DE202023106837U1

DE202023106837U1 - Ein System zum Nachweis der Heilaktivitäten des ethanolischen Extrakts aus Anogeissusleiocarpus auf chirurgisch hergestellten Hautwunden

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Publication number: DE202023106837U1
Application number: DE202023106837.5U
Authority: DE
Original assignee: Num Adom Sabina Mbafan
Current assignee: Num Adom Sabina Mbafan
Priority date: 2023-11-20
Filing date: 2023-11-20
Publication date: 2023-12-19
Anticipated expiration: 2033-11-21

Abstract

Ein System zum Nachweis der Heilwirkung von ethanolischem Extrakt aus Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden. Das System umfasst:
eine Synthesevorrichtung zur Synthese der Rohausbeute an ethanolischem Extrakt der Stammrinde von A. leoicarpus mit destilliertem Wasser, um eine 5.2 %ige Lösung bereitzustellen;
eine Spritze zur oralen Verabreichung der Lösung an die Probanden in einer Dosis von 1000 mg/kg zweimal täglich. Gew., einmal täglich über einen Zeitraum von 21 Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Einwirkung der chirurgischen Wunde;
eine Probensammeleinheit zum viermaligen Sammeln von 5 ml Blutproben von den Probanden während ihrer Akklimatisierungsphase vor Beginn des Experiments, um ein grundlegendes hämatologisches, biochemisches Serum- und Lipidprofil zu erhalten, wobei 2 ml Blut sofort in Vacutainer mit EDTA als Antikoagulans für hämatologische Analysen abgegeben werden;
eine Zentrifuge zum Zentrifugieren von 3 ml Blut, das man 3 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1000 U/min gerinnen lässt, um das Serum abzutrennen;
eine Trennkammer zum Trennen von Serum mit einem Serumseparator und zum Einfüllen in Reagenzgläser; und
ein Wundbeurteilungsgerät zur Beurteilung der Wundheilung an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Einleitung chirurgischer Wunden auf der Grundlage der groben klinischen Wundmerkmale, histologischen Merkmale und des Prozentsatzes der Wundkontraktion.

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein System zum Nachweis der Heilwirkung von ethanolischem Extrakt aus Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden. Im Detail wird das System zur Untersuchung der diabetischen Stoffwechselstörung, verzögerter Wundheilung, mit ethanolischen Extrakten von A. leiocarpus eingesetzt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diabetes mellitus (DM) hat weltweit gefährliche Fortschritte gemacht und die öffentliche Gesundheit vor große Herausforderungen gestellt, da die Budgets erhebliche gesundheitliche Bedenken haben. Diabetes galt als die weltweit größte Todeskrankheit, von der bis 2030 über 552 Millionen Menschen betroffen sein könnten, wobei die Prognosen für 2035 noch schlimmer ausfallen würden. Diabetes mellitus, eine Stoffwechselstörung mit mehreren Ursachen, die durch chronische Hyperglykämie aufgrund von Störungen des Kohlenhydrat-, Lipid- und Proteinstoffwechsels gekennzeichnet ist Dies resultiert aus einem Insulinsekretionsdefekt der β-Zellen der Bauchspeicheldrüse (Typ 1), einer Inaktivität von Insulin oder einem Verlust der Insulinreaktivität in seinem Ziel, wie Fettgewebe und Muskeln (Typ 2) oder beidem.
Durch Hyperglykämie verursachte Verletzungen, die unter anderem zur Desialylierung von Endothelzellen und zahlreichen anderen Körperzellen sowie zu oxidativem Stress führten, erklärten teilweise die vielfältigen mikrovaskulären und makrovaskulären Schäden, die zu zahlreichen lebensbedrohlichen Komplikationen wie Nephropathie, Neuropathie und Retinopathie führten Blindheit. Trotz der haushaltszerstörenden Auswirkungen von DM, wie sie durch den besorgniserregenden Risikofaktor für Progression, Prognose und Mortalität von COVID-19 deutlich werden, kam es insbesondere bei COVID-19-Patienten mit vorbestehendem Typ-2-Diabetes zu einer weiteren seit langem bestehenden, besorgniserregenden Situation, die den Staatshaushalten Schaden zufügte96 Diese Erkrankungen sind durch schwere Diabeteserkrankungen, durch Hyperglykämie verursachte verzögerte oder nicht heilende Wunden, diabetische oder Fußgeschwüre entstanden, die in vielen Fällen zu peinlichen Amputationen von Gliedmaßen mit begleitender sozialer Bedrohung führten.
