DE2104620B2

DE2104620B2 - Verfahren zur Herstellung von a -L-Aspartyl-Lphenylalanin-und a -L- Aspartyl-L-tyrosin-C,. bis C 3-alkylestern

Info

Publication number: DE2104620B2
Application number: DE2104620A
Authority: DE
Inventors: Yasuo Ariyoshi; Naotake Tokio Sato (Japan); Koji Toi; Noboru Uchiyama; Tetsuo Yamatani; Naohiki Yasuda
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1970-01-31
Filing date: 1971-02-01
Publication date: 1979-11-15
Also published as: DE2104620A1; FR2077172A5; GB1309605A; US3798206A; IE34917B1; CA947279A; IE34917L; SE397677B; DE2104620C3; CH517076A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin- und «-L-Aspartyl-L-tyrosin-Cr bis -Cj-alkylestern.

Die vorgenannten Ester sind bekannte Süßungsmittel mit einem Geschmack ziemlich ähnlich demjenigen von Rohrzucker (vgl. BE-PS 7 17 373 und US-PS 34 75 403). Sie werden deshalb durch Umsetzung von Estern des L-Phenylalanins oder L-Tyrosins mit einem Derivat der L-Asparaginsäure hergestellt, worin die Aminogruppe und die ß-Carboxygruppe maskiert sind und die Λ-Carboxygruppe in eine reaktionsfähige funktionell Gruppe überführt ist. Nach der Umsetzung müssen die maskierenden Gruppen entfernt werden, wozu auf die NL-OS 68 00 870 und die US-PS 34 75 403 verwiesen wird.

Bei den bekannten Verfahren sind zahlreiche Stufen und verschiedene Reagentien erforderlich, und die Gesamtausbeute ist so niedrig, daß sie nicht für eine industrielle Anwendung geeignet ist.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von «-L-Aspartiyl-L-phenylalanin- und «-L-Aspartyl-L-tyrosin-Ci- bis -Cj-alkylettern in einfacher und direkter Weise, bei welcher nicht die Anwendung von Maskierungsmit'.eln erforderlich ist.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Herstellung von «-L-Aspartyl-L-phenylalanin- und «-L-Aspartyl-L-tyrosin-Q- bis -Cj-alkylestern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Salz aus L-Asparaginsäureanhydrid und einer starken Säure mit einem L-Phenylalanin- oder L-Tyrosin-Ctbis -Cj-alkylester in einem Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 6O⁰C umsetzt und den jeweiligen «-L-Aspartyl-ester isoliert.

Bei dem Verfahren gemäß der Erfindung werden die gewünschten Produkte direkt in hoher Ausbeute erhalten, es brauchen weder die Amino- noch die /3-Carboxygruppe der Asparaginsäure maskiert zu werden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren sind deshalb nicht zahlreiche Stufen und verschiedene teuere Mittel zur Maskierung der funktioneilen Gruppen mit Schutzgruppen und deren Entfernung notwendig.
Es ist bekannt, daß sowohl öl- als auch /J-Aspartylderivate im allgemeinen durch Umsetzung eines N-geschützten Asparaginsäureanhydrids mit einem Amin gebildet werden und daß das 0-Aspartylderivat häufig in größerer Menge gebildet wird. Auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden sowohl das «-Isomere als auch das jS-Isomere gebildet Jedoch wird entweder das «-Isomere bevorzugt gebildet oder die Gesamtausbeute an ac- und /Msomeren ist beim erfindungsgemäßen Verfahren sehr hoch. Das gewünschte α-Isomere kann leicht von dem /3-Isomeren abgetrennt werden, zum Beispiel durch Behandlung der Reaktionsmischung mit Salzsäure, wonach die leichter löslichen Verunreinigungen einschließlich aes /Msomeren entfernt werden. Die niederen Alkylester von 0-L-Aspartyl-L-phenyialanin und von /?-L-AspartyI-L-tyrosin haben einen bitteren Geschmack und sind als Süßungsmittel nicht geeignet.

Das Salz der starken Säure des L-Asparaginsäureanhydrids wird mit dem Methyl-, Äthyl- oder Propylester von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin zweckmäßig in Mengen von 1 Moi oder mehr, vorzugsweise 1,5 bis 6 Mol, je Mol des Salzes der starken Säure des L-Asparaginsäureanhydrids umgesetzt. Die Umsetzung kann in irgendeinem Lösungsmittel ausgeführt werden.

