DE2316893A1 - Antibiotikum em-98, seine salze, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung als antibiotikum - Google Patents

Description

u.Z.: K 257 (Vo/H)
Case M-268 994-S

E.R. Squibb & Sons, Inc.
Princeton, New Jersey, V.St.A.

"Antibiotikum EM-98, seine Salze, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung als Antibiotikum"

Priorität: 10. April 197?, V.St.A., Nr. 24 2 304 5. Juli 1972, V.St.A., ITr. 263994

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum,, nachstehend mit EM-98 bezeichnet, und seine Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es durch Züchten von Streptoir.yces venezuelae ATGC 21782 bei üblichen pH- und Temperaturbedingungen in üblichen Nährrtedien, die assimilierbare Kohlenhydrate und stickstoffhaltige Verbindungen enthalten, unter submers-aeroben Bedingungen, Isolieren und Reinigen des Antibiotikums in an sich bekannter V/eise und gegebenenfalls SaIzbildung mit einer anorganischen oder organischen Säure hergestellt worden ist.

Pio Krl.i .>:3ung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung :!s Α/·ό I bicf; i; u:i!:: EM-98 und seine:r _;Jalze, dat; dadurch ^okenn^ei.ahu

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l fcD

ist, daß man Streptomyces venezuelae ATCG 21782 bei üblichen pH- und Temperaturbedingungen in üblichen Hährmedien, die' assimilierbare Kohlenhydrate und stickstoffhaltige Verbindungen enthalten, unter submers-aeroben Bedingungen züchtet,- das Antibiotikum in an sich bekannter Weise isoliert und reinigt und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Säure in ein Salz überführt. .

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Stamm von Streptomyces venezuelae wurde aus einer Bodenprobe bei Miami Beach, Elorida,isoliert. Eine EuItür des lebenden Mikroorganismus wurde in der American Type Culture Collection, Bockville, Maryland, V.St.A., unter der Nummer ATCC 21782 hinterlegt.

Zur Isolierung und Charakterisierung des Mikroorganismus wurde ein Teil der Bodenprobe in sterilem destilliertem Wasser ge„-schüttelt und auf ein Nähragarmedium überimpft, das folgende Bestandteile enthält:

Bestandteil Menge , g

Agar 15,0'

Glycerin, 10,0

Citronensäure 1,2

(NH^)₂HPO₄ 0,4' .

KCl 0,08

O 0,A1.8

_{2 2}0 0,036

FeCl .6H₀O ■ " . 0,023 ■

ZnCl v6HO ' 0,021

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CoCl₂-GH₂O - 0,004-

mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen.

Dieses Nährmedium wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.

Nach 7-bis 10tägiger Bebrütung bei 25°C werden Kolonien von Streptomyces venezuelae ATCG 21782 von der überimpften Bodenprobe isoliert. Diese isolierten Kolonien werden hierauf· in einem Nährmedium folgender Zusammensetzung gezüchtet :

Bestandteil . Menge, g

Rindfleischextrakt 1,0

Hefeextrakt 1,0

NZ Amine A 2,0

Glucose · 10,0

Agar 15,0 Auffüllen mit destilliertem V/asser auf 1 Liter.

Das Nährmedium wird auf einen pH-Wert von 7i3 eingestellt und 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert.

Der Mikroorganismus läßt sich einordnen in die Gruppe der rot pigmentierten Streptorayceten nach Pridham; vgl. T.G. Pridham, C.W. Hesseltine und R.G. Benedict, ¹¹A Guide for the Classification of Streptomyces According to Selected Groups¹; Applied Microbiol., Bd. 6 (1958), S. 52-79.

Die Sporenträger (Sporophoren) sind gerade und vertikal, und sie entsprechen

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den Kriterien der morphologischen Gruppe der Rectiflexiblen.

