DE202022106098U1

DE202022106098U1 - System zum Nachweis von durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern (Salmonellen)

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Publication number: DE202022106098U1
Application number: DE202022106098.3U
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-10-29
Filing date: 2022-10-29
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2032-10-30

Abstract

System (100) zum Nachweis von durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern (Salmonellen), wobei das System (100) Folgendes umfasst:
einen Behälter (102) zur Aufbewahrung eines Lebensmittels, das zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit analysiert werden soll;
eine Vielzahl von Sensoren (104), die auf der Oberfläche des Behälters (102) angeordnet sind, um Signale einer Vielzahl von Parametern zu messen, die sich auf die Sicherstellung des Echtzeitzustands des gelagerten Lebensmittels beziehen, um die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten, wobei die Vielzahl von Parametern Lichtenergie, Wärmewert, pH-Änderung und Massenänderung umfasst;
einen Verstärker (106), der mit der Vielzahl von Sensoren (104) verbunden ist, um die gemessenen Signale der Vielzahl von Parametern zu verstärken; und
einen Prozessor (108), der mit dem Verstärker (106) verbunden ist, um das vom Verstärker empfangene analoge Signal in einen entsprechenden digitalen Wert umzuwandeln und das Signal zu verarbeiten, um den Echtzeitzustand des gelagerten Lebensmittels durch Vergleich mit einem Referenzwert zu identifizieren und das Vorhandensein des Krankheitserregers Salmonellen zu erkennen.

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Gebiet der Biosensoren. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein System zum Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern Salmonellen unter Verwendung des Aptamers mit funktionellen Gold-Nanopartikeln.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die zunehmende Reisetätigkeit der Menschen auf der ganzen Welt und der globale Handel haben die Ernährungsgewohnheiten der Menschen nachhaltig verändert und die Methoden der Lebensmittelproduktion und - verarbeitung geprägt. Diese Veränderungen in der Lebensmittelproduktion und -verarbeitung haben den Nährwert der Lebensmittel verbessert und den Lebensmittel exportierenden Ländern geholfen, Devisen zu verdienen. Diese veränderten Produktions- und Verarbeitungsmuster haben auch zu neuen Herausforderungen im Bereich der Lebensmittelsicherheit geführt.
Heutzutage machen sich die Menschen mit zunehmender Bildung viel mehr Sorgen um ihre Gesundheit und die Lebensmittelsicherheit. Jeder Verbraucher kauft heutzutage ein Produkt, nachdem er sich über dessen Sicherheit überzeugt hat. Das Hauptanliegen eines jeden Lebensmittelherstellers ist die Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit, da sie einer der Schlüsselfaktoren ist, um die Verbraucher anzuziehen und das Geschäft zu steigern. Der Wert, den die Lebensmittelindustrie für die Kontrolle und Bewertung der Lebensmittelqualität ausgibt, wird auf 1.5 bis 2 % geschätzt. Auch die Regierung ist um die Lebensmittelsicherheit besorgt, und so haben viele Länder ihre eigenen Normen für die Lebensmittelsicherheit festgelegt, wie in Indien die FSSAI-Normen, in Europa die EFSA-Normen usw.
Die Lebensmittelsicherheit muss vom landwirtschaftlichen Betrieb bis zum Verbraucher gewährleistet sein, denn sie umfasst alle Bestandteile von Lebensmitteln, darunter Rückstände von Pestiziden und Düngemitteln, Schwermetalle, versehentlich hinzugefügte Fremdstoffe, Lebensmittelzusatzstoffe, die über den empfohlenen Mengen liegen, Toxine oder Allergene, die durch biochemische Aktivität aufgrund enzymatischer oder mikrobieller Aktivität während der Lagerung entstehen, usw.
US8747775B2 offenbart eine Vorrichtung zur Lebensmittelsicherheit, die einen oder mehrere Sensoren umfasst, die mindestens einen Zustand des Produkts und/oder seiner Umgebung messen, sowie einen oder mehrere optische Indikatoren, die so konfiguriert sind, dass sie einen visuellen Hinweis auf die Frische und/oder Sicherheit des Produkts anzeigen. Eine Antenne sendet und empfängt Daten bezüglich des mindestens einen gemessenen Zustands des Produkts und der Frische und/oder Sicherheit des Produkts. Ein Logikmodul führt eine programmierbare Logik aus, um den Frischegrad und/oder die Sicherheit des Produkts zu bestimmen.
US6668240B2 offenbart ein System zur Überwachung der Leistung von Lebensmittelprodukten und Kühlsystemen an einem entfernten Standort. Das System umfasst ein Verwaltungszentrum, das über ein Kommunikationsnetz mit einem entfernten Standort kommuniziert. Das Verwaltungszentrum empfängt Leistungsinformationen des entfernten Standorts in Bezug auf Betriebsparameter von Komponenten eines Kühlsystems des entfernten Standorts sowie Temperaturdaten, bei denen Lebensmittel gelagert wurden.
Daher ist die Erkennung von Gefahren und die Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit mit herkömmlichen Analysemethoden ziemlich schwierig, da sie mehr Zeit und Ressourcen verbrauchen und außerdem geschultes Personal zur Auswertung und große, zentralisierte Labors erfordern.
Um die oben genannten Nachteile zu überwinden, muss daher ein schnelles, zuverlässiges, empfindliches und tragbares System zum Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern wie Salmonellen entwickelt werden, das Echtzeitmessungen durchführt und die für die Lebensmittelsicherheit wichtigen Daten speichert.
Der technische Fortschritt, der durch die vorliegende Erfindung offenbart wird, überwindet die Einschränkungen und Nachteile bestehender und konventioneller Systeme und Methoden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein System zum Nachweis von durch Lebensmittel übertragbaren Krankheitserregern wie Salmonellen.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein System zum Nachweis von durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern wie Salmonellen bereitzustellen;
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Biosensor zur Verfügung zu stellen, der eine große Rolle beim Nachweis der Lebensmittelsicherheit spielen kann;
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Echtzeitmessung des Vorhandenseins einer Gefahr zu ermöglichen; und
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des Aptamers mit funktionellen Gold-Nanopartikeln.
In einer Ausführungsform ein System zum Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern wie Salmonellen, wobei das System Folgendes umfasst:

