DE2316854A1 - Fibrinolytisches material - Google Patents

Fibrinolytisches material

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DE2316854A1
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Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT1 DIPLOMCHEMIKER
8 KÖLN 51, OBERLÄNDER UFER 90
Köln, den 3.April 1973 Eg/Stü.
South African Inventions Development Corporation, Administration Building, C.S.I.R., Scientia, Pretoria, Süd-Afrika
FIBBIIiOLYTISCHSS i?
Die vorliegende Erfindung betrifft ein fibrinolytisch aktives Produkt.
Die Gerinnung von Fibrinogen im Blut ergibt Fibrinzusaaraenballungen, d.h. Blutgerinsel· Einerseitsist die Blutgerinnbarkeit notwendig um Blutungen offener Wunden zu beenden· Sie gibt aber auch Anlass zur Thrombose wenn sich Blutgerinsel im Blutkreislauf selbst bilden· Es sind bereits Substanzen bekannt, von denen einige auch therapeutisch anwendbar sind, die die
^*111* rtiSrWw 3098*1/1103
Bildung von Fibringerinseln hemmen, z.B. Heparin oder die Aktivsubstanz aus dem Gift der malayischen Grubenviper. Wenn es darauf ankommt bereits gebildete Fibringerinsel zu lösen, sind die meisten dieser Wirkstoffe entweder völlig oder weitgehend unwirksam· Ausserdem können gefährliche Nebenerscheinungen auftreten· Plasmin ist ein Enzym welches Blutgerinsel löst. Die normale Piasminkonzentration im menschlichen Blut ist jedoch zu gering um kurzfristig wirksam zu sein. Die Plasminbildung kann man durch Verabreichung gewisser Proteinsubstanzen, insbesondere Streptokinase anregen. Dieses Präparat ist jedoch sehr teuer und hat Nebenwirkungen. Andere Wirkstoffe sind derartig teuer, dass sie höchstens von akademischem Interesse sind· Es besteht somit ein eindeutiger Bedarf an neuen Substanzen mit fibrinolytischer Aktivität, d.h. der Eigenschaft bereits gebildete Blutgerinsel wieder zn lösen, selbst wenn diese neuen Substanzen auch nur in einer einzigen Hinsicht Torteile gegenüber dem oben aufgezeichneten Stand der Technik aufweisen würden» Solche Substanzen wären nicht nur für therapeutische Zwecke, sondern auch für Laboratoriumszwecke wertvoll. Für viele Zwecke würde es den Wert solcher Substanzen noch erhöhen, wenn diese ausserdem die Eigenschaft hätten, auch die Bildung von neuen Blutgerinseln zu hemmen·
Der .· vorliegenden Erfindung, liegt die JSufgäbe zugrunde fibrinolytische Substanzen zu schaffen, die den obengenannten Forderungen nachkomm ei** sowie Fibringer ins el enzymatisch aufzulösen bzw. die Bildung solches· Gerinsel zu hemmen.
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Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung eines neuen fibrinolytischen Produktes, bzw· einer Substanzgruppe, die in Galle vorkommt.