Die Sporen sehen unter dem Elektronenmikroskop glatt aus. Sie zeigen auf Bennett's-Agar gute Sporenbildung. Das- Luftmyeel ist

von hellrosa-beiger Farbe (ISCC-NBS-^, hellgraustichig-rotstichig braun). Die Rückseite, d.h. das vegetative Mycel, ist durch ein melanoides Pigment, das in peptonhaltigen Nährböden synthetisiert wird, dunkelbraun gefärbt.

Auf dem Basalmedium von Pridham und Gottlieb (T.J. Pridham und D. Gottlieb, The Utilization of Carbon Compounds by Some Actinomycetales as an Aid for Species Determination, J. Bacteriology, Bd.. % (1W), 'S- 107-114) werden zum Wachstum Kohlenhydrate, Glucose, Fructose, Galactose und Salicin verwertet. Der E'M-98 bildende Mikroorganismus ist ein Stamm von Streptomyces venezuelae. Wegen seiner Unfähigkeit zur Verwertung von Xylose, Arabinose und Rhamnose ähnelt er dem Streptomyces venezuelae Stamm, der Lemacidin erzeugt. Morphologisch kann der EM-98 erzeugende Stamm nicht von Streptomyces venezuelae ATCC 10712 und dem Lemacidin erzeugenden Stamm Streptomyces venezuelae ETH 9692 unterschieden werden. Sie unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihrerVerwertung von Kohlenstoffquellen und der erzeugten Antibiotika. Während durch einen Stamm von Streptomyces venezuelae Chloramphenicol gebildet-wird, erzeugt Streptomyces venezuelae ATCC 21782 kein derartiges Antibiotikum. Das Antibiotikum EM-98 unterscheidet sich von den Antiobiotika Netropsin, Distamycin A und Anthelvencin A und B durch sein Verhalten bei der Chromategraphie.

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Streptomyces venezuelae ATCC 21782 -erzeugt ein Antibiotikum, das gegenüber den verschiedensten grampositiven und graranegativen Bakterien aktiv ist. Zur Herstellung des Antibiotikums wird Streptomyces venezuelae ATCC 21782 vorzugsweise bei 25°C unter submers-aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenhydrate und Stickstoffquellen enthält. Die Vergärung wird während 60 bis 150 Stunden, vorzugsweise etwa 144 Stunden durchgeführt. Danach hat sich das Antibiotikum in genügender Menge gebildet. Nach beendeter Vergärung wird die Gärmaische mit einer Filtrierhilfe versetzt und filtriert. Das Antibiotikum findet sich nicht nur im Filtrat sondern auch im Myeel. Deshalb wird das Mycel mit einem Alkohol, wie Methanol, extrahiert. Der Alkoholextrakt wird bei einer Temperatur unterhalb 45°C eingedampft. Es hinterbleibt eine wäßrige .Suspension, die mit dem Filtrat vereinigt, auf einen pH-Wert von etwa 9 eingestellt und mit einem mit Wasser nicht mischbaren Alkohol, vorzugsweise mit wassergesättigtem n-Butanol, extraliiert wird. Der n-Butanolextrakt wird bei einer Temperatur unterhalb 45⁰C möglichst stark eingedampft. Sodann wird das Konzentrat mit dem mindestens 15fachen Volumen eines organischen Lösungsmittels, wie Diäthyläther, Athylacetat, 2-Butanon oder vorzugsweise Aceton, verdünnt,und die gebildete Fällung wird entweder abfiltriert oder abgeschleudert und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wird ein amorphes, hellgelbbraunes Pulver erhallen. Dieses in Aceton unlösliche Pulver kann durch Chromatographie weiter gereinigt werden. Beispielsweise kann man dan Produkt an einer mit Diäthylaminoäthylcollu·- lor.G ge füll Lon Chromatographieriuäuie und mit Methanol als Lauf--·

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mittel und anschließende Adsorptio-nschromatographie an Kieselsäure reinigen. Verunreinigungen werden zunächst aus der Zieselsäurekolonne mit einem Gemisch gleicher Volumteile Ithylacetat und Methanol eluiert. Danach wird das aktive Material mit Methanol eluiert. Die weitere Reinigung wird durch Chromatographie an Cellulose-Dünnschichtchromatographieplatten mit der oberen Schicht des Lösungsmittelgemisches aus 4- Volumteilen n-Butanol, 5 Volumteilen Wasser und 1 Volumteil Essigsäure als Entwicklungslösungsmittel erreicht.