Aus der Sicht der vorangegangenen Diskussion wird deutlich, dass ein Bedarf an einem System zum Nachweis der Heilwirkung des ethanolischen Extrakts von Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden besteht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Offenbarung zielt darauf ab, ein System zum Nachweis der Heilungsaktivitäten des ethanolischen Extrakts von Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden bereitzustellen. Die modulierenden Wirkungen von ethanolischen Extrakten der Stammrinde von Anogeissus leiocarpus auf Sialoglyco-Konjugate, die Oberfläche von Erythrozyten und Sialinsäuren im Serum in Verbindung mit deren antidiabetischer, antioxidativer, antidyslipidämischer und verstärkter Hämatopoese führten zu diesem System, das die diabetische Stoffwechselstörung, verzögerte Wundheilung, mit ethanolischen Extrakten von A. leiocarpus. Es werden vier Gruppen von jeweils drei Hunden verwendet: nicht-diabetische, chirurgisch verwundete Hunde (NDW), diabetische, chirurgisch verwundete, mit Insulin behandelte Hunde (DWI), diabetische, chirurgisch verwundete, mit Extrakt behandelte Hunde (DWE) und diabetische, chirurgisch verwundete, unbehandelte Hunde (DWU).. Einundzwanzig Tage nach der Einleitung und Bestätigung des Diabetes werden humane, chirurgische Hautexzisionswunden in voller Dicke mit einem Durchmesser von 2 cm x 2 cm induziert, unmittelbar gefolgt von Insulin- und Extraktbehandlungen für die nächsten 21 Tage nach der Einleitung der Hautwunden. Alle Hunde werden auf Merkmale von Diabetes, grobe klinische Wundmerkmale und eine histopathologische Untersuchung von Wundstellenbiopsien hinsichtlich fortschreitender Kollagenbildung und Epithelisierung untersucht. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt und einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Dunnet-Test unter Verwendung des Statistikpakets GraphPad Prism ® 8 unterzogen. Alle Erscheinungsformen von Typ-1-Diabetes mellitus, einschließlich Panzytopenie, sind bei diesen Alloxan-induzierten diabetischen Hunden reproduzierbar. Zu den Thrombozytopathien gehörte Thrombozytose bei NDW- und DWE-Hunden, bei den DWI- und DWU-Hunden traten jedoch Thrombozytopenien auf. Die groben klinischen Wundmerkmale von DWE unterscheiden sich im Vergleich zur unbehandelten Gruppe, sind jedoch denen der nicht-diabetischen Gruppe ähnlich. Die Extraktbehandlung erhöhte das faserige Bindegewebe mit fortschreitender Kollagenisierung und Epithelisierung, die fast identisch mit Geweben normaler Kontrollen waren. Ethanolische Extrakte von A. leiocarpus verbesserten die Wundheilung bei Hunden mit Alloxan-Diabetes.
In einer Ausführungsform, Offenbart wird ein System zum Nachweis der Heilwirkung von ethanolischem Extrakt aus Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden. Das System umfasst eine Synthesevorrichtung zur Synthese der Rohausbeute an ethanolischem Extrakt der Stammrinde von A. leoicarpus mit destilliertem Wasser, um eine 5.2 %ige Lösung bereitzustellen. Das System umfasst außerdem eine Spritze zur oralen Verabreichung der Lösung an die Probanden in einer Dosis von 1000 mg/kg zweimal täglich. Gew., einmal täglich über einen Zeitraum von 21 Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Einwirkung der chirurgischen Wunde. Das System umfasst außerdem eine Probensammeleinheit zum Sammeln von 5 ml Blutproben von den Probanden viermal während ihrer Akklimatisierungsphase vor Beginn des Experiments, um ein hämatologisches, biochemisches und Lipid-Grundlinienprofil zu erhalten, wobei sofort 2 ml Blut mit EDTA als Antikoagulans für die hämatologische Analyse abgegeben werden. Das System umfasst außerdem eine Zentrifuge zum Zentrifugieren von 3 ml Blut, das man 3 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1000 U/min gerinnen lässt, um das Serum abzutrennen. Das System umfasst außerdem eine Trennkammer zum Trennen des Serums mit einem Serumseparator und zum Einfüllen in Reagenzgläser. Das System umfasst außerdem ein Wundbewertungsgerät zur Bewertung der Wundheilung an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Einleitung chirurgischer Wunden auf der Grundlage der groben klinischen Wundmerkmale, histologischen Merkmale und des Prozentsatzes der Wundkontraktion.
Ein Ziel der vorliegenden Offenbarung besteht darin, die Wundheilung von ethanolischen Extrakten von A. leiocarpus bei Alloxan-induzierten diabetischen Hunden zu verbessern.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Offenbarung ist die Untersuchung der diabetischen Stoffwechselstörung, der verzögerten Wundheilung, mit ethanolischen Extrakten von A. leiocarpus.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein schnelles und kostengünstiges System zur Erkennung von Heilungsaktivitäten bereitzustellen.
Um die Vorteile und Merkmale der vorliegenden Offenbarung weiter zu verdeutlichen, erfolgt eine detailliertere Beschreibung der Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind. Es versteht sich, dass diese Zeichnungen nur typische Ausführungsformen der Erfindung darstellen und daher nicht als deren Umfang einschränkend anzusehen sind. Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen genauer und detaillierter beschrieben und erläutert.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Offenbarung werden besser verständlich, wenn die folgende detaillierte Beschreibung unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen gelesen wird, in denen in den Zeichnungen gleiche Bezugszeichen gleiche Teile darstellen, wobei:

1 zeigt ein Blockdiagramm eines Systems zum Nachweis der Heilungsaktivitäten des ethanolischen Extrakts von Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung;
2 veranschaulicht einen intravenösen Glukosetoleranztest bei Hunden vor der Auslösung von Diabetes mellitus gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung;
3 veranschaulicht eine Wirkung der Behandlung mit Insulin und rohem Ethanolextrakt von A. leiocarpus-Extrakt auf den intravenösen Glukosetoleranztest nach Auslösung von Diabetes mellitus unter Verwendung von Alloxan-Monohydrat gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung;
4 veranschaulicht. Tabelle 1 zeigt die Wirkung der Verwendung von rohem ethanolischem Stammrindenextrakt von A. leiocarpus auf das Körpergewicht (kg) der Versuchshunde gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung; und
5 veranschaulicht. Tabelle 2 zeigt die Auswirkungen der Behandlung mit Insulin und rohem Ethanol-Stammrindenextrakt von A. leiocarpus auf den Nüchternblutzuckerspiegel (FBG) in mg/dl bei Hunden mit experimentellem Alloxan-induziertem Diabetes mellitus gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Offenlegung.