Geeignete Lösungsmittel sind z. B. Wasser, Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Äthylenglykol und Triäthylenglykol, Ketone, wie Aceton, Äthylmethylketon und Diäthylketon, acyclische und cyclische Äther, wie Diäthyläther, Dioxan und Tetrahydrofuran, Nitrile, wie Acetonitril, Ester, wie Äthylacetat, Butylacetat, Äthylformiat, Methylpropionat und Äthylpropionat, aliphalische halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform, Dichlormethan, 1,2-Dichloräthan, Trichloräthylen und 1,1,2-Trichloräthan, tertiäre Amine, wie Pyridin, Picolin und Chinolin, organische Säuren, wie Essigsäure und Propionsäure, Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, Xylol. Hexan und Cyclohexan, Dimethylformamid, Diäthylsulfoxyd, y-Butyrolacton oder Nitromethan. Gemische von zwei oder mehr der vorstehend

4) aufgeführten Lösungsmittel können ebenfalls als Reaktionsmedium bei dieser Umsetzung eingesetzt werden.

Als starke Säuren, die das Säuresalz von L-Asparaginsäureanhydrid bilden, seien die folgenden Säuren aufgeführt: Anorganische Säuren, w>e Chlorwasserstoff,

><> Bromwasserstoff, Jodwasserstoff, Chlorsulfonsäure, Fluorsulfonsäure und Schwefelsäure, und organische Säuren, wie organische Sulfonsäure, beispielsweise Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und j9-Naphthalinsulfonsäure, und Carbonsäure, beispielsweise Di-

Y, chloressigsäure, Trichloressigsäure und Trifluoressigsäure.

Die Umsetzung kann bei jeder gewünschten Temperatur aufgrund der hohen Reaktionsfähigkeit der Salze von L-Asparaginsäureanhydrid mit starken Säuren

ho ausgeführt werden. Zwar läuft die Umsetzung auch bei gewöhnlicher Temperatur ab, so daß höhere Temperaturen nicht notwendig sind. Temperaturen unterhalb etwa 6O⁰C werden gewählt, da die Reaktionsteilnehmer eine Neigung zur Racemisierung bei sehr hoher

hi Temperatur zeigen. Niedrigere Temperaturen von unterhalb etwa IO°C werden bevorzugt bei dieser Umsetzung angewendet. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Ausbeute an dem gewünschten «-Isomeren

häufig zu, da die Ausbildung des /Msomeren und/oder anderer Nebenprodukte, wie Aspartylasparaginsäure, Aspartylphenylalanin und Aspartyltyrosin, unterdrückt wird. Die Wirkung der Erniedrigung der Reaktionstemperatur bei der Bildung der gewünschten «-Isomeren ist besonders bemerkenswert bei der Umsetzung unter Anwendung organischer Lösungsmittel.

Schwache organische Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure und tertiäre Amine, wie Pyridin und Picolin werden als Reaktionslösungsmittel, wie vorstehend aufgeführt, verwendet. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Ausbeute an dem gewünschten «-Isomeren bemerkenswert ansteigt, wenn diese organischen Säuren und Amine in katalytischen Mengen zusammen mit anderen Lösungsmitteln verwendet werden. Die Mengen dieser organischen Säuren oder Amine liegen vorzugsweise unterhalb von lOmolaren Äquivalenten, bezogen auf den verwendeten niederen Alkylester von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin.

Die Umsetzung wird üblicherweise durch Zugabe eines Salzes einer starken Säure von L-Asparaginsäureanhydrid zu einer Lösung oder Suspension eines niederen Alkylesters von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin unter Rühren durchgeführt. Die Umsetzung läuft auch ab, wenn eine Lösung oder Suspension eines niederen Alkylesters von L-Phenyialanin oder L-Tyrosin zu einer Lösung oder Suspension eines Salzes einer starken Säure des L-Asparaginsäüreanhydrids zugegeben wird. Die Umsetzung ist allgemein innerhalb von 2 Stunden beendet.

Nach beendeter Umsetzung wird das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wird etwa auf einen pH-Wert von 5, jeispielsweise mit Natriumhydrogencarbonat, eingestellt und dann mit einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel vermischt, welches den niederen Alkylester von L-Phenylalanin oder L-Tyrosin löst, beispielsweise Äthylacetat oder Äthylendichlorid. Der nicht umgesetzte Ester geht in die organische Schicht und das Umsetzungsprodukt in die wäßrige Schicht. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und unter verrringertem Druck eingeengt und ergibt ein Gemisch der«- und /J-Isomeren.