ein Behälter zur Aufbewahrung eines Lebensmittels, das zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit analysiert werden soll;
eine Vielzahl von Sensoren, die auf der Oberfläche des Behälters angeordnet sind, um Signale einer Vielzahl von Parametern zu messen, die mit der Sicherstellung des Echtzeit-Zustands des gelagerten Lebensmittels zusammenhängen, um die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten, wobei die Vielzahl von Parametern Lichtenergie, Wärmewert, pH-Änderung und Massenänderung umfasst;
einen Verstärker, der mit der Vielzahl von Sensoren verbunden ist, um die gemessenen Signale der Vielzahl von Parametern zu verstärken; und
einen Prozessor, der mit dem Verstärker verbunden ist, um das vom Verstärker empfangene analoge Signal in einen entsprechenden digitalen Wert umzuwandeln und das Signal zu verarbeiten, um den Echtzeitzustand des gelagerten Lebensmittels durch Vergleich mit einem Referenzwert zu identifizieren und das Vorhandensein des Krankheitserregers Salmonellen zu erkennen.

In einer Ausführungsform besteht die Mehrzahl der Sensoren aus einer Fotodiode, einem Thermistor, einer pH-Elektrode und einer Quarzelektrode.
In einer Ausführungsform misst die Photodiode die Lichtenergie, der Thermistor die Wärmeenergie, die pH-Elektrode die pH-Änderung und die Quarzelektrode die Massenänderung.
In einer Ausführungsform entfernt ein Signalaufbereitungsmodul das Rauschen aus dem verstärkten Signal, um die Qualität der Signale zu verbessern.
In einer Ausführungsform ist ein Analog-Digital-Wandler an das Signalaufbereitungsmodul angeschlossen, um das aufbereitete Analogsignal in ein Digitalsignal umzuwandeln.
In einer Ausführungsform ist ein Display mit dem Prozessor verbunden, um das umgewandelte Digitalsignal anzuzeigen und dem Benutzer das Vorhandensein des Salmonellenerregers zu verdeutlichen.
In einer Ausführungsform ist der Prozessor mit einem Komparator ausgestattet, der den von den mehreren Sensoren gemessenen Wert mit einem von einem Benutzer bereitgestellten Referenzwert vergleicht.
In einer Ausführungsform ist ein Benutzerschnittstellenmodul über ein Kommunikationsmodul mit dem Prozessor verbunden, um den Referenzwert der Vielzahl von Parametern bereitzustellen.
In einer Ausführungsform ist dem Kommunikationsmodul eine Datenbank zugeordnet, in der der Referenzwert der Vielzahl von Parametern gespeichert wird.
Um die Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung weiter zu verdeutlichen, wird eine genauere Beschreibung der Erfindung durch Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon, die in der beigefügten Figur dargestellt ist, gemacht werden. Es wird davon ausgegangen, dass diese Figur nur typische Ausführungsformen der Erfindung zeigt und daher nicht als Einschränkung ihres Umfangs zu betrachten ist. Die Erfindung wird mit zusätzlicher Spezifität und Detail mit der beigefügten Figur beschrieben und erläutert werden.
Figurenliste
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung mit Bezug auf die beigefügte Figur gelesen wird, in der gleiche Zeichen gleiche Teile in der Figur darstellen, wobei:

1 ein Blockdiagramm eines Systems zum Nachweis von durch Lebensmittel übertragbaren Krankheitserregern (Salmonellen) zeigt.