Das Antibiotikum EM-98 ist eine Base, die mit anorganischen und organischen Säuren Salze bildet. Beispiele für diese Säuren sind Halogenwasserstoff säuren, .wie Salzsäure und Bromwasserstoff säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure/ Salpetersäure, Reinecke-Säure, Picrinsäure und Naphthalinsiilfonsäure. Die Salze können aus dem. Antibiotikum durch Umsetzen mit der anorganischen oder organischen Säure -hergestellt werden» Vorzugsweise wird die Umsetzung in einem Lösungsmittel durchgeführt, in welchem das Salz unlöslich ist. Aus dem Salz kann die freie Base des Antibiotikums durch Neutralisation mit einer stärkeren Base, wie Natronlauge oder Bariumhydroxid,wieder in Freiheit- gesetzt werden. Hierauf kann das Antibiotikum erneut in ein anderes Salz verwandelt werden. Dieses Verfahren ist auch geeignet zur Isolierung und Reinigung des Antibiotikums.·

Das Hydrochloric! des Antibiotikums EM-98 ist das bevorzugte Salz, weil es sich bei der Umsetzung des "Antibiotikums" mit- viißriger Salzsäure in einem Alkohol, wie Methanol, leicht in kr?i stalli

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Form bildet. Das Hydröchlorid ist auch besonders geeignet zur Aufnahme des IR-Absorptio&sspektrums und zur anderweitigen Charakterisierung des Antibiotikums. Fig. 1 zeigt das IR-Spektrum des Antibiotikums in Form seines Hydrochlorids. Fig. 2 zeigt das IR-Absorptionsspektrum des Antibiotikums in Form der freien Base.

Das Antibiotikum EM-98 ist gegen gramnegative und grampositive Bakterien, wie Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coil und Pseudomonas aeruginosa, aktiv. Das Antibiotikum und seine physiologisch verträglichen Salze können daher als Desinfektionsmittel, zum Beispiel in Form eines Stäubemitteis bis zu etwa Ί Gewichtsprozent Wirkstoffgehalt, oder als Arzneimittel zur Bekämpfung von Infektionen, verwendet werden. Zu diesem Zwe'ck kann das Antibiotikum lokal in Form einer Creme oder einer Salbe bis zu etwa 1 Prozent Wirkstoffgehalt oder in Form eines Injektionspräparats in einer Tagesdosis von etwa 50 bis 250 mg/kg Körpergewicht verabfolgt werden. Beispiels\*eise genügen bereits etwa 250 mg/kg des Antibiotikums in Form des rohen Pulvers, das bei der Acetonfällung erhalten wird, in einer einzigen Dosis, um Mäuse gegen eine letale systemische Infektion durch Escherichia coli zu schützen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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Beispi.el-1 -■""·.

Sehrägröhrchen, die einen Nährboden aus Hefeextrakt, Rind- ' fleischextrakt und Agar enthalten, werden mit Streptomyces venezuelae ATCC 21782 beimpft. Nach 14tägiger Bebrütung werden sie zum Beimpfen von 50 ml eines wäßrigen Nährmediums der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben verwendet. Dieses Anzuchtmedium hat folgende Zusammensetzung : ' ■ ■--"■""·

Bestandteil	Menge, g
SoJabohnenmehl	15,0
entwässertes Kartoffelpüree	15,0
Glucose	50,0
CoCl .6H2O	0,005
CaCo,	Ίο,Ό

mit destilliertem-Wasser auf 1 Liter auffüllen.

Das Nährmedium .wird 30 Minuten bei 121⁰G-"sterilisiert.

