durch Filtration wiedergewonnen und in frischem Dextrose-Sirup erneut
suspendiert. Es wurden je Gramm Dextrose 0,045 S Gel-Enzym-Präparat (Trockengewicht), hergestellt nach Beispiel 1, angewandt.

30984^/1044

Prozentuale Umwandlung-Lauf Nr. Reaktionszeit in Stunden Angenäherte Restaktivität 10 15- 20 % von Beispiel 1

15 31 42 46 100

15 32 41 46 · -100

14 30 42 48 .- 100

100

100 100 90 85 80

75 70 60

4	14	30	40	47
5	14	30	40	47
6	14	31	40	47
7	15	• 31	40	45
8	14 '	30	39	" 44
9 ■	13	29	.37	43
10	13	28	37	42
11	13	28	37	41
12		27	35	39

Beispiel 5

dor Isomerisation bei verschiedenen pH-Werten und !'■-■inporaburen. ■ ■■"'■'

En wurden der Reaktor und die Bedingungen nach ^eispiel 2 angewandt, .üer kobalt- una mapneGiumhaltigo, ^0-prozentige Dextroseu.yrup wurde mit zollgcbundenem und'mit nach B_ei_Spi_e]_ ^ herpoctelltei.i, golpebundenem Enzym' isomorisiert. Bio Menge des zell-

3098ΑΛ/1044

gebundenen Enzyms betrug 5,0 g (Trockensubstanz) und 24 g (Trockensubstanz) in Polyacrylamid gebundenen Enzyms ge Gramm Dextrose. Der pH-Wert wurde im erforderlichen Maße mit oder HGl eingestellt.

Versuch 1: Zellgebundenes, behandeltes Enzym - -Temperatur 67°C

Prozentuale Umwandlung

pH Reaktionszeit in Stunden

5 10 -15 20

5,ο 5,5 6,0 6,5 7,0

Versuch 2: In Gel gebundenes Enzym - Temperatur 6?°G

Prozentuale Umwandlung

pH Reaktionszeit in Stunden

5 10 15 20

5,0 7 16 24,5 32

5,5 11 22,5 51,5 59

6,0 16 35 40,5 45

6,5 14 50 42 48

7,0 15 32 43 49

8	9	10	10
10	14	16	18
14 .	27	32	36
16	33	41	45
18	36	44	• 46

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Versuch 3* Zellgebundenes, behandeltes Enzym - pH = 6,7

Prozentuale Umwandlung

Temperatur Reaktionszeit in Stunden

⁰C 5 .10 15

60

67 80

8	18	26	34
16	33 '	41'	45
16	20	22

Versuch 4: In Gel gebettetes Enzym - pH = 6,7

Temperatur

Prozentuale Umwandlung

Reaktionszeit in Stunden 5 10 .15 20

60

67 80

7	16	25	32
14-	30	42	48
28	4-7	50

.Beispiel 6

Wiederverwendung des eingebetteten Enzyms ohne Kobalt im Dextrose-Sirup.

Die Isomerisationsbedingungen und die Ausrüstung entsprachen Beispiel 2.

Zwischen jeder Isomerisation wurde das Enzym-Präparat durch Filtration zurückgewonnen und in frischem Dextrose-Sirup erneut

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231768Q

verwendet. Es wurden 25 g Gel-Enzym (Trockengewicht) nach
Beispiel 1 angewandt.

Versuch

1 2

4 . 5 6

Prozentuale Umwandlung

Reaktionszeit in Stunden Angenäherte Restaktivit. 5 10 15 20 in # der Anfangsaktivität

100 85

85 80

70 50 30

14	31	40	45
13	29	38	42
13	28	38	42
12	27	37	41
11	26	35	39
10	24	33	37
5	11	16	19

Beispiel 7

■durchführung des kontinuierlichen Verfahrens nach Beispiel 3B,

Herstellung eines isomerisierten Sirups aus einem Dextrose-

cirup. Daraus gewonnene Analysenwerte.

Tabelle 7-A - Physikalische Eigenschaften von Sirupen.