Darüber hinaus werden erfahrene Handwerker erkennen, dass Elemente in den Zeichnungen der Einfachheit halber dargestellt sind und möglicherweise nicht unbedingt maßstabsgetreu gezeichnet wurden. Beispielsweise veranschaulichen die Flussdiagramme die Methode anhand der wichtigsten Schritte, die dazu beitragen, das Verständnis von Aspekten der vorliegenden Offenbarung zu verbessern. Darüber hinaus können im Hinblick auf die Konstruktion des Geräts eine oder mehrere Komponenten des Geräts in den Zeichnungen durch herkömmliche Symbole dargestellt worden sein, und die Zeichnungen zeigen möglicherweise nur die spezifischen Details, die für das Verständnis der Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung relevant sind um die Zeichnungen nicht durch Details zu verdecken, die für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, der Nutzen aus der Beschreibung hierin zieht, leicht ersichtlich sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG:
Um das Verständnis der Prinzipien der Erfindung zu fördern, wird nun auf die in den Zeichnungen dargestellte Ausführungsform Bezug genommen und für deren Beschreibung eine spezifische Sprache verwendet. Es versteht sich jedoch, dass dadurch keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, da Änderungen und weitere Modifikationen des dargestellten Systems und weitere Anwendungen der darin dargestellten Prinzipien der Erfindung in Betracht gezogen werden, wie sie einem Fachmann normalerweise in den Sinn kommen würden in der Technik, auf die sich die Erfindung bezieht.
Der Fachmann versteht, dass die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erläuternd für die Erfindung sind und diese nicht einschränken sollen.
Verweise in dieser Spezifikation auf „einen Aspekt“, „einen anderen Aspekt“ oder eine ähnliche Sprache bedeuten, dass ein bestimmtes Merkmal, eine bestimmte Struktur oder ein bestimmtes Merkmal, das in Verbindung mit der Ausführungsform beschrieben wird, in mindestens einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung enthalten ist. Daher beziehen sich die Formulierungen „in einer Ausführungsform“, „in einer anderen Ausführungsform“ und ähnliche Formulierungen in dieser Spezifikation möglicherweise, aber nicht unbedingt, auf dieselbe Ausführungsform.
Die Begriffe „umfasst“, „umfassend“ oder alle anderen Variationen davon sollen eine nicht ausschließliche Einbeziehung abdecken, sodass ein Prozess oder eine Methode, die eine Liste von Schritten umfasst, nicht nur diese Schritte umfasst, sondern möglicherweise andere Schritte nicht umfasst ausdrücklich aufgeführt oder diesem Prozess oder dieser Methode innewohnend sind. Ebenso schließen ein oder mehrere Geräte oder Subsysteme oder Elemente oder Strukturen oder Komponenten, denen „umfasst...a“ vorangestellt ist, nicht ohne weitere Einschränkungen die Existenz anderer Geräte oder anderer Subsysteme oder anderer Elemente oder anderer Strukturen aus andere Komponenten oder zusätzliche Geräte oder zusätzliche Subsysteme oder zusätzliche Elemente oder zusätzliche Strukturen oder zusätzliche Komponenten.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstanden werden. Das hier bereitgestellte System, die Methoden und Beispiele dienen nur der Veranschaulichung und sollen nicht einschränkend sein.
Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung werden im Folgenden ausführlich unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
Unter Bezugnahme auf 1 ist ein Blockdiagramm eines Systems zum Erkennen von Heilaktivitäten des ethanolischen Extrakts von Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung dargestellt. Das System 100 umfasst eine Synthesevorrichtung 102 zum Synthetisieren der Rohausbeute an ethanolischem Extrakt der Stammrinde von A. leoicarpus mit destilliertem Wasser, um eine 5.2 %ige Lösung bereitzustellen.
In einer Ausführungsform wird eine Spritze 104 verwendet, um den Probanden die Lösung in einer Dosis von 1000 mg/kg bd oral zu verabreichen. Gew., einmal täglich über einen Zeitraum von 21 Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Einwirkung der chirurgischen Wunde.
In einer Ausführungsform wird eine Probensammeleinheit 106 zum Sammeln von 5 ml Blutproben von den Probanden viermal während ihrer Akklimatisierungsphase vor Beginn des Experiments verwendet, um ein hämatologisches, biochemisches und Lipid-Grundlinienprofil zu erhalten, wobei 2 ml Blut erforderlich sind sofort in Vacutainer mit EDTA als Antikoagulans für die hämatologische Analyse abgegeben.
In einer Ausführungsform wird eine Zentrifuge 108 zum Zentrifugieren von 3 ml Blut verwendet, das man 3 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1000 U/min gerinnen lässt, um das Serum abzutrennen.
In einer Ausführungsform wird eine Trennkammer 110 zum Trennen von Serum mit einem Serumseparator 112 und zum Einfüllen in Reagenzgläser verwendet.
In einer Ausführungsform wird ein Wundbewertungsgerät 114 zur Bewertung der Wundheilung an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Induktion chirurgischer Wunden auf der Grundlage grober klinischer Wundmerkmale, histologischer Merkmale und des Prozentsatzes der Wundkontraktion verwendet.
In einer anderen Ausführungsform wird die Stammrinde in kaltem 95 %igem Ethanol mazeriert.
