DE2231725A1

DE2231725A1 - Verfahren zur messung der dicke und der dickenabweichungen eines in einem mikrotom geschnittenen abschnittes sowie verfahren zur erzeugung von dickenaenderungen des abschnittes

Info

Publication number: DE2231725A1
Application number: DE2231725A
Authority: DE
Inventors: Eskil Rautio; Per Wikefeldt
Original assignee: LKB Produkter AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1971-06-30
Filing date: 1972-06-28
Publication date: 1973-01-18
Also published as: US3845659A; DE2231725B2; SE349862B; GB1385787A; JPS5544893B1; FR2144392A5; DE2231725C3

Description

2231725 Patentanwalt Dipl.-Phys.Gerhard Liedl 8 München 22 Steinsdorfstr.21 22 Tel.298462

A 5641

LKB -Produkter AB, S-161 25 Bromma 1, Schweden

Verfahren zur Messung der Dicke und der Dickenabweichungen eines in einem Mikrotom geschnittenen Abschnittes sowie Verfahren zur Erzeugung von Dickenänderungen des Abschnittes

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Dicke und ihrer Abweichungen eines in einem Mikrotom von einem Probenblock abgeschnittenen Abschnittes sowie ein Verfahren zur Erzeugung von Dickenänderungen eines in einem Mikrotom von einem Probenblock abgeschnittenen Abschnittes.

Wenn ultradünne Abschnitte (< 1.000 A) abgeschnitten wurden, die für Untersuchungen in einem Elektronenmikroskop verwenden werden sollen, zeigt sich manchmal aufgrund dieser Untersuchungen, daß die Abschnitte mit störenden parallelen Linien versehen sind, die durch Änderungen in

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der Dicke des Abschnittes gebildet werden. Diese Linien können sich selbst dann ergeben, wenn äußere Schwingungsquellen beseitigt werden, weswegen die Dickenänderungen eine Folge bzw. ein Ergebnis des Schneidens an sich sind. Die Linien, die senkrecht zur Schneidrichtung verlaufen, werden üblicherweise als "Riefen" oder mit dem englischen Ausdruck "chatter" bezeichnet. Der Abstand zwischen diesen Linien liegt in aller Regel in der Größenordnung von 5. 000 A. Diese Linien können daher in einem Lichtmikroskop nicht erkannt werden, sondern werden lediglich dann entdeckt, wenn der Abschnitt im Elektronenmikroskop untersucht wird. Das Verfahren zum Entfernen dieser Linien, das beispielsweise durch Abändern des Winkels zwischen der Messerkante und der Probe durchgeführt wird, ist daher sehr zeitraubend.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren zu schaffen, mittels dessen die Erzeugung von Riefen beim Schneiden festgestellt werden kann und mittels dessen es daher möglich ist, die erforderlichen Justierungen zur Beseitigung der Dicken änderungen durchzuführen, ohne daß die Abschnitte in einem Elektronenmikroskop untersucht werden müssen.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das erfindur/wgemäße Verfahren derart ausgestaltet, daß die beim Schneiden auftretenden Kräfte parallel zur Schnittfläche einer Kraftmeßeinrichtung zugeleitet werden, die mit dem Messer oder dem Probenblock verbunden wird und ein Meßsignal erzeugt, daß ein Maß für diese während des Schneidvorganges auftretenden Kräfte und damit für die Dicke des Abschnittes ist.

Ein weiteres Problerii bei der ultramikroskopischen Untersuchung besteht in der Bestimmung des Abstandes zwischen verschiedenen Elementen eines Abschnitt es, wenn dieser im Elektronenmikroskop untersucht wird.

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Die Bestimmung dieser Abstände innerhalb des Abschnittes ist bisher üblicherweise auf die Weise durchgeführt worden, daß kleine Latexbälle mit genau definiertem Durchmesser über den Abschnitt verteilt wurden, um auf diese Weise eine Oberflächenbezugsskala zu erhalten. Der Nachteil dieses Verfahrens liegt darin begründet, daß der Abschnitt in seiner Struktur häufig in Schneidrichtung zusammengedrückt ist, weswegen sich die Oberflächeribezugsskala auf den zusammengedrückten Abschnitt bezieht und keine exakte Information hinsichtlich der ursprünglichen Abstände in der Struktur der Probe gibt.

Der Erfindung liegt daher weiterhin die Aufgabe zugrunde, diese Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren zu schaffen, mittels dessen eine Abstandsbestimmung bezüglich der ursprünglichen Probe durchgeführt werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß zur Schnittfläche senkrechte Kräfte mittels einer mit dem Messer oder mit dem Proberiblock verbundenen Krafterzeugungseinrichtung zum Messer oder zum Probenblock geleitet und hierdurch entsprechende Abweichungen in der Dicke der Abschnitte erzeugt werden.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen sowie aus der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen anhand der Zeichnung. Diese zeigt in:

Fig. 1 eine Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung;

Fig. 2 eine Darstellung zur Verdeutlichung der Anzeigesignale, die sich beim Schneiden mit Riefen ergeben, und

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Fig. 3 eine Darstellung zur Verdeutlichung der Anzeigesignale, die sich beim Schneiden ohne Riefen ergeben.

