DE2153673C3 - Vorbereiteter Objektträger zur Anfärbung von Retikulozyten, Plättchen und weißen Blutzellen in einer Blutprobe und zur mikroskopischen Betrachtung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen vorbereiteten Objektträger zur Anfärbung von Retikulozyten, Plättchen und «s weißen Blutzellen in einer Blutprobe und zur mikroskopischen Betrachtung.

Es ist erwünscht, in einer Blutprobe getrennt voneinander das Retikulum von jungen lebensfähigen Erythrozyten, Plättchen und den verschiedenen Kornponenten und Konstituenten des Gesamtgehaltes an weißen Blutzellen zu identifizieren, beispielsweise Eosinophile, Zytoplasma, zytoplasmische Granuli, Nuklei und Mitochondrien. Dies wurde im allgemeinen erreicht durch die Anwendung einer Vielzahl von Färbungsmitteln zur Separierung der Proben zur Bestimmung der verschiedenen interessierenden Komponenten. Im allgemeinen wurden die Färbemittel in Lösung angewendet, obwohl ein begrenzter Erfolg bei der Verwendung von einem getrockneten Färbungsmittelfilm berichtet worden ist.

Basische vitale Färbungsmittel färben nichtfixierte Retikulozyten spezifisch. Wenn eine Blutprobe mit Methylalkohol fixiert wird, ist die basische Färbung diffus. Es wird dabei keine Identifizierung von Plättchenzellen und weißen Blutkörperchen erzielt.

Sabin hat die Verwendung eines getrockneten Films von Neutralrot gemischt mit Janusgrün B auf einem Objektträger beschrieben, wobei eine kleine Menge Blut zugefügt wird. Die neutrophilcn, basophilen und eosionophilen Granuli werden geringfügig differenziert durch die pH-Empfindlichkeit des Neutralrots. Mitochondrien werden durch Janusgrün B gegengefärbt. Weiße Blutkörperchen werden differenziert durch Färben der Zytoplasmagranuli, die Größe und die Zellenbeweglichkeit — dies erfordert, daß die Zellen am Leben gehalten werden müssen trotz der mäßigen Toxizität der Färbemittel. Kürzliche Prüfungen dieser Methode zeigten keine zufriedenstellenden Ergebnisse. Dies spiegelt möglicherweise die Tatsache wieder, daß s° die Normen für ein ausreichendes Ergebnis sich seit dem ursprünglichen Bericht von Sabin in dem Jahr 1923 geändert habtr».

Bei anderen vorbekannten Methoden wird Brillant-Kresolblau verwendet, um Retikulozyten zu färben. Aber die weißen Blutkörperchen werden dabei nicht differenziert, die Nuklei färben sich nur schlecht und die Einfärbung von Zytoplasma ist unregelmäßig.

Retikulozyten können »efärbt werden in einem Gemisch von Blut und Methylenblau N, das in Salzlösung ausgebreitet und auf einem Objektträger getrocknet wird. Die Plättchen sind jedoch etwas verdeckt durch die Ausbildung von Niederschlag und bei den weißen Blutkörperchen werden nur die Zytoplasmagranuli gefärbt. <>5

Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß es keine vorbekannte Methode gibt, welche die getrennte Identifizierung von Retikulozyten, Plättchen und weißen Blutzellen (Leukozyten) einschließlich Einfärbung der Nuklei gestattet, sowie eine Differenzierung von Zytoplasmagranuli und Eosinophilen in einer einzigen Probe.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, einen vorbereiteten Objektträger zur Anfärbung von Retikulozyten, Plättchen und weißen Blutzellen in einer einzigen Blutprobe zu schaffen. Diese Aufgabe wird gemäß der vorliegenden Erfindung durch einen Objektträger gelöst, der einen getrockneten, homogenen Film von Methylenblau N und Kresolviolettazetat aufweist.

Die Benutzung des so erhaltenen vorbereiteten Objektträgers erfolgt in der Weise, daß auf die eingefärbte trockene Oberfläche ein Biuttropfen gegeben und durch das Gewicht eines Deckglases verteilt wird. Nach 5 Minuten der Einfärbung sind die Retikulozyten, Plättchen, Neutrophile (mit Unterscheidung von Zytoplasma und Kernen), Eosinophile (mit Unterscheidung von Zytoplasma und Kernen) und Basophile (mit Unterscheidung von enthaltenen Granuli) alle selbständig identifizierbar. Die erfindungsgemäßen Objektträger können vorbereite i und trocken gelagert werden, bis sie für die Verwendung benötigt werden.

Beschreibung einer Ausführungsform-.