In einer anderen Ausführungsform wird der Bereich der Kopfvene jedes Probanden mit Chlorhexidien abgetupft und eine Venenpunktion mit der 5-ml-Spritze und einer daran befestigten 21-G-Nadel durchgeführt, um durch Kapillarwirkung 0.1 ml Blut zu entnehmen.
In einer anderen Ausführungsform wird der Teststreifen des Glukometers in das Glukometer 116 eingeführt und beim ersten Piepton des Glukometers wird ein Blutstropfen aus der Spritze auf den Teststreifen gegeben und der Messwert wird unmittelbar am Ende eines zweiten Pieptons erfasst und der Glukosespiegel wird in Gramm/Deziliter aufgezeichnet.
In einer anderen Ausführungsform werden die Serumproben auf Elektrolyte, Leber- und Nierenbiomarker-Enzyme analysiert und die Enzyme auf Aspartataminotransferase (AST), Alaninaminotransferase (ALT) und alkalische Phosphatase (ALP), Kreatinin, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN), Gesamtserumproteine, Albumin, Globuline, Serumtriglyceride und Cholesterin, und die gemessenen Elektrolyte sind Natriumionen (Na+), Chloride (Cl-), Kalium (K+) und Bikarbonate (HCO₃-) unter Verwendung ihrer Bayer-Diagnosereagenzien .
In einer anderen Ausführungsform werden in wöchentlichen Abständen über einen Zeitraum von drei Wochen sowohl Blut- als auch Serumproben für Analysen entnommen.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Probandenüberwachungsgerät 118 zum Wiegen von Tieren und zum Überwachen lebenswichtiger Parameter einschließlich Herzfrequenz, Atemfrequenz und Temperatur für jedes Tier vor Beginn des Experiments eingesetzt, um sicherzustellen, dass es sich in einem gesunden Zustand befindet.
In einer anderen Ausführungsform werden von Probanden in allen Gruppen an den Tagen 14 und 21 nach der chirurgischen Induktion der Wunden Biopsien von etwa 2 mm aus der Umgebung entnommen, wobei die Proben in 10 % neutral gepufferter Lösung fixiert werden Formalinlösung untersucht und anschließend zu 5 µm dicken Paraffinschnitten für histologische Flecken verarbeitet und mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung gefärbt, wobei die Bildung von Granulationsgewebe, die Angiogenese und die Bildung der Epithelisierung untersucht werden.
Materialen und Methoden
Pflanzensammlung, -vorbereitung, -extraktion, qualitative und quantitative phytochemische Screenings.
Sammlung: Die Stammrinde der Pflanze wird im Juni in Samaru, Zaria, gesammelt; Das Herbarium der Abteilung für Botanik authentifizierte es als A. leiocarpus und hinterlegte es mit der Belegnummer 01738.
Vorbereitung: Die Vorbereitung der Stammrinde von A. leiocarpus wurde bereits beschrieben.
Ethanolische Extraktion der Stammrinde von A. leiocarpus:
Die Stammrinde wird in kaltem 95-prozentigem Ethanol mazeriert, ein Standardverfahren, wie zuvor beschrieben.
Qualitatives und quantitatives phytochemisches Screening von rohen ethanolischen Extrakten von A. leiocarpus.
Die verschiedenen phytochemischen Bestandteile werden erkannt und ihre prozentualen Ausbeuteberechnungen werden unter Verwendung der zuvor beschriebenen Standardverfahren durchgeführt.
Versuchstiere.
Ermittlung der Basisdaten
Zwölf ausgewachsene nigerianische einheimische Hunde stammen aus der Umgebung von Zaria, Nigeria. Den Tieren werden während ihrer Akklimatisierungsphase vor Beginn des Experiments vier (4) Mal zwei (2) ml Blutproben entnommen, um ein grundlegendes hämatologisches, biochemisches Serum- und Lipidprofil zu erhalten. Die Blutzuckerwerte werden innerhalb des Zeitraums auch mit einem Glukometer (Acu-check®, activate Blood Glucose Meter System, Int. Medical Equipment Diabetes Care, Berlin, Deutschland) gemessen, um die Grundglukosewerte der Tiere zu bestimmen. Vor Beginn des Experiments werden die Tiere gewogen und außerdem werden bei jedem Tier Vitalparameter wie Herzfrequenz, Atemfrequenz und Temperatur gemessen, um sicherzustellen, dass sie sich in einem gesunden Zustand befinden.
Fütterung und Impfungen: Die Hunde werden nach Belieben mit Futter und Wasser versorgt; Sie sind gegen Tollwut geimpft und werden auf Ekto- und Endoparasiten überwacht.
Experimentelles Design:
Für dieses System wird ein randomisiert-kontrolliertes Design verwendet. Nach einer einmonatigen Akklimatisierung werden die Hunde nach dem Zufallsprinzip zu gleichen Teilen in vier Gruppen der Gruppe A NDW = nicht-diabetisch, medizinisch chirurgisch verwundet und unbehandelt eingeteilt. Gruppe B DWI = Diabetiker, chirurgisch verwundet und mit Insulin behandelt (Positivkontrolle).
Gruppe C DWE = Diabetiker, chirurgisch verwundet und mit dem Extrakt behandelt.
Gruppe D DWU = Diabetiker, menschlich chirurgisch verwundet und unbehandelt (Negativkontrolle).
