DE202017107858U1 - Vorrichtung für ein Proteinkorona-Sensor-Array zur Früherkennung von Krankheiten - Google Patents

Vorrichtung für ein Proteinkorona-Sensor-Array zur Früherkennung von Krankheiten Download PDF

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Abstract

Sensor-Array mit einer Mehrzahl von Sensorelementen,wobei die Mehrzahl von Sensorelementen sich in wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheiden,wobei die Mehrzahl von Sensorelementen wenigstens zwei Sensorelemente aufweist, undwobei jedes Sensorelement dazu in der Lage ist, zum Erzeugen einer Biomolekülkorona-Signatur eine Mehrzahl von Biomolekülen in einer Probe zu binden, wobei jedes Sensorelement eine von den anderen verschiedene Biomolekülkorona-Signatur aufweist.

Description

  • QUERVERWEIS AUF VERWANDTE ANMELDUNGEN
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen US-Anmeldung 62/435,409 , die am 16. Dezember 2016 eingereicht wurde und deren Inhalt hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit aufgenommen ist.
  • ERKLÄRUNG ZU STAATLICH GEFÖRDERTER FORSCHUNG
  • N/A.
  • AUFNAHME DURCH BEZUGNAHME
  • Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, sind hierin durch Bezugnahme im gleichen Umfang enthalten, als ob jede einzelne Veröffentlichung, jedes einzelne Patent oder jede Patentanmeldung eigens und einzeln als durch Bezugnahme mit aufgenommen erklärt wäre.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das Gebiet der Erfindung bezieht sich auf Sensoranordnungen bzw. Sensor-Arrays (im Folgenden als Sensor-Arrays bezeichnet) zur Erkennung und zur Diagnose verschiedener Krankheitszustände, wobei die Erfindung insbesondere die Fähigkeit betrifft, Krankheiten oder Störungen zu diagnostizieren oder zu prognostizieren.
  • Je früher eine Krankheit diagnostiziert wird, desto wahrscheinlicher ist es, dass die Krankheit geheilt oder erfolgreich behandelt werden kann, was zu einer besseren Prognose für den Patienten führt. Wenn man eine Krankheit frühzeitig behandelt, kann man Probleme der Krankheit möglicherweise verhindern oder verzögern und die Ergebnisse für den Patienten verbessern, einschließlich der Verlängerung des Lebens und/oder der Lebensqualität des Patienten.
  • Eine frühzeitige Diagnose von Krebs ist entscheidend, da viele Krebsarten in ihren frühen Stadien erfolgreich behandelt werden können. Zum Beispiel liegt die 5-Jahres-Überlebensrate nach der frühzeitigen Diagnose und Behandlung von Brust-, Eierstock-und Lungenkrebs bei 90%, 90% und 70%, im Vergleich zu 15%, 5% und 10% bei Patienten mit Diagnosen in einem fortgeschrittenen Stadium der Krankheit. Sobald Krebszellen ihr Ursprungsgewebe verlassen, wird eine erfolgreiche Behandlung unter Verwendung verfügbarer etablierter Therapeutika sehr unwahrscheinlich. Obwohl das Erkennen der Warnzeichen von Krebs und das Ergreifen sofortiger Maßnahmen zu einer frühen Diagnose führen kann, zeigen die meisten Krebsarten (z.B. Lunge) ihre Symptome nur, nachdem Krebszellen bereits in das umgebende Gewebe eingedrungen sind und im ganzen Körper metastasiert sind. Zum Beispiel haben mehr als 60% der Patienten mit Brust-, Lungen-, Dickdarm- und Eierstockkrebs bis zur Erkennung ihrer Krebserkrankungen verdeckte oder sogar metastatische Kolonien. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung eines effektiven Ansatzes für die Früherkennung von Krebs. Ein solcher Ansatz sollte die Empfindlichkeit haben, einen Krebs in verschiedenen Stadien zu identifizieren, und die Spezifität, ein negatives Ergebnis zu erhalten, wenn die getestete Person frei von Krebs ist. Es gab umfangreiche Bemühungen, Verfahren zur Früherkennung von Krebs zu entwickeln; Obwohl eine große Anzahl von Risikofaktoren und Biomarkern eingeführt wurde, ist eine breit anwendbare Plattform für die Früherkennung einer breiten Spektrum von Krebserkrankungen schwer zu finden.
  • Da verschiedene Krebsarten die Zusammensetzung von Blutplasma - bereits in frühen Stadien - verändern können, ist die molekulare Blutanalyse für Biomarker ein vielversprechender Ansatz für die Früherkennung. Obwohl diese Vorgehensweise bereits für einige Krebsarten (wie PSA für Prostatakrebs) funktioniert hat, gibt es für die Mehrheit der Krebsarten noch keine spezifischen Biomarker für die Früherkennung. Für solche Krebsarten (z.B. der Lunge) wurde kein Kandidat der definierten zirkulierenden -Biomarker klinisch validiert, und sehr wenige haben das Spätstadium der klinischen Entwicklung. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Ansätzen, um die Fähigkeit zu verbessern, Krebs in sehr frühen Stadien zu erkennen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein sensitives, vielseitig einsetzbares Sensor-Array zur Erkennung eines breiten Spektrums von Krankheiten und Störungen und zur Bestimmung von Krankheitszuständen eines Probanden zur Verfügung. Die Einzigartigkeit der vorliegenden Erfindung besteht in der Kombination dieser Erkennung eines biomolekularen Fingerabdrucks aus einer Probe von einem Probanden und der Fähigkeit, für diesen Probanden einen Krankheitszustand im Gesundheitskontinuum zu bestimmen.
  • Gemäß einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Sensor-Array zur Verfügung, das eine Mehrzahl von Sensorelementen aufweist, wobei sich die Mehrzahl von Sensorelementen in wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheidet und die Mehrzahl von Sensorelementen wenigstens zwei Sensorelemente aufweist. Gemäß einigen Aspekten ist jedes Sensorelement in der Lage, mehrere Biomoleküle in einer Probe zu binden, um eine Biomolekülkorona-Signatur zu erzeugen, wobei jedes Sensorelement eine zu den anderen unterschiedliche Biomolekülkorona-Signatur hat. Gemäß einigen Aspekten ist das Sensorelement ein nanoskaliges Sensorelement.
  • Gemäß einigen Aspekten erzeugt die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Biomolekülkorona-Signaturen, wenn sie von der Probe kontaktiert werden, wobei die Kombination der Mehrzahl von Biomolekülkorona-Signaturen einen Biomolekül-Fingerabdruck für die Probe erzeugt.
  • Gemäß einigen Aspekten sind die Sensorelemente mit einem Substrat verbunden.
  • Gemäß einigen Aspekten sind die Sensorelemente diskrete Elemente (Abschnitte) auf einem Substrat, einer Platte oder einem Chip mit topologischen und funktionellen Unterschieden, wobei jedes einzelne Element (Abschnitt) eine unterschiedliche Biomolekülkorona-Signatur erzeugt. Das Substrat, der Chip oder das Array selbst bilden zusammen das Sensor-Array und stellen den Biomolekül-Fingerabdruck für die Probe bereit.
  • Gemäß einigen Aspekten stellt die Erfindung Verfahren zum Erkennen eines Krankheitszustands eines Probanden zur Verfügung, umfassend: Einholen einer Probe von dem Probanden; Kontaktieren der Probe mit einem Sensor-Array, wobei das Sensor-Array mehrere Sensorelemente umfasst, wobei sich die mehreren Sensorelemente in wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheiden und die mehreren Sensorelemente wenigstens zwei Sensorelemente umfassen, und Bestimmen eines Biomolekül-Fingerabdrucks, der mit der Probe assoziiert ist, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck den Krankheitszustand des Probanden unterscheiden kann. Gemäß einigen Aspekten umfasst das Verfahren ferner das Vergleichen des Biomolekül-Fingerabdrucks der Probe mit einer Gruppe von Biomolekül-Fingerabdrücken, die mit einer Mehrzahl von Krankheitszuständen assoziiert sind, um zu bestimmen, welcher Krankheitszustand mit der Probe assoziiert ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen eines Biomolekül-Fingerabdrucks zur Verfügung, der mit wenigstens einem Krankheitszustand oder wenigstens einer Krankheit oder einer Störung assoziiert ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Einholen von Proben von wenigstens zwei Probanden, bei denen der Krankheitszustand oder die wenigstens eine Krankheit oder Störung diagnostiziert ist; (b) Kontaktieren jeder Probe durch ein hierin beschriebenes Sensor-Array, und (c) Bestimmen eines Biomolekül-Fingerabdrucks für das Sensor-Array, der mit dem Krankheitszustand oder der wenigstens einen Krankheit oder Störung assoziiert ist. Gemäß einigen Aspekten umfasst Schritt (c) ferner das Erkennen der Zusammensetzung der Biomolekülkorona jedes Sensorelements, wobei die Kombination der Zusammensetzung jeder Biomolekülkorona zwischen den verschiedenen Sensorelementen den mit der Probe assoziierten Biomolekül-Fingerabdruck erzeugt. Gemäß anderen Aspekten umfasst Schritt (c) das Dissoziieren des Biomolekül-Fingerabdrucks von jedem Sensorelement und das Prüfen der Mehrzahl von Biomolekülen jeder Biomolekülkorona, wobei die Kombination von den geprüften Biomolekülen den Biomolekül-Fingerabdruck erzeugt.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Krankheit oder Störung in einem Probanden zur Verfügung, umfassend das Einholen einer Probe von einem Probanden; in Kontakt bringen der Probe mit einem hierin beschriebenen Sensor-Array, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu erzeugen, Vergleichen des Biomolekül-Fingerabdrucks mit einer Gruppe von Biomolekül-Fingerabdrücken, die mit einer Mehrzahl von Krankheiten oder Störungen assoziiert sind; und Diagnostizieren oder Prognostizieren der Krankheit oder Störung.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines Biomarker-Musters zur Verfügung, das mit einer Krankheit oder Störung assoziiert ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Einholen von Proben von wenigstens zwei Probanden, bei denen die Krankheit oder Störung diagnostiziert wurde, und wenigstens zwei Kontrollpersonen ; (b) Kontaktieren jeder Probe mit einem Sensor-Array, um eine Mehrzahl von Biomolekülkoronen für jeden Probanden zu erzeugen, und (c) Vergleichen der Zusammensetzung der Mehrzahl von Biomolekülkoronen der Probanden mit der Erkrankung oder Störung mit der Zusammensetzung der Mehrzahl von Biomolekülkoronen der Kontroll-Probanden, um ein Muster von Biomarkern zu bestimmen, die mit der Krankheit oder Störung assoziiert sind.
  • Gemäß einigen Aspekten ist die Krankheit oder Störung Krebs, eine endokrine Störung, eine kardiovaskuläre Erkrankung, eine entzündliche Erkrankung oder eine neurologische Erkrankung.
  • Gemäß einem Aspekt ist die Krankheit oder Störung Krebs.
  • In einem anderen Aspekt ist die Krankheit oder Störung eine kardiovaskuläre Erkrankung. Gemäß einem Aspekt ist die kardiovaskuläre Erkrankung eine Koronararterienerkrankung (KHK).
  • Gemäß einem weiteren Aspekt ist die Krankheit oder Störung eine neurologische Störung. Gemäß einem Aspekt ist die neurologische Störung die Alzheimer-Krankheit.
  • Gemäß einigen Aspekten stellt die Erfindung ein Kit zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Krankheit oder Störung zur Verfügung, wobei das Kit umfasst: ein Sensor-Array, das eine Mehrzahl von nanoskaligen Sensorelementen aufweist, wobei sich die Mehrzahl von Sensorelementen in wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheiden und die Mehrzahl von Sensorelementen wenigstens zwei Sensorelemente aufweist.