Eine Lösung von 2,0 g Methylenblau N (Farbindex Basisblau 24) in 25 ml Methylalkohol (absolut) wird vorbereitet und über Nacht stehen lassen, d. h. zwischen 16 und 24 Stunden lang. Sie wird dann gefiltert, um irgendwelche ungelösten Rückstände zu entfernen.

Eine Losung von 1,0 g Kresolviolettazetat in 25 ml Methylalkohol (absolut) wird vorbereitet und über Nacht stehen lassen, d. h. zwischen 16 und 24 Stunden lang. Sie wird dann gefiltert, um irgendwelche ungelösten Reste zu entfernen.

1,0 ml der oben beschriebenen Lösung von Methylenblau N wird in ein Reagenzglas gegeben und 13 Tropfen (0,65 ml) der oben beschriebenen Lösung von Kresolviolettazetat werden zuge^f"gt und das Ganze durch Schütteln gemischt. Diese Menge reicht aus zur Vorbereitung von etwa 40 Objektträgern.

Ein Tropfen des Farbstoffgemisches wird auf das Ende eines sauberen Mikroskopobjektträgers gegeben. Ein anderer Objektträger aus Glas wird vertikal auf den Tropfen gesetzt und breitseits über die Oberfläche des ersten Objektträgers gezogen. Die Kapillarwirkung zwischen dem Objektträger und der Flüssigkeit wird eine gleichmäßige Verteilung des Farbstoffes gewährleisten. Es ist besonders wichtig, daß der Objektträger frei ist von Fetten oder Teilchen, beispielsweise von Staubteilchen. Der Objektträger wird dann sofort getrocknet durch Schwenken in Luft oder durch einen Strom eines sauberen trocknenen Gases, beispielsweise Luft, Unmittelbar nach dem Trocknen ist der Objektträger bereit für die Verwendung. Er kann jedoch für zukünftigen Gebrauch bei geringem Feuchtigkeitsgehalt gespeichert werden. Ein hoher Feuchtigkeitsgehalt bewirkt eine gewisse Deformation des Färbemittelfilms.

Zur Verwendung des Objektträgers wird die Probenentnahmestelle, beispielsweise der Finger, in konventioneller Weise mit 70%igem Methylalkohol sterilisiert und mit einer Blutlanzette punktiert, Der erste Blutstropfen wird abgewischt, der nächste Tropfen wird unmittelbar auf die vorgefärbte Oberfläche des Objektträgers gegeben.

Es wird sofort ein Deckglas über den kleinen Blutstropfen gelegt. Das Gewicht des Deckglases kann

ausreichen, um den Tropfen gleichmäßig über den Objektträger zu verteilen. Wenn dies nicht erfolgt, dann bewirkt ein geringer Druck auf das Deckglas (bequemerweise mit dem sauberen Ende eines Kapillarrohrs) eine solche Verteilung. Wenn es erwünscht ist, die Probe zu lagern, können die Kanten des Deckglases mit Petrolatum aus einer Spritze abgedichtet werden.

Nach etwa 5 Minuten bei Zimmertemperatur wird eine für die Beobachtung ausreichende Einfärbung beendet sein. Der mit Deckglas versehene Objektträger wird dann unter einem Hochleistungsmikroskop, am besten mit einem ölimmersionsobjektiv, betrachtet.

Die Charakteristika der Färbung unterscheiden sich von denen der vorbekannten Färbung nach Wright. Die Färbecharakteristika des Objektträgerüberzugs sind die folgenden:

Neutrophile enthalten ein fein granuliertes Zytoplasma, welches sich bei frischer Darstellung zu einem hellen Purpur färbt und bei einer älteren Probe zu einer grünlichen Färbung verblaßt. Die Kerne färben sich hellpurpur.

Eosinophile zeigen einen hellen purpurfarbenen Kern und ein Zytoplasma, das mit großen gleichmäßig orangefarbenen Granülen gefüllt ist, welche bei einem e'.wa 12 Stunden alten Präparat grünlich-orangefarben verblassen.

Basophile enthalten eine kleinere Anzahl von gleichförmig großen Granülen wie Eosinophile, die sich zu einem dunklen Purpur färben und oft vollständig den Kern verdecken. Bei geeigneter Fokussierung kann man einen Orangefarbton in den Granülen am Rand der Zelle beobachten, und dies stellt ein wirksames identifizierendes Merkmal dar.

Lymphozyten erhalten einen purpurfarben gefärbten Kern, umgeben von Zytoplasma mit hellerer Purpurfarbe, welche mit zunehmendem Alter des Präparats so dunkel wie der Kern werden kann.

Monozyten besitzen eine Affinität für das Färbemittel ähnlich den Lymphozyten. Die ausreichenden Merkmale sind die größere Abmessung und die größere Menge Zytoplasma der Monozyten. Es wurde gefunden, daß die Differenzierung zwischen beiden leicht erlernbar ist.