Erfindungsgemäss ist das Produkt der eingangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, dass es in reinerer bzw· konzentrierter er Form als in der Natur vorliegt, und dass es neben seiner fibrinolytischen Aktivität folgende Eigenschaften aufweist:
(i) Es kommt in der Galle von Säugetieren vor und kann daraus, gegebenenfalls nach Entfernung störender Gallensäuren ,mit Amaoniumsulphat gefällt und durch Exklusionschromatographie auf vernetz tem Polydextran, das sich zur Trennung von Proteinen im Molekulargewichtsbereich von 5 000 eignet, weiter gereinigt werden,
(11) es bat die Eigenschaft Fibrin zu lösen, aktiviert aber nicht Plasminogen, Trypsinogen und Chymotrypsinogen,
(iii) es lässt sich nicht dialysieren,
(iv) es 1st ein Protein,
(v) bei PH 7,h verhält es sich anionisch;
und umfasst ausserdem fibrinolytiseh aktive Derivate dieses Produktes·
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Aus menschlicher bzw. Säugetiergalle lassen sieb mehrere solcher Substanzen mit den oben aufgezählten Eigenschaften gewinnen, die im folgenden der Einfachheit halber als "Cholelysin" bezeichnet seien· Sie weichen voneinander unter anderem bezüglich des Molekulargewichtes ab. Einige dieser Substanzen sind möglicherweise fibrinolytisch aktive Abbauprodukte von aktiven Substanzen höheren Molekulargewichts« Andere dieser Substanzen sind möglicherweise assoziierte aktive Formen von aktiven Substanzen geringeren Molekulargewichtes·
Es wurde ferner festgestellt, dass diese in Galle vorkommenden aktiven Substanzen mit Säure gefällt werden können^ insbesondere durch Ansäuren mit Salzsäure unterhalb pH 3jOe Der Niederschlag lässt sich mindestens teilweise in Paffer bei pH 10«0 rekonstituieren·
Die bevorzugten Substanzfraktionen befinden sich im Molekulargewichtsbereich zwischen 5 000 und 5® 000. Sie haben auch kaseinolytische Aktivität· Die Fraktionen haben ferner dieEigenschaft, dass sie sich in der Zwischenphase zwischen einem Chloroform/Methanol-Verteilungssystem anreichern lassens und dass sie in beiden Phasen im wesentlichen unlöslich sinds und in diesem Versuch etwa k % ihrer lytischen Aktivität mch 3-wöchigen Stehen bei U-0C beibehalten. Im Falle sofortiger Entfernung aus dem System bleibt der grosste Teil der Aktivität erhalten, während nach etwa 1 bis 3 Stunden in dem Sys ti® noch etwa 1/3 der Aktivität übrig bleibt·
309 84 1/1103 - h -
Wegen der Neigung solcher Enzyme assoziierte aktive Formen Ton höherem Molekulargewicht zu bilden, spielt die obere KoIekulargewichtsgrenze keine so wesentliche Bolle, vorausgesetzt, dass die aktive Substanz noch einigermassen wasserlöslich ist«
Trotzdem kann gesagt werden (z.B. vom Standpunkt der leichteren Reinigung), dass die meisten bevorzugten Substanzen Molekulargewichte zwischen 5 000 und 20 000, insbesondere zwischen 7 OCO und 15 000, genauer genommen zwischen 9 000 und 12 000 besitzen, wobei diese Molekulargewichte nach dem Exklusionschromatographieverfahren bestimmt sind· Eine dieser Substanzen hatte allerdings auch ein Molekulargewicht von 7 500, und eine andere von 50 000.
Die bevorzugten Substanzen bzw* Fraktionen, haben ausserdem
.Si
gerinnungshemmende Eigenschaften, insbesondere solche, die mindestens zum Teil auf eine Hemmung der BIutplätte hen-Aggregation durch Callagen, und vorzugsweise auch durch Adenosin-Diphosphat (im Blutplättchen-Aggregometer gemessen) zurückfuhren lassen·
Cholelysin scheint etwa 5 % des Gesamtproteins der Galle darzustellen, und es konnten keine wesentlichen Unterschiede zwischen Cholelysin aus verschiedenen Ausgangsmaterialien festgestellt werden (z.B. aus menschlicher Galle und der Galle verschiedener Säugetiere)·
Wie die meisten Proteinelasst sich Cholelysin bei niederer Temperatur mit Alkohol oder Azeton fällen·
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Was die Coaggulationseigensc haften betrifft, wurde festgestellt, dass die partielle thromboplastische Zeit mit Kaolin und die einstufische Prothrombinzeit (beide in herkömmlicher Weise gemessen) von Cholelysin nicht beeinflusst werden·
Cholelysin bricht Fibren in andere Abbauprodukte ab, als mit Plasmin der Fall ist· Cholelysin lässt sich mit Kalzium bzw. Magnesiumion (z.B.· Chlorid) stabilisieren.
Cholelysin wurde bereits in menschlicher Galle und der Galle von Pavianen, Bindern, Schweinen und Batten festgestellt. Die höchsten Werte bezüglich fibrinolytischer Aktivität der gesamten Galle wurden in BinJergallenproben festgestellt.
Die bevorzugten Substanzen sind natürliche Bestandteile der Galle in einer Konzentration, die mindestens 10 mal, vorzugsweise mindestens 100 mal so hoch ist wie die Konzentration in durchschnittlicher menschlicher Galle. Die Substanzen sind vorzugsweise ferner ausreichend gereinigt, dass sieh die Substanz chromatographisch, insbesondere exklusionschromatographisch oder ionenaus tausc hexe hromatographisch, vorzugsweise durch beide Verfahren gemeinsam nicht mehr weiter zerlegen lässt.