  • Gemäß anderen Aspekten stellt die Erfindung ein Kit zum Bestimmen und/oder Erkennen von wenigstens einem Biomarker zur Verfügung, der mit einer Krankheit oder Störung assoziiert ist, umfassend wenigstens eine Sensor-Array mit einer Mehrzahl von Sensorelementen, wobei sich die Mehrzahl von Sensorelementen wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheiden und die Mehrzahl von Sensorelementen wenigstens zwei Sensorelemente aufweist.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Unterscheiden von Zuständen einer komplexen biologischen Probe eines Probanden unter Verwendung einer Mehrzahl von Partikeln mit Oberflächen mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften bereit, wobei das Verfahren umfasst: Exponieren der komplexen biologischen Probe der Mehrzahl von Partikel, um eine Bindung von Proteinen der komplexen biologischen Probe an die Mehrzahl von Partikeln ermöglichen, wobei Protein-Bindungsmuster der Mehrzahl von Partikeln basierend auf den physikochemischen Eigenschaften der Oberflächen der Partikel unterschiedlich sind; Definieren eines Biomolekül-Fingerabdruck-Vertreters für Proteine, der sich an die Mehrzahl von Partikeln bindet; und Verknüpfen des Biomolekül-Fingerabdrucks mit einem biologischen Zustand des Probanden.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Sensor-Array bereit, das eine Mehrzahl von Partikeln mit Oberflächen mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften aufweist, wobei sich Proteine einer komplexen biologischen Probe beim Exponieren der komplexen biologischen Probe der Mehrzahl von Partikeln an die Mehrzahl von Partikeln binden, wobei ein Bindungsmuster der Proteine unter der Mehrzahl von Partikeln von der physikochemischen Eigenschaft einer Oberfläche des Partikels abhängt.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Sensor-Array bereit, das eine Mehrzahl von Liposomen aufweist, wobei sich die Mehrzahl von Liposomen in wenigstens einer Proteinbindungseigenschaft unterscheiden, die durch eine lipidbasierte Oberfläche jedes Liposoms definiert ist; wobei die lipidbasierte Oberfläche jedes Liposoms eine Teilmenge von Proteinen einer Probe an einer Lipid-Protein-Grenzfläche kontaktiert, wodurch die Teilmenge von Proteinen unter Erzeugung eines Proteinbindungsmusters gebunden wird; wobei das Proteinbindungsmuster eines ersten Liposoms sich von dem Proteinbindungsmuster eines zweiten Liposoms unterscheidet, das sich von dem ersten Liposom in der wenigstens einen Proteinbindungseigenschaft unterscheidet.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren eines biologischen Zustands eines Probanden unter Verwendung einer Mehrzahl von Liposomen bereit, die sich in wenigstens einer Proteinbindungseigenschaft unterscheiden, die durch eine lipidbasierte Oberfläche jedes Liposoms definiert ist, wobei das Verfahren umfasst: Exponieren der Probe der Mehrzahl von Liposomen, um das Binden von Proteinen der Probe an die Mehrzahl von Liposomen zu erlauben, wobei sich ein Proteinbindungsmuster unter Liposomen mit unterschiedlichen Proteinbindungseigenschaften unterscheidet; Trennen der Proteine von den Liposomen; Definieren eines Biomolekül-Fingerabdrucks der Proteine, die von den Liposomen getrennt sind; und Verknüpfen des Biomolekül-Fingerabdrucks mit einem Zustand der komplexen biologischen Probe des Probanden.
  • Die vorstehenden und andere Aspekte sowie Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung. In der Beschreibung wird auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen, die einen Teil davon bilden und in denen zur Veranschaulichung eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung gezeigt ist. Eine solche Ausführungsform stellt jedoch nicht notwendigerweise den vollen Umfang der Erfindung dar. Daher wird zur Beschreibung des Umfangs der Erfindung auf die Ansprüche verwiesen.
  • Figurenliste
  • Die Patent- oder Anmeldungsakte enthält wenigstens eine in Farbe ausgeführte Zeichnung. Kopien dieser Patent- oder Patentanmeldungsveröffentlichung mit Farbzeichnung(en) werden vom Amt auf Anfrage und Zahlung der erforderlichen Gebühr zur Verfügung gestellt.
    • 1. Ein Schema einer Ausführungsform, die ein Beispiel des Studiendesigns des Proteinkorona-Muster-Ansatz-Ansatzes für die Krebserkennung zeigt. Es werden drei Arten von Liposomen mit Plasma von gesunden Menschen und Krebspatienten inkubiert, und das Proteinkorona-Muster-Ansatz, das sich auf jedem Liposom im Plasma jedes Probanden (gesunde und mit verschiedenen Krebsarten) bildet, wird durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (auch Liquid-Chromatographie-Massenspektrometrie/Massenspektometrie, LC-MS/MS) charakterisiert. Die Bildung von Proteinkoronen an den drei Liposomen führt zur Anreicherung eines überlappenden, aber unterschiedlichen Pools ausgewählter Plasmaproteine, und die angereicherten Proteine sind die Grundlagen für die anschließende multivariate Analyse. Über Klassifikationsansätze werden die wichtigen Proteine in den Korona-Mustern identifiziert und dazu verwendet, Krebserkrankungen unter Verwendung sowohl von Blindplasmen als auch von Kohortenproben vorherzusagen, um die Genauigkeit des Multi-Nanopartikel-Proteinkorona-Nanosystems zu prüfen. Es wurden 29 menschliche Proben (25 Krebspatienten, d.h. 5 Patienten pro 5 Krebsarten und 4 gesunde Probanden), die 261 verschiedene LC-MS/MS-Durchläufe (3 Liposomen, 29 Probanden, 3 Replikate) repräsentieren, verwendet, um ein Klassifikationsmodell zu trainieren. Es wurden 16 menschliche Proben (3 Patienten pro 5 Krebsarten und 1 gesunder Proband) von Blindplasma und 144 verschiedene LC-MS/MS-Durchläufe (3 Liposomen, 16 Probanden, 3 Replikate) zur Krebsvorhersage verwendet, d.h. zum Testen des Klassifikationsmodells. Es wurden 15 menschliche Proben (5 Patienten pro 3 Krebsarten) von Kohortenplasma, die 135 verschiedene LC-MS/MS-Durchläufe (3 Liposomen, 15 Probanden, 3 Replikate) repräsentieren, ebenfalls für eine sehr frühe Krebsvorhersage verwendet.
    • 2A. TEM (Transmissionselektronenmikroskopie)-Aufnahmen von Liposomen mit ihren Größenverteilungsprofilen.
    • 2B. Physikochemische Eigenschaften verschiedener Liposomen vor und nach Wechselwirkungen mit menschlichem Plasma von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen. DLS- und Zeta-Potential-Daten über verschiedene Liposomen vor Wechselwirkungen mit menschlichem Plasma und Korona-Komplexen, die frei von überschüssigem Plasma sind, erhalten nach der Inkubation mit Plasma von gesunden und Krebspatienten (PDI: Polydispersitätsindex aus einer Kumulantenanpassung).
    • 2C. Eine Klassifikation der identifizierten Korona-Proteine aus Liposomen nach ihren physiologischen Funktionen im menschlichen Plasma gesunder Personen und von Patienten mit verschiedenen Krebsarten (die dargestellten Daten spiegeln eine Berechnung aus fünf biologischen Plasmen pro Gruppe und drei technischen Wiederholungen pro Plasma wider).
    • 3A. Eine Klassifikation von durch Sensor-Arrayelemente identifizierten Koronen entsprechend ihrer physiologischen Funktionen, einschließlich der akuten Phase, in menschlichem Plasma von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Krebsarten.
    • 3B. Eine Klassifikation von durch Sensor-Arrayelemente identifizierten Koronen entsprechend ihren physiologischen Funktionen, einschließlich einer Koagulation, in menschlichem Plasma von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Krebsarten.
    • 3C. Eine Klassifikation von durch Sensor-Arrayelemente identifizierten Koronen entsprechend ihren physiologischen Funktionen, einschließlich Immunglobuline, in menschlichem Plasma von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Krebsarten.
    • 3D. Eine Klassifikation von durch Sensor-Arrayelemente identifizierten Koronen entsprechend ihren physiologischen Funktionen, einschließlich Lipoproteine, in menschlichem Plasma von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Krebsarten.
    • 3E. Eine Klassifikation von durch Sensor-Array-Elementen identifizierten Koronen gemäß ihren physiologischen Funktionen, einschließlich des Austretens von Gewebe, in menschliches Plasma von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Krebsarten.
    • 3F. Eine Klassifikation von durch Sensor-Array-Elemente identifizierten Koronen gemäß ihren physiologischen Funktionen, einschließlich des Austretens von Gewebe in menschliches Plasma von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Krebsarten.
    • 3G. Eine Klassifikation von identifizierten Koronen durch Sensor-Arrays-Elemente gemäß ihren physiologischen Funktionen, einschließlich des Austretens von Gewebe, in menschliches Plasma von gesunden Probanden und Patienten mit verschiedenen Krebsarten.
    • 4A. Die Entdeckung eines Prädiktors und der Beitrag von jedem einzelnen Prädiktor zur Trennung jeder Klasse durch eine PLS-Diskriminierungsanalyse. Die Untersuchung des Prädiktors nach gewichtetem VIP wurde durchgeführt, indem die bewerteten Variablen einzeln dem PLS-DA-Modell (Partial Least Squares Discriminant Analysis-Modell bzw. Diskriminanzanalyse mit kleinsten partiellen Quadraten-Modell) hinzugefügt wurden und der Klassifikationsfehler für die interne Kreuzvalidierung berechnet wurde (10-fach). Das Verringern des Klassifikationsfehlers führte zur Feststellung einer minimalen Menge von 69 Prädiktoren mit der höchstmöglichen Wichtigkeit zum Trennen jeder Klasse von den anderen. Der Beitrag jedes einzelnen Markers zur Trennung jeder Klasse basierend auf der PLS-Diskriminierungsanalyse. Ein VIP-Ranking-Diagramm der Marker von 69 für ihren Beitrag zur Trennung jeder Klasse von der PLS-Diskriminierungsanalyse ausgewählten Variablen. Der VIP-Score > 1 zeigt an, dass ein wichtiges Protein zu einer guten Vorhersage der Klassenzugehörigkeit führt, wohingegen Variablen mit einem VIP-Score < 1 unwichtige Proteine für jede Klasse anzeigen.
    • 4B. Die Ergebnisse für die 69 Variablen für ein Glioblastom.
    • 4C. Die VIP-Werte für die 69 Variablen für ein Meningiom.
    • 4D. Die VIP-Werte für die 69 Variablen für Lungenkrebs.
    • 4E. Die VIP-Werte für die 69 Variablen für ein Myelom an.
    • 4F. Die VIP-Werte für die 69 Variablen für ein Pankreaskarzinom.
    • 5A. Ein PLS-DA-Diagramm, das die Trennung von verschiedenen Krebsproben untereinander und von Kontrollproben zeigt. Ein PLS-Score-Diagramm, das mithilfe einer PLS-Toolbox erstellt wurde und die Objekte in den Unterraum projiziert, der durch die erste, zweite und dritte latente Variable des Modells erstellt wurde.
    • 5B. Ein PLS-DA-Diagramm, das die Trennung von verschiedenen Krebsproben untereinander und von Kontrollproben zeigt. Objekte, auf denen die 4. und 5. latente Variable des Modells angezeigt werden. Wie zu erkennen ist, wurden Meningiom- und Glioblastom-Fälle nicht angemessen in drei Dimensionen getrennt, sie können aber in der vierten und fünften Dimension des PLS-Modells getrennt werden.
    • 5C. Eine Assoziationstabelle eines CPANN mit allen Variablen und ausgewählten Variablen. (C) Die Assoziationstabelle, die durch Training eines CPANN-Netzwerks (8 × 8 Neuronen) unter Verwendung des gesamten Datensatzes (1823 Variablen) erhalten wurde. Die Assoziationsqualität ist nicht gut und es bestehen bei verschiedenen Arten von Krebs Konflikte bezüglich der Assoziation.