Die Anzuchtkulturkolben werden 96 Stunden bei 25°C~auf einer Drehschüttelmaschine mit einem Hub von etwa -5" cm bei 280 U/min, inkubiert. -

Sodann werden 5 volumprozentige Übertragungen aus den Anzuchtkulturkolben in 500 ml fassende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, welche"100 ml des gleichen Nährmediums wie in den Anzuchtkulturkolben enthalten. Diese Kulturkolben werden in gleicher Weise inkubiert und geschüttelt. Am 4. und 6. Tag werden Proben entnommen. Das Mycel wird abzentrifugicrt, der Überstand auf einen

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pH-Wert von 9?O eingestellt und mit der Hälfte des Volumens mit wassergesättigtem n-Butanol extrahiert. Das abzentrifugierte Mycel wird mit Methanol in.einer Volumenmenge extrahiert, die dem dekantierten Überstand entspricht. Sowohl der Butanolextrakt als auch der Methanolextrakt v/erden papierchromatographisch und durch biologische Tests untersucht. Zur Chromatographie werden geeignete Mengen auf Bögen von Whatman Nr. 1 Filterpapier aufgebracht, und die Chromatogramme werden,mit einem Lösungsmittelsystem aus 4· Volumteilen n-Butanol, 5 Volumteilen V/asser und 1 Volumteil Essigsäure entwickelt. Die obere Phase dieses Lösungsmittelgemisches wird als Entwicklungslösungsmittel verwendet. In diesem Lösungsmittelsystem hat das Antibiotikum EM-98 einen R^-Wert von 0,3. Das Antibiotikum wird durch Bioautographie gegenüber Escherichia coli Al¹GG 10536 erkannt.

Beispiel 2

Ein 250 Liter Ansatz von Streptomyces venezuelae ATGC 21782 wird in einem etwa 380 Liter fassenden Edelstahlbehälter unter den nachstehend angegebenen Bedingungen fermentiert.

1. Stufe :

Inoculum: Eine Kultur von Streptomyces venezuelae ATGC 21782 wird in flüssigem Stickstoff aufbewahrt und auf Schrägagarröhr- chen folgender Zusammensetzung gezüchtet:

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- ίο -

Bestandteil Menge, g

Hefeextrakt 1,0 .

Rindfleischextrakt 1,0

NZ Amine A · 2,0 ⁼

Glucose 10,0

Agar " 15,0 ■

mit' destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllen.

Das Nährmedium wird auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und 30 Minuten bei 121°C sterilisiert.

Das Oberflächenwachstum aus einem Sehrägröhrchen wird in 11,0 ml einer O,01-prozentigen xfäßrigen Natriumlaurylsulfatlösung suspendiert. 3 ml dieser Suspension werden zum Beimpfen des folgenden Nährmediums verwendet: ^v

Bestandteil	Menge, g
So j abohnenmehl	15,0
Entwässertes Kartoffe!püree	15,0
Glucose	5O,o
CoCl2.6H2O	0,005
CaCO7	. 10,0
mit destilliertem Wasser auf 1	Liter auff ü11e η,

100 ml dieses Nährmediums in einem 500 ml fassenden. Erlenice;yer-Kolbcn werden 96 Stunden bei 25°C auf einer Drehschütte!maschine mit einem Hub von 5 cm und bei 280 U/min inkubiert.

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2. Stufe: . ■ Inoculum: 100 ml aus der 1. Stufe.

Nährmedium: Es wird das gleiche Nährmedium wie in Stufe 1 verwendet. 1000 ml des Nährmediums und Inoculums in einem 4 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben werden ^r/2 Stunden bei 25°C auf einer Schüttelmaschine mit einem Hub von 5 cm und mit 120 Ausschlägen pro Minute geschüttelt.

3. Stufe :

Inoculum: 1000 ml aus der Stufe 2.