ErfincLungsgemäss ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des fibrinoly tischen Produktes vorgesehen, das dadurcb. gekennzeichnet ist, dass es als- Teil einer proteinbaltigen Fraktion aus Galle abgetrennt wird.
Hierzu können die verschiedensten Proteinabtrennverfahren verwendet werden· Schon durch die Abtrennung des gesamten Proteingehaltes aus Galle findet eine erhebliche Anreicherung und Reinigung des Cholelysins statt, da der gesamte Proteingehalt der Galle nur etwa 0,1? Gew· % beträgt· Die Abtrennung findet vor- zugsweise durch Fällung mit einem Proteinfällungsmittel statt· Das bevorzugte Fäilungsmittel ist Ammoniumsulphat, das anscheinend gleichzeitig eine stabilisierende Wirkung ausübt· Amconiuo sulphat wird vorzugsweise in einer Konzentration zwischen etva 12 und **5 % verwendet, je nach den sonstigen Eigenschaften der verwendeten Galle, In den meisten Fällen fand eine vollständige Fällung mit etwa 26 Gew.$ Ammoniumsulphat statt· Vorzugsweise werden die Fällungsprodukte durch Chromatographie weiter gereinigt, vorzugsweise durch Exklusionschromatographie und/oder Ionenaustauscherchromatographie, vorzugsweise durch eine Kombination beider Verfahren·
Es ist aber auch möglich auf andere Reinigungsverfahren auf KoIekülgrössen, Form- und Ladungsgrundlage zurückzugreifen, ζ·Β· Isoelektrische Focusierung, Elektrodialyse und/oder Ultrazentrifugierung·
Im bevorzugten Verfahren geht der Abtrennung des Cholelysins aus der Galle eine Verfahrensstufe zur Entfernung der Gallensäuren voran· Hierzu verwendet man z.B. Ionenaustauscher·
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Erfindungsgemäss wird ferner ein Verfahren zur ,Auflösung von Fibrin vorgesehen, mit dem Kennzeichen, dass das Fibrin der lytischen Wirkung eines Präparates ausgesetzt wird, das als aktiven Bestandteil eine fIbrinolytische Substanz gemass der Erfindung (Cholelysin) enthält.
JErfindungsgemäss ist ferner ein Verfahren zur Hemmung der Blutgerinnung vorgesehen, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut mit einer koäggulationshemmenden Konzentration eines solchen Produkte= versetzt wird·
Die Verfahren können sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden·
Erfindungsgemäss ist ferner ein pharmazeutisches Präparat vorgesehen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine fibrinolytisch wirksame, bzw» Blutplättehen-aggregationshemmende Konzentration eines erflndungsgemässen Produktes (Cholelysin) in einer physiologisch verträglichen Form, vorzugsweise, einer intravenös verabreichbarer Form enthält.
Das bevorzugte Präparat dient der Behandlung von Thrombosen und wird vorzugsweise in Form von Doseneinheiten geliefert. Das Präparat kann beispielsweise in einer intravenös einspritzbaren Form oder als Intravenöse Dauerinfusion vorliegen.
Das Präparat kann als Doseneinheiten, ζ·Β· in Form von Ampullen fttr Einspritzzwecke vorliegen, wobei eine Doseneinheit z.B.