    • 5D. Eine Assoziationstabelle durch Training eines CPANN-Netzwerks (8x8 Neuronen) unter Verwendung von 69 Variablen. Hochdimensionale Eingabevektoren (Samples) sind auf einem zweidimensionalen Netzwerk von Neuronen abgebildet, wobei die Ähnlichkeit und Topologie erhalten bleiben. Farben zeigen die Ähnlichkeit eines Neurons mit einem bestimmten Typ eines Eingabevektors (Klassentyp) an. Diese Tabelle zeigt auch die Wichtigkeit des Prädiktorauswahlschritts und den Effekt der Löschung von nichtinformativen und irrelevanten Prädiktoren auf die Modellqualität.
    • 5E. Ein Dendrogramm, das die 51 Proteine zeigt, die als fähig zur Unterscheidung zwischen den sechs Krebsgruppen identifiziert wurden.
    • 5F. Die 51 Proteine, die als fähig identifiziert wurden, zwischen den sechs Gruppen zu unterscheiden, sind in einer „Heatmap“ dargestellt, die mit einem unüberwachten Cluster-Algorithmus (Agglomerative HCA mit weitestgehender Nachbarbindung) generiert wurde. Die visuelle Untersuchung von sowohl dem Dendrogramm (5E) als auch der Heatmap (5F) zeigt eine krebsspezifische Proteinkorona-Signatur und eine klare Clusterbildung von sechs Gruppen von Proben (fünf Gruppen von Krebsproben plus normale Proben) und auch erwartete Ähnlichkeiten unter fünf Patienten aus jeder Gruppe. Die Heatmap zeigt auch wesentliche Unterschiede in den Mustern von Variablen (Markern) verschiedener Krebsarten (jede Spalte stellt einen Patienten dar, und jede Zeile stellt ein Protein dar). Höhere und niedrigere Proteinspiegel sind in Rot bzw. Grün angegeben.
    • 6A. Ein PLS-Score-Diagramm, das durch die Berücksichtigung von 69 wichtigen Markern erhalten wird, die die Kohortenobjekte in den Unterraum projizieren, der durch die erste und zweite latente Variable des Modells erzeugt wird.
    • 6B. Ein PLS-DA-Modell mit hervorragenden Statistiken, das unter Verwendung von 8 Variablen erzeugt wird, die die Kohortenobjekte in den Unterraum projizieren, der durch die erste und zweite latente Variable des Modells erzeugt wird.
    • 6C. Die Assoziationstabelle, die sich durch Training eines CPANN-Netzwerks (8 × 8 Neuronen) unter Verwendung von 69 wichtigen Markern erhalten lässt.
    • 6D. Die Assoziationstabelle, die sich durch Training eines CPANN-Netzwerks (8 × 8 Neuronen) mit nur 8 Markern ohne Fehlklassifikationen erhalten lässt. Probennummern sind auf jedem Neuron angegeben.
    • 7A. Eine Schematische Darstellung des Studienumrisses. Eine informative Variablenauswahl und Klassifikationsmodellbildung.
    • 7B. Eine Auflistung von Proteinname und ID von 69 ausgewählten Variablen. Einige der Proteine waren in der Proteinkorona von mehr als einem Liposom vorhanden (DOPG, DOTAP und CHOL werden durch folgende Textformatierungen bezeichnet: Kursiv und Unterstreichung, Fettdruck und einfache Formatierung).
    • 7C. Krankheitsspezifische Biomarker, die in den vorgeschlagenen Modellen als signifikante Variablen enthalten sind.
    • 8A. Eine ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic-Kurve), die von der PLS-DA basierend auf den 69 höchstbewerteten Variablen für die Kontrolle abgeleitet wird. Eine ROC-Kurve der Empfindlichkeit (richtig positiv bzw. True Positive Rate, Y-Achse) gegenüber einer 1 - Spezifität (falsch positiv bzw. False Positive Rate, X-Achse) basierend auf einer PLS-DA, die sich auf die 69 Marker mit dem höchsten Beitrag für sechs Klassen (Kontrolle, Glioblastom, Meningiom, Myelom, Pankreas, Lunge) stützt.
    • 8B. Eine ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic-Kurve), die von der PLS-DA basierend auf den 69 höchstbewerteten Variablen für das Glioblastom abgeleitet wird. Eine ROC-Kurve der Empfindlichkeit (richtig positiv bzw. True Positive Rate, Y-Achse) gegenüber einer 1 - Spezifität (falsch positiv bzw. False Positive Rate, X-Achse) basierend auf einer PLS-DA, die sich auf die 69 Marker mit dem höchsten Beitrag für sechs Klassen (Kontrolle, Glioblastom, Meningiom, Myelom, Pankreas, Lunge) stützt.
    • 8C. Eine ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic-Kurve), die von der PLS-DA basierend auf den 69 höchstbewerteten Variablen für das Meningiom abgeleitet wird. Eine ROC-Kurve der Empfindlichkeit (richtig positiv bzw. True Positive Rate, Y-Achse) gegenüber einer 1 - Spezifität (falsch positiv bzw. False Positive Rate, X-Achse) basierend auf einer PLS-DA, die sich auf die 69 Marker mit dem höchsten Beitrag für sechs Klassen (Kontrolle, Glioblastom, Meningiom, Myelom, Pankreas, Lunge) stützt.
    • 8D. Eine ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic-Kurve), die von der PLS-DA basierend auf den 69 höchstbewerteten Variablen für das Myelom. Ein ROC-Diagramm der Empfindlichkeit (richtig positiv bzw. True Positive Rate, Y-Achse) gegenüber einer 1 - Spezifität (falsch positiv bzw. False Positive Rate, X-Achse) basierend auf einer PLS-DA, die sich auf die 69 Marker mit dem höchsten Beitrag für sechs Klassen (Kontrolle, Glioblastom, Meningiom, Myelom, Pankreas, Lunge) stützt.
    • 8E. Eine ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic-Kurve), die von der PLS-DA basierend auf den 69 höchstbewerteten Variablen für das Pankreas abgeleitet wird. Ein ROC-Diagramm der Empfindlichkeit (richtig positiv bzw. True Positive Rate, Y-Achse) gegenüber einer 1 - Spezifität (falsch positiv bzw. False Positive Rate, X-Achse) basierend auf einer PLS-DA, die sich auf die 69 Marker mit dem höchsten Beitrag für sechs Klassen (Kontrolle, Glioblastom, Meningiom, Myelom, Pankreas, Lunge) stützt.
    • 8F. Eine ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic), die von der PLS-DA basierend auf den 69 höchstbewerteten Variablen für die Lunge ab. ROC-Diagramm der Empfindlichkeit (True Positive Rate, Y-Achse) versus 1 - Spezifität (False Positive Rate, X-Achse) basierend auf einem PLS-DA auf Basis der 69 Marker mit dem höchsten Beitrag für sechs Klassen (Kontrolle, Glioblastom, Meningiom, Myelom, Pankreas, Lunge) stützt.
    • 9A. Eine schematische Darstellung der Dekonvolution einer dreidimensionalen Datenmatrix in eine zweidimensionale Matrix.
    • 9B. Eine Assoziationstabelle, die vom CPANN (14x14) erhalten wird und mit 90 Proben (Replikaten) mit allen 1823 Variablen trainiert wird. Die Probennummern sind auf jedem Neuron angegeben. Die Neuronenfarbe (das zugewiesene Label) wird basierend auf der Ähnlichkeit zwischen dem Klassenlabel (ein 6 × 1-Binärvektor) und dem Gewichtsvektor in der Ausgabeschicht des entsprechenden Neurons entschieden. Trotz der Verwendung aller Biomarker gibt es einige deutliche Ähnlichkeiten zwischen Proben der gleichen Krebsklasse. Die replizierten Proben werden auch auf benachbarte oder den gleichen Neuronen abgebildet.
    • 9C. Klassifikationsfehler der CPANN-Abbildung, der bei einer anderen Abbildungsgröße unter Verwendung einer 10-fachen Kreuzvalidierung berechnet wurde.
    • 9D. Das CPANN-Netzwerk, das 69 Gewichtsschichten hat, was der Anzahl der Variablen entspricht, die zum Trainieren des Modells verwendet werden. Die i-te Gewichtsschicht spiegelt die Wirkung der i-ten Variable (Biomarker) auf das Muster der Assoziationstabelle wider.
    • 9E. Die Korrelation der Assoziationstabelle und der 69 Gewichtsschichten (Gewichtskarten) kann berechnet werden und könnte dazu beitragen, die Biomarker für jede Krebsklasse zu identifizieren. Es kann auch visuell entschieden werden; Die Ähnlichkeit kann durch den Absolutwert des Korrelationskoeffizienten zweier Karten überwacht werden.
    • 9F. Die Korrelation der Assoziationstabelle und der 69 Gewichtsschichten (Gewichtskarten), die berechnet werden und dazu beitragen kann, die Biomarker für jede Krebsklasse zu identifizieren. Es kann auch visuell entschieden werden; die Ähnlichkeit kann durch den Absolutwert des Korrelationskoeffizienten zweier Karten überwacht werden.
    • 10A. Die Protein-Wichtigkeit für die Klassifikation vs. dem Anteil der Proteine, die an dem Proteinkorona-Nanosystem adsorbiert sind. Die Felder (a) - (c) veranschaulichen die Wichtigkeit der beobachteten Protein-Liposom-Wechselwirkungen („Variablen“) bei der Vorhersage spezifischer Krebsarten. Proteine werden nach ihren physiologischen Funktionen gruppiert. Die Felder (d) - (f) veranschaulichen den Prozentsatz an Proteinen, die an jedem Liposom adsorbiert sind. Die Protein-Liposom-Gruppen, die sich als relevant für die Vorhersage eines Krebses herausstellen, sind in Krebsarten sehr unterschiedlich (Gruppes (a) - (c)). Darüber hinaus ist diese Unterscheidung wesentlich ausgeprägter als die Varianz des Prozentsatzes an Proteinen, die an den Liposomen über diese Krebsarten adsorbiert sind (Tafeln (d) - (f)).
    • 10B. Ein Venn-Diagramm, das die Anzahl der in der Korona-Zusammensetzung jedes Liposoms identifizierten einzigartigen Proteine und deren Kombinationen zeigt (die Tabelle rechts stellt die gleichen Daten numerisch dar).
    • 10C. Die Variablen-Wichtigkeit für die Klassifikation. Jede Zeile zeigt die Wichtigkeit eines spezifischen Proteins an. Die drei Punkte auf jeder Zeile entsprechen der Wichtigkeit der beobachteten Wechselwirkung mit jedem der drei Liposomen. Die horizontale Linien, die sich über die Punkte erstrecken, zeigen das 25. und 75. Perzentil der Wichtigkeit von Klassifikatoren an, die auf 1000 zufälligen Ziehungen des Trainingssatzes aus den Daten trainiert wurden. Diese Konfidenzintervalle zeigen die „Stabilität“ des trainierten Modells im Hinblick auf die Protein-Liposom-Wechselwirkungen an, auf die es sich in Bezug auf zufällige Datenziehungen entscheidend stützt.
    • 11. Die gewichteten Durchschnittswerte von Protein-Liposomen-Wechselwirkungen klassifizieren Krebsarten. Die Verteilung der absoluten Z-Scores für jede Patientengruppe, Histogramm über die 100 am häufigsten vorkommenden Proteine (grau) und zuvor identifizierte Biomarker (weiß mit schwarzen Punkten). Der lange schwarze Balken entspricht dem Z-Score für eine lineare Kombination der Protein-Liposom-Wechselwirkungen. Ein großer Z-Score für eine spezifische Protein-Liposom-Interaktion zeigt an, dass sich die Gruppe von dem Rest der Patienten bei dieser speziellen Interaktion „trennt“. Die Figur zeigt folglich an, dass, während keine individuelle Protein-Liposom-Wechselwirkung ausreicht, um einen der Krebsarten zu klassifizieren, ihre gewichteten Kombinationen eine Trennung zwischen 2 und 2,5 Standardabweichungen induzieren.
