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Mikroskopanordnung zur Untersuchung tiefgekühlter Proben, mit einer
zwischen Mikroskopobjcktiv und Probe bz..
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Probenabdeckung angeordneten Immersionsflüssigkeit In bsstimmten
Fällen, z.B. wenn biologisches Material mit möglichst unzerstörten Zellen untersucht
werden soll, ist es unerläßlich, daß die Probe tiefgekühlt wird. Es sind auch bereits
Einrichtungen bekannt, um von extrem tief (z.B. auf 77° K) gekühltem Probenmaterial
mikroskopische Dünnschnitte herzustellen, Auch Kikroskope mit an eine
Kühlvorrichtung
angeschlossenen Probenhalterungen, die eine Kühlung; der Probe und eille Konstanthaltung
der Kühltemperatur gestatten, sind bekannt, Insbesondere bei Mikroskopen mit hohem
Auflösungsvermögen ist der bestand zwischen Probe und Objektiv senr gering, Zwischen
der tiefgekühlten Probe und dem Objektiv stellt sich deshalb in der dazwischen befindlichen
luft oder Immersionsflüssigkeit ein sehr steiler Temperaturgradient ein, der das
Konstenthalten besonders extrem tiefer Probentemperaturen erschwert.
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Die Erfindung scljafft eine einfache Anordnung zur wirksamen Konstanthaltung
extrem tiefer Probenterilperaturen in einer Nikroskopanordnung. Sie betrifft insbesondere
L.ikroskopanordnungen mit Objektiven, die tiefgekühlt werden können.
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SSe geht dabei aus von einer Mikroskopanordnung, bei der zwischen
Objektiv und Probe eine Immersionsflüssigkeit angeordnet ist. Immersionsflüssigkeiten
sind bekanntlich Flüssigkeiten mit angepaßtem Brechungsindex, die dazu dienen, die
numerische apertur des ldikroskops und damit sein Auflösungsvermögen zu vergrößern.
Immersionsflüssigkeiten, in der Regel bestimmte Öle, werden bisher ausschlie13lich
aufgrund ihrer optischen Eigenschaften ausgewählt und bei Zimmertemperatur oder
mäßigen Heizungs-- oder Kühltemperaturen verwendet.
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Erfindungsgomäß ird nun die Immersionflüssigkeit selbst zur Kühlung
bzw, Kühlhal@ung der Prube herangezogen. Hierzeu ist gemäß der Erfindung vorgesehen,
duß die Immersionsflüssigkeit durch eine Kühlvorrichtung auf eine bei oder nahe
der Probentemperatur liegende Temperatur kühlbar ist. Verzugsweise zirkuliert die
Immersionsflüssigkeit ständig durch die Kühlvorrichtung.
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Die extrem tiefen Kühltemperaturen, bei denen die Erfindung vorzugsweise
angewendet werden soll, stellen beson-@ore Anforderungen in die Bescheffenheit der
Inmersionsflassigkeit. Es @ird vorzugsweise eine bei extrem niedrigen Temperaturen
(unterhalb 100° K, insbesondere 77° K) flüs-@ige, für ultraviolettes Licht durchlässige
Substanz mit geringem Dampfaruck, insbesondere ein fluorierter Kohlenwasserstoff
(z.B. Prigen 13) verwendet.
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Unter @iner @ikroskopanordnung, bei der die Erfindung an-@endbar
ist, sind @ußer reinen Leobachtungsmikroskopen insbosondere auch solene Anordnungen
zu verstehen, bei denen dem @i@roskop @in Laser vorgeschaltet ist, dessen von einem
@ikroskopobjektiv durch die Immersionsflüssigkeit auf die Probe fo ussierte Strahlung
eine örtliche Anregung, Ver-@@@pfung, Zerstöran, Veränderung bzw. Ionisierung des
Prosenmaterials be@irkt. Die Immersionsflüssigkeit muß deshalb
nicht
nur, wie die bekannten Immersionsflüssigkeiten, im sichtbaren Bereich, sondern vor
allem auch im Wellenlängenbereich der verwendeten Laserstrahlung, z.B. im ultravioletten
Bereich, strahlungsdurchlassig sein.
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Eine Anordnung dieser Art kann beispielsweise als sogenanntes Strahlensticherät
dazu benutzt werden, um bei tiefgekühlten biologischen Proben auf kleinsten, wohl
definierten Bereichen eine Anregung, Koagulierung, Verdampfung, Zerstörung bzw.