Der Fachmann wird verstehen, dass die Elemente in den Figur der Einfachheit halber dargestellt sind und nicht unbedingt maßstabsgetreu gezeichnet wurden. Die Flussdiagramme veranschaulichen beispielsweise das Verfahren anhand der wichtigsten Schritte, um das Verständnis der Aspekte der vorliegenden Offenbarung zu verbessern. Darüber hinaus kann es sein, dass eine oder mehrere Komponenten der Vorrichtung in den Figur durch herkömmliche Symbole dargestellt sind und dass die Figur nur die spezifischen Details zeigen, die für das Verständnis der Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung relevant sind, um die Figur nicht mit Details zu überfrachten, die für Fachleute, die mit der vorliegenden Beschreibung vertraut sind, leicht erkennbar sind.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Um das Verständnis der Erfindung zu fördern, wird nun auf die in der Figur dargestellte Ausführungsform Bezug genommen und diese mit bestimmten Worten beschrieben. Es versteht sich jedoch von selbst, dass damit keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, wobei solche Änderungen und weitere Modifikationen des dargestellten Systems und solche weiteren Anwendungen der darin dargestellten Grundsätze der Erfindung in Betracht gezogen werden, wie sie einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung normalerweise einfallen würden.
Es versteht sich für den Fachmann von selbst, dass die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung beispielhaft und erläuternd für die Erfindung sind und diese nicht einschränken sollen.
Wenn in dieser Beschreibung von „einem Aspekt“, „einem anderen Aspekt“ oder ähnlichem die Rede ist, bedeutet dies, dass ein bestimmtes Merkmal, eine bestimmte Struktur oder eine bestimmte Eigenschaft, die im Zusammenhang mit der Ausführungsform beschrieben wird, in mindestens einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Daher können sich die Ausdrücke „in einer Ausführungsform“, „in einer anderen Ausführungsform“ und ähnliche Ausdrücke in dieser Beschreibung alle auf dieselbe Ausführungsform beziehen, müssen es aber nicht.
Die Ausdrücke „umfasst“, „enthaltend“ oder andere Variationen davon sollen eine nicht ausschließliche Einbeziehung abdecken, so dass ein Verfahren oder eine Methode, die eine Liste von Schritten umfasst, nicht nur diese Schritte einschließt, sondern auch andere Schritte enthalten kann, die nicht ausdrücklich aufgeführt sind oder zu einem solchen Verfahren oder einer solchen Methode gehören. Ebenso schließen eine oder mehrere Vorrichtungen oder Teilsysteme oder Elemente oder Strukturen oder Komponenten, die mit „umfasst...a“ eingeleitet werden, nicht ohne weitere Einschränkungen die Existenz anderer Vorrichtungen oder anderer Teilsysteme oder anderer Elemente oder anderer Strukturen oder anderer Komponenten oder zusätzlicher Vorrichtungen oder zusätzlicher Teilsysteme oder zusätzlicher Elemente oder zusätzlicher Strukturen oder zusätzlicher Komponenten aus.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, allgemein verstanden wird. Das System, die Methoden und die Beispiele, die hier angegeben werden, dienen nur der Veranschaulichung und sind nicht als Einschränkung gedacht.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügte Figur im Detail beschrieben.
1 zeigt ein Blockdiagramm eines Systems (100) zum Nachweis von lebensmittelbedingten Krankheitserregern wie Salmonellen, wobei das System (100) Folgendes umfasst: einen Behälter (102), eine Vielzahl von Sensoren (104), eine Photodiode (104a), einen Thermistor (104b), eine pH-Elektrode (104c), eine Quarz-Elektrode (104d), einen Verstärker (106), einen Prozessor (108), ein Signalaufbereitungsmodul (108a), einen Analog-Digital-Wandler (108b), einen Komparator (108c), eine Anzeige (110), ein Benutzerschnittstellenmodul (112), eine Datenbank (114) und ein Kommunikationsmodul (116).
Der Behälter (102) enthält ein Lebensmittel, das zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit analysiert werden soll.
Das Lebensmittel wird nach dem folgenden Verfahren zubereitet:

Eine 0.1-M-Stammlösung von ABEI wird durch Lösen von ABEI (Sigma Aldrich, Merck) in 0.1-M-NaOH-Lösung ohne zusätzliche Filtration hergestellt und bei 4°C aufbewahrt. Eine HAuCl4-Stammlösung (0.2 % HAuCl4, w/v) wird durch Auflösen von HAuCl₄-4H₂O in gefiltertem Wasser hergestellt und bei 4 °C aufbewahrt. P-Iodophenol (PIP) (Reinheit > 98.0%) und Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP) (Reinheit > 98.0%) werden von Hitech Associates, (Delhi, Indien) gekauft. Chitosan wird von Hitech Associates von Sigma-Aldrich (Delhi-Indien) gekauft.