Dextrose Isomerisierter Parameter Methode Einheit Syrup Syrup

6,0

0,00

52,9

43,9

PH	pH-Meter	Normal	6,5
l'Virbe	bei 400 nm	OD	0,00
Poststoffe	Refraktometer	g/100 g	52
insgesamt
Umwandlung	Polarimeter	%	__

30984A/1044

Tabelle 7-B ι Zucker-Analyse des isomerisierten Sirups mittels - ■ . Gas-Chromatographie

Parameter Beobachteter Wert . '

Glucose ' 31.0 g/100 g iruktose 23,2 g/100 g·

Umwandlung 4-2,8 %

4-, 0	6,0
0,0	0,0
0,13	0,27
beobachtet	0,03
geschätzt	0,20

Tabelle 7-C - Analyse der Verunreinigungen der Sjrupe

Dextrose Isomerisierter Analyse Methode Einheit Syrup Syrup

Gesamt-N KJeldahl mg/100 ml Protein-N Kjeldahl/TCA mg/100 ml alpha-Amino-N Ninhydrin mg/100 ml

Maltose Gas-Chromatographie g/100 g

Isomaltose Gas-Chromatographie g/100 g

alpha-Amino-Stickstoff wurde als niedrigmolekularer Stoff mittels Sephadex-Gel-Chromatographie bestimmt.

Beispiel 8

Isomerisation mit einem Produkt aus behandelten Zellen und in Gel eingebettetem Enzym aus Glucose-Isomerase, gewonnen aus Athrobacter sp. NRRL B-3726.

Das Präparat aus behandelten Zellen und eingebettetem Enzym .wurde nach Beispiel 1 herßeotellt. Die isomerisationGbeciingungen und aio /vucrÜGtunp: entsprachen iJeicpiel 2. Die ToilchonfTröße des

30984A/104A

38	42	44
41	44	45
42	43	44

- ²⁵ - 231768Q

Präparats lag zwischen 400 und 1000 Mikron.

Versuch 1:

Verwendung behandelter Zellen. Die Enzym—Aktivität war 3OOO Glucose-Isomerase-Einheiten. Je Gramm Dextrose wurden 0,012 g angewandt, der pH-Wert wurde bei 6,5 gehalten.

Temperatur Prozentuale Umwandlung bei

⁰C 5 10 15 20 Stunden

62 25

67 28

75 32

Versuch 2: Verwendung eines eingebetteten Enzym-Produkts. Das Präparat enthielt 40 bis 42 # behandelte Zellen, bezogen auf Trockengewicht. Je Gramm Dextrose kamen 0,062 g (Trockensubstanz) des Präparats zur Anwendung; der pH-Wert wurde bei 6,5 behalten.

Temperatur Prozentuale Umwandlung bei

⁰C 5 10 15 20 Stunden

62
67
75

Vor euch ^yy.

Es wurden gleiche Bedingungen wie bei Versuch 2 eingestellt,

nur der pH-Wert wurde bei 6,0 gehalten.

3 09844/104

28	40	44	46
30	43	47	49
34	46	51	_—

_ 24- —

Temperatur !Prozentuale Umwandlung bei

⁰G 5 10 15 20 Stuncen

62 "14. 25-29 32

67 . " 20 29 34. 41.

'75 25 57 4-5 . 48 .

Aus den Yersuchen 1 und 2 geilt hervor., daß beinahe die gleiche Umwandlung mit 0,06 g des Präparats mit einem Gehalt von etwa O,024 g behandelten Zellen wie axt 0,012 g behandelten Zellen "bei direktem Einsatz erzielt wird. Damit .erweisen sich ^O % der Aktivität als solche im eingebetteten Präparat.

Die vorangegangenen Beispiele beweisen das Ausmaß, auf welches isomerisierte Synupe sit hervorragender- Qualität aus Dextrose-, Sjrupen unter Verwendung des ErHger-Gel-Enzym-Präparats gemäß der lärfindung hergestellt werden können. So können bei· Batch— Betrieb die■Gel-Seilchen (nach vorheriger Quellung, wenn sie trocken sind) unmittelbar dem Syrup-Ansatz in der Heiige zugegeben werden, die etwa 10 bis Ί00 Glucose-Isomerase-Einheiten/g Dextrose entspricht- C Eine Glucose-Isomerase-Einheit ist die Menge an Enzym, die Fruktose alt äeT Geschwindigkeit von 1 mg/Stunde erzeugt).