Wie aus Fig. 1 ersichtlich, ist in einem Mikrotom ein Probenarm SH vorgesehen, an dem sich ein Proberiblock S befindet. Wenn der Probenblock S, der beispielsweise aus einer in Kunststoff eingebetteten organischen Probe bestehen kann, geschnitten wird, wird der Probenarm SH in Keilrichtung nach unten gegen ein Messer K verfahren, das einen Abschnitt, d. h. eine Schnittprobe vom Probenblock S abschneidet. Die zum Vorschub des Probenarms SH und zur Handhabung der Abschnitte verwendeten Vorrichtungen sind an sich bekannt und in Fig. 1 daher nicht weiter dargestellt. Der Probenarm SH ist weiterhin mit zwei piezoelektrischen Sensoren Pl und P2 versehen, die javeils einen Teil des Probenarms SH bilden. Wenn der Probenarm SH beim Schneiden nach unten in Richtung zum Messer K verfahren wird, üben die sich vom Messer K her ergebenden senkrechten Kräfte auf den unteren Sensor P2 eine Zigkiaft und auf den oberen Sensor Pl eine Druckkraft aus. Die Summe aus der auf den unteren Sensor P2 wirkenden Zugkraft und aus der auf den oberen Sensor Pl wirkenden Druckkraft bildet dann ein Maß für die Querkraft, die auf die Probe einwirkt. Die Ausgänge der elektrischen Sensoren Pl, P2 sind gegeneinander, d. h. über Kreuz verbunden, so daß sich zwischen den Eingängen Il und 12 eines Verstärkers A eine Spannung ergibt, die dieser Kraft entspricht. Der Verstärker A. ist ein Rechenverstärker bzw. Funktionsverstärker mit einer hohen Eingangsimpedanz und einer hohen negativen Innenverstärkung. Der Verstärker A ist weiterhin mit einem Rückkoppelungsweg versehen, der einen zwischen den einen Ausgang Ul des Verstärkers A und den Eingang Il geschalteten Kondensat or Siufweist. Die restlichen Eingangs- bzw. Ausgangsanschlüsse 12 bzw. U2 sind an Erde gelegt.

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Die Vorrichtung funktioniert folgendermaßen:

Wenn auf die Sensoren Pl, P2 eine Zugkraft oder Druckkraft ausgeübt wird, wird in ihnen eine elektrische Ladung Q erzeugt, die zum Kondensator C geleitet wird. Die am Kondensator C anliegende Spannung entspricht dannQ/C und liegt außerdem an den Ausgangsverbindungen Ul und XJ2 an, da der Rückkoppelungsweg eines Verstärkers mit den oben beschriebenen Eigenschaften bedingt, daß die beiden Eingänge an im wesentlichen derselben Spannung gehalten werden.

Das piezoelektrische Material der Sensoren Pl, P2 wird so ausgewählt, daß die elektrische Ladung Q für eine vorgegebene Kraft so groß wie möglich wird. Der Vorteil einer Messung der von den Sensoren erzeugten elektrischen Ladung anstatt einer Messung der erzeugten Spannung liegt darin, daß der Kondensator C als Speicherelement wirkt, d. h. wenn die Sensoren über einen bestimmten Zeitraum hin einer konstanten Kraft ausgesetzt sind, bleibt das Aus gangs signal während dieses Zeitraumes konstant. Wenn die Ausgangsspannung zwischen den Anschlußenden der Sensoren gemessen wird, nimmt das Meßsignal bei einer konstanten Kraft ab und zwar aufgrund von Ableitungsströmen. Es kann weiterhin nachgewiesen werden, daß die Empfindlichkeit unabhängig von der Länge und der Querschnittsfläche der Sensoren ist, wenn die erzeugte Ladung gemessen wird. Die Sensoren können daher dünn ausgebildet werden und weisen eine große Querschnittsfläche auf, was hinsichtlich des Umstandes von Bedeutung ist, daß die Elastizitätseigenschaften des Mikrotoms nicht beeinflußt werden.

Der links in Fig. 2 ersichtliche Abschnitt Sl wurde von dem Probenblock S gemäß Fig. 1 in Pfeilrichtung abgeschnitten. Hierbei ist die Dicke des Abschnittes Sl mit & bezeichnet. Aus dem Diagramm rechts in Fig. 2 ist das Ausgangssignal V ersichtlich, das sich während des Schneidens an

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den Ausgangsklemmen Ul und U2 ergab. Dieses Ausgangssignal nimmt während des Schneidvorganges linear ab ,und zwar aufgrund der sich in Pfeilrichtung verringernden Breite des Abschnittes Sl. Versuche haben weiterhin gezeigt, daß die Schneidkraft und daher auch die Amplitude des Ausgangs signals innerhalb gewisser Grenzen linear von der Dicke des Abschnittes abhängen. Die Vorrichtung gemäß Fig. 1 kann daher nach einer Eichung zur Dickenbestimmung der Abschnitte verwendet werden.