    • 12. Die Multi-Liposome konzentrieren sich auf wenige und seltene Proteine. Protein-Korona-Beitrag im Vergleich zur bekannten Plasmakonzentration, aufgetragen auf einer log-log-Skala. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Protein und Liposom mit Korona-Beitrag für jede Krankheit und gesunde Einzelpersonen, und sowohl der Korona-Beitrag als auch die Plasmakonzentration sind in Bezug auf Albumin normalisiert. Die Plasmakonzentrationen variieren über 10 Größenordnungen, während das Liposomen-Array dieselben Proteine über 4-5 Größenordnungen detektiert. Korona-Beiträge von Proteinen, deren Plasmakonzentration unbekannt/nicht berichtet ist, sind im roten Bereich rechts aufgetragen.
    • 13. Beispiele für die Arten von nanoskaligen Sensorelementen, die für einige Ausführungsformen der Sensor-Arrays verwendet werden können. Es können verschiedene Arten von Nanopartikeln (z.B. organische, anorganische und polymere Nanopartikel) mit verschiedenen physikochemischen Eigenschaften (z.B. unterschiedliche Oberflächeneigenschaften, Größen und Formen) als Sensorelemente verwendet werden. Das Sensor-Array kann durch mindestens zwei Elemente zu einer unbegrenzten Anzahl von Elementen erstellt werden.
    • 14. Beispiel für ein Verfahren zur Sammlung von Korona-beschichteten Partikeln in in-vitro, ex-vivo und in-vivo Bedingungen. Die Partikel werden mit biologischen Flüssigkeiten (z.B. Plasma von Patienten mit verschiedenen Krankheitstypen) inkubiert und die koronabeschichteten Partikel werden gesammelt und zur Analyse gelagert.
    • 15A. Beispiele für die Konjugation von Nanoobjektmaterialien (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) an Substrate (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften), um einen Proteinkorona-Sensor-Array-Chip (A) vor Wechselwirkungen mit einer Proteinquelle (z.B. Humanplasma verschiedener Erkrankungen) herzustellen. Die spezifische Proteinkorona wird sich auf der Oberfläche von Nanoobjekten mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften bilden. Die Substrate können auch durch verschiedene Arten von Proteinen beschichtet werden, die vernachlässigbare Auswirkungen auf die Detektionseffizienz des Chips haben.
    • 15B. Beispiele für die Konjugation von Nanoobjektmaterialien (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) an Substrate (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften), um einen Proteinkorona-Sensor-Array-Chip nach Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. menschlichem Plasma mit verschiedenen Krankheiten) herzustellen.
    • 16A. Beispiele für Protein-Korona-Sensor-Array-Chips mit Nanokrümmung (hergestellt durch eine Vielzahl von verfügbaren Ansätzen wie Lithographie und Formengießen) mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften vor Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. menschliches Plasma mit verschiedenen Krankheiten). Die spezifische Proteinkorona wird sich auf der Oberfläche von Nanoobjekten mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften bilden. Die Substrate können auch durch verschiedene Arten von Proteinen beschichtet werden, die vernachlässigbare Auswirkungen auf die Detektionseffizienz des Chips haben.
    • 16B. Beispiele für Protein-Korona-Sensor-Array-Chips mit Nanokrümmung (hergestellt durch eine Vielzahl von verfügbaren Ansätzen wie Lithographie und Formengießen) mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften nach Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. menschliches Plasma verschiedener Erkrankungen). Die spezifische Proteinkorona wird sich auf der Oberfläche von Nanoobjekten mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften bilden. Die Substrate können auch durch verschiedene Arten von Proteinen beschichtet werden, die vernachlässigbare Auswirkungen auf die Detektionseffizienz des Chips haben.
    • 17A. Beispiele für die Konjugation von Nano-Objektmaterialien (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) an Substrate (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) zur Herstellung eines Protein-Korona-Sensor-Arrays Mikro/Nano-Fluidchips vor und (b) nach Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. Humanplasma von verschiedene Krankheiten). Die spezifische Proteinkorona wird sich auf der Oberfläche von Nanoobjekten mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften bilden. Die Substrate können auch durch verschiedene Arten von Proteinen beschichtet werden, die vernachlässigbare Auswirkungen auf die Detektionseffizienz des Chips haben.
    • 17B. Beispiele für die Konjugation von Nanoobjektmaterialien an Substrate, um einen Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro/Nano-Fluidchip nach Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. Humanplasma verschiedener Erkrankungen) herzustellen. Die spezifische Proteinkorona wird sich auf der Oberfläche von Nanoobjekten mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften bilden.
    • 18A. Beispiele für Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro-/Nano-Fluid-Chips mit Nanokrümmungen (hergestellt durch eine Vielzahl von verfügbaren Ansätzen wie Lithographie und Formengießen) mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften vor Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. menschliches Plasma verschiedener Erkrankungen).
    • 18B. Beispiele für Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro/Nano-Fluid-Chips mit Nanokrümmungen (hergestellt durch eine Vielzahl von verfügbaren Ansätzen wie Lithographie und Formengießen) mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften nach Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. menschliches Plasma verschiedener Erkrankungen).
    • 19A. Beispiele für die Konjugation von zufällig angeordneten Nano-Objektmaterialien (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) an Substrate (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) zur Herstellung eines Protein-Korona-Sensor-Array-Chips (A) vor Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. humanes Plasma verschiedener Erkrankungen) .
    • 19B. Beispiele für die Konjugation von zufällig angeordneten Nano-Objektmaterialien (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) an Substrate (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) zur Herstellung eines Protein-Korona-Sensor-Array-Chips (b) nach Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. Humanplasma verschiedener Erkrankungen).
    • 20A. Beispiele für Protein-Korona-Sensor-Array-Chips mit zufällig angeordneten Nanokrümmungen (hergestellt durch eine Vielzahl von verfügbaren Ansätzen wie Lithographie und Gussformen) mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften, (A) vor Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. humanes Plasma verschiedener Erkrankungen).
    • 20B. Beispiele für einen Protein-Korona-Sensor-Array-Chip mit zufällig angeordneten Nano-Krümmungen mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften (b) nach Wechselwirkungen mit einer Proteinquelle (z.B. menschliches Plasma mit verschiedenen Krankheiten).
    • 21A. Beispiele für die Konjugation von zufällig geordneten Nano-Objektmaterialien (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) an Substrate (mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften) zur Herstellung eines Protein-Korona-Sensor-Arrays Mikro/Nano-Fluidchips (A) vor Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. menschliches Plasma von verschiedenen Krankheiten).
    • 21B. Beispiele für die Konjugation von zufällig angeordneten Nanoobjektmaterialien an Substrate, um einen Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro/Nano-Fluidchip (b) nach Wechselwirkungen mit einer Proteinquelle (z.B. menschliches Plasma mit verschiedenen Krankheiten) herzustellen.
    • 22A. Beispiele für Protein-Korona-Sensor-Arrays Mikro/Nano-Fluidik-Chips mit zufällig angeordneten Nanokrümmungen (hergestellt durch eine breite Palette verfügbarer Ansätze wie Lithographie und Gussformen) mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften, (A) vor Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z Plasma verschiedener Krankheiten).
    • 22B. Beispiele für Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro/Nano-Fluid-Chips mit zufällig angeordneten Nano-Krümmungen mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften nach Wechselwirkungen mit Proteinquellen (z.B. Humanplasma verschiedener Erkrankungen).
    • 23. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Amidierungsreaktion zwischen den Aminogruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Carbonsäuregruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 24 Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Ringöffnungsreaktion zwischen den Epoxygruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 25. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Michael-Additionsreaktion zwischen den Maleimidgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Thiol- oder Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 26. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Urethanreaktion zwischen den Isocyanatgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Hydroxyl- oder Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 27. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Oxidationsreaktion zwischen den Thiolgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und denen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 28. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die „Klick“ -Chemie zwischen Azidgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Alkingruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 29. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Thiol-Austauschreaktion zwischen 2-Pyridyldithiolgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Thiolgruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 30. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Koordinationsreaktion zwischen Boronsäuregruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Diolgruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 31. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die UV-Licht-bestrahlte Additionsreaktion zwischen C = C-Bindungen auf der Silizium-Substratoberfläche und C = C-Bindungen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 32. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Goldoberfläche (als repräsentatives Substrat) über Au-Thiol-Bindungen.
    • 33. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Gold-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Amidierungsreaktion zwischen den Carbonsäuregruppen auf der Gold-Substratoberfläche und den Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 34. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Goldsubstratoberfläche (als repräsentatives Substrat) durch „Klick“ -Chemie zwischen den Azidgruppen auf der Goldsubstratoberfläche und den Alkingruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 35. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Goldsubstratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über eine Urethanreaktion zwischen den NHS-Gruppen auf der Goldsubstratoberfläche und den Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 36. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Silizium-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Ringöffnungsreaktion zwischen den Epoxygruppen auf der Gold-Substratoberfläche und Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 37. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Goldsubstratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die Koordinationsreaktion zwischen Boronsäuregruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Diolgruppen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 38. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Gold-Substratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die UV-Licht-bestrahlte Additionsreaktion zwischen C = C-Bindungen auf der Goldoberfläche und C = C-Bindungen auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 39. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Goldsubstratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die „Ligand-Rezeptor“-Wechselwirkung zwischen Biotin auf der Goldsubstratoberfläche und Avidin auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 40. Ein Beispiel für die Konjugation von Nanopartikeln an die Goldsubstratoberfläche (als repräsentatives Substrat) über die „Wirt-Gast“ -Wechselwirkung zwischen a-Cyclodextrin (a-CD) auf der Goldsubstratoberfläche und Adamantin (Ad) auf der Nanopartikeloberfläche.
    • 41. Dissoziation von Proteinen von der Oberfläche von Nanopartikeln und deren Korona-Analyse. Analyse der Protein-Korona-Sensor-Array-Daten mit überwachten und unüberwachten Ansätzen zur Erkennung und Unterscheidung von Krankheiten.
    • 42. Ein Beispiel eines Sensor-Arrays mit nanoskaligen Sensorelementen zufälliger Ordnung zur Fluoreszenz- oder Lumineszenzanzeige.
    • 43. Ein Beispiel für ein Sensor-Array mit nanoskaligen Sensorelementen zum Auslesen der Fluoreszenz- oder Lumineszenz.
    • 44A. Die Charakterisierung von freiliegenden Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Aminmodifikation (NH2) und Carboxylmodifikation (COOH)), die die drei verschiedenen verwendeten Polystyrolnanopartikel (nicht funktionalisiert, P-NH2 und P-COOH), deren Größen, DLS und Zetapotential der blanken Partikel.
    • 44B. Die Charakterisierung von freiliegenden Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Aminmodifikation (NH2) und Carboxylmodifikation (COOH)), die drei verschiedenen verwendeten Silizium-Nanopartikel (nicht funktionalisiert, S-NH2 und S-COOH), deren Größen, DLS und Zetapotential.
    • 44C. Die Charakterisierung von freiliegenden Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Amin-Modifikation (NH2) und Carboxyl-Modifikation (COOH)), die TEM von freiliegenden Polystyrol-Nanopartikeln zeigt.
    • 44D. Die Charakterisierung von freiliegenden Polystyrol- und Siliciumdioxidnanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Aminmodifikation (NH2) und Carboxylmodifikation (COOH)), die TEM von freiliegenden Siliciumdioxidnanopartikeln zeigt.
    • 45A. Die Charakterisierung von Proteinkorona-beschichteten Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Aminmodifikation (NH2) und Carboxylmodifikation (COOH)), die Größen, DLS und Zeta-Potential der Protein-Korona-beladenen Polystyrol-Nanopartikel zeigen.
    • 45B. Die Charakterisierung von Proteinkorona-beschichteten Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Aminmodifikation (NH2) und Carboxylmodifikation (COOH)), die Größen, DLS und Zetapotential der Protein-Korona-beladenen Silizium-Nanopartikel zeigen.