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zwischen 1 und $0 mg vorzugsweise zwischen 5 und 30 mg, insbesondere 25 mg für die Humantherapie beträgt. Im Falle der Intravenösen Dauerinfusion sollen beispielsweise zwischen 1 und 50, insbesondere 25 mg pro Stunde verabreicht werden·
An Batten wurde festgestellt, dass die Halblebzeit für Cholelysin in vivo etwa eine halbe Stunde beträgt·
Bei Einhaltung der obengenannten Konzentrationen der Anwendung, war die einzige beobachtbare physiologische Wirkung eine drastische Verlängerung der Blutungszelt·
Das gleichzeitige Vorhandensein koaggulatlonshemmender und fibrinolytischer Eigenschaften kann besonders wertvoll sein, da bereits gebildete Gerinsel wieder gelöst werden können, während die Bildung neuer Gerinsel verhindert'wird, bzw, die neu gebildeten Gerinsel geschwächt werden·
Die pharmazeutischen Präparate können herkömmliche Streckmittel, bzw. Träger, enthalten und sind vorzugsweise stabilisiert. Cholelysin kann in pharmazeutischen Präparaten auch mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden, z.B. anderen Wirkstoffen zur Hemmung der Blutgerinnung, einschliesslich der .eingangsin der Beschreibung genannten bekannten Wirkstoffe. Cholelysin kann auch mit anderen Wirkstoffen kombiniert werden, die entweder selbst fibrinoly tische Wirkung besitzen, oder die FlbriröLyse in vivo fördern·
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Cholelysin kann in entsprechenden Fällen auch in Kombination mit anderen Arzeimitteln zur Anwendung kommen, um eventuellen thrombogenischen Nebenwirkungen solcher Arzeimittel entgegen zu wirken·
Im folgenden soll die Erfindung an Hand von Beispielen, teilweise unter Verweisung auf die Zeichnungen, näher erläutert werden·
Se stellen dart
Fig· 1 die fibrinolytische Aktivität von ganzer menschlicher Galle und die Stabilität dieser Aktivität bei verschiedenen Temperaturen;
Fig· 2 ein Ionenaustausc herehromatogramm des mit Ammoniumsulphat aus Ochsengalle gefällten Niederschlages;
Fig. 3 ein Exklusionschromatogramm des mit Ammoniuasulphat aus Ochsengalle gefällten Niederschlages·
Beispiel 1
Es wird auf Fig· 1 hingewiesen· Die Galle von U- Patienten wurde gesammelt und im Verhältnis 1 ί 20 Tris/NaCl Puffer (Tris 0,06 K und NaCl 0,09 M mit 0,02 % Azid, pH 7,5) verdünnt. Dieser Puffer wurde für sämtliche Verdünnungen und als Elutionsmittel in der Säulenchromatographie verwendet. Die Proben wurden in Wasser bei den genannten Temperaturen vorinkubiert· Anscbliessend vurden Proben von 2$ Microliter in 2-fach auf Fibriplatten aufgetragen· Die Fibrinplatten wurden 2h Stunden lang in einer vasserdampfgesättigten Kammer inkubiert. Anschliessend vurden die Lysen-Zonen an 2 Durchmessern im rechten Winkel zueinander gemessen,
""■3fl9IU.1l/1 H i© :f - 10 -
Der Durchschnitt der daraus berechneten Oberflächen wurde in mm aufgezeichnet. FtIr Vergleichszwecke wurde Plasmin in 50£ Glyzerin (gelagert bei -UO0C) verwendet. 25 Microliter der Piasminlösung, die 0,1 CTA-Einheiten pro Milliliter enthielt, ergaben eine .'. , Lysen-Zone von 180 +/- 20 mm ·
Beispiel 2
100 ml Ochsengalle wurde 30 Minuten lang bei 25°C gründlich mit 3 g Ionenaustauscher (DEAE Sephadex A 50) vermischt zur Extraktion der Gallensäuren· Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 15 000 U.p.M. zentrifugiert* Der Niederschlag wurde, mit 50 ml Tris ECl Puffer, pH 3»0 ausgewaschen und zentrifugiert·
Die überstehenden Flüssigkeiten wurden kombiniert und mit Puffer auf ein Gesamtvolumen von 100 ml verdünnt und mit kO Gew.jS Ammoniumsulphat versetzt· Das Semisch wurde bei h°C und 15 000 ü.p.M, zentrifugiert·
Der Niederschlag wurde wieder in Tris HCl Puffer pH 8,5 gelöst und Dialyse gegen Tris HCl Puffer pH 8,5 gereinigt.
Proben der so erhaltenen Lösung wurden dann folgendermassen chromatographiert:
Die proteolytische Aktivität für beide Chromatogramme (Ionenaustauscher sowie molekulare Exklusionschromatographie) wurde durch Messung der lysierten Oberfläche (mm ) nach 17 Stunden an Fibrinplatten bei 37°C an sämtlichen gesammelten Fraktionen bestimmt und aufgetragen·
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Ionenaustauscher Chromatographie
Diese wurde bei U0C an einer Whatman DE 32 Säule, 1,5 cm χ \J cm, durchgeführt. Tris Puffer 0,006M, pH 8,5 mit Natriumchlorid-Gefälle wurde als Elutionsmittel verwendet. Das Elutionsprof il ist aus Fig. 2 ersichtlich.
