DE2050672A1 - Durchströmungskammer zur optischen Messung von Teilcheneigenschaften - Google Patents
Durchströmungskammer zur optischen Messung von TeilcheneigenschaftenInfo
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Description
Anmelder: PHYWE Aktiengesellschaft, ^4 Göttingen, Salinenweg
"Durchströmungskammer zur optischen Messung von Teilcheneigenschaften"
.
Beschreibung:
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur optischen Messung physikalischer oder chemischer Eigenschaften von Teilchen,
die in einem flüssigen Medium suspendiert sind.
Diese Messung hat heute in der Medizin für die Untersuchung von Zellen besondere Bedeutung, da in vielen Fällen die reine Zählung
oder visuelle Beobachtung unter dem Mikroskop nicht ausreicht. So unterscheiden sich z.B. Tumorzellen von gesunden Körperzellen
oft durch die Menge der Desoxyribonukleinsäure, die in den Zellen enthalten ist. Eine schnelle und automatische Mengenbestimmung von
Zeilinhaltsstoffen ist also ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel.
Es sind bereits mehrere Verfahren und Vorrichtungen bekannt, die zur automatischen Zählung von einzelnen Teilchen in Suspension,
insbesondere von Blutzellen, geeignet sind. Diesen Verfahren ist gemeinsam, daß die Suspension durch eine öffnung mit kleinem
Querschnitt strömt, den die Teilchen nacheinander passieren.
Bei einem Verfahren werden die Teilchen in dieser öffnung auf
Grund einer elektrischen Widerstands- oder Kapazitätsänderung nachgewiesen. Dieses Nachweisverfahren ergibt für jedes Teilchen
ein elektrisches Signal, dessen Amplitude vom Volumen des Teilchens und von seiner Bahn innerhalb der öffnung abhängt. Eine genaue
Messung des Teilchenvolumens ist möglich, wenn die Teilchenbahn durch die Mitte der öffnung führt. Um dies zu erreichen, sind
ein Hüllstromverfahren und eine Einspritzung der Teilchen in die Mitte der öffnung bekannt.
Andere Verfahren weisen die Teilchen in dieser öffnung mit optischen
Methoden nach. Bei einem Verfahren wird die öffnung intensiv beleuchtet
und die Lichtintensität hinter der öffnung mit einem fotoelektischen Detektor gemessen. Die Teilchensuspension strömt
durch die öffnung parallel zur Richtung des Lichteinfalls.
209817/0516 ORIGINAL INSPECTED
- Blatt 2 -
Ein In der öffnung befindliches Teilchen absorbiert Licht und
ruft so am Ausgang des Detektors ein Signal hervor, dessen Amplitude u. a. von der Größe des Teilchens abhängt. Zur genauen
Messung der Teilchengröße ist diesesVerfahren nicht geeignet,
da diese Amplitude auch vom Ort des Teilchens in der öffnung abhängt und gleich große Teilchen mit unterschiedlichen Bahnen
unterschiedliche Signale auslösen.
Eine Weiterentwicklung dieses Verfahrens mißt statt dessen die Intensität des vom beleuchteten Teilchen ausgehenden Streu- oder
Fluoreszenzlichtes.
Man erhält dafür besonders einfache optische Anordnungen, nenn
die Beleuchtung und Beobachtung der von der Teilchensuspension durchflossenen öffnung durch das selbe optische System in der
sog. Auflichtanordnung erfolgt.
Das von einem Teilchen ausgehende Streu- oder Fluoreszenzlicht wird dabei durch halbdurchlässige Spiegel und geeignete Filter
vom Beleuchtungslicht abgetrennt und einem fotoelektrischen Detektor zugeführt. Die Signalamplituden an dessen Ausgang sind
proportional zur Fluoreszenzfärbung des Teilchens, die wiederum
je nach dem gewählten Fluorochromierungsverfahren proportional der Menge eines bestimmten Stoffes in dem Teilchen ist. Durch bekannte
elektronische Auswertungsmethoden für die Signalamplitude kann somit diese Menge gemessen werden, wenn die Signalamplitude
nicht von der Bahn des Teilchens in der öffnung abhängt. Das ist der
Fall, wenn die Ausleuchtung der öffnung gleichmäßig, z. B. nach dem
Köhlerschen Beleuchtungsprinzip, erfolgt. Dann sind mit diesen Verfahren Meßgenauigkeiten von einigen Prozent zu erzielen, wie
sie für viele medizinische und biologische Fragestellungen erforderlich sind.