    • 45C. Die Charakterisierung von Proteinkorona-beschichteten Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Amin-Modifikation (NH2) und Carboxyl-Modifikation (COOH)), die TEM von Protein-Korona-beladenen Polystyrol-Nanopartikeln zeigen.
    • 45D. Die Charakterisierung von Proteinkorona-beschichteten Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Aminmodifikation (NH2) und Carboxylmodifikation (COOH)), die TEM von Protein-Korona-beladenen Silizium-Nanopartikeln zeigen.
    • 46. Ein Diagramm der Art von Krebsplasmaproben, die mit den Polystyrol-und Silizium-Nanopartikeln gescreent wurden.
    • 47. Die Proteinkorona-Profile von Polystyrol- und Siliciumdioxid-Nanopartikeln (100 nm) mit glatten, aminmodifizierten und carboxylmodifizierten Oberflächen nach Inkubation mit Plasma von Patienten mit verschiedenen Krebsarten, analysiert durch SDS-PAGE.
    • 48. Die Proteinkorona-Profile von Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln (100 nm) mit glatten, aminmodifizierten und carboxylmodifizierten Oberflächen nach Inkubation mit Plasma gesunder Einzelpersonen, wie von SDS-Page analysiert.
    • 49. Ein Diagramm, das die Trennung von Patienten mit Krebs von den gesunden Einzelpersonen zeigt, unter Verwendung eines Sensor-Arrays der vorliegenden Erfindung.
    • 50A. Die Charakterisierung von Polystyrol und Silika-Nanopartikel für KHK-Screening verwendet, zeigt Profile von freiliegenden, KHK, NICHT-KHK und kontrollbehandelten Nanopartikel.
    • 50B. Die Charakterisierung von Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln für das KHK-Screening, die das Zeta-Potential für die verschiedenen Nanopartikelgruppen zeigen.
    • 50C. Die Charakterisierung von Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln für das KHK-Screening, die die TEM der verschiedenen Nanopartikel im KHK-Bildschirm zeigen.
    • 51A. Die Proteinkonzentrationen von verschiedenen Proteinkoronen aus der Analyse der KHK, NICHT-KHK, und kein Risiko für KHK (KONTROLLE) -Nanopartikel, zeigt Bradford-Test von Proteinkonzentrationen der verschiedenen Proteinkoronen.
    • 51B. Die Proteinkonzentrationen von verschiedenen Proteinkoronen aus der Analyse der KHK, NICHT-KHK, und kein Risiko für KHK (KONTROLLE) -Nanopartikel, die personalisierte Proteinkorona-Profile zeigen, wurden analysiert und durch 1D-SDS-PAGE verglichen.
    • 51C. Die Proteinkonzentrationen von verschiedenen Proteinkoronen aus der Analyse der KHK, NICHT-KHK, und kein Risiko für KHK (KONTROLLE) Nanopartikel, zeigt Gel-Analyse durch Densitometrie festgestellt Unterschiede in der Menge an Protein in den KHK, NICHT-KHK und KONTROLLE-PCs.
    • 52. Balken zeigen die Unterschiede im prozentualen Beitrag der 20 wichtigsten Proteine in den PCs.
    • 53. Eine Darstellung der Klassifikation des Probanden in KHK, NICHT-KHK und KONTROLLE durch Analyse der von den proteinbeschichteten Korona-Nanopartikeln erzeugten Fingerabdrücke.
    • 54A. Die synthetische und biologische Identität von Nanopartikeln nach Inkubation im Alzheimer-Plasma. Nanosight Nanopartikel Tracking-Analyse (Größe). Polystyrol-Nanopartikel vor und nach der Beschichtung mit AK (Alzheimer-Krankheit)-Protein-Koronen. Bare Nanopartikel sind 90-100 nm und homogen in der Größe. AK-PC-beschichtete Nanopartikel sind größer und weniger homogen in der Größe. Intensitätsprofile und Streudiagramm jeder Messung werden gemeldet. Die Werte sind Durchschnitt ± SD (n = 3).
    • 54B. Die synthetische und biologische Identität von Nanopartikeln nach Inkubation im Alzheimer-Plasma. Nanosight Nanopartikel Tracking-Analyse (Größe). Silizium-Nanopartikel vor und nach der Beschichtung mit AK-Protein-Koronen. Bare Nanopartikel sind 90-100 nm und homogen in der Größe. AK PC-beschichtete Nanopartikel sind größer und weniger homogen in der Größe. Intensitätsprofile und Streudiagramm jeder Messung werden gemeldet. Die Werte sind Durchschnitt ± SD (n = 3).
    • 55. Eine TEM-Analyse. Nanopartikel vor und nach der Beschichtung mit AK-Protein-Koronen wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie analysiert, um mögliche Veränderungen in Morphologie und Größe zu bewerten. P: Polystyrol; PN: Polystyrol-NH 2, PC: Polystyrol-COOH; S: Siliciumdioxid; SN: Siliciumdioxid-NH 2; SC: Siliciumdioxid-COOH. Alle Nanopartikel zeigen nach der Inkubation im Plasma eine Größenzunahme.
    • 56. SDS-PAGE-Gele und densitometrische Analyse der Banden. Ladereihenfolge: P, P-NH 2, P-COOH, S, S-NH 2, S-COOH, wobei P: Polystyrol; PN: Polystyrol-NH 2, PC: Polystyrol-COOH; S: Siliciumdioxid; SN: Siliciumdioxid-NH 2; SC: Siliciumdioxid-COOH. Personalisierte Proteinkorona-Profile wurden analysiert und mittels SDS-PAGE verglichen. Vier repräsentative Gele von Alzheimer-Protein-Korona und eine gesunde Protein-Korona werden gezeigt. Die Intensität der Banden im Verhältnis zu den an Nanopartikeln adsorbierten Plasmaproteinen wurde mit ImageJ (y-Achse: Intensität, x-Achse: Molekulargewicht) analysiert.
    • 57. Die Klassifizierung von gesunden und AK-Kranken Die weißen Punkte sind AK und die schwarzen Punkte sind gesunde Proben.
    • 58. Die SDS-Page Gel-Analyse von Siliciumdioxid-Nanopartikeln unterschiedlicher Durchmesser unter Verwendung des gleichen Volumens (10 ul, links) oder der gleichen Menge (10 ug, rechts).
    • 59. Ein Schema, das die durchgeführten Experimente zeigt, um die Existenz von Nukleinsäuren in der biomolekularen Korona zu untersuchen.
    • 60. Die Analyse von Agarose-Gel von Nukleinsäure, das bis zu drei verschiedene Nanopartikel bindet.
    • 61. Die Analyse des Nukleinsäuregehalts im Plasma.
    • 62. Die Analyse von Nukleinsäure-Mengen, die mit einer Biomolekülkorona eines Nanopartikels assoziiert sind, wenn Protein durch Harnstoff aus der Korona dissoziiert wird.
    • 63. Die Analyse von Nukleinsäure-Mengen, die mit einer Biomoleküle Korona eines Nanopartikels assoziiert sind, wenn die Koronaproteine nicht von der Oberfläche der Partikel dissoziiert werden.
    • 64. Die Analyse von Nukleinsäure-Mengen, die mit einer Biomolekülkorona eines Nanopartikels assoziiert sind, wenn Nukleinsäuren zunächst aus Plasma mit einem Reinigungskit gereinigt und dann mit Nanopartikeln inkubiert werden.
    • 65. Eine schematische Darstellung eines Verfahrens zum Unterscheiden von Zuständen einer komplexen biologischen Probe.
    • 66. Eine schematische Darstellung eines Computersystems.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird in Bezug auf eine oder mehrere bevorzugte Ausführungsformen beschrieben und es sollte klar sein, dass neben den ausdrücklich genannten viele Äquivalente, Alternativen, Variationen und Modifikationen möglich sind und im Schutzbereich der Erfindung liegen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Sensor-Arrays und Verfahren zur Verwendung für die Prognose, Diagnose und zum Nachweis eines Krankheitszustandes bei einem Probanden zur Verfügung. Das Sensor-Array der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich von bekannten Sensor-Arrays, die einzelne Sensoren aufweisen, die spezifische Biomoleküle erkennen. Bei dem vorliegenden Sensor-Array müssen die Biomoleküle nicht bekannt sein, da das System nicht auf dem Vorhandensein oder Fehlen eines spezifischen Biomoleküls oder Mengen spezifischer Krankheitsmarkern beruht. Dieses neue Sensor-Array ist in der Lage, Veränderungen in den Zusammensetzungen der Biomolekülkorona zu erkennen, die den verschiedenen Sensorelementen assoziiert ist. Diese Fähigkeit, relative Veränderungen oder Muster zu erkennen (entweder die tatsächlichen Biomoleküle, die den verschiedenen Sensorelementen assoziiert sind, oder in den Mengen und/oder der Gestaltung eines jeden Biomoleküls, das jedem Sensorelement assoziiert ist), ermöglicht eine Bestimmung eines eindeutigen Biomolekül-Fingerabdrucks für jedes Array. Dieser Biomolekül-Fingerabdruck kann verschiedene Gesundheits- und Krankheitszustände von Probanden stratifizieren. In einigen Ausführungsformen ist der biomolekulare Fingerabdruck nicht nur in der Lage, zwischen gesunden Probanden und Probanden in verschiedenen Stadien einer Krankheit oder Störung zu unterscheiden, sondern auch einen Vor-Krankheitszustand eines Probanden zu bestimmen, in dem der Proband die Krankheit oder Störung zu einem späteren Zeitpunkt entwickeln wird. Dies ist deutlich verschieden und neuartig gegenüber Systemen im Stand der Technik, die spezifische Biomarker messen oder erkennen, die einer Krankheit oder Störung assoziiert sind, um so eine Prädisposition (z.B. eine Möglichkeit oder Wahrscheinlichkeit) zur Entwicklung der Krankheit zu geben. Der vorliegende Sensor und die Verfahren sind dazu in der Lage, eine Krankheit zu erkennen, bevor irgendwelche Anzeichen oder Symptome zu auftreten, in anderen Worten, kann die Krankheit vor dem Auftreten konkreter Anzeichen oder Symptome vorab diagnostiziert werden.
  • Die Einzigartigkeit der vorliegenden Erfindung ist die Kombination dieser Erkennung eines biomolekularen Fingerabdrucks aus einer Probe von einem Probanden und der Fähigkeit, einen Krankheitszustand für diesen Probanden in einem Gesundheitskontinuum zu bestimmen.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf Arbeit der Erfinder, die gezeigt haben, dass die Oberfläche von Sensorelementen, z.B. Nanopartikel, schnell mit einer Schicht aus verschiedenen Biomolekülen, einschließlich Proteine, bedeckt wird, um eine „Biomolekülkorona“ zu bilden, wenn sie mit einer biologischen Probe in Kontakt gebracht werden. Die Art, Menge und Kategorien der Biomoleküle, die diese Biomolekülkorona bilden, stehen im starken Zusammenhang mit den physikochemischen Eigenschaften der Sensorelemente selbst und den komplexen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Biomolekülen selbst und den Sensorelementen. Diese Wechselwirkungen führen zu der Erzeugung einer (ein-)eindeutigen Biomolekülkorona-Signatur für jedes Sensorelement. Mit anderen Worten, beeinflusst das Sensorelement, je nachdem, welche Biomoleküle interagieren, nicht nur die Zusammensetzung der Biomolekülkorona, sondern es kann auch verändern, welche anderen unterschiedlichen Biomoleküle mit diesem speziellen Sensorelement in Wechselwirkung treten können.