Die Plättchenzellen färben sich zu einer Fleischfarbe. Es wird am besten sobald wie möglich nach der Färbezeit eine Plättchenbestimmung vorgenommen, da mit fortschreitender Zeit eine Ansammlung von Trümmern erfolgt.

Retikulozyten enthalten ein rötlich-purpurfarbenes Netzwerk. Sie verblassen jedoch sogar dann nicht, wenn die roten Zellen bereits verzerrt sind. Trotzdem sollte die Zählung auf Retikulozyten ebenfalls innerhalb 4 bis 5 Stunden nach der Färbeperiode vorgenommen werden, da einige der roten Blutkörperchen verblassen, wenn sie sterben.

Literaturstellen über bisherige Färbemethoden:

Brecher, G., 1949, »New Methylene Blue as a Reticulocyte Stain«, in American Journal of Clinical Pathology, 19:895-6.

Conn, H. J. (ed), Biological Stains, 7. Aufl., Williams and Wilkins Company, Baltimore, Maryland, 1961.

Cunningham, J. K„ 1920, »A Method for Permanent Staining of Reticulated Red Blood Cells«, Archives of Internal Medicine, 26 :405-9.

Dacie, J. V. and Lewis, S. M., 1963, Practical Haematology,3.Aufl.,S.28bis29.

Doan, C. A. and Ralph, P. H. Jr_n McClung's Handbook of Microscopial Technique, 3. Aufl„ 1950, S. 571 bis 585.

F r a η k e 1, S. and Reitman, S, Sonnerw i r t h, A. C, Gradwohl's Clinical Laboratory Methodes and Diagnosis, 6. Aufl, Bd. 2, C. V. Mosby Company, St. Louis, 1963, S. 1 i 32 bis 1134.

Spiridonovitch, R^ 1924, »Vital Staining of White Blood Cells with Cresyiechi Violet«, Anatomical Record, 27 :367 bis 373.

Watson, CI. and Clark, 1937, »Occurrence of Protoporphyrine in Reticulocytes«, Proceedings of the Society of Experimental Biology and Medicine, 36 :65 bis 69.

H e ρ 1 e r, O. E, Manual of Clinical Laboratory Methods, 4. AufL, Charles C. Thomas, Springfield, Illinois, 1965, »Hematology«.

Die Möglichkeit zur Verwendung von vorgefärbten Objektträgern, zur Verringerung der Färbezeit und zur beträchtlichen Vereinfachung des Verfahrens zur Darstellung des Präparats und zur Mehrfachbestimmung mit einem einzigen Objektträger an Stelle der Verwendung mehrerer Präparate für die verschiedenen Bestimmungen stellen bemerkenswerte Vorteile der Erfindung dar.

Der Anteil »on Methylenblau N in dem Überzug beträgt etwa 75% und der Anteil von Kresolviolcttazetat beträgt etwa 25%. Mäßige Abweichungen von diesen Gehalten sind selbstverständlich zulässig und können sogar erwünscht sein, wenn die Färbung eines bestimmten Bestandteils betont werden soll. Einen wesentlichen Gesichtspunkt für die Erfindung bildet die Kombination von Färbemittel für die Blutprobe. Es ist daher nicht notwendig, daß der Film der getrockneten Färbemittel auf den Objektträger aufgebracht wird. Es ist in gleicher Weise möglich, den getrockneten Färbemittelfilm auf einem Transparentfilm herzustellen, welcher über einem Blutstropfen auf einem sauberen Objektträger angebracht wird. Solche vorgefärbten Transparentfilme können in einzeln versiegelte Hüllen verpackt werden, wodurch sich automatisch eine geeignete trockene Atmosphäre zur Speicherung des Färbemittelfilms ergibt. Auf diese Weise wird selbstverständlich bemerkenswerterweise das Problem der Verpackung für den Versand und die Speicherung vereinfacht.

Die Belastung des technischen Personals der Klinik wird bedeutend verringert dadurch, daß das klinische Labor befreit wird von der Handhabung flüssiger Färbemittel und die ganze Vorbereitung der Färbung in eine Fabrik verlagert wird. Außerdem wird durch die Beseitigung der verschiedensten Zwischenstufen nach dem Stand der Technik nicht nur die für eine Bestimmung verbrauchte Zeit verringert, sondern es ergibt sich auch eine Tendenz zu einem höheren Ausmaß der Gleichförmigkeit der Präparate.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Vorbereiteter Objektträger zur Anfärbung von Retikulozyten, Plättchen und weißen Blutzellen in einer Blutprobe und zur mikroskopischen Betrachtung, dadurch gekennzeichnet, daß es einen getrockneten homogenen Film von Methylenblau N und Kresolviolettazetat aufweist