Intravenöser Glukosetoleranztest (IVGTT)
Die Hunde werden über Nacht nüchtern gehalten und ihr Blutzuckerspiegel wird mit einem Glukometer (Acu-Check®, Activate Blood Glucose Meter System, Int. Medical Equipment Diabetes Care, Berlin, Deutschland) bei 0 Minuten gemessen. Fünfhundert (500) mg/kg Körpergewicht Glukose werden über einen Zeitraum von 30 Sekunden durch die Kopfvene infundiert. Anschließend werden die Blutzuckerwerte 5, 15, 30, 60 und 120 Minuten nach der Glukoseinfusion erneut gemessen, um den Glukosetoleranzwert der Tiere zu bestimmen. Die Blutzuckerkonzentrationen in diesen spezifischen Zeiträumen werden geschätzt. Vor dem Experiment wird ein intravenöser Glukosetoleranztest (IVGTT) durchgeführt, um einen bestehenden Diabetes bei den Tieren auszuschließen. Anschließend wird er 21 Tage nach der Alloxan-Verabreichung wiederholt, um einen Alloxan-induzierten Typ-1-Diabetes zu bestätigen, bevor die Operationswunden entstehen. Während der ersten 21 Tage nach der Entstehung von Typ-1-Diabetes wird der Glukosespiegel mit dem Blutzuckermessgerät überwacht und geschätzt.
Induktion von Diabetes mit Alloxan-Monohydrat
Diabetes mellitus Typ 1 wird bei Hunden der Gruppen B, C und D induziert. Die Tiere werden über Nacht nüchtern gehalten, gewogen und bei jedem Tier werden Vitalparameter wie Herzfrequenz, Atemfrequenz und Temperatur gemessen. Der Blutzuckerspiegel wird bei 0 Minuten mit einem Glukometer (Acu-Check®, aktiviertes Blutzuckermesssystem, Int. Medical Equipment Diabetes Care, Berlin, Deutschland) gemessen. Alloxan-Monohydrat wird in normaler Kochsalzlösung rekonstituiert, um eine Konzentration von 200 mg/ml zu erhalten. Die Tiere werden fixiert und das Alloxan-Monohydrat wird schnell durch die Kopfvene (mit Hilfe eines intravenösen Katheters) in einer Dosis von 100 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Anschließend wird der Blutzuckerspiegel alle 15 Minuten gemessen, um eine hypoglykämische Reaktion festzustellen. Anschließend wird Glukose (50 ml 10 % Dextrose-Kochsalzlösung) verabreicht, um die Tiere vor einem akuten hypoglykämischen Schock zu schützen. Die Vitalparameter der Hunde werden überwacht und die Hunde kontinuierlich auf etwaige unerwünschte Anzeichen beobachtet. Der Nüchternblutzuckerspiegel (FBG) jedes Hundes wird an den Tagen 3, 7, 14 und 21 nach der Verabreichung von Alloxan-Monohydrat bestimmt. Hunde mit einem erhöhten Glukosespiegel von ≥ 200 mg/dl nach 120 Minuten gelten als Diabetiker. Anschließend werden ihnen während der gesamten Zeit ad libitum Futter und Wasser zur Verfügung gestellt.
Wundbildung
Nach Bestätigung des Diabetes (FBG > 120 mg/dl) am 21. Tag nach der Verabreichung von Alloxan-Monohydrat werden alle Hunde mit Xylazin-Hel sediert und in einer Dosis von 1 mg/kg zweimal täglich intramuskulär injiziert. Gew. und in die sternale Liegeposition gebracht. Durch die Injektion von 2 % Xylocain-HCl an der Hautinzisionsstelle wird eine lokale Infiltrationsanalgesie erreicht. Nach der routinemäßigen aseptischen Vorbereitung des Wundbereichs bei jedem Hund werden am Rücken jedes Hundes drei quadratische Vollhautwunden mit einer Breite von jeweils 2 cm und einer Länge von jeweils 2 cm angelegt. Blutungen werden durch Druck mit Gaze auf die Wundoberfläche gestillt. Die Wunden werden mit einem sterilen Stück Mull abgedeckt und anschließend mit einem Schutzverband mit Klebeband versehen, um sie 24 Stunden lang vor Kontamination und Fliegen zu schützen. Der Verband wird in der ersten Woche täglich und dann zwei Wochen lang jeden zweiten Tag gewechselt, bis die vollständige Heilung erfolgt ist. Unmittelbar vor der Behandlung mit dem Extrakt am Tag Null der Wundinduktion (d. h. 21 Tage nach der Diabetesinduktion) wird jede Wunde mit 10 % Povidon-Jod gewaschen und zunächst mit destilliertem Wasser gespült.
Versuchs- und Behandlungsgruppen
Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in vier (4) Gruppen eingeteilt, wie in Tabelle 1 gezeigt:
Zusammensetzung der ethanolischen Extrakte:
Die Rohausbeute des ethanolischen Extrakts aus der Stammrinde von A. leoicarpus wird mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt, um eine 5,2 %ige Lösung zu erhalten. Die Lösung wird den Hunden der Gruppe C (DWE) in einer Dosis von 1000 mg/kg zweimal täglich oral verabreicht. Gew. mit einer 10-ml-Spritze (ohne Nadel) einmal täglich über einen Zeitraum von 21 Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Einwirkung der Operationswunde. Die Dosis wird für frühere Studien angewendet. Hunden der Gruppe B (DWI) wird eine Insulindetemir-Injektion (LEVEMIR®, ein humanes rekombinantes Insulinanalogon; hergestellt von Novo Nordisk, Dänemark) subkutan in einer Dosierung von 0,5 IE/kg verabreicht; Die Behandlung begann auch am ersten Tag nach der chirurgischen Erzeugung der Wunden am 21. Tag nach der Induktion von Typ-1-Diabetes mellitus. Den Tieren in der Gruppe (NDW) wird normale Kochsalzlösung verabreicht.