Nochmalige Chromatographie zeigte^ dass die Spitzen I und III chromatographisch verhältnismässig homogen waren, während die Spitzen II und IV jeweils aus mehr als einem Enzym bestanden.
Das NaCl-Gefälle entsprach einer Konzentrationszunsbne von 0,006 auf 0,2M NaCl in der 0,06M Otis-Puffer Lösung (pH 8,5)·
In Fig· 2 (und ebenso in Fig.3) stellt die gestrichelte Linie die , Lyse dar, während die Absorption von der durchgehenden Linie dargestellt wird.
21 ml der dialysierten Probe wurden verwendet. Die Elutionsgeschwindigkeit betrug 28 ml pro Stunde.
Molekulare Exklus ionschromatograu hie .
Proben von 2 ml wurden auf einer Sephadex Q 200 SKuIe (1,5 χ 96 cm) caromatographiert. Die Elutionsgeschwindigkeit betrug 8,8 ml/Stunde und die Fraktionsgrösse 2,2 ml. Als Elutionsmittel fand Puffer, 0,006M Tris, pH 8,5i Verwendung. Das Chromatogramm ist aus Fig· ersichtlich.
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Analyse der enzymatischen .Aktivität.
1. Proteolytische Aktivität.
(a) Fibrinolatte '
Die Spitzen I - IV des Ionenaustauschercnromatogramms (Fig.2) wurden getrennt untersucht· Hierzu wurden 20 Microliter Proben auf kalte bzw. erwärmte (360C, 30 Min·) Fibrinplatten aufgetragen· Die Platten wurden 17 Stunden lang bei 37°C inkubiert
und das Ausmass der Lyse in v.aa gemessen. Das Ergebnis ist Tabelle I zu entnehmen.
Tabelle I
Fibrinplatte erwärmt normal erwärmt
156 70 81
Probe Versuch 1 Versuch 2 37^ 226 182
SPITZE I normal 168 252 156
II 195 81 96 120
III hlB ifOOO
IV 126 72 90
DEAE amm·-
ßulphat
Niederschlag		 70 IM+
Plasmin 3375
menschliche
Galle
238
- 13 -
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(b) Casein Hydrolyse.
Die proteolytische -Aktivität hinsichtlich Gaseinhydrolyse wurde gemäss einer Standardmethode (Methods in Enzymology, Cslöwick & Kaplan) bestimmt und in Tabelle II tabelliert« Kristallines Trypsin und Chymotrypsin wurden vergleichsweise ebenfalls bestimmt·
Tabelle II.
Proteolytische Aktivität von Gallenfraktionen hinsichtlieh Casein-Hydrolyse.
Enzym Proteolytische Aktivität
ά A 280 mg prot· °x -
CHYMOTHYPSIK 92 ■■■.'■■
TRYPSIN 35
SPITZE I 9*88 ■." . ' . -
SPITZE II 15.63 .■■.-."
SPITZE III 20.91 (appzoz·) (axuäiheröä)-
SPITZE IV 21.765
(c) Spezifische S
Die Ionenaustauscherfraktionen wurden auf" i für basische ümminosäuren unter Verwendung Argenyl ÄthyO^pster (BjfflE) geprüft, nach einem (Pty)Ltd. angegebenen Verfahren.
Die Ergebnisse sind aus Tabelle III ersichtlich.
»£&» Benzoyl-Miles, Seravae
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Tabelle III
Reaktionsgeschwindigkeit der Spitzen I » IV mit BAEB
ENZYM HYDEOLYSEGESCHWINDIGKEIT VON BAEE
Δ A 253» aln t »g P*o tZ"1
THYPSIN 3.13
SPITZE I 0.201
SPITZE II 0
SPITZE III 0
SPITZE IV 0
2. Aktivator Aktivität
Die vier Spitzen (I - IV) des Ionenaustauscherchromatogramms wurden auf Plasminogen-Aktivatoraktivität geprttft. In diesem Versuch wurde die von den Spitzen I - IV in Gegenwart bzw· Abwesenheit von einer Einheit pro ml Plasminogen hydrolisierte Menge Kasein gemessen. Urokinase, 500 Microgramm/al diente als Standard· Die Ergebnisse waren sämtliche negativ.