mit Enzym versetzte Syrup wird im Reaktor leicht mechanisch

, bis sich der gewünschte ÜEiv/andlungsgrad eingestellt iiafe: intensiv genug, um die Enajim-Gel-Teilchen gut im Svrup zu suspendieren, zu dispergieren tmd. den Syrup zu mischen. In einem 1-Liter-VersucbcpefMS erwies sich ein Paddel-Ruhrer mit

i»U bis SO U/Min, als ausreichend. - - ■

- 309844/Ί044 "" ' -

jjor pü-'.-/ert; eines frisch bereiteten Dextrose-Sirups liegt üblicher V/eise zwischen 6,5 und ?,y. "Da axe Isomerisation mittels inzym-Gel-Teilchen bei einem bevorzugten pH-Bereich von 5»O bis 7,0 durchgeführt wird, kann sich eine Einstellung des pH-v/ertes euren Zugabe von Säure zu Beginn als notwendig erweisen. ;-;äh-" rcnd des Ablaufs der Isomerisation tritt jedoch eine schwache pIi-Änaerung ein. Bleibt sie aus, so ict das von Vorteil, weil das die Abwesenheit von oUure-Hobenprodukten und das Ausbleiben von Seitenreaktionen anzeigt, welche die Ausbeute an Iruktose herabsetzen und IFarbkörper erzeugen.

Die erwartete Umwandlungsgeschwindigkeit hängt natürlich stark von der Betriebstemperatur ab; die Umwandlung kann bei Jeder Temperatur zwischen etwa 50 und 85 C vorgenommen v/erden. Die •.rfinciungsgemivßen Enzym-Gel-Teilchen besitzen gute Kitze-Stabilität, !''eraer wirkt sich die Reaktions-Gleichgewichts-Konstante l<ei höheren Temperaturen nach größeren Ausbeuten an IPruktose aus. Für die Praxis sind jedoch Karamellsierung oder Verfärbung una kürzere Lebensdauer des wiederverwendeten Enzyms zu berück-' sichtigen; die bevorzugten Betriebstemperaturen bev/egen sich daher zwischen 60 und 75 G·

in jedem Fall wird die Rührung abgebrochen, wenn der gewünschte

d erreicht ist. Da die Gel-Teilchen sich infolge ir: schnell, z.B. in 10 bis 60 Hinuten, absetzen, ist eic- schnelle und -/ollkoumene Schwere-Trennung ein anderer, wesentlicher 7:'._-.*:;ν "7 .:.-:-r Isomerisation rait dem Gel-Snzym-Präparat. Der

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/ 2377880

isomorisiorte Sirup kann oben von dem abgesetzten Bett de:? GeI-ieilclien abgezogen v/erden; der .zurückbleibende Reaktor ist für eine V/ioderboscIiickung mit Dextrose'—£irup und einen neuen Lauf wit den gleichen Enzym-Gel-Sräger-Teilchen bereit.

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Claims (7)

1. Patentansprüche

   [Λ\ Präparat mit immobiler Glucose-Isomerase in fein zerteilter Ho rs, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mit Ko ο alt beiiandelten, ganzen Zellen eines eine Isomerase enthaltenden Mkroorganisiaus, die in einem Träger-Gel aus einem
   vernetzten Polymerisat aus einem wasserlöslichen Acryl-Konoseren dispergiert ist, wobei der Zellanteil etwa
   zwischen Λ bis 50 % w/v, bezogen auf das GeI-Volumen, beträgt.
2. 2. Präparat; nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen des Gels eine Größe zwischen etwa 100 bis 1500
   ifrkron besitzen.
3. · Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Acryl-Monomere Acrylamid ist.
4. ^r. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das die Zellen von Bacillus so. EREL B-5351 stammen.
5. 5. Verfahren zur Herstellung des Präparates nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, aa3 man.

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   a) eine wässrige Suspension aus Glucose-Isomerase enthaltenden Zellen von r-Iikroorganismen in Gegenwart von . Kobalt-Ionen hitzebehandelt, .

   'b) die behandelten Zellen in einer wässrigen Lösung eines wasserlösuchen Acryl-Monomeren suspendier/t,

   c) das Acryl-Monomere zu einem unlöslichen Gel polymerisiert und vernetzt, wobei der Zellanteil etwa zwischen 1 bis 50 % w/v, bezogen auf das Gel-Volumen, beträgt, und .

   d) das Gel-Produkt fein zerteilt.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß die Kitzebehandlung bei'50 bis 80⁰C in einer wässrigen Lösung mit 0,001 bis 0,1 Mol Co50_/(_ durchgeführt wird.
7. 7. Verwendung eines Präparats nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat auf einen glucosehaltigen Sirup mit einem pH-Wert zwischen 6 und 7 bei einer Temperatur zwischen

   etwa 60 und "75°G zur Einwirkung gebracht wird

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