Messung des Nüchternblutzuckerspiegels:
Der Nüchternblutzuckerspiegel aller Hunde wird zweimal wöchentlich mit einem Blutzuckermessgerät (Acu236 check®, Activate Blood Glucose Meter System, Int. Medical Equipment Diabetes Care, Berlin, Deutschland) gemessen. Der Bereich der Kopfvene jedes Hundes wird mit Chlorhexidien abgetupft und mit einer 5-ml-Spritze und einer daran befestigten 21-G-Nadel wird eine Venenpunktion durchgeführt, um durch Kapillarwirkung 0,1 ml Blut zu entnehmen. Der Teststreifen des Glukometers wird in das Glukometer eingeführt und beim ersten Piepton des Glukometers wird ein Blutstropfen aus der Spritze auf den Teststreifen gegeben. Der Messwert wird unmittelbar nach dem zweiten Piepton abgelesen und der Glukosespiegel wird in Gramm/Deziliter (dl) aufgezeichnet, wie vom Hersteller empfohlen.
Sammlung von Proben für hämatologische und biochemische Serumanalysen
Entnahme und Analyse von Blutproben
Der Bereich der Vena cephalica wird mit 10 % Chlorhexidien abgetupft und fünf (5) ml Blut entnommen, von dem genau 2 ml Blut sofort in Vacutainer mit EDTA als Antikoagulans abgegeben und ordnungsgemäß gekennzeichnet werden. Das Blut wird sofort zur hämatologischen Analyse ins Labor transportiert. Hämatologische Parameter werden mit einem Shenzen Mindray® Biochemical Electronics Auto Haematological Analyzer (2007) Version 1.3 bestimmt. Das Analysegerät verwendet zwei unabhängige Methoden zur Bestimmung der weißen Blutkörperchen, roten Blutkörperchen und Blutplättchen sowie die kolorimetrische Methode zur Bestimmung des Hämoglobins. Ein Analysezyklus besteht aus Ansaugen, Verdünnen und Mischen, bevor die Bestimmung jedes Parameters erfolgt.
Sammlung und Analyse von Serumproben
Die restlichen 3 ml Blut, die aus der Kopfvene entnommen werden, werden in gerinnungshemmende Vacutainer abgegeben. Man lässt das Blut gerinnen und zentrifugiert es dann 3 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1000 U/min, um das Serum abzutrennen. Das Serum wird mit einem Serumseparator abgetrennt, in Reagenzgläser gefüllt und sofort zur Analyse ins Labor gebracht. Der Express plus Clinical Chemistry Analyzer (Bayer®), Deutschland, wird zur Analyse der Serumproben auf Elektrolyte, Leber- und Nieren-Biomarker-Enzyme verwendet. Die untersuchten Enzyme sind: Aspartataminotransferase (AST), Alaninaminotransferase (ALT) und alkalische Phosphatase (ALP), Kreatinin, Blutharnstoffstickstoff (BUN), Gesamtserumproteine, Albumin, Globuline, Serumtriglyceride und Cholesterin sowie die Elektrolyte Gemessen werden Natriumionen (Na⁺), Chloride (Cl^-), Kalium (K⁺) und Bikarbonate (HCO₃ ^-). Alle diese Parameter werden mit den von der International Federation of Clinical Chemistry (266 IFCC) zugelassenen Bayer-Diagnosereagenzien bestimmt. Für Analysen werden über einen Zeitraum von drei (3) Wochen in wöchentlichen Abständen sowohl Blut- als auch Serumproben entnommen.
Beurteilung der Wundheilung:
Die Beurteilung der Wundheilung erfolgt an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Einleitung chirurgischer Wunden auf der Grundlage der groben klinischen Wundmerkmale, histologischen Merkmale und des Prozentsatzes der Wundkontraktion. Die mittlere Verringerung der Wundabmessungen (Länge und Breite) wird an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Einleitung chirurgischer Wunden im Vergleich zur Abmessung von Tag 0, dem Tag der Einleitung chirurgischer Wunden, zur Berechnung des Prozentsatzes der Wundkontraktion bestimmt. Es wird die folgende Gleichung angewendet. $Wundkontraktion (WC%) = \frac{W 0 - Wn}{W 0} \times 100$
Wo:

W ₀ = die anfängliche Wundmessung, d. h. Tag 0 (1. Messung in cm).
W _n = das Wundmaß am Tag der Messung (in cm) (n = 7, 14, 21. Tag nach der Entstehung chirurgischer Wunden).

Sammlung von Wundgewebebiopsien zur histologischen Untersuchung: Von Tieren aller Gruppen werden an den Tagen 14 und 21 nach der chirurgischen Einleitung der Wunden Hautbiopsien von etwa 2 mm aus der Umgebung zur histologischen Beurteilung entnommen. Die Proben werden in 10 % neutral gepufferter Formalinlösung fixiert. Anschließend werden sie verarbeitet, um 5 µm dicke Paraffinschnitte für histologische Flecken herzustellen, und mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung gefärbt. Untersucht werden die Bildung von Granulationsgewebe, die Angiogenese und die Ausbildung der Epithelisierung.
Datenanalyse
Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die Daten werden einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Dunnett-Test unter Verwendung des Statistikpakets GraphPad Prism® 8 unterzogen. Werte von P < 0.05 gelten als signifikant.