25% Glutaraldehyd (OHC (CH₂)₃CHO), FeCl₃-6H2O, NaOH, 1.6-Hexandiamin, wasserfreie Natriumessigsäure-Ableitung, Glykol, Ethanol waren von wissenschaftlicher Qualität und wurden von Hitech Associates (Delhi-Indien) gekauft. Das bei der Identifizierung der Wiege verwendete H₂O₂ wurde täglich neu aus 30% (v/v) H₂O₂ zusammengestellt.) Alle übrigen verwendeten Reagenzien sind von logischer Qualität. Das Geflügelfleisch wird auf dem Markt gekauft. Ultrareines Wasser wird mit einem Millipore Milli-Q-Gerät aufbereitet. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wird mit einem JEOL-Modell 2100HR-Gerät durchgeführt, das mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV arbeitet (Punjab- Chandigarh). Hell wahrnehmbare (UV-vis) Aufnahmespektren werden mit einem UV-2300-Spektrophotometer aufgenommen. FTIR-Spektren der aminofunktionalisierten NPs wurden mit einem Nicolet Nexus 470 Fourier-Change-Infrarot-Spektrophotometer unter Verwendung der KBr-Strategie aufgenommen. Das Pulver X-Beam Diffraction (XRD) Design wird geschätzt. Die Elektrophorese-Analyse wird mit einem Western-Elektrophoresegerät durchgeführt. Die CL-Schätzung erfolgt mit einem statischen Infusions-CL-Gerät, das aus einem CL-Identifikator des Modells MPI-M und einem multifunktionalen CL-Finder des Modells besteht.
Die Vielzahl von Sensoren (104) ist auf der Oberfläche des Behälters (102) angeordnet, um Signale einer Vielzahl von Parametern zu messen, die sich auf die Sicherstellung des Echtzeit-Zustands der gelagerten Lebensmittel beziehen, um die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten, wobei die Vielzahl von Parametern Lichtenergie, Wärmewert, pH-Änderung und Massenänderung umfasst. Die Mehrzahl der Sensoren (104) besteht entweder aus einer Fotodiode (104a) oder einem Thermistor (104b) oder einer pH-Elektrode (104c) oder einer Quarzelektrode (104d) oder einer Kombination davon. Die Fotodiode (104a) misst die Lichtenergie, der Thermistor (104b) misst die Wärmeenergie, die pH-Elektrode (104c) misst die pH-Änderung und die Quarzelektrode (104d) die Massenänderung.
Der Verstärker (106) ist mit der Vielzahl von Sensoren (104) verbunden, um die gemessenen Signale der Vielzahl von Parametern zu verstärken.
Der Prozessor (108) ist mit dem Verstärker (106) verbunden, um das vom Verstärker empfangene analoge Signal in einen entsprechenden digitalen Wert umzuwandeln und das Signal zu verarbeiten, um den Echtzeitzustand der gelagerten Lebensmittel durch Vergleich mit einem Referenzwert zu identifizieren und das Vorhandensein des Krankheitserregers Salmonellen zu erkennen. Das Signalkonditionierungsmodul (108a) entfernt das Rauschen aus dem verstärkten Signal, um die Qualität der Signale zu verbessern. Der Analog-Digital-Wandler (108b) ist mit dem Signalaufbereitungsmodul (108a) verbunden, um das aufbereitete Analogsignal in ein Digitalsignal umzuwandeln. Der Komparator (108c) ist in den Prozessor (108) integriert, um den von den mehreren Sensoren (104) erhaltenen Messwert mit einem von einem Benutzer bereitgestellten Referenzwert zu vergleichen und das Vorhandensein des Krankheitserregers Salmonellen zu erkennen.
Das Benutzerschnittstellenmodul (112) ist über ein Kommunikationsmodul (116) mit dem Prozessor (108) verbunden, um den Referenzwert der Vielzahl von Parametern bereitzustellen.
Die Datenbank (114) ist mit dem Kommunikationsmodul (116) verbunden, um den Referenzwert der Vielzahl von Parametern zu speichern.
Die Anzeige (110) ist mit dem Prozessor (108) verbunden, um das umgewandelte Digitalsignal anzuzeigen und dem Benutzer das Vorhandensein des Salmonellenerregers zu verdeutlichen.
Kulturmedien und Bakterienstämme: S. enterica ATCC /NCTC 14028, Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 6538, Escherichia coli (E. coli) ATCC 11229 , Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) ATCC 19111, Bacillus cereus (B. cereus) ATCC 10876 werden von Himedia (Delhi-Indien) und NCIM (Pune-Indien) beschafft. Die Mikroben werden in Luria-Bertani (LB) (BD Difco) angeimpft, bis eine OD600 von 0.3 erreicht ist. Die Zellen der Mikroorganismen werden bei 4000 U/min und 4 °C pelletiert und anschließend zweimal in 0.01 M Phosphat (PB) (pH 7.4) bei Raumtemperatur gewaschen. Die Planung der aminfunktionalisierten Fe₃O₄-Magnetnanopartikel (MNPs) und die Einfangsonde der aminfunktionalisierten Fe₃O₄-MNPs sind fertig. Momentan werden 6.5 g 1.6-Hexandiamin, 2 g wasserfreie Natriumessigsäure und 1 g FeCl₃-6H₂O zu 30 mL Glykol gegeben und die Lösung wird bei 50 °C kräftig gemischt, bis eine klare Lösung entsteht. Dann wird die Lösung für 6 Stunden in einen mit Teflon ausgekleideten Autoklaven bei 198 °C überführt. Der Autoklav wird normal auf Raumtemperatur abgekühlt, woraufhin die obere Flüssigkeit und die magnetischen Nanopartikel magnetisch isoliert werden. Die magnetischen Nanopartikel werden 2- bis 3-mal mit Ethanol und Wasser gewaschen, um das lösliche und ungebundene 1,6-Hexandiamin zu entfernen. Die so aufbereiteten Nanopartikel werden dann 12 Stunden lang bei 60 °C getrocknet, bevor die Merkmale identifiziert und weiter verwendet werden. Die Größe und Morphologie der MNP werden mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Die aus Aptameren gebildeten Fe₃O₄-MNPs werden mit der traditionellen Glutaraldehyd-Technik mit einigen Anpassungen hergestellt. Zunächst werden 5 mg MNPs in 5 ml PB durch 20-minütige Ultraschallsonation verteilt, dann werden 200 µl 25 % Glutaraldehyd zugegeben. Die Lösung wird 2 h lang bei 37 °C geschüttelt, und die MNP werden mehrmals mit PB gewaschen, anschließend wird das ungebundene Glutaraldehyd durch magnetische Trennung entfernt. Daraufhin wurden 500 µl von 1 mg mL-1 Avidin und 5 mL einer Suspension von Fe₃O₄-MNPs in PB gemischt und 12 Stunden lang bei 37 °C gebrütet und anschließend mehrfach mit PB gewaschen. Schließlich werden 150 µL eines 10 µM S.-Enteric-Aptamers und 5 mL der Avidin-gebildeten MNPs bei 37 °C für 2 h gebrütet. Die Fängersonden werden vor ihrer Verwendung zusätzlich mehrfach gewaschen.
Eine Mischung aus ABEI-AuNFs und Co2+ verbesserte die Signaltests: ABEI-AuNFs werden unter Verwendung von reduziertem HAuCl4 mit ABEI und Chitosan gemäß der Technik mit einigen Änderungen hergestellt. ABEI-AuNFs werden synthetisiert, indem zunächst 0.075 g Chitosan in 25 mL saurer Lösung (HAc, 2 % v/v) aufgelöst werden. Nach Zugabe von 3.0 mL der ABEI-Stammlösung wird das Gemisch auf 43 mL verdünnt und unter schnellem und kontinuierlichem Schütteln bis zum Sieden erwärmt. Dann werden 8 mL HAuCl4-Stammlösung tropfenweise zugegeben und die Mischung unter ständigem Rühren 1 h lang zum Sieden gebracht. Anschließend lässt man den Kolben normal auf Raumtemperatur abkühlen und bewahrt die Mischung zur weiteren Verwendung bei 4 °C auf. Die Streuungen des kolloidalen Goldes werden mittels TEM analysiert. Die anorganischen oder organischen unerwünschten Verbindungen werden durch ein Zentrifugations-Ultraschall-Dispergierverfahren vollständig entfernt, und der angesammelte Niederschlag wird zur TEM-Auswertung in Reinstwasser redispergiert. Die thiolierten hybridisierten komplementären ABEIAuNF-Signalsonden werden nach der Technik von Li und Cui mit einigen Änderungen hergestellt. Zunächst werden 5 ml der vorbereiteten Mischung 10 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert, und der Niederschlag wird mit 1.5 ml 30 mM Tris-HCl (pH 7.4) suspendiert, um ein ABEI-AuNFs-Kolloid zu erhalten. Auf diese Weise werden dem ABEI-AuNFs-Kolloid 45 µL eines 10 µM thiolierten Aptamer-Komplementärstrangs und 45 µL 10 µM TCEP zugesetzt und 24 h lang bei Raumtemperatur gebrütet. Dann wird die Mischung zusätzlich mit 100 µL 30 mM Co2+-Lösung versetzt und 30 min lang bei Raumtemperatur gehalten. Schließlich wird die so erhaltene Lösung 10 min lang bei einer Geschwindigkeit von 10000 rpm zentrifugiert. Nachdem der Überstand abgenommen wurde, wird der feine Niederschlag in 1.5 mL PB für die weitere Verwendung gestreut.