Ein Nachteil dieser Anordnung 1st, daß die öffnung sorgfältig zum
Mikroskopobjektiv ausgerichtet sein muß. Geringe FehlJustierungen
Führen bereits zu einer verringerten Meßgenauigkeit, da gleiche
Teilchen, die auf verschiedenen Bahnen durch die öffnung treten, unterschiedliche Signale hervorrufen.
209817/0516
- Blatt 3 -
- Blatt 3 -
Ein weiterer Nachteil dieser Anordnung besteht darin, daß die parallel zur Beleuchtungs- und Beobachtungsrichtung durch die
öffnung strömende Teilchensuspension vor dem Mikroskopobjektiv rechtwinklig zur Seite hin abgelenkt werden muß, um sie aus dem
Meßbereich zu führen. Dadurch entsteht eine Unsymmetrie der Teilchenbahnen in bezug auf Beleuchtungs- und Beobachtungsrichtung,
die zu einer verringerten Meßgenauigkeit führt. Wenn es nicht gelingt, den Teilchenstrom vor Erreichen des Deckglases,
das die Flüssigkeit vom Mikroskopobjektiv fernhält, abzulenken, so verschmutzt das Deckglas und kontinuierliche Messungen sind
nicht möglich.
Ein weiterer Nachteil dieser Anordnung 1st die Möglichkeit, daß die enge öffnung durch in der Teilchensuspension mitgeführte
größere Partikel verstopft wird, wodurch ebenfalls die Messung unterbrochen wird.
Insbesondere durch die Fluoreszenzlichtmessung werden die bekannten
cytophotometrischen Identifizierungs- und Meßmöglichkeiten diesem automatischen Durchflußverfahren zugänglich. Der
Nachteil der cytophotometrischen Verfahren, bei denen sich die Teilchen auf Objektträger befinden und jeweils vom Bedienungspersonal
einzeln ausgesucht, eingestellt und gemessen werden müssen, entfällt dabei. Die Meßgeschwindigkeit kann auf das
Hunderttausendfaehe erhöht und die statistischen Fehler der kleinen Zahl vermieden werden.
Bei anderen bekannten Verfahren erfolgt die Beleuchtung und Beobachtung
der Teilchen senkrecht zu deren Bewegungsrichtung. Dazu fließt die Teilchensuspension statt durch eine öffnung, durch
eine längere Kapillare von kleinem Querschnitt. Die Änderung der Intensität des beleuchtenden Lichtes durch die Absorption der
Teilchen oder die Intensität des «on Teilchen gestreuten Lichtes wird mit einem fotoelektrischen Detektor gemessen. Die Signalamplitude hängt auch hier außer von der Größe der Teilchen von
seiner Bahn in der Kapillare, insbesondere von seinem Abstand von der seitlichen Begrenzung, ab.
209817/0516 .
- Blatt k -
Eine Anordnung ist vorgeschlagen worden, in der diese seitlichen
Begrenzungen durch einen HUllstrom ersetzt werden. Dabei wird die Teilchensuspension durch eine enge Röhre in eine
teilohenfreie, in gleicher Richtung strömende Flüssigkeit injiziert, die die Suspension allseitig umhüllt. Bei geeigneten
Abmessungen und Strömungsgeschwindigkeiten bleibt die Teilchensuspension in dem Hüllstrom auf einem zylindrischen Bereich mit
kleinem Querschnittbeschränkt. Dadurch entfällt eine Störung der
von den Teilchen hervorgerufenen Signale durch die begrenzenden Wände.