2 veranschaulicht einen intravenösen Glukosetoleranztest bei Hunden vor der Auslösung von Diabetes mellitus gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
Intravenöse Glukosetoleranztests: Der IVGTT vor der Auslösung von Typ-1-Diabetes mellitus mit Alloxan-Monohydrat zeigte das normale Muster der Glukoseverwertung bei den Hunden nach 150 Minuten, wie in dargestellt. Fünf Minuten danach trat ein plötzlicher Anstieg des Glukosespiegels auf -intravenöse Infusion von Glukose mit 500 mg/kg zweimal täglich. Gew. Ab der 15. Minute ist ein Absinken des Blutzuckerspiegels zu beobachten und bei allen Hunden sinken die Werte noch 150 Minuten lang weiter auf den Ausgangswert bzw. knapp unter den Ausgangswert. Alle Hunde zeigten eine normale Glukosetoleranz, was bedeutet, dass keiner der Hunde vor Beginn des Experiments Diabetiker war.
3 veranschaulicht eine Wirkung der Behandlung mit Insulin und rohem Ethanolextrakt von A. leiocarpus-Extrakt auf den intravenösen Glukosetoleranztest nach Auslösung von Diabetes mellitus unter Verwendung von Alloxan-Monohydrat gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung. Die IVGTT 21 Tage nach der Induktion von Typ-1-Diabetes mellitus unter Verwendung von Alloxan-Monohydrat vor der Entstehung der Operationswunden sind in dargestellt. Ein starker Anstieg des Glukosespiegels trat 5 Minuten nach der intravenösen Glukoseinfusion von 500 mg/kg zweimal täglich auf. Ab der 15. Minute wird ein Abfall des Glukosespiegels festgestellt, der nach 120 Minuten weiter auf den Ausgangswert oder knapp unter den Ausgangswert sinkt. Dies ist in allen Gruppen zu beobachten, mit Ausnahme der unbehandelten Gruppe mit Diabetes-Verletzten, in der der anfängliche Glukosespiegel hoch ist kann nach 120 Minuten nicht mehr auf den Ausgangswert zurückkehren.
4 zeigt. Tabelle 1 zeigt die Wirkung der Verwendung von rohem ethanolischem Stammrindenextrakt von A. leiocarpus auf das Körpergewicht (kg) der Versuchshunde gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.
Auswirkung der Verwendung von rohem ethanolischem Stammrindenextrakt von A. leiocarpus auf das Körpergewicht der Versuchshunde
Das Körpergewicht der Diabetiker-, Operationsverletzten- und Unbehandelten-Gruppe ist bis zum Ende des Experiments deutlich (P < 0.05) reduziert, von 10.0 ± 0.3 auf 8.0 ± 1.4 kg. bis zum 56. Tag, während das Körpergewicht der Diabetiker-, chirurgisch verwundeten und mit Extrakt behandelten Gruppe im Vergleich zu dem der unbehandelten Gruppe bis zum Tag 56 signifikant (P < 0.05) von 10.3 ± 0.8 auf 13.0 ± 0.4 anstieg (Tabelle 1).
5 zeigt. Tabelle 2 zeigt die Auswirkungen der Behandlung mit Insulin und rohem Ethanol-Stammrindenextrakt von A. leiocarpus auf den Nüchternblutzuckerspiegel (FBG) in mg/dl bei Hunden mit experimentellem Alloxan-induziertem Diabetes mellitus gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Offenlegung.
Hyperglykämie, Anämie, Leukopenie, Leber- und Nierenschäden, gestörte Elektrolyte und Dyslipidämie sind bei Alloxan-induziertem Diabetes mellitus bei Hunden reproduzierbar. Thrombozytopenie und begleitende Panzytopenie sind Merkmale des Alloxan-induzierten Diabetes mellitus bei Hunden. Bei den beobachteten Thrombozytopathien handelt es sich um Thrombozytose, die durch die Behandlung mit ethanolischem Extrakt aus A. leiocarpus-Stammrinde induziert wird und die Heilung chirurgischer Vollhaut-Exzisionswunden bei diabetischen Hunden beschleunigt, was in ähnlicher Weise bei nicht-diabetischen verwundeten Kontrollhunden beobachtet wurde; Thrombozytopenische Veränderungen trugen teilweise zur verzögerten Wundheilung bei unbehandelten und mit Insulin behandelten diabetischen Hunden bei. Unsachgemäßes Zurückziehen des Blutgerinnsels und teilweise Thrombasthenie trugen zur verzögerten Wundheilung bei. Ethanolischer Extrakt aus der Stammrinde von A. leiocarpus beschleunigte die Wundkontraktion, was auf seine Wirksamkeit bei der Vorbeugung diabetischer Geschwüre schließen lässt.
Die Zeichnungen und die vorstehende Beschreibung geben Beispiele für Ausführungsformen. Fachleute werden erkennen, dass eines oder mehrere der beschriebenen Elemente durchaus zu einem einzigen Funktionselement kombiniert werden können. Alternativ können bestimmte Elemente in mehrere Funktionselemente aufgeteilt werden. Elemente einer Ausführungsform können zu einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. Beispielsweise können die Reihenfolgen der hier beschriebenen Prozesse geändert werden und sind nicht auf die hier beschriebene Weise beschränkt. Darüber hinaus müssen die Aktionen eines Flussdiagramms nicht in der gezeigten Reihenfolge implementiert werden; Es müssen auch nicht unbedingt alle Handlungen ausgeführt werden. Auch solche Handlungen, die nicht von anderen Handlungen abhängig sind, können parallel zu den anderen Handlungen durchgeführt werden. Der Umfang der Ausführungsformen wird durch diese spezifischen Beispiele keineswegs eingeschränkt. Zahlreiche Variationen, ob explizit in der Spezifikation angegeben oder nicht, wie z. B. Unterschiede in Struktur, Abmessung und Materialverwendung, sind möglich. Der Umfang der Ausführungsformen ist mindestens so breit wie durch die folgenden Ansprüche angegeben.