Das gewünschte Λ-lsomere kann von dem ^-Isomeren durch Umkristallisation aus Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, wie Alkoholen oder Ketonen, abgetrennt werden.

Die Abtrennung des niederen Alkylesters des ct-L-Aspartyl-L-phenylalanins von dem /Msomeren kann bewirkt werden, indem unlösliche Addukte in wäßrigen Medien mit bestimmten aromatischen Carbonsäuren oder Phenolen, wie Zimtsäure, jS-Resorcylsäurc, p-Hydroxybenzoesäure, 5-Chlorsalicylsäure oder 2-Dichlorphenol gebildet werden, worauf die Addukte abgetrennt werden. Die abgetrennten Addukte werden in die Bestandteile zersetzt und der niedere Alkylester von Λ-L-Aspartyl-L-phenylalanin in üblicher Weise gewonnen.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

In den Beispielen sind die Ausbeuten jeweils auf das eingesetzte Säuresalz des L-Asparaginsäureanhydrids bezogen, und die Bestimmung des /%- und 0-Derivats erfolgte durch Papierelektrophoretische Analyse in folgender Weise: Die Papierelektrophorese wurde in wässeriger Essigsäure, pH 2,8 bei 25 V/cm durchgeführt Das Chromatogramm wurde mit dem Kadmium-Ninhydrin-Reagens nach dem Verfahren von J. Heilmann und Mitarbeiter (Z. Physiol, Chem., 309, 219[1957]) gefärbt. Die zwei Flecken entsprechend den x- und ^-Isomeren wurden einzeln ausgeschnitten, mit Methanol eluiert und die Absorptionen der Eluate bei 510 Γημ bestimmt

Beispiel 1

ίο 10,8 g L-Phenylaianin-methylesterhydrochlorid (0,05 Mol) wurden in 200 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser suspendiert und die Suspension durch Zusatz von 4,6 g Natriumbicarbonat (0,055 Mol) neutralisiert Die Äthylacetatschicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat g ?trocknet und unter verringertem Druck eingeengt

Der erhaltene L-Phenylalaninmethylester wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst Zu der erhaltenen Lösung wurden 4,9 g (0,025 MoI) an L-Asparaginsäurear.hydridhydrobromid bei — 50⁰C unter Rühren zugesetzt Die Umsetzung wurde 40 Minuten unter Rühren fortgesetzt. Nach beendeter Umsetzung wurde das kristallhaltige Reaktionsgemisch mit 100 ml Wasser zur Auflösung der Kristalle vermischt. Die wäßrige Schicht wurde nach der Einstellung auf einen pH-Wert von 5 und kräftigem Schütteln abgetrennt und unter verringertem Druck eingeengt. Nach der Umkristallisation des festen Rückstandes aus Waf.ser wurden 6,1 g eines Gemisches von x- und /J-L-AspartylL-phenylalanin-methylester erhalten.

jo Das vorstehend angegebene Kristallgemisch wurde in 300 ml Wasser gelöst, mit 2,0 g Zimtsäure versetzt, bei Raumtemperatur während 5 Stunden gerührt und über Nacht im Kühlschrank gehalten. Das ausgefällte Addukt wurde abfiltriert und in 300 ml Wasser suspendiert. Die

j» Suspension wurde auf pH 2 mit Salzsäure eingestellt und die freigesetzte Zimtsäure mit 150 ml Äther extrahiert.

Die wässerige Schicht wurde unter verringertem Druck eingeengt Nach der Umkristallisation des festen Rückstandes aus Wasser wurden 2,5? g -x-L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester erhalten. Ausbeute 33%.

Die Ergebnisse der Elementaranalyse waren folgende:

FUrC₄Hi₈N₂O₅ ■ '/2H₂O:
^4> Gefunden: C 55,44, H 6.31, N 9,24%;
berechnet: C 55,45, H 6,27, N 9,24%.

Die Kristalle wurden als reines α-Derivat aufgrund ihres Schmelzpunktes (235 bis 236°C) und der ■ίο papierdektrophoretischen Analyse identifiziert.