Ionisierung des Probenmaterials zu bewirken und dadurch Untersuchungen z.B. von
subzellulären Strukturen durchzuführen. Beispielsweise kann das im Laserbrennfleck
verdampfte bzw. ionisierte Material in einem MassenspeLtrometer analysiert werden.
Die durch die Brfindung ermöglichte extreme Tiefkühlung der Probe dient dann im
wesentlichen dazu, die zu untersuchenden Zellen, ihre Substrukturen und lonenverteilung
ortsfest zu lokalisieren und die Braunsche Molekularbewegung auszuschalten.
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Besonders vorteilhaft kann die Brfindung jedoch in der Form angewendet
werden, daß die durch die Laserstrahlung, vorzugsweise von einem durchstimrnbaren
Laser angeregte Lumineszenz der Probe mittels einer auf die Probe gerichteten Nachweis-
und Spektroskopieeinrichtung gemessen und analysiert wird. flierbei wird durch die
Tiefkühlung der besondere
Vorteil erzielt, das die Spektrallinien
der Sumineszenzstrahlung wesentlich scharfer sind als bei ungekühlter Probe und
daß außerdem bei Anregung durch Laserimpulse die Abklingzeiten der Lumineszenz länger
der Messung zugänglich werden, wodurch eine zusätzliche Information über die Lumineszenzstrahlung
und damit über den Aufbzu der untersuchten Substanz gewonnen werden kann.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform taucht das Mikroskopobjektiv
in ein oben offenes, mit Immersionsflüssigkeit gefülltes Gefäß, das durch Leitungen
an eine Kühlvorrichtung angeschlossen ist und dessen Boden ein als Probenhalterung
dienendes durchsichtiges Fenster bildet oder aufweist. Vorzugsweise ist das Gefäß
mit der Probenhalterung über einer Üffnung einer mit Vakuum und/oder Schutzgas beaufschlagbaren
Kammer angeordnet und darauf abdichtend und in der Probenebene verschiebbar geführt.
Auf diese Veise ist die an der Unterseite des als Probenhalterung dienenden Fensters
angebrachte Probe unmittelbar dem Vakuum kzvs. Schutzgas ausgesetzt und kann außerdem
im Gesichtsfeld des Mikroskops zumindest um begrenzte Beträge verschoben werden.
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Ausführungsformen der Erfindung werden im folgenden anhand der Zeiclmungen
näher erläutert.
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Fig. 1 zeigt schematisch eine vollständige Likroskopanordnung gemäß
der Erfindung zur Untersuchung von Laserstrahl-angeregtor Lumineszenz.
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Fig. 2 bis 4 zeigen Details der Probenhalterung in geänderten Ausführungsformen.
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Gemäß Fig. 1 befindet sich die zu untersuchende Probe 1 auf der Unterseite
eines Deckgläschens im Innern einer Kammer 2, die svakuiert oder mit Schutzgas gefüllt
werden kann, wobei das Deckgläschen in unmittelbarem Kontakt mit einem Abdeckfenster
3 der Kammer steht. Die Probe 1 wird von einer probenhalterung 4 gehalten, die aus
einem gut wärmeleit fähigen Material, z.B. Kupfer, besteht und gleichzeitig zur
Kühlung der Probe dient. Zu diesem eck ist in die Probenhalterung 4 eine Stange
7 aus gut wärmeleitfähigem Material angeschlossen, die mit einer Abzweigung in eine
Kühlflüssigkeit 6 in einem außerhalb der Kammer 2 angeordneten Gefäß 5 taucht. Die
Stange 7 dient außerdem zur Verschiebung der Probe in X-, Y- und Z-Richtung. Statt
mittels Wärmeleitung durch die Stange 7 könnte die Kühlung auch dadurch erfolgen;
daß die Kühlflüssigkeit durch die hohl ausgeführte Stange 7 direkt an die Probenhalterung
4 herangeführt wird Zwischen dem Äbdeckfenster 3 und dem Mikroskopobjektiv 8 befindet
sich in einem offenen Gefäß 9 eine Immersionsflüssigkeit
10. Durch
Zu- und Ableitungsrohre 11, 12 wird die Immersionsflüssig@eit ständig durch eine
(nicht dargestellte) Kühlvorrichtung umgewälzt und durch diese ständig auf einer
der gewünsenten Probentemperatur entsprechenden tiefen Temperatur gehalten.