Stabilisierung
Alle vier Fraktionen waren 5 Monate lang bei h°C in Gegenwart von jJk CaCl2 und Mg Cl2 stabil. Molekulargewichtsbestimmungen mittels Exklusionschromatographies
SPITZE I 10 000 SPITZE II 12 000 SPITZE III 9 500
jag) (12 pg) (32
SPITZE IV (50 000) (50 Ug) (7 500)
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Gerlnmingshemmende und Iytische Wirkung, in messenterischen Gefässen von Batten,
Thrombose wurde in einer bekannten Weise durch Anwendung eines elektrischen Stromes (60 Sek. lang) zur Erzeugung von Spasmen induziert mit folgendem Ergebnis«
Strom Kontraktion
UA 		Thromböse 0 100 % Embolle
(Minut.)		 00 Auflösung
d,Gerinsels
(Minuten)		 W- 6
Kontrollversuch 0 00 If - 18
50 1 60 % 50.% 5
100 + 100 $> 1 Stund· naoh Einsoriteune von Cholelvein 8 - 15-.**
200 + 100 % 50 I 15 - CQ
ITach Anwendung von 2^ ug Cholelrsin 100 +
50 1 Ό 0
100 + 0 0
200 + W- 18 min· 8 · Co
1 -- 5 min·
1 - 5 min·
- 16 -
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Thrombolytische Wirkung in Kaninchen«
Der Versuch wurde in bekannter Weise durch künstliche Induktion einer Thrombose mit Phenol in einem abgeklemmten Abschnitt der Femorvene von Kaninchen durchgeführt· Trotz der erheblichen VersuchsSchwierigkeiten liess sich eine tbrombosehemmende Wirkung beobachten·
BlutDlättchenaggregationsmessung.
Verwendete· Materials menschliches Plasma mit 200 000 Blutplttttchen pro Microliter·
Kochsalzlösung / Phosphatpuffer·
Cholelysin itOO Einheiten pro ml· (Eine Einheit ist die Menge, welche 1 mm2 Lyse an Fibrinplatten erzeugt·) Die Fibrinplatten werden mit 10 ml 0.1 % Fibrinogenlösung und 0.2 ml Kalziumthroabinlösung hergestellt. Die Platten werden 20 mal vorsichtig umgedreht, 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur offen gehalten, und dann 10 Hinuten lang bei 370C inkubiert·
Adenosin-Diphosphat
IT*
Collagen Standardsuspension (5g Sehne im Waring-Mischer eitraiert, Gesamtvolumen 30 ml)·
Methode?
Die Blutplättehensuspension wird in einem Kunststoffbehälter gründlich mit der zu prüfenden Substanz vermischt und mit einem magnetischen Bttbrer verrührt· Die optische Dichte wird automatisch aufgetragen, wobei ein Anstieg der Kurve einer zunehmenden Lichtdurchlässigkeit entspricht·
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- 17 .
Cholelysin wird mit ADP bzw. Collagen in Endkonzentratioa von kO bzw· 80 Einheiten pro ml versetzt· Die Hemmung lässt sich bereits bei kO Einheiten beobachten und ist bei 80 Einheiten vollständig.
Fällungs reaktionen
Die durch Molekularexcluaionschromatographi® gereinigten Fraktionen wurden auf ihre Fällbarkelt mit einigen Fallungsmitteln getestet»
Sämtliche Proben wurden mit O1IM Phosphatpuffer (pH 5,8) auf eine Konzentration von kQO Einheiten pro ml verdünnt.
Versetzen mit Chlorpromazin (Endkonzentration 10 mM> ergab quantitative Fällung·
Versetzen mit Promazin oder imttryptilene (End« konzentration 5 mH bzw· 10 mM) ergab durchschnittlich 75$ FSllung der lytisehen AktivitSW
30 9 841 i

Claims (1)

  1. Pa tentansp rüc he
    Fibrinolytisch aktives Produkt, dadurch gekennzeichnet, dass es in reinerer bzw. konzentriertererForm als in der Natur vorliegt, und dass es neben seiner fibrinolytischen Aktivität folgende Eigenschaften aufweist:
    (i) Es kommt in der Galle von Säugetieren vor und kann daraus, gegebenenfalls nach Entfernung störender Gallensäuren,mit Ammoniumsulphat gefällt und durch Exklusionschromatographie auf vernetzten Polydextran, das sich zur Trennung von Proteinen im Molekulargewichtsbereich von 5 000 eignet, weiter gereinigt werden,
    (ii) es hat die Eigenschaft Fibrin zu lösen, aktiviert aber nicht Plasminogen, Trypsinogen und Chymotrypsinogen,
    (111) es lässt sich nicht dialysieren,
    (Iv) es ist ein Protein,
    (v) bei pH 7th verhält es sich anionisch; sowie fibrinolytisch aktive Derivate dieses Produktes·
    2· Produkt gemäss Anspruch I9 gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht zwischen 5 000 und 5° 000 und durch kaseinolytische Aktivität.