Beispiel 2

21,6 g (0,10 Mol) L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid wurden in 100 ml Wasser gelöst und die Lösung

V) mit 9,2 g Natriumbicarbonat neutralisiert. Der freigesetzte L-Phenylalaninmethylester wurde mit 150 ml Äthylendichlorid extrahiert. Nach der Trocknung mit wasserfreiem Natriumsulfat wurde der Extrakt unter verringertem Druck eingedampft und der Rückstand in

ho 200 ml eines Gemisches aus Äthylacetat und Methanol (4: I, V/V)gelöst.

Die Lösung wurde auf -20 bis -30⁰C abgekühlt und 13,7 g L-Asparaginsäureanhydridbenzolsulfonat (0,05 Mol) in 10 Minuten unter Rühren zugesetzt. Das

hi Reaktionsgemisch wurde wieterhin 45 Minuten bei -20 bis -TO⁰C gerührt und dann zur Entfernung des Lösungsmittels unter verringertem Druck eingedampft.

Der erhaltene Rückstand wurde in 300 ml Wasser

gelöst und die Lösung nach der Einstellung auf pH 5 mit Natriumhydrogencarbonat mit 100 ml Äthylendichlorid zur Entfernung des nicht umgesetzten L-Phenylalaninmethylesters extrahiert Die Wasserschicht wurde abgetrennt und auf 50 ml unter verringertem Druck eingedampft Der Niederschlag, der bei der Aufbewahrung der eingeengten Lösung im Kühlschrank auftrat, wurde abfiltriert Die abgetrennten Kristalle wurden aus Wasser urrkristallisiert und 6,05 g a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester erhalten, was einer Ausbeute von 38,9% entspricht. Der Schmelzpunkt betrug 235 bis 236° C.

Das Produkt war elektrophoretisch rein.

Beispiel 3

10,8 g L-Phenylalatiinmethylester-hydrochlorid (50 mMol) wurden in 100 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 5,0 g Triäthylamin neutralisiert 5,0 g L-Asparaginsäureanhydrid-hydrobromid (25 mMol) wurden zu der erhaltenen Lösung unter Rühren und Eiskühlung zugegeben und das Gemisch während weiterer 30 Minuten gerührt. Nach beendeter Umsetzung wurde die Lösung auf pH 5 mit Natriumbicarbonat eingestellt und mit 50 ml Äthylacetat gewaschen. Die wässerige Schicht wurde abgetrennt und unter verringertem Druck eingedampft. Der erhaltene feste Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert und ergab den a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester, der bei 234 bis 236°C schmilzt. Ausbeute45%,[λ], +30,1° (c=l,in Essigsäure).

Beispiel 4

2.16 g L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid (10 mMol) wurden in jeweils 20 ml der in Tabelle I angegebenen Lösungsmittel gelöst und die Lösung durch Zusatz von 1,01g (10 mMol) Triäthylamin neutralisiert. 0,98 g L-Asparaginsäureanhydrid-hydrobromid (5 mMol) wurden zu der erhaltenen Lösung unter Rühren und Eiskühlung zugesetzt und das Rühren während weiterer 30 Minuten fortgesetzt.

Die ' usbeuten an «-L-Aspartyl-L-phenylalanin sind in Tabelle I angegeben:

Tabelle	I	Ausbeute
Ver	Lösungsmittel (Volumenverhältnis)
suchs-		(%)
Nr.		58,5
1	Wasser	55,5
2	Wasser/AcRtonitril (1:3)	51,0
3	Wasser/Dioxan (1:1)	52,3
4	Wasser/Tetrahydrofuran (1:2)	46,5
5	Wasser/Dimethylformamid (1:1)	51,0
6	Wasser/Aceton (1:1)	54,2
7	Wasser/Methanol (1:1)	53,8
8	Wasser/Äthanol (1 : ')	65,0
9*)	Wasser/Äthylenglykol (2 : 3)	52,5
10	Wasser/Äthylacetat (1:1)

(5 mMol) wurden zu der erhaltenen Lösung bei Raumtemperatur unter Rühren zugegeben. Die Umsetzung wurde während IO Minuten unter Rühren fortgesetzt. 0,71 g Λ-L-AspartyI-L-phenylalanin-methyI-ester wurden in der Reaktionslösung erhalten. Ausbeute 47%.

Beispiel 6

Das Verfahren von Versuch Nr. 1 gemäß Beispiel 4 ίο wurde unter Anwendung von 2,3 g L-Phenylalaninäthylester-hydrochlorid (10 mMol) anstelle des L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorids wiederholt Die Ausbeute an «-L-Aspartyl-L-phenylalaninäthylester in dem Reaktionsgemisch betrug 54%.