  • Verschiedene Sensorelemente mit ihrer jeweils eigenen Biomolekülkorona-Signatur können mit einer Probe in Kontakt gebracht werden, um einen eindeutigen Biomolekül-Fingerabdruck für diese Probe zu erzeugen. Dieser Fingerabdruck kann dann verwendet werden, um einen Krankheitszustand eines Probanden zu bestimmen. Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im Folgenden näher erörtert werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Sensor-Arrays zur Verfügung, die im Wesentlichen oder gänzlich aus einer Mehrzahl von Sensorelementen bestehen, wobei sich die Mehrzahl der Sensorelemente in wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheiden. In einigen Ausführungsformen ist jedes Sensorelement in der Lage, eine Mehrzahl von Biomolekülen in einer Probe zu binden, um eine Biomolekülkorona-Signatur zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen weist jedes Sensorelement eine eindeutige Biomolekülkorona-Signatur auf.
  • Die Mehrzahl von Sensorelementen erzeugt, wenn sie mit einer Probe in Kontakt gerät, eine Mehrzahl von Biomolekülkorona-Signaturen, die gemeinsam einen Biomolekül-Fingerabdruck bilden. Der „Biomolekül-Fingerabdruck“ ist die kombinierte Zusammensetzung oder das Muster von Biomolekülen aus wenigstens zwei Biomolekülkorona-Signaturen für die Mehrzahl von Sensorelementen.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Sensorelement“ auf Elemente, die dazu in der Lage sind, eine Mehrzahl von Biomolekülen zu binden, wenn sie mit einer Probe in Kontakt sind und umfassen den Begriff „nanoskaliges Sensorelement“. In einer Ausführungsform ist das Sensorelement ein Element von etwa 5 Nanometer bis etwa 50.000 Nanometer in wenigstens einer Richtung. Geeignete Sensorelemente schließen ein, sind jedoch nicht auf ein Sensorelement beschränkt, das sich in wenigstens einer Richtung von beispielsweise etwa 5 nm bis etwa 50.000 nm, von etwa 5 nm bis etwa 40.000 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 30.000 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 20.000 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 10.000 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 5.000 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 1.000 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 500 nm, alternativ von etwa 5 nm bis 50 nm, alternativ von etwa 10 nm bis 100 nm, von alternativ etwa 20 nm bis 200 nm, alternativ von etwa 30 nm bis 300 nm, alternativ von etwa 40 nm bis 400 nm, alternativ von etwa 50 nm bis 500 nm, alternativ von etwa 60 nm bis 600 nm, alternativ von etwa 70 nm bis 700 nm, alternativ von etwa 80 nm bis 800 nm, alternativ von etwa 90 nm bis 900 nm, alternativ von 100 nm bis 1000 nm, alternativ etwa 1000 nm bis 10000 nm, alternativ von etwa 10.000 nm bis 50.000 nm und jede beliebige Kombination oder jeden Betrag dazwischen erstreckt (z.B. 5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 1000 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm, 1500 nm, 1600 nm, 1700 nm, 1800 nm, 1900 nm, 2000 nm, 2500 nm, 3000 nm, 3500nm, 4000 nm, 4500 nm, 5000 nm, 5500 nm, 6000 nm, 6500 nm, 7000 nm 7500 nm, 8000 nm, 8500 nm, 9000 nm, 10000 nm, 11000nm, 12000nm, 13000nm, 14000nm, 15000 nm, 16000 nm, 17000 nm, 18000nm, 19000 nm, 20000nm, 25000nm, 30000 nm, 35000 nm, 40000 nm 45000, nm, 50000 nm und jede beliebige Zahl dazwischen). Ein nanoskaliges Sensorelement bezieht sich auf ein Sensorelement, das sich weniger als 1 Mikrometer in wenigstens eine Richtung erstreckt. Geeignete Beispiele für Bereiche von nanoskaligen Sensorelementen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, beispielsweise Elemente von etwa 5 nm bis etwa 1000 nm in einer Richtung, eingeschlossen Bereiche von beispielsweise etwa 5 nm bis etwa 500 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 400 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 300 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 200 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 100 nm, alternativ von etwa 5 nm bis etwa 50 nm, alternativ von etwa 10 nm bis etwa 1000 nm, alternativ von etwa 10 nm bis etwa 750 nm, alternativ von etwa 10 nm bis etwa 500 nm, alternativ von etwa 10 nm bis etwa 250 nm, alternativ von etwa 10 nm bis etwa 200 nm, alternativ von etwa 10 nm bis etwa 100 nm, alternativ von etwa 50 nm bis etwa 1000 nm alternativ von etwa 50 nm bis etwa 500 nm, alternativ von etwa 50 nm bis etwa 250 nm, alternativ von etwa 50 nm bis etwa 200 nm, alternativ von etwa 50 nm bis etwa 100 nm, und beliebige Kombinationen davon, Bereiche oder jeden Betrag dazwischen (z.B. 5 nm, 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 125 nm, 150 nm, 175 nm, 200 nm, 225 nm, 250 nm, 275 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm, 500 nm, 550 nm, 600 nm, 650 nm, 700 nm, 750 nm, 800 nm, 850 nm, 900 nm, 1000 nm, etc.). In Bezug auf die hier beschriebenen Sensor-Arrays, schließt die Verwendung des Begriffs Sensorelement die Verwendung eines nanoskaligen Sensorelements für den Sensor und zugehörige Verfahren mit ein.
  • Der Begriff „Mehrzahl von Sensorelemente“ bezieht sich auf mehr als ein, zum Beispiel wenigstens zwei Sensorelemente. In einigen Ausführungsformen schließt die Mehrzahl von Sensorelementen wenigstens zwei Sensorelemente bis zu wenigstens 1000 Sensorelemente ein, vorzugsweise von etwa zwei Sensorelementen bis etwa 100 Sensorelementen. In geeigneten Ausführungsformen weist das Array wenigstens zwei bis wenigstens 100 Sensorelemente auf, alternativ wenigstens zwei bis zu wenigstens 50 Sensorelemente, alternativ wenigstens 2 bis zu 30 Sensorelemente, alternativ wenigstens 2 bis zu 20 Sensorelemente, alternativ wenigstens 2 bis zu 10 Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 50 Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 30 Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 20 Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 10 Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis zu wenigstens 50 Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 30 Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis zu wenigstens 20 Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis zu wenigstens 10 Sensorelemente, und einschließlich einer beliebigen Anzahl von in Betracht gezogenen Sensorelementen dazwischen (z.B. wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, etc.). In einigen Ausführungsformen umfasst das Sensor-Array wenigstens 6 Sensorelemente bis zu wenigstens 20 Sensorelementen, alternativ wenigstens 6 Sensorelemente bis zu wenigstens 10 Sensorelementen.
  • Der Begriff „Mehrzahl von nanoskaligen Sensorelementen“ bezieht sich auf mehr als ein, zum Beispiel wenigstens zwei nanoskalige Sensorelemente. In einigen Ausführungsformen schließt die Mehrzahl von nanoskaligen Sensorelemente wenigstens zwei nanoskalige Sensorelemente bis zu wenigstens 1000 nanoskalige Sensorelemente ein, vorzugsweise etwa zwei nanoskalige Sensorelemente bis zu etwa 100 nanoskalige Sensorelemente. In geeigneten Ausführungsformen weist das Array wenigstens zwei bis zu wenigstens 100 nanoskalige Sensorelemente auf, alternativ wenigstens zwei bis zu wenigstens 50 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 2 bis wenigstens 30 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 2 bis wenigstens 20 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 2 bis 10 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 50 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 30 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis wenigstens 20 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 10 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 50 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 30 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 20 nanoskalige Sensorelemente, alternativ wenigstens 4 bis zu wenigstens 10 nanoskalige Sensorelemente, und einschließlich einer beliebigen Anzahl von in Betracht gezogenen nanoskaligen Sensorelemente dazwischen (z.B. wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, etc.).
  • Bei der Verwendung hierin bezieht sich der Begriff „Biomolekülkorona“ auf die Mehrzahl von verschiedenen Biomolekülen, die sich an ein Sensorelement binden können. Der Begriff „Biomolekülkorona“ schließt „Proteinkorona“ mit ein, was ein im Stand der Technik verwendeter Begriff zur Bezugnahme auf Proteine ist, Lipide und andere Plasmakomponenten ein, die Nanopartikel binden, wenn sie in Kontakt mit biologischen Proben oder einem biologischen System kommen. Zur Verwendung hierin, schließt der Begriff „Biomolekülkorona“ sowohl die weiche als auch harte Proteinkorona ein, wie sie im Stand der Technik bezeichnet werden, siehe z.B. Milani et al. „Reversible versus Irreversible Binding of Transferring to Polystyrene Nanoparticles: Soft and Hard Korona" ACS NANO, 2012, 6(3), pp. 2532-2541; Mirshafiee et al. „Impact of protein pre-coating on the protein korona composition and nanoparticle cellular uptake" Biomaterials vol. 75, Jan 2016 pp. 295-304, Mahmoudi et al. „Emerging understanding of the protein korona at the nano-bio interfaces" Nanotoday 11(6) Dec. 2016, pp. 817-832, und Mahmoudi et al. „Protein-Nanoparticle Interactions: Opportunities and Challenges" Chem. Rev., 2011, 111(9), pp. 5610-5637, deren Inhalt durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist. Wie im Stand der Technik beschrieben, zeigt eine Adsorptionskurve den Aufbau einer stark gebundenen Monoschicht bis zu dem Punkt einer einschichtigen Sättigung (bei einem geometrisch definierten Protein-zu-NP-Verhältnis), über das hinaus eine sekundäre, schwach gebundene Schicht gebildet wird. Während die erste Schicht irreversibel gebunden ist (harte Korona), zeigt die sekundäre Schicht (weiche Korona) einen dynamischen Austausch. Proteine, die mit einer hohen Affinität adsorbieren, bilden das, was als „harte“ Korona bekannt ist, bestehend aus fest gebundenen Proteinen, die nicht leicht desorbieren, und Proteine, die mit geringer Affinität adsorbieren, bilden die „weiche“ Korona, bestehend aus lose gebundenen Proteinen. Die weiche und harte Korona können auch auf Grundlage ihrer Wechselzeiten definiert werden. Die harte Korona zeigt in der Regel viel längere Wechselzeiten in der Größenordnung von mehreren Stunden. Siehe z.B. M. Rahman et al. Protein-Nanoparticle Interactions, Spring Series in Biophysics 15, 2013, das durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit aufgenommen ist.
  • Der Begriff „Biomolekülkorona-Signatur“ bezieht sich auf die Zusammensetzung, die Signatur oder das Muster von verschiedenen Biomolekülen, die an jedes separate bzw. einzelne Sensorelement gebunden sind. Die Signatur bezieht sich nicht nur auf die verschiedenen Biomoleküle, sondern auch auf die Unterschiede in der Menge, des Gehalts oder die Anzahl der an das Sensorelement gebundenen Biomoleküle oder auf Unterschiede im Konformationszustand des Biomoleküls, das an das Sensorelement gebunden ist. Es ist vorgesehen, dass die Biomolekülkorona-Signaturen jedes Sensorelements einige der gleichen Biomoleküle enthalten, unterschiedliche Biomoleküle in Bezug auf die anderen Sensorelemente enthalten können und/oder sich in Gehalt oder Menge, Art oder Konformation des Biomoleküls unterscheiden. Die Biomolekülkorona-Signatur kann nicht nur von den physikochemischen Eigenschaften des Sensorelements abhängen, sondern auch von der Art der Probe und der Dauer der Exposition bzw. des Exponierens. In einigen Fällen ist die Biomolekülkorona-Signatur eine Proteinkorona-Signatur. In einem anderen Fall ist die Biomolekülkorona-Signatur eine Polysaccharid-Korona-Signatur. In noch einem anderen Fall ist die Biomolekülkorona-Signatur eine Metabolit-Korona-Signatur. In einigen Fällen ist die Biomolekülkorona-Signatur eine Lipidomik-Korona-Signatur.
  • In einigen Ausführungsformen weist die Biomolekülkorona-Signatur die Biomoleküle auf, die sich in einer weichen und einer harten Korona finden. In einigen Ausführungsformen ist die weiche Korona eine weiche Proteinkorona. In einigen Ausführungsformen ist die harte Korona eine harte Proteinkorona.