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Ein schematisch angedeuteter Laser 13 ist neben dem Likroskop angeordnet,
seine Strahlung @ird im Mikroskop durch einen Spiegel 14 umgelenkt und durch das
Mikroskopobjektiv 8 1 ale Probe 1 fokussiert. Durch die Laserstrahlung von extrem
hoher Lnergi edichte können in biologischen Proben bestimmte Anregungs- bzw. Zerstörungseffekte,
die auf kleinste Bereiche (z.B. 1 µm Durchmesser und weniger) beschränkt sind, hervorgerufen
werden. Insbesondere kann hierdurch Lumineszenz angeregt werden, die durch ein entsprechendes
Nachweisgerät 15 aufgefangen und analysiert werden kann. Vorzugsweise wird ein im
UV- ellenlängenbereich arbeitender laser 13 verwendet, z.B. ein Rubinlaser mit Frequenzverdoppler.
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Die Immersionsflüssigkeit 10 muß außer den an jede Immersionsflüssigkeit
zu stellenden Anforderungen (Durchlässigkeit und passender Brechungsindex in dem
jeweiligen ellenlängenbereich insbesondere ach Im im W ) außerdem noch die Eigenschaft@@
einer Kühlflüssigkeit haben, d.h. bei den
angestrebten tiefen Temperaturen
flüssig bleiben. Es wurde gefunden, daß Frigen 13, ein fluorierter Kohlenwasserstoff,
eine als Tiefkühlmittel geeignete Immersionsflüssigkeit ist.
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Bei einer vereinfachten Ausführungsform kann das Fenster 3 der Kammer
2 gleichzeitig als Probenhalterung dienen.
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Bei der in Fig. 2 dargestellten Ausführungsform ist der Boden des
die Immersionsflüssigkeit aufnehmenden Gefäßes 9 als Vakuumflansch 16 ausgeführt,
in den abdichtend das Fenster 3 eingesetzt ist, welches an seiner Unterseite die
Probe 1 trägt. In einer Ringnut in der oberen V«and der VakuuinJammer 2 ist eine
Dichtung 17 eingelegt, welche gegen die Unterseite des Vakuumflansches 16 anliegt,
wobei nicht dargestellte Andrück- und Führungsmittel den ausreichenden Dichtungsdruck
zwischen dem Flansch 16 und der Dichtung 17 aufrechterhalten.
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Auf diese Weise kann das gesamte Gefäß 9 mittels geeigneter Feintriebe
(wie z.B. bei 18 dargestellt) in X- und Y-Richtung verschoben werden, damit der
Brennpunkt des Laserstrahls auf bestimmte Probenbereiche gerichtet werden kann.
Geeignete Dichtungsanordnungen 17, die auch gegen Vakuum ausreichend abdichten und
Verschiebungen zulassen, sind im Handel erhältlich.
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Eine speziell für Hochvakuum geeignete Ausführungsform zeigt Fig.
3. liuf der oberen iand der Vakuumkammer 2 ist
das die Immersioneflüssigkeit
aufnehmende Gefäß 9 mittels Feintrieben (z.B. 18) in X- und Y-Richtung verschisbbar,
wobei zwischen der Außenwand des Gefäßes 9 und einem umlauf enden Dund 20 der Kammer
2 ein Dieitungsbalg 19 eus einem gewellten material, z.B. gewelltem Metallblech,
an geordnet ist. dieser Dichtungsbalg 19 ermöglicht bei hufrechterhaltung einer
gegen Höchstvakuum wirksamen Abdichtung begrenzte, jedoch in der Praxis völlig ausreichende
Verschiebungen des Gefäßes 9. In den wiederum als Ringflansch 16 ausgebildeten Boden
des Gefäßes 9 ist ein Fassungsring 21 auswechselbar eingesctzt. Zur Abdichtung dienen
Dichtungsringe 22. die keine Verschisbungen aufzunehmen brauchen. Der Fassungsring
21 trägt das Fenster 3, das als Probenhalterung für die Probe 2 dient.
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In Fig. 4 ist eine Anordnung angedeutet, bei der ein zylindrischer
Dichtungsbalg 23 aus gewelltem metallblech direkt zwischen den Fassungsring 21 und
der oberen and der Kammer 2 angeordnet ist.