Beispiel 7

2,16 g L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid (10 mMol) wurde in 20 ml Äthylacetat und 10 ml Wasser suspendiert und die Suspension durch Zusatz vcn 0,84 g μ (10 mMol) Natriumbicarbonat nrritralisiert.

Die Ath^v!scetstsch!cht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und 0.98 g (5 mMol) L-Asparaginsäureanhydrid-hydrobromid zu der erhaltenen Lösung unter Rühren bei 20°C zugesetzt. Die Umsetzung wurde während 40 Minuten unter Rühren fortgesetzt. Die Ausbeute an a-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester betrug 39%.

Wenn die Umsetzung bei —25°C wiederholt wurde, wurde eine Ausbeute von 51% des gewünschten ίο (x-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesters erhalten.

Beispiel 8

2,16 g (10 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hy-

drochlorid wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben.

F, behandelt, und der erhaltene L-Phenylalaninmethylester wurde in jeweils 20 ml der in Tabelle II angegebenen Lösungsmittel gelöst.

0,98 g (5 mMol) L-Asparaginsäureanhydrid-hydrobromid wurden zu der erhaltenen Lösung bei den in 4(i Tabelle II angegebenen Temperaturen unter Rühren zugesetzt und das Rühren während weiteren 30 Minuten fortgesetzt. Die Ausbeuten an «- und /J-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester sind in Tabelle Il angegeben.

*) Dieser Versuch erfolgte unter Kühlung mit Trockeneis/ Methanol.

Beispiel 5

1.2 g L-Phenylalaninmcthylester-hydrochlorid (5,5 mMol) wurden in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0,64 g Natri'imbicarbonat (5,5 mMol) neutralisiert. 0,74 g L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid

Tabelle	II	Reak-	Ausbeute*) (",»)	>lso-
Ver-	Lösungsmittel	tions-		meres
suchs-		tcmpe-	σ-lso-	22
Nr.		ratur ( C)	mcres	32
		-60	57	49
I	Methanol	-40	38	21
2	Äthylenglykol	-30	34	55
3	Isoproj anol	-25	57	45
4	Tetrahydrofuran	-40	39	46
5	Chloroform	-35	36	29
6	Aceto.iitril	-25	39
7	Aceton	-20	5'y	57
8	Äthylacetat/Metha			53
	nol (1 : 1)	-20	37	48
9	Dimethylformamid	-25	46
10	Toluol	-15	36
11	Nitromethan

·) Reaktionsausbcute (nicht isoliert).

Beispiel 9

1.08 g (5 mMol) L-Phenylalaninmethylester-hydro· chlorid wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben, behandelt, und der erhaltene L-Phenylalaninmethyiester wurde in 20 ml Chloroform gelöst, worauf zu der erhaltenen Lösung 0,76 g (5 mMol) L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid bei -30°C unter Rühren zugegeben wurde. Die Umsetzung wurde während I Stunde fortgesetzt. Die Ausbeuten an λ- und ^-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester betrugen 35 bzw. 48%.

Beispiel 10

Das gleiche Verfahren wie in Heispiel 7 wurde bei -10°C unter Anwendung von 2.3 g L-Phcnylalaninäthylcstcrhydrochlorid (10 mMol) anstelle des L-Phcny la la η in met hy lestcr-hy dmchlorids durchgeführt. Die Ausbeulen an x- und /M.-Aspartyl-L-phenylalaninäthylester betrugen 35 bzw. 59%.

B e i s ρ i eI 11

2.16 g l.-Phenylalaninmethylcster-hydrochlorid (10 mMol) wurden in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 0.90 g Natriumbicarbonat neutralisiert. Der freigesetzte L-Phenvlalaninmethylester wurde mit 25 ml Äthylcndichlorid extrahiert. Der Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trokkenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in jeweils 40 ml der in Tabelle III angegebenen Lösungsmittel gelöst. Zu diesen Lösungen wurden 1.37 g L-Asparaginsäureanhydridbenzolsulfonat (5 mMol) zugesetzt und das Reaktionsgemisch während ! Stunde bei der in Tabelle III angegebenen Temperatur gerührt. Die Ausbeuten der λ- und /J-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethvlester im Reaktionsgemisch sind aus Tabelle III ersichtlich.