RCA-Reaktionssysteme: 20 µL von 10-6 M Aptamer-Groundwork-Test und 20 µL von 10-6 M Latch-Test werden in einem divergenten Zylinder gemischt. Dann werden 2.5 µL T4-DNA-Ligase (5.0 U µL-1) und 5.0 µL T4-DNA-Ligase-Träger in die DNA-Anordnung gegeben. Dieser Komplex wird bei 37 °C unter leichtem Schütteln für 120 min geschlüpft. Auf diese Weise wird die RCA-Antwort mit der Expansion von 10 µL Phi29 DNA-Polymerase-Träger, 2 µL BSA, 5 µL 5 mM dNTPs, 5 µL 10 U µL-1 Phi29 DNA-Polymerase bei 37 °C für 90 min durchgeführt. Nach der RCA-Reaktion wird die Anordnung für 15 min in die thermostatische Wasserdusche bei 75 °C getaucht, um die Verbindungen zu devitalisieren. Die Gelelektrophorese wird zum Nachweis der Test- und Polymerasegesteuerten Replikationseinheit verwendet. Die Gelelektrophorese wird mit 0.7%igen Agarosegelen und 1× TAE-Träger (0.04 mol L-1 Tris, 0.02 mol L-1 HAc, 0.01 mol L-1 EDTA, pH 8.0) bei Raumtemperatur unter einer konstanten Spannung von 100 V für 60 min durchgeführt, wobei 5 µL jedes Beispiels in die Pfade gestapelt werden.
Arbeitsstrategie: S.enetrica wird wie folgt bestimmt: Die Konzentration von S.enetrica wird durch Plattenzählung bestimmt, und 500 µL der Probenlösung, die verschiedene Konzentrationen von S.enetrica enthält, und 500 µL der vorbereiteten Fängersonde werden gemischt und 50 Minuten lang bei 37 °C gebrütet. Die Mischung wird mit magnetischer Kraft extrahiert und 3-4 Mal gewaschen. Dann werden 10 µl des RCA zugegeben und 50 Minuten lang gebrütet. Das nicht gebundene RCA wird durch magnetische Trennung entfernt. Von diesem Zeitpunkt an werden die Co2+-verbesserten Signalsonden zugegeben und 50 Minuten lang gebrütet. Schließlich wird die Lösung unter magnetischer Einwirkung extrahiert und zur CL-Identifizierung in PB gestreut. Bei einer komplexen CL-Detektion werden 100 µL der obigen Lösung und 100 µL des Detektionspuffers (0.2 mol L-1 H2O2, 0.05 mol L-1 PIP, 0.00095 mol L-1 Na₂HPO₄-2H₂O, 0.00405 mol L-1 NaH₂PO₄-12H₂O und 0.1 mol L-1 NaOH) in die Vertiefungen gegeben und die CL-Intensität nach 500 s bestimmt. Die Analyse wird dreimal durchgeführt und die Beobachtungen in dreifacher Ausfertigung gemacht.
Testbereitschaft: 5 g Geflügelfleischpaste werden in 10 ml PB gegeben und sterilisiert, und die Paste wird 15 Minuten lang bei 10000 U/min zentrifugiert, um die festen Partikel in der Testprobe zu entfernen. Dann werden mehrere Verdünnungen von S.enetrica zu der Geflügelfleischpaste hinzugefügt. Die erhaltene Probe wird zur Schätzung der relativen Standardabweichung (RSD) und der Wiederfindung des Testexperiments verwendet.
Ergebnisse und Diskussion: Diese Erfindung beinhaltet Fe3O4 MNPs als steigende Station für die CL-Identifizierung von S.enetrica basierend auf RCA und ABEI-AuNFs. Die Fe3O4 MNPs sind mit Aptameren von S. enterica für die Bildung von Einfangsonden funktionalisiert. In der Zwischenzeit wird der thiolierte hybridisierte komplementäre Strang auf der äußeren Schicht der ABEI-AuNFs verändert, um Signalsonden zu bilden. Der Aptamer-Primer-Komplex besteht aus zwei Bereichen, die je nach ihren unterschiedlichen Fähigkeiten als I und II bezeichnet werden.
Region I ist die Anordnung des Aptamers für S. enterica. Region II ist eine Primer-Sequenz, die nicht nur als Gerüst für die RCA-Antwort, sondern auch als Gerüst für die Ligation der Padlock-Sonde dienen kann. Nach der Hybridisierung und Ligation der Vorhängeschloss-Sonde könnte in Gegenwart von Phi29-DNA-Polymerase und dNTPs eine direkte RCA-Antwort gestartet werden, die viele Paar-Tandem-Wiederholungssequenzen liefert. Wenn S. enterica im System vorhanden ist, kann es zunächst von der Fängersonde eingefangen werden. Danach wird das RCA-Produkt in das Gerüst gegeben, und der Aptamer-Bereich des Produkts wird an die immobilisierten S.enterica in einem einzigartigen Sandwich-System gebunden, um die Tandem-Repeat-DNA-Gruppierungen direkt an die S.enetrica zu immobilisieren. Kurze Zeit später können die mit Co2+ aufgewerteten Signalsonden intermittierend auf den RCA-Produkten gesammelt werden, um die erkennbaren Ereignisse zu verstärken. Auf diese Weise wird nach der magnetischen Partitionierung mit einem äußeren Magneten eine außerordentlich eindeutige und empfindliche Identifizierung von S.enterica durch die Bewertung der CL-Signale der Co2+-verbesserten Signalsonden auf den RCA-Produkten erreicht.
Eigenschaften von Fe₃O₄-MNPs und ABEI-AuNPs: Die hier verwendeten aminfunktionalisierten Fe3O4-MNPs werden durch eine Ein-Topf-Kombination hergestellt. TEM-Bilder, FT-IR und XRD werden verwendet, um die inkorporierten MNPs zu beschreiben. Die MNPs haben eine gute Dispergierbarkeit und Morphologie mit einer typischen Größe von etwa 50 nm. Die solide IR-Bande bei 575 cm^-1 ist normal für die Fe-O-Schwingungen, während die Übertragungen um 1632, 1385 und 1130 cm^-1 von den aminfunktionalisierten Nanopartikeln gut mit denen von freiem 1,6-Hexadiamin koordiniert sind, was die Anwesenheit der freien Aminogruppe auf den aminfunktionalisierten Nanomaterialien zeigt. Die Ergebnisse aus FT-IR aufgedeckt, dass die MNPs mit Amino Versammlungen in der konstruierten Zyklus funktionalisiert wurden.
Das Beispiel der Pulver-Röntgenbeugung (XRD) zeigt deutliche Pinnacles, die die hohe Kristallinität der kombinierten Nanokristalle belegen. Die Positionen und Stärken der Spitzen stimmen gut mit der Norm JCPDS 82-1533 überein. Die ABEI-AuNFs werden durch Verminderung von HAuCl₄ mit ABEI und Chitosan gewonnen. HAuCl₄ wird zu blumenartigen Nanopartikeln vermindert, die durch das entsprechende Maß an ABEI und Chitosan erweitert werden. Die Morphologie der ABEI-AuNFs wird mittels TEM untersucht, die eine regelmäßige blumenartige Form mit einer typischen Größe von etwa 80 nm zeigte.
Einige Arten von Metallpartikeln, z. B. Cu²+, Co²+, Pb²+ und Ni²+, wurden zur Katalyse der CL-Reaktionen von Luminol und dessen Analogon mit H₂O₂ herangezogen, und die Katalyse dieser Metallpartikel wird untersucht und verglichen. Unter den Augen von PIP ist das CL-Rahmensystem im konsistenten Zustand angelegt, und die CL-Intensität folgt dem Befehl: Co2+ > Cu2+ > Pb2+ > Ni2+. Auf diese Weise wird Co2+ als Verstärker des vorgeschlagenen ABEI-AuNFs-H2O2-PIP-CL-Systems im konsistenten Zustand ausgewählt. Die CL-Intensität des mit Co2+ verstärkten Systems (a) ist 30 Mal höher als die des Systems ohne Co2+ (e).
Tatsächliches Aussehen des RCA-Artikels: Die RCA-Reaktion besteht aus zwei Zyklen. Im ersten Schritt wurde die 5'phosphorylierte markierte DNA (zirkulärer Rahmen) geplant. Zwei Verschlüsse der zirkulären Vorlage werden mit den Sequenzen des Primers (Teil des Aptamer-Vorläufer-Komplexes) entworfen. Die Mischung aus zirkulärem Template und Primer kann mit Hilfe der T4-Ligase eine geschlossene zirkuläre DNA einrahmen. Nach der Hybridisierung und Ligation des zirkulären Rahmens kann eine lineare RCA-Antwort unter den Augen der Phi29-DNA-Polymerase und dNTPs gestartet werden, wodurch eine Reihe von Tandem-Wiederholungssequenzen entsteht. Zur Überprüfung der RCA-Reaktion wird eine Agarosegel-Elektrophorese durchgeführt. Das Ergebnis ist eine glänzende Bande in Sichtweite der T4-Ligase und der Phi29-DNA-Polymerase. Gemäß dem Zeichen des Markers (250-15000 bp) (Pfad 1) wird die Menge der im RCA-Element enthaltenen Basen (Pfad 2 und 3) auf mehr als 15 000 bp geschätzt, was beweist, dass die RCA-Antwort tatsächlich stattgefunden hat. Im Vergleich zu den Pfaden 2 und 3 zeigten die Pfade 4 und 5 keine Banden ohne die Anwesenheit von T4-Ligase und Phi29-DNA-Polymerase, was zeigt, dass die RCA-Reaktion nicht ausgelöst wird. Außerdem wird die Mischung aus RCA-Produkt und S.enetrica zusätzlich durch Agarosegel-Elektrophorese beschrieben. Die beiden Pfade mit einem Marker von 250-15000 bp zeigten den S.enetrica-Komplex vor (Pfad 4 und 5) bzw. nach (Pfad 2 und 3) der Inkubation mit dem RCA-Produkt. Die Ergebnisse zeigten, dass das RCA-Produkt effektiv mit der Fängersonde und dem S.enetrica-Komplex kombiniert wurde, was wiederum die effektive Kombination von Fängersonde und S.enetrica zeigte.