  • Der Begriff „Biomolekül“ bezieht sich auf biologische Komponenten, die an der Koronabildung beteiligt sein können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, beispielsweise Proteine, Polypeptide, Polysaccharide, einen Zucker, ein Lipid, ein Lipoprotein, ein Metabolit, ein Oligonukleotid, ein Metabolom oder Kombination davon. Es ist vorgesehen, dass die Biomolekülkorona-Signaturen von jedem der Sensorelemente einige der gleichen Biomoleküle enthalten, unterschiedliche Biomoleküle in Bezug auf die anderen Sensorelemente enthalten können und/oder sich in Gehalt oder Menge, Art oder Konformation des Biomoleküls unterscheiden, das sich an jedes Sensorelement bindet. In einer Ausführungsform ist das Biomolekül aus der Gruppe von Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden und Metabolomen ausgewählt.
  • In einigen Ausführungsformen weist das Sensor-Array auf besteht im Wesentlichen aus oder besteht gänzlich aus einem ersten Sensorelement, das wenigstens eine erste Biomolekülkorona-Signatur erzeugt, und wenigstens einem zweiten Sensorelement, das eine zweite Biomolekülkorona-Signatur erzeugt, das Sensor-Array mit einer biologischen Probe in Kontakt gebracht wird. Ein Biomolekül-Fingerabdruck ist die Kombination der ersten Biomolekül-Signatur und der wenigstens zweiten Biomolekül-Signatur. Es ist vorgesehen, dass die Biomolekül-Signatur kann aus wenigstens zwei Biomolekülkorona-Signaturen erzeugt wird, um so viele verschiedene Biomoleküle Signaturen zu untersuchen, z.B. wenigstens 1000 verschiedene Biomolekülkorona-Signaturen. Die Biomolekülkorona kann für jedes Sensorelement separat untersucht werden, um die Biomolekülkorona-Signatur für jedes Element zu bestimmen, und kann kombiniert untersucht, um den Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen, oder die zwei oder mehr Biomolekülkoronen können gleichzeitig untersucht werden, um den Biomolekül-Fingerabdruck auf einmal auszubilden.
  • In einigen Ausführungsformen weist der Biomolekül-Fingerabdruck wenigstens zwei Biomolekülkorona-Signaturen auf. In einigen Ausführungsformen weist der Biomolekül-Fingerabdruck von wenigstens zwei Biomolekülkorona-Signaturen bis wenigstens 1000 Biomolekülkorona-Signaturen auf, vorzugsweise etwa zwei Biomolekülkorona-Signaturen bis etwa 100 Biomolekülkorona-Signaturen. In geeigneten Ausführungsformen weist der Biomolekül-Fingerabdruck wenigstens zwei bis wenigstens 100 Biomolekülkorona-Signaturen auf, alternativ wenigstens zwei bis wenigstens 50 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 2 bis 30 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 2 bis 20 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 2 bis 10 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 3 bis zu wenigstens 50 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ dazu zumindest 3 bis wenigstens 30 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ dazu zumindest 3 bis wenigstens 20 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ dazu zumindest 3 bis wenigstens 10 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 50 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 30 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 20 Biomolekülkorona-Signaturen, alternativ wenigstens 4 bis wenigstens 10 Biomolekülkorona-Signaturen, einschließlich einer beliebigen, dazwischen liegenden Anzahl von Biomolekülkorona-Signaturen (z.B. wenigstens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500 , 550, 600, 650, 700, 750, 800, etc.).
  • Fortschritte in der Proteom-Analyse unter Verwendung der Massenspektrometrie haben neue Einblicke in die Veränderungen ermöglicht, die im gesamten Spektrum der Gesundheit und Krankheit einschließlich Krebserkrankungen im Frühstadium stattfinden. Doch die Empfindlichkeit und die Spezifität der Massenspektrometrie-Ansätze sind aufgrund des hohen Rauschens, das durch die 10.000 Proteine, die das menschliche Proteom aufweist, erzeugt wird, wobei sich geschätzte Konzentrationen bei 35 bis 50 mg/ml für Albumin bis 1 bis 10 pg/ml für einige Zytokine bewegen, für eine zuverlässige bzw. robuste Früherkennung von Krebserkrankungen teilweise nicht ausreichend gewesen. Die bestehenden Technologien haben einen Kompromiss zwischen der Abdeckungstiefe und dem Durchsatz der Verarbeitung von Plasmaproteinen erfordert. Es wurden mehrere Versuche unternommen, um den aktuell niedrigen Grad des Proteinnachweises, einschließlich der Abreicherungen von weit verbreiteten Proteinen, isobarem Labeln auf der Peptid-Ebene für die multiplexierte relative Quantifizierung, Post-Abreicherung-Plasmafraktionierungsstrategien, Biomarker-Sammeltechniken, mathematischer Ansätze zur Analyse von qualitativ hochwertigen Datensätzen und gemultiplexten Workflows (d.h. einer Kombination von Ansätzen). Trotz dieser Bemühungen, haben massenspektrometrische Ansätze für die Plasmaproteomik bei der Früherkennung von Krebserkrankungen keinen nachhaltigen Erfolg gezeigt. In der Tat hat keine frühere Studie, ob proteomisch oder anderweitig, über eine genaue Vorhersage und Klassifikation einer Zeile von Krebsarten, einschließlich der frühesten präsymptomatischen Stadien, berichtet. Das vorliegende Sensor-Array stellt das erste Erfassungssystem zur Verfügung, das einen Krankheitszustand genau vorhersagt und klassifiziert, einschließlich präsymptomatischer Krankheitszustände für eine Zeile von verschiedenen Krankheiten.
  • Frühere Bestrebungen haben versucht, die „krankheitsspezifische Proteinkorona“ zu verwenden, um eine Krebsart unter Verwendung einer Gelelektrophorese und von Änderungen der Aggregationsgröße von Nanopartikeln zu identifizieren. Wie jedoch in den nachfolgenden Beispielen gezeigt wird, waren die feinen Unterschiede in der Proteinkorona an der Oberfläche eines Nanopartikel-Typs nicht ausreichend für eine robuste und genaue Identifizierung und Unterscheidung von Krebsarten mit akzeptabler Vorhersagegenauigkeit, hauptsächlich aufgrund des anhaltenden Problems der unzureichenden Proteomabdeckung.. Das hierin beschriebene Sensor-Array ist in der Lage, Krankheitszustände genau zu klassifizieren. Es ist aber nicht nur in der Lage, den Krankheitszustand vorherzusagen, sondern auch, Patienten zu klassifizieren, die präsymptomatisch für die Krankheit sind (z.B. Alzheimer), oder die Patienten entsprechend der Art der Erkrankung (z.B. Krebsart) zu klassifizieren.
  • Um die Fähigkeit der Proteinkorona für eine robuste und genaue Krebserkennung mit hervorragender Vorhersage-Fähigkeit wesentlich zu erhöhen, haben die Erfinder ein Sensor-Array (hierin gelegentlich auch als Proteinkorona-Nanosystem oder Sensor-Array-Nanosystem bezeichnet) entwickelt. Verglichen mit früheren Ansätzen, die auf die Oberfläche eines einzelnen Nanopartikels beschränkt sind, liefert es signifikant umfassendere Proteomdaten über einen breiteren dynamischen Bereich von Plasmaproteinkonzentrationen. Das Sensor-Array ermöglicht die Probennahme einer komplexen biologischen Probe (z.B. einer menschlichen Plasmaprobe) unter Verwendung von Multi-Nanopartikeln mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften, um die Anzahl und den Bereich von Proteinen mit sowohl niedriger als auch hoher Abundanz, die ohne Protein-Abreicherung identifiziert wurden, signifikant zu erhöhen. Dies reduziert wirksam das Rauschen in der überwiegend Mehrzahl der verfügbaren proteomischen Information, was eine genauere frühe Differenzierung der für eine Krankheit charakteristischen proteomischen Signatur ergibt. Aufgrund der Kombination von Protein-Nanopartikeln und Protein-Protein-Wechselwirkungen, die unter Verwendung des Sensor-Arrays eindeutig abgeleitet werden, kann jeder Proteintyp in verschiedenen Konzentrationen auf der Oberfläche verschiedener Nanopartikel vorhanden sein, wodurch eine zusätzliche proteomische Information bereitgestellt wird. Die Verwendung von Multi-Nanopartikeln mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften wird hauptsächlich durch unsere neueren Erkenntnisse gestützt, dass bereits kleine Änderungen der physikochemischen Eigenschaften von Nanopartikeln dramatische, aber reproduzierbare Veränderungen in der Proteinkorona-Zusammensetzung hervorrufen können.
  • Das vorliegende Sensor-Array hat eine Empfindlichkeit und einen dynamischen Bereich von zehn (10) Größenordnungen in Bezug auf die Proteinerkennung unter Verwendung von Massenspektroskopie-Ansätzen. Die vorliegende Untersuchung ist in der Lage, Proteine nachzuweisen, die innerhalb einer Probe im sub-ng-Bereich gefunden werden. Diese Untersuchung oder dieser Ansatz haben einen viel größeren dynamischen Bereich als derzeitige Untersuchungen zum Messen von Proteinen in einer Probe. Zum Beispiel hat Massenspektrometrie nur einen Dynamikbereich von 4-6 Größenordnungen. Dieses neuartige Sensor-Array hat die Fähigkeit, einen größeren dynamischen Bereich abzutasten, als dies bisher möglich war. Das vorliegende Sensor-Array ermöglicht die Erkennung und Bestimmung von selten vorkommenden und seltenen Proteinen, die man bisher nicht nachweisen konnte.
  • Der Begriff „Probe“ bezieht sich auf eine biologische Probe oder eine komplexe biologische Probe, die von einem Probanden erhalten wird. Geeignete biologische Proben schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, biologische Flüssigkeiten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, systemisches Blut, Plasma, Serum, Lungenlavage, Zelllysaten, Menstruationsblut, Urin, verarbeitete Gewebeproben, Fruchtwasser, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränen, Speichel, Sperma und dergleichen.. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine Blut- oder Serumprobe. Blutplasma enthält mehrere tausend verschiedene Proteine mit zwölf Größenordnungen Unterschied in den Konzentrationen dieser Proteine. Das vorliegende Sensor-Array ist in der Lage, Veränderungen in diesen Blutproben über die Zeit oder über Krankheitszustände des Patienten hinweg zu erkennen.
  • In einigen Ausführungsformen werden die biologischen Flüssigkeiten oder komplexen biologischen Proben durch im Stand der Technik bekannte Verfahren und Kits hergestellt. Zum Beispiel können einige biologische Proben (z.B. Menstruationsblut, Blutproben, Sperma usw.) zuerst mit niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert werden, um Zelltrümmer, Blutgerinnsel und andere zelluläre Komponenten zu entfernen, die das Array stören können. In anderen Ausführungsformen können beispielsweise Gewebeproben zerhackt oder homogenisiert werden, mit Enzymen behandelt werden, um das Gewebe aufzubrechen und/oder zentrifugiert werden, um Zelltrümmer zu entfernen, was die Untersuchung und Extraktion der Biomoleküle innerhalb der Gewebeproben ermöglicht. Geeignete Verfahren zur Isolierung und/oder richtigen Vorbereitung und Speicherung von Blutproben sind im Stand der Technik bekannt und können die Zugabe eines Antikoagulans einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Geeignete Sensorelemente schließen beispielsweise Partikel, wie organische Partikel, nicht-organische Partikel oder Kombinationen davon ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. In einigen Ausführungsformen sind die Partikel beispielsweise Nanopartikel, Mikropartikel, Mizellen, Liposome, Eisenoxid, Graphen, Siliciumdioxid, Protein-basierte Partikel, Polystyrol, Silber- und Goldpartikel, Quantenpunkte, Palladium, Platin, Titan und Kombinationen davon. In einigen Ausführungsformen sind die Nanopartikel Liposomen. Der Fachmann kann hierzu geeignete Partikel auswählen und herzustellen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind die Sensorelemente nanoskalige Sensorelemente. Geeignete nanoskalige Sensorelemente sind in wenigstens einer Richtung kleiner als 1 µm. Gemäß einigen Aspekten sind die nanoskaligen Sensorelemente kleiner als etwa 100 nm in wenigstens einer Richtung.