Vorteile, andere Vorzüge und Problemlösungen wurden oben im Hinblick auf spezifische Ausführungsformen beschrieben. Die Vorteile, Vorzüge, Problemlösungen und alle Komponenten, die dazu führen können, dass ein Nutzen, ein Vorteil oder eine Lösung eintritt oder ausgeprägter wird, dürfen jedoch nicht als kritische, erforderliche oder wesentliche Funktion oder Komponente von ausgelegt werden einzelne oder alle Ansprüche.
REFERENZEN

100: Blockdiagramm eines Systems zum Nachweis der heilenden Wirkung eines ethanolischen Extraktes von Anogeissusleiocarpus auf chirurgisch induzierte Hautwunden.
102: Synthesegerät
104: Spritze
106: Probensammeleinheit
108: Zentrifuge
110: Trennkammer
112: Serumabscheider
114: Wundbeurteilungsgerät
116: Blutzuckermessgerät
118: Subjektüberwachungsgerät

Claims

Ein System zum Nachweis der Heilwirkung von ethanolischem Extrakt aus Anogeissusleiocarpus bei chirurgisch bedingten Hautwunden. Das System umfasst: eine Synthesevorrichtung zur Synthese der Rohausbeute an ethanolischem Extrakt der Stammrinde von A. leoicarpus mit destilliertem Wasser, um eine 5.2 %ige Lösung bereitzustellen; eine Spritze zur oralen Verabreichung der Lösung an die Probanden in einer Dosis von 1000 mg/kg zweimal täglich. Gew., einmal täglich über einen Zeitraum von 21 Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Einwirkung der chirurgischen Wunde; eine Probensammeleinheit zum viermaligen Sammeln von 5 ml Blutproben von den Probanden während ihrer Akklimatisierungsphase vor Beginn des Experiments, um ein grundlegendes hämatologisches, biochemisches Serum- und Lipidprofil zu erhalten, wobei 2 ml Blut sofort in Vacutainer mit EDTA als Antikoagulans für hämatologische Analysen abgegeben werden; eine Zentrifuge zum Zentrifugieren von 3 ml Blut, das man 3 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1000 U/min gerinnen lässt, um das Serum abzutrennen; eine Trennkammer zum Trennen von Serum mit einem Serumseparator und zum Einfüllen in Reagenzgläser; und ein Wundbeurteilungsgerät zur Beurteilung der Wundheilung an den Tagen 7, 14 und 21 nach der Einleitung chirurgischer Wunden auf der Grundlage der groben klinischen Wundmerkmale, histologischen Merkmale und des Prozentsatzes der Wundkontraktion.
System nach Anspruch 1, wobei die Stammrinde in kaltem 95 %igem Ethanol mazeriert wird.
System nach Anspruch 1, wobei der Bereich der Kopfvene jedes Probanden mit Chlorhexidien abgetupft wird und eine Venenpunktion unter Verwendung der 5-ml-Spritze mit einer daran befestigten 21-G-Nadel durchgeführt wird, um durch Kapillarwirkung 0.1 ml Blut zu entnehmen.
System nach Anspruch 1, wobei der Teststreifen des Glukometers in das Glukometer eingeführt wird und beim ersten Piepton des Glukometers ein Blutstropfen aus der Spritze auf den Teststreifen gegeben wird und der Messwert unmittelbar am Ende abgelesen wird Es ertönt ein zweiter Piepton und der Glukosespiegel wird in Gramm/Deziliter aufgezeichnet.
System nach Anspruch 1, wobei die Serumproben auf Elektrolyte, Leber- und Nierenbiomarkerenzyme analysiert werden und wobei die Enzyme auf Aspartataminotransferase (AST), Alaninaminotransferase (ALT) und alkalische Phosphatase (ALP) sowie Kreatinin, Blutharnstoffstickstoff (BUN), Gesamtserumproteine, Albumin, Globuline, Serumtriglyceride und Cholesterin untersucht werden und die gemessenen Elektrolyte sind Natriumionen (Na+), Chlorid (Cl-), Kalium (K+) und Bikarbonate (HCO₃-).
System nach Anspruch 1, wobei sowohl Blut- als auch Serumproben in wöchentlichen Abständen über einen Zeitraum von drei Wochen für Analysen entnommen werden.
System nach Anspruch 1, bei dem vor Beginn des Experiments ein Probandenüberwachungsgerät zum Wiegen der Tiere und zur Überwachung der Vitalparameter, einschließlich Herzfrequenz, Atemfrequenz und Temperatur, für jedes Tier eingesetzt wird, um sicherzustellen, dass es sich in einem gesunden Zustand befindet.
System gemäß Anspruch 1, wobei die Hautwundenbiopsien von etwa 2 mm aus der Umgebung von Probanden in allen Gruppen an den Tagen 14 und 21 nach der chirurgischen Induktion der Wunden zur histologischen Bewertung entnommen werden, wobei die Proben fixiert werden in 10 % neutraler gepufferter Formalinlösung behandelt und anschließend zu 5 µm dicken Paraffinschnitten für histologische Flecken verarbeitet und mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung gefärbt , wobei die Bildung von Granulationsgewebe, Angiogenese und die Bildung von Epithelisierung untersucht werden.