Tabelle III

Versiichs- Nr.	Lösungsmittel (VolumenverhältnisI	Reaktinnstemperatur	Ausheute**) »-Isomeres	("■„) /Mso-
		( Ο		meres
1	Wasser	0 + 2	29,1	30,2
2	Wasser/Tetrahydrofuran (1:4)	-20 ~ -30	47.8	43,1
3	Wasser/Äthylacetat (1 : 20)	-20- -30	51.4	46,2
4	Wasser/Aceton (1:10)	-20 - -30	49,8	47,4
5	Wasser/Dimethylformamid (1 : 10)	-20- -30	45.6	46.4
6*)	Methanol	-40 - -50	50.2	45.2
7	Aceton	-20 - -30	47.5	46,2
8*)	Acetonitril	-5 ~ -10	45.6	48,4
9	Toluol	-5 - -10	41.5	39,8
10*)	Äthylendichlorid	-5 - -10	44,4	43.8
11*)	Äthylacetat	-20 - -30	49.2	49,4
12	Äthylacetat	+25 ~ +30	47,4	48,5
13	Äthylacetat/Methanol (4:1)	-20 ~ -30	49,4	48,6
14	Äthylacetat/Methano! (4:1)	0~+5	48,4	48,6
15	Äthylacetat/Methanol (4:1)	+25 ~ +30	47,3	47,9

*) Bei diesen Versuchen wurden 4.32 g L-Phenylalaninmethylester (20.TiMoI) und 1.08 g

Natriumbicarbonat verwendet.
**) Reaktionsausbeute (nicht isoliert).

Beispiel 12

Die gleichen Verfahren wie in Beispiel 11 wurden unter Anwendung von 2,28 g L-Phenylalaninäthylesterhydrochlorid (10 mMol) anstelle von L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt

	Tabelle IV	Lösungsmittel	Reaktions	-50	21 04	1 }	620	10	e VI	Reak-	Ausbeute*) (%)	■	^-Iso
		(Volumenverhältnis)	temperatur	-30				Lösungsmittel	tions-		meres
	Ver-			-30			Tabell		tempe-	α-Iso
9	suchs-		( C)	-30		Ver-		ratur	meres	44
Nr.			-30	Ausbeute	suchs-		( C)		39
	Methanol	-40		an (7-1 so-	Nr.		-30	24	35
	Tetrahydrofuran	-20		merem*) ^		Aceton	-25	32	23
1	Aceton	-20		(%)		Dimethylformamid	+5	20
2	Äthylacetat	~20		I	Wasser	-25	45	33
3	Äthylacetat/Metha	-20	44,4 If)	2	Tetrahydrofuran/			45
4	nol (4:1)		45,4	3	Wasser (9: I, V/V)	-50	62	29
5		*) Reaktion'Niiusbeute (nicht isoliert).	42,1	4	Methanol	-35	48	41
			48,5		Äthylacetat	-25	43
			48,4	5	Chloroform	-25	38
		6	Acetonitril
		7
		8

Beispiel 13

Die gleichen Verfahren wie in Beispiel ti wurden unter Verwendung von 1,78 g (5 mMol) L-Asparaginsäureanhydrid-p-toluol-sulfonat anstelle von L-Asparaginsäureanhydridbenzolsulfonat wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.

ibelle V

Ver- suchs- Nr.	Lösungsmittel (Volumen verhältnis	Reaktions temperatur	-50	Ausbeute tf-Iso-	*) (%) /Mso-
		( C)	-20	meres	rneres
1	Methanol	-40	-20	41,4	39,6
2	Dioxan	-10	-20	43,6	44,2
3	Acetonitril	-10	-30	45.4	41,8
4	Äthylacetat	-10	49,2	43,9
5	Äthylacetat/ Methanol (4:1)	-20	49,2	42,9

·) Reaktionsausbeute (nicht isoliert).

Beispiel 14

10 mMol L-Tyrosinester-hydrochlorid wurden in 20 ml Äthylacetat und 10 ml Wasser suspendiert und die Suspension durch Zusatz von 0,84 g (10 mMol) Natriumbicarbonat neutralisiert

Die Äthylacetatschicht wurde abgetrennt und die wässerige Schicht weiterhin nochmals mit 20 ml Äthylacetat extrahiert Die vereinigten Extrakte wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingeengt Der Rückstand wurde in jeweils 40 ml der in Tabelle VI angegebenen Lösungsmittel gelöst 0,76 g L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid (5 mMol) wurden zu der erhaltenen Lösung unter Rühren bei der in Tabelle VI angegebenen Temperatur zugesetzt Die Umsetzung wurde während 40 Minuten unter Rühren fortgeführt

In Tabelle VI sind die Ausbeuten an a-L-Aspartyl-L-tyrosinester und dem /J-Isomeren angegeben.