Die oben beschriebene genaue Messung von Inhaltsstoffen mit Hilfe von Fluoreszenzlicht ist mit dieser Hüllstromanordnung allerdings
nicht möglich, da zur Erzielung von Fluoreszenzlichtsignalen ausreichender Intensität die Verwendung von Mikroskopobjektiven
hoher Apertur erforderlich ist. Diese besitzen aber nur einen Tiefenschärfenbereich von wenigen Mikrometern, in dem alle Teilchenbahnen
während der Messung verlaufen müssen. Bei der bekannten Hüllstromanordnung treten stets Verlagerungen der mitgeführten
Teilchensuspension senkrecht zur Bewegungsrichtung auf, die die Teilchen aus dem Tiefenschärfenbereich weit herausführen.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung
zu schaffen, mit welcher eine genaue optische Messung von Teilcheneigenschaften, insbesondere eine Mengenmessung von Inhaltsstoffen möglich ist. Die Teilchen sollen dabei in einem strömungsfähigen
Medium mitgeführt und automatisch eines nach dem anderen der Messung unterzogen werden.
Die Nachteile der oben beschriebenen, bekannten Anordnungen sollen
dabei vermieden werden.
Diese Aufgabe wird durch eine Anordnung gelöst, in der die Teilchensuspension
in einer Schicht, deren Dicke von der Größenordnung des Tiefenschärfenbereiches ist, in festem Ahstand vom Mikroskopobjektiv
an einer ebenen Wandfläche geführt ist. Da Kapillaren mit Wandabständen von der Größenordnung des Tiefenschärfenbereiches
schwer herstellbar sind und sehr häufig verstopfen würden, wird
209817/0516 . Blatt 5 .
die geringe Schichtdicke der Teilchensuspension erfindungsgemäß durch einen zweiten, teilchenfreien Flüssigkeitsstrom
erreicht.
Das Prinzip dieser Anordnung zeigt Pig. I.
Die Anordnung besteht aus einem Durchströmungskanal, der durch eine Wand 1 und eine Platte 2 aus lichtdurchlässigem
Material begrenzt wird. Die Frontlinie J5 des beleuchtenden
und/oder beobachtenden Mikroskopobjektivs hoher Apertur ist so angeordnet, daß die von der Wand 1 und der teilchenfreien
Flüssigkeit 4 begrenzte Teilchensuspension 5 im Bereich 6 der Tiefenschärfe des Mikroskopobjektivs liegt. Durch die Wand 1
ist damit die Lage des Teilchensuspensionsstromes zum Tiefenschärfenbereich fixiert, während durch die teilchenfreie Flüssigkeit
verhindert ist, daß Teilchen in den Bereich außerhalb der Tiefenschärfe gelangen, wo sie falsche Meßergebnisse erzeugen
würden.
Bei dieser Anordnung ist eine genaue optische Auswertung von Teiloheneigensohaften möglich, da die Teilchensuspension ausschließlich
im Bereich der Tiefenschärfe die Meßstelle passiert. Insbesondere kann mit dieser Anordnung im Gegensatz zu den bekannten
eine genaue Absorptionsmessung an den Teilchen ausgeführt Werden, wenn die Wand 1 aus durchsichtigen Material besteht
und die Intensität des durchgehenden Lichtes gemessen wird. Dabei kann sowohl bei dieser Durchliohtanordnung als auch bei der
oben beschriebenen Auflichtanordnung die Beleuchtung oder/und Beobachtung durch die Platte 2 oder durch die Wand 1 erfolgen.
Eine Verschiebung des Mikroekopobjektivs in Strömungerichtung
hat auf die Meßgenauigkeit keinen Einfluß, da längs der Strömung die Meßbedingungen, wie Abstand zwischen Teilchensuspension und
Mikroskopobjektiv, Ausleuchtung, Teilohengesohwindigkeit, Breite der Strömung usw., konstant sind. Dadurch ergibt eich eine unkritische
Justierung.
- Blatt 6 -209817/0516
- Blatt 6 -
Eine Verschmutzung der Platte 2 durch die Teilchensuspension
1st bei dieser Anordnung ausgeschlossen, da sie lediglich von
der teilchenfreien Flüssigkeit berührt wird. Eine Verstopfung
des Kanals durch größere Partikel kann nicht eintreten, da der Kanal einen konstanten Querschnitt aufweist und die Abmessungen
dieser Partikel nicht auf die Schichtdicke der Teilchensuspension beschränkt sein müssen.