Nährmedium: Es wird das gleiche Nährmedium wie in Stufe 1, jedoch unter Zusatz eines Antischaummittels (0,05 Prozent Ucon LB 625) verwendet. 30 Liter des Nährmediums und Inoculums in einem 38 Liter fassenden Fermentationsbehälter werden 73 Stunden bei 25°C inkubiert. Während der Inkubation wird die Gärmaische mit 285 U/min gerührt und in einer Menge von 0,065 m pro Minute belüftet.

4. Stufe :

Inoculum: 12500 ml aus Stufe 3.

Nährmedium: Es wird das gleiche Nährmedium wie in Stufe 3 verwendet. 250 Liter Nährmedium und Inocolum in einem etwa 38O Liter fassenden Edelstahlfermenter werden 144 Stunden bei 25°C inkubiert. Während der Inkubation wird die Gärmaiscne mit 155 U/min gerührt und in einer Menge von 0,283 m^ pro Minute belüftet.

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B e i s ρ i e 1 3

222 Liter der in Beispiel 2 erhaltenen Gärmaische, werden mit 11 kg Diatomeenerde als Filtrierhilfe versetzt. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert. Es werden 212 Liter Filtrat und 43,8 kg Filterrückstand erhalten.

Beispiel 4

43,8 kg des in Beispiel 3 erhaltenen Filterrückstands werden dreimal mit jeweils 50 Liter Methanol extrahiert. Zwischen den Extraktionen wird die Aufschlämmung filtriert.. Die. Methanolextrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 5 Liter eingedampft. Es hinterbleibt eine x^äßrige Suspension, die mit den in Beispiel -3 erhaltenen 212 Litern Filtrat vereinigt wird..

B e i s ρ i e 1 5.

Die in Beispiel 4 erhaltenen 217 Liter der wäßrigen Suspension werden mit etwa I30 ml konzentrierter Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 9₅1 eingestellt. Sodann wird das wäßrige Gemisch dreimal mit jeweils 66 Liter mit wassergesättigtem-n-Butanol extrahiert. Die Butanolextrakte werden vereinigt'(179 Liter) und bei einer Temperatur unterhalb 45°C auf etwa 2,5 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird mit etwa 37 Liter Aceton versetzt. Die gebildete amorphe Fällung wird abfiltriert und unter vermindertem Druck bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute 112g Rohprodukt. -

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Beispiel 6

30 g des in Aceton unlöslichen pulverförmigen Rohprodukts werden in 20 ml Methanol gelöst, Die Lösung wird auf eine, mit Diäthylarainoäthy!cellulose gefüllte Chromatographiersäule mit den Abmessungen 6 χ 50 cm gegeben, die etwa 100 g Diäthylaininoäthylcellulose eingeschlämmt in Methanol enthält. Die Chromatographiersäule wird mit Methanol entwickelt und 20 ml Fraktionen werden aufgefangen. Die antibiotisch aktiven Fraktionen, bestimmt nach der Diffusionsmethode auf einem Agar-Nahrboden mit dem Blättchentest gegenüber Escherichia coli ATCG 10536* werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Es werden 5 g antibiotisch v/irksames Material erhalten.

Beispiel?

5 g des in Beispiel 6 erhaltenen antibiotisch wirksamen Materials werden in 10 ml eines Gemische gleicher Volumteile Äthylacetat und Methanol gelöst. Die Lösung wird auf eine mit etwa 120 g Kieselsäure in einem Gemisch gleicher Volumteile Äthylacetat und Methanol eingeschlämmte Chromatographiersäule mit den Abmessungen 3?5 χ 45 cm gegeben. Die Chromatographiersäule wird mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt. Nach dem Eluieren des inaktiven pigmentierten Materials wird das Eluat hellgelb. Zu diesem Zeitpunkt wird das Entwicklungslösungsmittel gewechselt, und die Eluierung wird mit Methanol fortgesetzt. Die antibiotisch aktiven Fraktionen, bestimmt gemäß Beispiel 6, werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Es werden etwa 0,7 g antibiotisch wirksames Material als fester Rückstand erhalten.