') keaktionsausbeute (nicht isoliert).
Bemerkung:

Bei den Versuchen 1 bis 4 wurde das L-Tyrosinmethylesterhydrochlorid angewandt und bei den Versuchen 5 bis 8 wurde das L-Tyrosinäthylester-hydrochlorid angewandt. Bei Versuch 4 betrug die angewandte Menge an L-Tyrosinmethylmethylester-hydrochlorid 5 mMol.

Beispiel 15

1,3 g L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid (5,5 mMol) wurden in 18 ml Tetrahydrofuran und 20 ml Wasser suspendiert und dann mit 0,56 g (5 mMol) Triethylamin neutralisiert.

Zu der erhaltene Lösung wurden 0,98 g (5 mMol) L-Asparaginsäureanhydrid-hydrobromid unter Rühren bei -25°C zugesetzt. Es wurde weitere 40 Minuten bei der vorstehenden Temperatur gerührt. Die Ausbeute an λ- und /3-L-Aspartyl-L-tyrosinmethylester betrugen 0,77 g (50%) bzw. 0,34 g (22%).

Beispiel 16

12,3 g L-Tyrosinäthylester-hydrochlorid (0,05 Niol) wurden in 200 ml Äthylacetat und 100 ml Wasser suspendiert und dann mit 4,6 g (0,055 Mol) Natriumbicarbonat neutralisiert. Die Äthylacetatschicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingeengt. Der erhaltene L-Tyrosinäthylester wurde in 20 m! Methanol gelöst. 3,8 g L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid (0,025 Mol) wurden zu der erhaltenen Lösung bei -25⁰C unter Rühren zugegeben. Die Umsetzung wurde 45 Minuten fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck eingedampft und der Rückstand in 100 ml Wasser gelöst. Nach der Einstellung auf pH 5,1 und Wäsche mit 100 ml Äthylacetat wurde die Lösung zur Trockenheit eingedampft. Der feste Rückstand wurde aus Wasser umkristallisiert und ergab 3,4 g (Ausbeute 42%) Kristalle. Die Kristalle schmolzen zweifach bei 179bisl80^oCund218°C

Aufgrund der Schmelzpunkte, der Infrarotspektroskopie und der papierelektrophoretischen Analyse wurden die Kristalle als reiner «-L-Aspartyl-L-tyrosinäthylester identifiziert

Beispiel 17

11,8g (0,05 Mol) L-Tyrosinmethylester-hydrochlorid wurden in 200 ml Äthylacetat und löömi Wasser suspendiert und dann mit 4,6 g (0,055 Mol) Natriumbicarbonat neutralisiert Die Äthylacetatschicht wurde mit

wasserfreim Natriumsulfat getrocknet und unter verringertem Druck eingeengt, wobei die Kristalle des L-Tyrosinmethylesters erhalten wurden.

Die Kristalle wurden in 200 ml Pyridin gelöst. 3,8 g (0,025 Mol) L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid wurden zu der Pyridinlösung unter Rühren bei -25°C zugesetzt. Die Umsetzung wurde während einer Stunde bei der vorstehenden Temperatur fortgesetzt. Nach beendeter Umsetzung wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 100 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf pH 5,0 eingestellt und mit 100 ml Äthylacetat gewaschen. Die Lösung wurde zur Trockenzeit eingedampft. Es wurden 3,7 g (Ausbeute 48%) an Kristallen durch Umkristallisation der erhaltenen festen Substanz aus Wasser erhalten.

Die Kristalle zeigten Doppelschmelzpunkte von 187⁰C und 222 bis 223°C.

Die Kristalle wurden als reiner oc-L-Aspartyl-L-tyro-

Tabelle VIl

sinmethylester aufgrund von Infrarotspektrum, Schmelzpunkt unü papierelektrophoretischer Analyse identifiziert.