Eine parallele Strömung von Teilchensuspension und teilchenfreier
Flüssigkeit gelingt bei Durohströmungskammern mit den hler erfordern ohen Abmessungen von Bruchteilen eines Millimeters leicht«
da es sich nloht um turbulente, sondern um rein laminare Strömungen handelt. So beträgt bei einer typisohen Strömungsgeschwindigkeit von 5 m/s und einer Kanaltiefe von 0,1 mm die Reynolds-Zahl Re - 500. Dieser Wert liegt weit unter dem kritischen Wert
Re - 2}00.
Die Teilchensuspension und die tellohenfrele Flüssigkeit müssen
vor der Meßsfeelle zusammengeführt werden, wobei sich mehrere Lösungen anbieten.
In der Anordnung nach Flg. 2 wird die Teilchensuspension 5 durch
•ine Öffnung 7 in der Wand 1 der bereits Im Kanal strömenden teilchenfreien Flüssigkeit zugegeben.
Dabei ist die Form dieser öffnung und Ihr Durchmesser in Strömungsrichtung unkritisch, was einfache Herstellungsverfahren zuläßt.
Senkrecht zur Strömungsrichtung muß der Durohmesser der Öffnung gleich der duroh die Größe des Mikroskopobjektivs gleichmäßig ausgeleuchteten Feldes bestimmten Breite des Teilcheneuspensionsstromes sein. Die Teilchensuspension wird dann auch seitlich von
der tellohenfreien Flüssigkeit begrenzt, so daß die seitlichen Wände des Kanals größere Abstände voneinander haben können.
Da der Durohmesser des vom Mikroskopobjektivs gleichmäßig ausgeleuohteten Feldes groß 1st, gegen den Bereich der Tiefensohärfe
(oa. 10 ι 1), 1st eine seitliohe Fixierung der Teilchensuspension
durch eine feste Wand nicht erforderlich, Verlagerungen In dieser
209817/0516 n, .. _
- Blatt 7 -
- Blatt 7 -
Richtung beeinflussen die Meßgenauigkeit kaum, während, wie oben ausgeführt. Änderungen des Abstandes zwischen Teilchensuspension
und Mikroskopobjektiv starke Störungen verursachen.
Größere öffnungen zur Zuführung der Teilchensuspension können
benutzt werden, wenn eine kontinuierliche Verjüngung des Kanalquerschnitts zwischen der öffnung und der Meßstelle vorgesehen
wird, womit eine geringere Verstopfungsgefahr bewirkt ist.
In dieser Anordnung können auch andere Formen der Zusammenführung der Teilchensuspension und der teilchenfreien Flüssigkeit benutzt
werden. Die kontinuierliche Verjüngung des Kanalquerschnitts erlaubt dabei große, leicht herstellbare und nicht verstopfende
Zuführungskanäle. Eine Ausführung zeigt Fig. 3. Sie besteht aus
einem Zuführungskanal 12 für die teilchenfreie Flüssigkeit. Eine kontinuierliche Verjüngung 13 des Kanals führt in den Kanalabschnitt,
in dem die Messung stattfindet.
Fig. 4 zeigt eine Aufsicht auf diese Ausführung. Dabei ist der
Zuführungskanal 11 für die Teilchensuspension so breit gehalten, daß sich nach der kontinuierlichen Verjüngung 13 ein Teilchensuspensionsstrom
gewünschter Breite ergibt.
209817/0516
Claims (2)
- PHYWE AG Göttingen, SaJUnenwegPatent ansprüche1« Vorrichtung zur optischen Messung von Eigenschaften der Teilchen einer Suspension, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilohensuspension als Schicht geringer Dicke zwischen einer * festen ebenen Wand und einer parallel strömenden teilchenfreien Flüssigkeit geführt ist.
- 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchensuspension vor der Meßstelle der teilchenfreien Flüssigkeit durch eine öffnung in der festen ebenen Wand zugeführt wird.2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Stroraungsquerschnitt vor der Meßstelle kontinuierlich verringert wird.209817/0516Leerseite
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C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: ORTHO DIAGNOSTIC SYSTEMS INC., RARITAN, N.J., US |
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