Bewertung der Spezifität und analytische Ausschreibung: Um die Aussagekraft des vorgeschlagenen CL-Biosensors für S.enetrica zu bewerten, wurden die Auswirkungen einiger anderer pathogener Mikroorganismen, einschließlich E. coli (a), S. aureus (b), B. cereus (c) und L. monocytogenes (d), ausgewählt und unter ähnlichen Untersuchungsbedingungen wie für S.enetrica (e) getestet. Das ΔCL-Verhältnis wird verwendet, um die Aussagekraft des Aptasensors zu bewerten, wobei das ΔCL-Verhältnis gleich CL/CLA ist und CLA die CL-Intensität von S.enetrica bezeichnet. Je kleiner das CL-Verhältnis ist, desto geringer ist die CL-Veränderung, die durch die unspezifische Bindung verursacht wird. Die durch die unspezifische Bindung ausgelöste Reaktion ist im Gegensatz zu der durch die Zielmikroorganismen ausgelösten Reaktion nicht zu erkennen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die geschaffene Technik aufgrund der großen Affinität und des Explizitheitsvorteils des Aptamers eine große Selektivität für S. enterica aufweist. Die Erreichbarkeit und Reproduzierbarkeit des vorgeschlagenen Biosensors für den Einsatz in der Praxis wird zusätzlich durch die Bewertung von S.enetrica in Geflügelfleischproben bestätigt, indem die Testproben mit einem zuvor evaluierten Inokulum von S.enetrica versetzt werden. Die Probe wird mit der vorgeschlagenen Technik und der traditionellen Plattenzähltechnik untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst; es gab keinen massiven Unterschied zwischen den Ergebnissen, die mit der vorgeschlagenen Technik erzielt wurden, und denen, die mit der Standardplattenstrategie erzielt wurden. Die Wiederfindungsrate der CL-Schätzungen von aufgestockten Testproben liegt zwischen 97 % und 104 %, was die hohe Präzision der auf Aptameren basierenden CL-Identifizierung für S.enetrica belegt. Tabelle 1: Untersuchung der Geflügelfleischtestergebnisse, die mit der entwickelten Strategie und der traditionellen Plattenzähltechnik erzielt wurden.