Der weiterhin links aus Fig. 3 ersichtliche Abschnitt S2 wurde ebenfalls vom Probenblock S abgeschnitten. Dieser Abschnitt S2 ist mit den oben erwähnten parallelen Linien versehen, d. h. die Dicke des Abschnittes S2 ändert sich entlang der Schneidrichtung, wie auf der Abschnittoberfläche angezeigt. Rechts aus Fig. 3 ist das entsprechende Aus gangs signal aus der Vorrichtung gemäß Fig. 1 ersichtlich. Wie ohne weiteres deutlich wird, ändert sich das Ansgangssignal entsprechend der Dickenänderimg

es
des Abschnittes S2, und kann daher auf diese Weise festgestellt werden, ob ein Abschnitt mit Riefen versehen ist. Zur Vermeidung dieser Riefen lassen sich daher entsprechende Verstellungen bzw. Justierungen vornehmen, indem beispielsweise der Messerwinkel cc. geändert wird, ohne daß der geschnittene Abschnitt in einem Elektronenmikroskop untersucht werden muß.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können daher durch Messen der Schneidkräfte die Dicke des Abschnittes sowie Änderungen dieser Dicke entlang des Schneidumfanges bestimmt werden. Unmittelbar darauf können entsprechende Vorkehrungen getroffen werden, um mögliche Fehler zu beseitigen, was bedeutet, daß Zeit eingespart und die Gefahr beseitigt wird, daß verfügbare Proben aufgebraucht werden, ohne daß sich für elektronenmikroskopische Untersuchungen geeignete Abschnitte bzw. Schnittproben ergeben.

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Die Vorrichtung gemäß Fig. 1 kann außerdem zur Erzeugung von Dickenänderungen der Abschnitte, die für die oben erwähnte Bezugsskalenbestimmung Anwendung finden sollen, verwendet werden. Wenn nämlich beide Sensoren Pl, P2 in Serie geschaltet werden und eine Wechselspannung bestimmter Frequenz den Anschlußklemmen II, 12 angelegt wird, erhält man Dickenänderungen des Abschnittes, wie sie beispielsweise aus Fig. ersichtlich sind. Wenn die Frequenz der Wechselspannung und die senkrechte Geschwindigkeit des Probenarms SH bekannt sind, erhält man parallele Linien, die einen genau bestimmten Abstand untereinander aufweisen. Solch ein Abschnitt kann dann als Bezugsskala für darauffolgende Abschnitte im Elektronenmikroskop verwendet werden. Auf diese Weise ergibt sich ein automatischer Ausgleich bei dem normalerweise in den Abschnitten auftretenden Zusammendrücken in Schneidrichtung, da der Abstand zwischen den Linien um ein entsprechendes Ausmaß zusammengedrückt wird bzw. zusammenrückt. Die Bezugsskala ist daher auf die Probe vor ihrem Schneiden bezogen. Dieses Verfahren ist einfacher und weniger aufwendig als das oben beschriebene Verfahren zur Bezugs Skalenbestimmung, bei dem Kunststoffbälle verwendet werden.

Die aus Fig. 1 ersichtliche Vorrichtung zur Bestimmung der Schneidkraft kann außerdem zur Messung solcher Abweichungen der Schneidkräfte verwendet werden, die von anderen Störungen des Schneidvorganges herrühren und sich beispielsweise aufgrund von Fehlern beim Einbetten der Probe in den Probenblock ergeben.

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Claims

Patentansprüche

l) Verfahren zur Messung der Dicke und der Dickenabweichungen eines von einem Probenblock mittels eines Messers in einem Mikrotom abgeschnittenen Abschnittes, dadurch gekennzeichnet, daß die beim Schneiden auftretenden Kräfte parallel zur Schnittfläche einer Kraftmeßeinrichtung (Pl, P2) zugeleitet werden, die mit dem Messer (K) oder dem Probenblock (S) verbunden wird und ein Meßsignal erzeugt, daß ein Maß für diese während des Schneidvorganges auftretenden Kräfte und damit für die Dicke des Abschnittes (Sl, S2) ist.
2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kraftmeßeinrichtung einen oder mehrere piezoelektrische Sensoren (Pl, P2) aufweist.
3. Verfahren zur Erzeugung von Dickenänderungen eines Abschnittes, der mittels eines Messers in einem Mikrotom von einem Probenblock abgeschnitten wird, dadurch gekennzeichnet, daß zur Schnittfläche senkrechte Kräfte mittels einer mit dem Messer (K) oder dem Probenblock (S) verbundenen Krafterzeugungseinrichtung zum Messer oder zum Proberiblock geleitet und hierdurch entsprechende Abweichungen in der Dicke der Abschnitte (Sl, S2) erzeugt werden.
4. Vorrichtung zur Durcliführung des Verfahrens nach Anspruch 3, dadurch gekennzoichnet, daß die Krafterzeugungseinrichtung von einem oder mehreren piezoelektrischen Elementen (Pl, P2) gebildet ist, an die ein elektrisches ßignnl geliefert wird.

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