    " 19 " 309841/1103
    3. Produkt gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich in der Zwischenphase zwischen einem Chloroform/Methanol-Verteilungssystem anreichern lässt, und dabei in beiden Phasen im wesentlichen unlöslich ist und in diesem Versuch nach-3 Wochen bei V5C noch etwa h % seiner lytischen Aktivität besitzt, im Falle sofortiger Entfernung aus diesem System den Überwiegenden Teil seiner Aktivität beibehält, sowie nach etwa 1 bis 3 Stunden in diesem System noch etwa -k seiner Aktivität besitzt.
    *f. Produkt gemäss einem der Ansprüche 1-3» gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht zwischen 5 000 und 20 000·
    5· Produkt gemäss Anspruch If, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht zwischen 5 000 und 15 000 nach der Exklusionchromatographie-Bestimmungsmethode.
    6· Produkt gemäss einem der Ansprüche 1-3» mit einem Molekulargewicht von der Grössenordnung von 5© 000.
    7. Produkt gemäss einem der Ansprüche 1 - 6, gekennzeichnet durch Antikoaggulationseigenschaften.
    8· Produkt gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikoaggulationseigenschaft mindestens teilweise auf die Inhibierung der Blutplättchen-Aggregierung durch Collagen zurückzuführen sind·
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    9. Produkt gemäss einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass es mit Kalzium- bzw! Magnesiumionen stabilisiert ist.
    10. Produkt gemäss einem der Ansprüche 1 ·· 9» dadurch gekennzeichnet, dass es ein natürlicher Bestandteil von Galle ist, und in mindestens 10 mal so hoher Konzentration wie in durchschnittlicher menschlicher Galle vorliegt.
    11· Produkt gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass es in mindestens 100 mal so grosser Konzentration wie in durchschnittlicher menschlicher Galle vorliegt.
    12· Produkt gemäss Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass es so weitgehend gereinigt ist, dass es sich durch Exklusionschromatographie im wesentlichen nicht weiter zerlegen lässt.
    13· Produkt gemäss einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich durch Ionenaustauscher-Chromatographie im wesentlichen nicht weiter zerlegen lässt.
    . Verfahren zur Herstellung einer fibrinolytischen Substanz gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass diese al· proteinhalt ige Fraktion aus Galle abgetrennt wird·
    Verfahren gemäss Anspruch l*f, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion mit Ammoniumsulphat gefällt wird.
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    16. Verfahren gemäss Anspruch lh oder 15Y dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion chromatographisch weiter gereinigt wird·
    17. Verfahren gemäss einem der Ansprüche lh- bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Abtrennung der Fraktion zunächst Gallensäuren aus der Galle entfernt werden·
    18. Verfahren zum lösen von Fibrin, dadurch gekennzeichnet, dass das Fibrin der Iytischen Aktivität eines Präparats ausgesetzt wird, das als aktiven Bestandteil eine Substanz gemäss eines der Ansprüche 1 bis 13 enthält·
    19· Verfahren zur Hemmung der Blutgerinnung, dadurch gekennzeichnet, dass das Blut mit einer gerinnungshemmenden Konzentration einer Substanz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12 versetzt wird.
    20. Verfahren gemäss Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet,-dass es in vitro durchgeführt wird·
    21. Verfahren gemäss Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass es in vivo durchgeführt wird·
    ■ - - ■ χ
    22· Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es eine fibrinoly tisch wirksame bzw. BIu tplät te hen-Aggregat ionshemmende Konzentration einer Substanz gemäss einem der Ansprüche 1 bis 13 in einer physiologisch verträglichen Form enthält·
    309841Ύ1103
    - 22 -
    23· Präparat gemäss Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es in intravenös anwendbarer Form vorliegt·
    · Verfahren gemäss Anspruch 23» dadurch gekennzeichnet, dass es in Doseneinheiten von zwischen 1 und 50 mg der Substanz vorliegt·
    309841/1103
    L e e r s e i t e
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