Beispiel 18

4,32 g L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid (20 mMol) wurden in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 1,8 g Natriumbicarbonat neutralisiert. Der freigesetzte L-Phenylalaninmethylester wurde mit 50 ml Äthyleridichlorid extrahiert. Der Extrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trokkenheit abgedampft. Der verbliebene Rückstand wurde in jeweils 40 ml der in Tabelle VII angegebenen Lösungsmittel gelöst. Die Lösungen wurden mit 1,37 g (5 mMol) L-Asparaginsä'ureanhydrid-benzolsulfat versetzt und wähernd 30 Minuten bei der in Tabelle ViI angegebenen Temperatur gerührt. Die Ausbeuten an iv und /J-L-Aspartyl-L-phenylalanintnethylester sind aus Tabelle VII ersichtlich.

Versuchs-Nr.

Lösungsmittel (Volumenverhältnis)

1 Aceton/Essigsaure (38,8 : 1,2)

2 Aceton/Essigsaure (38,8 : 1,2)

3 Äthylacetat/Essigsäure (37,6 : 2,4)

4 Äthylacetat/Propionsäure (37,0 : 3,0)

5 Äthylacetat/Methanol/Essigsäure (34,8 : 4,0 : 1,2)

6 Äthylacetat/Äthanel/Propionsäure (34,5 : 4,0 : 1,5)

7 Äthylendichlorid/Wasser/Essigsäure (36,8 : 2,0 : 1,2)

8 Äthylacetat/Pyridin (38,5 : 1,5)

9 Äthylacetat/Methanol/Pyridin (33,0 : 4,0 : 3,0)

10 Äthylendichlorid/Picolin (38,0 : 2,0)

11 Äthylendichlorid/Methanol/Picolin (32,0 : 4,0 :4,0) *) Reaktionsausbeute (nicht isoliert).

Beispiel

Das gleiche Verfahren wie in Beispiel 18 wurde unter Anwendung von 0,74 g (5 mMol) L-Asparaginsäureanhydrid-hydrochlorid anstelle des L-Asparaginsäureanhydrid-benzolsulfonats wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII angegeben.

Tabelle VIII

Molar	Reaktions	Ausbeute*	) (%)
verhältnis der	temperatur
Säure oder		σ-Iso	ß-Uo-
des Amins		meres	meres
/u lister	( O
1,0	+25	60,0	37,0
1.0	-25	66,4	33,7
2,0	0	73,0	22,5
2,0	-5	76,0	15,8
1,0	-20	74,5	19,2
1,0	-20	71.2	15,9
1.0	-25	70,2	24,9
1,0	+ 10	61,4	24,5
2,0	-30	78,1	18,4
1,0	-30	73,8	21,4
2,0	-30	72,8	22,5

Versuchs-

Lösungsmittel (Volumenverhältnis)

Molar verhältnis von Saure oder Amin zu Ester	Reaktions temperatur (C)	Ausbeute* ff-Iso- meres	) (%) /Mso- meres
2,0 1,0	-20 -30	64,6 73,6	28,2 21,8
1,0	-30	71,8	20,9
2,0 1,0	-10 -30	64,3 74,8	29,4 20,4
2,0 1,0	-30 -30	72,4 73,2	24,3 23,8

1 Äthylendichlorid/Essigsäure (37,6 : 2,4)

2 Äthylendichlorid/Methanol/Essigsäure
(34,8:4,0:1,2)

3 Äthylendichlorid/Methanol/Propionsäure (34,5:4,0:1,5)

4 Äthylacetat/Essigsäure (37,6 : 2,4)

5 Äthylacetat/Methanol/Propionsäure
(34,5:4,0:1,5)

6 Äthylendichlorid/Pyridin (37.0 :3,0)

7 Äthylacetat/Methanol/Picolin (3<i,0 :4,0 : 2,0) *) Reaktionsausbeute (nicht isoliert).

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von a-L-Aspartyl-L-phenylalanin- und «-L-Aspartyl-L-tyrosin-Ci- bis-C3-alkylestern, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Salz aus L-Asparaginsäureanhydrid und einer starken Säure mit einem L-Phenylalanin- oder L-Tyrosin-Cr bis -Cralkylester in einem Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb 60⁰C umsetzt und den jeweiligen α-L-Aspartyl-ester isoliert

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man dieses mit einem Salz aus L-Asparaginsäureanhydrid und einer Halogenwasserstoffsäure, einer Sulfonsäure oder einer starken Carbonsäure durchführt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß man dieses bei einer Temperatur nicht höher als 10° C durchführt

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart einer schwachen organischen Säure oder eines tertiären Amins durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man von der schwachen organischen Säure oder dem tertiären Amin eine Menge von nicht mehr als 10 Mol je Mol des eingesetzten Esters zugibt.