Muster	Hinzugefügt Konzentration (cfu mL-1)	Plattenzählung von S. enterica (cfu mL-1)	Gemessene Konzentration (cfu mL-1)	Wiederherstellung Verhältnis erhalten durch der entwickelten Methode (%)
Geflügelfleisch	1.0×103	(0.95 ± 0.23)×103	(0.97 ± 0.19)×103	97.0%
Geflügelfleisch	1.0×104	(1.05 ± 0.18)×104	(1.02 ± 0.22)×104	102.0%
Geflügelfleisch	1.0×104	(0.98 ± 0.20)×104	(1.04 ± 0.13)×104	104.0%

Mit der Erfindung wurde ein einzigartiger Festphasen-RCA-Ansatz auf der Grundlage von Fe₃O₄-MNPs für einen Steady-State-CL-Assay zur Identifizierung von S.enetrica eingeführt. Ein Aptamer, das an der Oberfläche von Fe₃O₄ MNPs adsorbiert ist, kann zunächst das Ziel einfangen, bevor es sich mit RCA-Produkten zu einem Sandwich-Komplex verbindet. Die RCA-Produkte wurden dann mit Co2+/ABEI-AuNFs-cDNA-Signalsonden integriert, um CL-Signale zu erzeugen und zu verbessern.
Avidin, das sich an der Oberfläche von Fe3O4-MNPs anlagert, und Tandem-Wiederholungsbereiche können, wenn sie mit Signalsonden gepaart werden, das Signal während des Prozesses effizient verstärken. Darüber hinaus kann das Co2+/ABEI-AuNFs-Komplexpräparat die CL-Intensität erheblich steigern und so einen empfindlichen Nachweis ermöglichen. Das Steady-State-CL-System auf der Grundlage von ABEI-AuNFs-PIP-H₂O₂ und das Aptamer-Erkennungsmodell können beide zufällige Fehler verhindern und ermöglichen eine hohe Selektivität und Genauigkeit des Verfahrens. Magnetische Nanopartikel sind auch für eine schnelle Trennung und Reinigung nützlich, wodurch die gesamte Testzeit verkürzt wird. Abhängig von einer universellen Markierung von Co2+/ABEI-AuNFs-cDNA-Signalsonden und dem Ersatz durch andere Aptamere, die bei der Hochdurchsatzdetektion eingesetzt werden können, könnte dieser Test auch auf den schnellen Nachweis anderer lebensmittelbedingter pathogener Bakterien erweitert werden.
Die Figur und die vorangehende Beschreibung geben Beispiele für Ausführungsformen. Der Fachmann wird verstehen, dass eines oder mehrere der beschriebenen Elemente durchaus zu einem einzigen Funktionselement kombiniert werden können. Alternativ dazu können bestimmte Elemente in mehrere Funktionselemente aufgeteilt werden. Elemente aus einer Ausführungsform können einer anderen Ausführungsform hinzugefügt werden. So kann beispielsweise die Reihenfolge der hier beschriebenen Prozesse geändert werden und ist nicht auf die hier beschriebene Weise beschränkt. Darüber hinaus müssen die Aktionen eines Flussdiagramms nicht in der gezeigten Reihenfolge ausgeführt werden; auch müssen nicht unbedingt alle Aktionen durchgeführt werden. Auch können die Handlungen, die nicht von anderen Handlungen abhängig sind, parallel zu den anderen Handlungen ausgeführt werden. Der Umfang der Ausführungsformen ist durch diese spezifischen Beispiele keineswegs begrenzt. Zahlreiche Variationen sind möglich, unabhängig davon, ob sie in der Beschreibung explizit aufgeführt sind oder nicht, wie z. B. Unterschiede in der Struktur, den Abmessungen und der Verwendung von Materialien. Der Umfang der Ausführungsformen ist mindestens so groß wie in den folgenden Ansprüchen angegeben.
Vorteile, andere Vorzüge und Problemlösungen wurden oben im Hinblick auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben. Die Vorteile, Vorzüge, Problemlösungen und Komponenten, die dazu führen können, dass ein Vorteil, ein Nutzen oder eine Lösung auftritt oder ausgeprägter wird, sind jedoch nicht als kritisches, erforderliches oder wesentliches Merkmal oder Komponente eines oder aller Ansprüche zu verstehen.
Bezugszeichenliste