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Beispiel 8

0,7 g des in Beispiel 7 erhaltenen antibiotisch wirksamen Mate—, rials v/erden in 1 ml Metha.no 1 gelöst und in einem Abstand von 2 cm vom· Boden auf Glasplatten mit den Abmessungen 20 χ 20 cm aufgetragen, die Cellulose in einer Schichtdicke von 1000 Mikron tragen» Die Chromatographierplatten werden mit der oberen Schicht eines Lösungsmittelgemisches aus 4 Volumteilen n-Butanol, 5 Volumteilen Wasser und 1 Volumteil Essigsäure entwickelt. Das Antibiotikum EM-98, das im UV-Licht (J60 nm) als blaues fluoreszierendes Band mit einem R^-V/ert von 0,3.sichtbar wird, wird. von der Platte abgeschabt und aus der Cellulose mit Methanol eluiert. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft. Es werden 0,1 g EM-98 als freie Base erhalten.

Beispiel 9

0,1 g der in Beispiel 8 erhaltenen freien Base von EM-9& werden in 1 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird mit 6 η Salzsäure auf einen pH-Wert von etwa .1 eingestellt und sodann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus einem Gemisch von Aceton und

etwa

Methanol umkristallisiert. Es werden,0,1 g des Hydrochloride erhalten.

Beispiel 10

100 mg des in Beispiel 9 .erhaltenen Hydrochloi^ids von EM-98 werden in 5 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird mit verdünnter Natronlauge auf etwa 5 eingestellt. Sodann iirird eine gesättigte Lösung von Pikrinsäure 'eingetropft, bis sich keine weitere Fällung mehr bildet. Die gebildete Fällung wird abfil-

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triert und aus 80prozentigem wäßrigem Aceton umkristallisiert. Ausbeute 80 mg gelbe Kristallnadeln.

Nachstehend werden die physikalischen und chemischen Eigenschaften des Antibiotikums EM-98, seines Hydrochlorids und Picrats angegeben:

GHU EM-98 (freie Base), C^^Jd'* ber. :■ 47,77 6,68. 27,86

gef. : 46,84- 6,52 28,49.

EM-98-Hydrochlorid, C₁₈H₃₀N₉O₅
' C H N Cl Ό ' ·

ber.: 41,03 6,11 24,05 13,36 15,20 gef.: 40,23 5,97 24,59 13,40 15,81. Der Sauerstoffgehalt wurde aus der Differenz berechnet.

EM-98-picrat, G₁₈B₅₀H₉O₅*2C₆H₃N₅O₇i

CH Έ 0

ber.: 39,55 3,95 23,07 33,40 gef.: 39,49 3,78 24,20 32,54 Der Sauerstoffgehalt wurde aus der Differenz berechnet.

UV-Absorptipnsspektrum von EM-98-2HC1:

in Methanol 240 nm, E ^/ = 375; 3OO nm, E = 390;

_{cm Λ cm}

UV-Abscrptionsspektrum von EM-98-picrat:

•χ in Methanol 240 nm, E ^u° = 667; 305 nm, E ^l/0 = 460;

^max 1 cm 1 cm

353 nm,, E ^/0 = 345-1 cm

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Der . . "■-'■■."

,R^-Wert von EM-98 (freie Base) bei der PapierChromatographie an

Whatman Hr. 1 Filterpapier, Lösungsmittelsystem n-Butanol, Wasser, Essigsäure (4:5:1) beträgt 0,3·

Das IR-Absorptionsspektrum von EM-98-2HC1 in KBr ist in Fig. 1,. das der freien Base in KBr ist in Fig. 2 wiedergegeben.

Schmelzpunkt des Hydrochloride 189 bis 191 °.C. Schmelzpunkt des Picrats 209 bis 210⁰C.

Löslichkeit : ■ -" . "

EM-98-2HCl ist in Wasser und Methanol löslich, in Aceton, Äthylacetat und Chloroform unlöslich.