100: System zum Nachweis von durch Lebensmittel übertragbaren Krankheitserregern (Salmonellen).
102: Behälter
104: Eine Vielzahl von Sensoren
104a: Fotodiode
104b: Thermistor
104c: Ph-Elektrode
104d: Quarzelektrode
106: Verstärker
108: Prozessor
108a: Signalaufbereitungsmodul
108b: Analog-Digital-Wandler
108c: Komparator
110: Anzeige
112: Benutzerschnittstellenmodul
114: Datenbank
116: Kommunikationsmodul

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 8747775 B2 [0005]
US 6668240 B2 [0006]

Claims

System (100) zum Nachweis von durch Lebensmittel übertragenen Krankheitserregern (Salmonellen), wobei das System (100) Folgendes umfasst: einen Behälter (102) zur Aufbewahrung eines Lebensmittels, das zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit analysiert werden soll; eine Vielzahl von Sensoren (104), die auf der Oberfläche des Behälters (102) angeordnet sind, um Signale einer Vielzahl von Parametern zu messen, die sich auf die Sicherstellung des Echtzeitzustands des gelagerten Lebensmittels beziehen, um die Lebensmittelsicherheit zu gewährleisten, wobei die Vielzahl von Parametern Lichtenergie, Wärmewert, pH-Änderung und Massenänderung umfasst; einen Verstärker (106), der mit der Vielzahl von Sensoren (104) verbunden ist, um die gemessenen Signale der Vielzahl von Parametern zu verstärken; und einen Prozessor (108), der mit dem Verstärker (106) verbunden ist, um das vom Verstärker empfangene analoge Signal in einen entsprechenden digitalen Wert umzuwandeln und das Signal zu verarbeiten, um den Echtzeitzustand des gelagerten Lebensmittels durch Vergleich mit einem Referenzwert zu identifizieren und das Vorhandensein des Krankheitserregers Salmonellen zu erkennen.
System nach Anspruch 1, wobei die Mehrzahl der Sensoren (104) entweder eine Photodiode (104a) oder einen Thermistor (104b) oder eine pH-Elektrode (104c) oder eine Quarzelektrode (104d) oder eine Kombination davon umfasst.
System nach Anspruch 1, wobei die Fotodiode (104a) die Lichtenergie, der Thermistor (104b) die Wärmeenergie, die pH-Elektrode (104c) die pH-Änderung und die Quarzelektrode (104d) die Massenänderung messen.
System nach Anspruch 1, bei dem ein Signalaufbereitungsmodul (108a) das Rauschen aus dem verstärkten Signal entfernt, um die Qualität der Signale zu verbessern.
System nach Anspruch 4, wobei ein Analog-Digital-Wandler (108b) mit dem Signalaufbereitungsmodul (108a) verbunden ist, um das aufbereitete Analogsignal in ein Digitalsignal umzuwandeln.
System nach Anspruch 1, wobei eine Anzeige (110) mit dem Prozessor (108) verbunden ist, um das umgewandelte Digitalsignal anzuzeigen und das Vorhandensein des Krankheitserregers Salmonella als Benutzerreferenz darzustellen.
System nach Anspruch 1, wobei ein Komparator (108c) in dem Prozessor (108) zum Vergleichen des von der Vielzahl von Sensoren (104) erhaltenen Messwerts mit einem von einem Benutzer bereitgestellten Referenzwert ausgebildet ist und das Vorhandensein des Krankheitserregers anzeigt.
System nach Anspruch 1, wobei ein Benutzerschnittstellenmodul (112) über ein Kommunikationsmodul (116) mit dem Prozessor (108) verbunden ist, um den Referenzwert der Vielzahl von Parametern bereitzustellen.
System nach Anspruch 1, wobei dem Kommunikationsmodul (116) eine Datenbank (114) zum Speichern des Referenzwerts der mehreren Parameter zugeordnet ist.