Farbreaktionen (sowohl der freien Base als auch des Hydrochlorids) : ' ' Ninhydrin, Anthron, Sakaguchi und FeCl, negativ.

Neutralisationsäquivalent des Picrats 449« Molekulargewicht des Picrats ber. 910.
Molekulargewicht der freien Base ber."452. Summenformel der freien Base C^₀H_7nN_nO,-.

I ο yvJ ) j

B'e i s ρ i e 1 11

In der,nachstehenden Tabelle ist die minimale Hemmkonzentration der in Beispiel 8 erhaltenen freien Base gegenüber verschiedenen Mikroorganismen angegeben. Es werden zweifache Verdunnurif-rr.-tests mit den Mikroorganismen durchgeführt, . ■

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Mikroorganismus minimale Hemmkonzentration,

Staphylococcus aureus FDA 209P 75

Streptococcus pyogenes C203 50

Escherichia coil ATCC 10536 - ' 100

Escherichia coli SG 8294 * ■ 100

Pseudomonas aeruginosa SC 8329. * 100

Candida albicans CBS 35H > 100

(*) E.R. Squibb & Sons, Inc. Kultur.

Beispiel 12

Mäuse werden intraperitoneal mit 500 LD₁-Q Dosen von Escherichia coli SC 8294-, suspendiert in 5prozentigem Schweinemagenschleim, injiziert. 1 Stunde nach der Infektion wird das Antibiotikum EM-98 subkutan verabfolgt. Das für diese Versuche verwendete Antibiotikum entspricht in seiner Reinheit dem in Beispiel 5

erhaltenen, in Aceton unlöslichen Pulver. Es genügen etwa rag/kg
/ Körpergewicht der antibiotisch wirksamen Substanz zum lOCprozentigen Schutz der Mäuse. Ohne Verabfolgung des Antibiotikums sterben sämtliche Mäuse.

Mäuse werden intraperitoneal mit 100 LD_Cq Dosen von Streptococcus pyogenes C2O3 injiziert. 1 Stunde und 5 Stunden nach der Infektion wird das Antibiotikum EM-98 subkutan verabfolgt. Das

in

für diese Versuche verwendete Antibiotikum entspricht ,seiner Reinheit dem in Beispiel 5 erhaltenen, in Aceton unlöslichen Pulver. Eg genügen etwa 250 mg/kg der antibiotisch wirksamen Substanz, um 20 Prozent der Mäuse gegen die letale Infektion zu

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schützen. Bei der Kontrollgruppe," der kein Antibiotikum verabfolgt wurde, überlebt« keines der Tiere»

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Claims (4)

Patentansprüche

1. Antibiotikum EM-98 und seine Salze, dadurch ge kennzeichnet , daß es durch Züchten von Streptomyces venezuelae ATCG 21782 bei üblichen pH- und Temperaturbedingungen in üblichen Nährmedien, die assimilierbare Kohlenhydrate und stickstoffhaltige Verbindungen enthalten, unter submers-aeroben Bedingungen, Isolieren und Reinigen des Antibiotikums in an sich bekannter Weise und gegebenenfalls Salzbildung mit einer anorganischen oder organischen Säure hergestellt worden ist.

2. "Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums EM-98 und seiner Salze nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Str-eptom7/ces venezuelae ATCC 21782 bei üblichen pH- und Temperaturbedingungen in üblichen Nährmedien, die assimilierbare Kohlenhydrate und stickstoffhaltige Verbindungen enthalten, unter submers-aeroben Bedingungen züchtet, das Antibiotiku.m in an sich bekannter V/eise isoliert und reinigt und gegebenenfalls durch Umsetzen mit einer anorganischen oder organischen Säure in ein Salz überführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei etwa 25°C durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung während etv.'a 60 bio I50 Stunden durchführt.

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5· Verwendung des Antibiotikums EM-98 und seiner Salze gemäß Anspruch- 1 als Antibiotikum und Desinfektionsmittel.

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