  • Überblick
  • Die vorliegende Offenbarung stellt ein Verfahren zur Erkennung eines Krankheitszustands unter Verwendung eines Biomolekülkorona-Nanosystems zur Verfügung. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Erkennen einer krankheitsspezifischen Proteinkorona.
  • Sensor-Arrays
  • 65 zeigt ein beispielhaftes Schema des vorliegend offenbarten Array-Systems. Wie in Schritt 1 von 65 gezeigt, kann eine komplexe biologische Probe (z.B. Blut 704) von einem Probanden 702 entnommen werden, der einen biologischen Zustand 703 (beispielsweise einen Krankheitszustand, beispielsweise vor irgendwelchen körperlichen Symptomen der Erkrankung und/oder während frühen und mittleren Stadien einer Krankheit) ausdrückt. Geeignete biologische Proben 704 schließen ohne eine Beschränkung darauf systemisches Blut, Plasma, Serum, Lungenspülung, Zelllysate, Menstruationsblut, Urin, behandelte Gewebeproben, Fruchtwasser, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränen, Speichel, Sperma und dergleichen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe eine Blut- oder Serumprobe. In einigen Ausführungsformen kann, wie in Schritt 2 von 65 gezeigt, Plasma 706 von Blutzellen 708 von Probanden getrennt werden, die einen biologischen Zustand 703 ausdrücken (z.B. gesunde Menschen (Kein krankhafter Zustand) und Krebspatienten (Krankheitszustand)).
  • Als nächstes kann, wie in Schritt 3 von 65 gezeigt, eine komplexe biologische Probe (z.B. Plasma 706) mit einem Sensor-Array 710, das eine Mehrzahl von Partikeln 712 mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften aufweist, inkubiert werden. Die Mehrzahl von Partikeln 712 kann mit dem Plasma 706 inkubiert werden, um es Biomolekülen in dem Plasma 706 (z.B. Proteine im Plasma 706) zu ermöglichen, sich an einen oder mehrere der Partikel 712 zu binden. Anschließend, wie in Schritt 4 von 65 gezeigt, können die Biomoleküle (z.B. Proteine), die an die Partikel 712 gebunden sind, in einer Proteinlösung 714 zur weiteren Analyse isoliert werden, beispielsweise zur Bestimmung der Zusammensetzungen der an jeden Typ von Partikel 712 gebundenen Proteine (z.B. anionische, neutrale und kationische Partikel 712).
  • Die Proteinlösung 714 kann beispielsweise, wie in Schritt 5 von 65 gezeigt, durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) 716 charakterisiert werden. Die Proteine, die unter Verwendung von LC-MS/MS 716 identifiziert wurden, können dann in Schritt 6 von 65 analysiert werden, um einen Biomolekül-Fingerabdruck 718 (z.B. einem Vertreter für Proteine, Nukleinsäuren, Lipide und Polysaccharide, die sich an eines oder mehrere der Partikel 712 binden) zu bestimmen, der dem biologischen Zustand 703 assoziiert ist.
  • In Schritt 7 von 65 kann ein Computer 720 (beispielsweise ein Computersystem 101 in 66) dazu verwendet werden, um einen Biomolekül-Fingerabdruck 718 (z.B. Protein-Fingerabdruck) einem biologischen Zustand 703 (z.B. Gesundheitszustand, Krankheitszustand) zuzuordnen. Zum Beispiel kann die Analyse eines Biomolekül-Fingerabdrucks 718 (z.B. Protein-Fingerabdruck) von mindestens zwei Proben (z.B. komplexen biologischen Proben wie Plasma 706) mit einem Computersystem 720 durchgeführt werden, um eine Assoziation 722 zwischen dem biologischen Zustand 703 und dem Biomolekül-Fingerabdruck 718 zu erzeugen (in Schritt 8 von 65). Das Erzeugen der Assoziation 722 kann durch eine Assoziationsanalyse oder eine statistische Klassifikation unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, die u.a. eine Vielzahl von überwachten und unüberwachten Datenanalyse- und Clustering-Ansätzen, wie z.B. hierarchische Clusteranalyse (HCA), Hauptkomponentenanalyse (PCA), Partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (PLS-DA), Maschinelles Lernen (auch bekannt als Random-Forest), logistische Regression, Entscheidungsbäume, Support Vector Machine (SVM), k-nächste Nachbarn, naive Bayes, lineare Regression, polynomiale Regression, SVM für Regression, K-means Clustering und Hidden Markov Modelle einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. In anderen Worten wird die Biomolekül-Fingerabdrücke 718 jeder Probe (z.B. Plasma 706) miteinander verglichen/analysiert (z.B. unter Verwendung eines Computers 720), um mit statistischer Signifikanz zu bestimmen, welche Muster die einzelnen Fingerabdrücke gemeinsam haben, um einen biologischen Zustand zu bestimmen, der dem Biomolekül (z.B. Protein) -Fingerabdruck 718 assoziiert ist.
  • Die Zuordnung bzw. Assozierung 722 kann den Biomolekül-Fingerabdruck 718 (z.B. Protein-Fingerabdruck) mit einer Mehrzahl von biologischen Zuständen 703 verknüpfen. Zum Beispiel kann ein Vergleich von Biomolekül-Fingerabdrücken 718 zwischen einem Probanden 702, bei dem eine Krankheit diagnostiziert ist (d.h., dass der biologische Zustand 703 ein Krankheitszustand ist), und einem Probanden 702, bei dem die Krankheit nicht diagnostiziert ist (d.h., dass der biologische Zustand 703 ein Kein krankhafter Zustand ist), zu einer Assoziation 722 zwischen dem Biomolekül-Fingerabdruck 718 des Probanden 702 mit der Krankheit und dem Krankheitszustand führen. Eine solche Assoziation 722 zwischen dem Biomolekül-Fingerabdruck 718 und dem Krankheitszustand (d.h. dem biologischen Zustand 703) kann in einigen Ausführungsformen sehr früh während des Fortschreitens einer Krankheit (d.h. bevor irgendwelche körperlichen Symptome der Krankheit auftreten und/oder vor der Diagnose der Krankheit) oder zu späteren Zeitpunkten während des Fortschreitens der Krankheit bestimmt werden.
  • Andere Beispiele für biologische Zustände 703, die einem Biomolekül-Fingerabdruck 718 assoziiert werden können, schließen die Ansprechbarkeit oder Nicht-Ansprechbarkeit auf ein Arzneimittel oder Medikament, das Ausmaß der Aktivierung des Immunsystems (z.B. aufgrund der Exposition eines Probanden gegenüber einem exogenen Antigen), die Anfälligkeit eines Probanden gegenüber nachteiligen Wirkungen, die mit der Verabreichung eines Arzneimittels verbunden sind, und die Identifizierung des Potentials eines Probanden, eine allergische Reaktion auf die Verabreichung einer bestimmten Zusammensetzung oder Substanz zu zeigen, ein.
  • Computersteuersystem
  • Die vorliegende Offenbarung stellt Computersteuersysteme bereit, die dazu programmiert sind, um Verfahren der Offenbarung zu implementieren. 66 zeigt ein Computersystem 100, das dazu programmiert oder anderweitig konfiguriert ist, einen Biomolekül-Fingerabdruck 718 einem biologischen Zustand 703 zuzuordnen. Diese Bestimmung, Analyse oder statistische Klassifikation wird durch im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt, die u.a. eine große Vielzahl von überwachten und unüberwachten Datenanalyse- und Clusterbildungsansätzen, wie etwa hierarchische Clusteranalyse (HCA), Hauptkomponentenanalyse (PCA), Partielle Fehlerquadrat-Diskriminanzanalyse (PLS-DA), Maschinelles Lernen (auch bekannt als Random Forest), logistische Regression, Entscheidungsbäume, Support Vector Machine (SVM), k-nächste Nachbarn, naive bayes, lineare Regression, Polynom Regression, SVM für Regression, K-Means-Clustering und versteckte Markov-Modelle, einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind. Das Computersystem 100 kann verschiedene Aspekte zum Analysieren der Biomolekül-Fingerabdrücke 718 der vorliegenden Offenbarung ausführen, wie zum Beispiel Vergleichen/Analysieren der Biomolekülkoronen mehrerer Proben, um mit statistischer Signifikanz zu bestimmen, welche Muster die einzelnen Biomolekülkoronen gemeinsam haben, um einen Biomolekül-Fingerabdruck 718 zu bestimmen, der dem biologischen Zustand 703 assoziiert ist. Das Computersystem kann dazu verwendet werden, um Klassifikator zum Erkennen und Unterscheiden von verschiedenen Biomolekül-Fingerabdrücken 718 (z.B. Eigenschaften der Zusammensetzung einer Proteinkorona) zu entwickeln. Die Daten, die von dem vorliegend offenbarten Sensor-Array gesammelt werden, können verwendet werden, um einen Maschinelles Lernen-Algorithmus zu trainieren, insbesondere einen Algorithmus, der Array-Messungen von einem Patienten empfängt und spezifische Biomolekülkorona-Zusammensetzungen für jeden Patienten ausgibt. Vor dem Training des Algorithmus können Rohdaten aus dem Array zuerst entrauscht werden, um die Variabilität in einzelnen Variablen zu reduzieren.
  • Das Maschinelles Lernen kann verallgemeinert werden als die Fähigkeit einer Lernmaschine, bei neuen, ungesehenen Beispielen/Aufgaben genau zu arbeiten, nachdem sie einen Lerndatensatz verarbeitet hat. Das Maschinelles Lernen kann die folgenden Konzepte und Verfahren enthalten. Konzepte des überwachten Lernens können AODE; ein künstliches neuronales Netzwerk, wie Backpropagation, Autoencoder, Hopfield-Netze, Boltzmann-Maschinen, Restricted Boltzmann-Machinen und Gepulste neuronale Netze, bayessche Statistik, wie Bayes'sches Netzwerk und Bayes'sche Wissensdatenbank; Fallbasiertes Schließen; Gaußsche Prozessregression; Genexpressionsprogrammierung; Gruppenmethode der Datenverarbeitung (GMDH); Induktive Logikprogrammierung; Instanzbasiertes Lernen; Lazy Learning; Learning Automata; Lernvektor-Quantisierung; Logistic Model Tree; Minimum message length (Entscheidungsbäume, Entscheidungsgraphen usw.), wie der „nearest neighbor“-Algorithmus und die Analogie modeling; Probably approximately correct learning (PAC learning); Ripple down rules, eine Wissenserwerbsmethodik; Symbolische Maschinenlern-Algorithmen; Support vector machines; Random Forest; Ensemble learning bzw. Ensemble of clasifiers, wie Bootstrap-Aggregation (Bagging) und Boosting (Meta-Algorithmus); Ordinale Klassifikation; Information fuzzy networks (IFN); Conditional Random Field (CRF); ANOVA; Lineare Klassifikator, wie die Fisher'sche Diskriminanzfunktion, lineare Regression, logistische Regression, multinomiale logistische Regression, einen naiven Bayes-Klassifikator, Perzeptron, Support Vektormaschinen; Quadratic classifiers; k-Nearest-Neighbor-Algorithmus; Boosting; Entscheidungsbäume wie C4.5, Random Forests, ID3, CART, SLIQ, SPRINT; Bayesianische Netze, wie naive Bayes-Klassifikatoren; und Hidden Markov Model einschließen. Konzepte des unüberwachten Lernens können den Expectation-Maximization-Algorithmus; Lernende Vektorquantisierung; Generative topographic map; Information bottleneck method; künstliches neuronales Netzwerk, wie z.B. Selbstorganisierende Karte; Association rule learning, wie Apriori-Algorithmus, Eclat-Algorithmus und FP-Growth-Algorithmus; Hierarchisches Clustering, z.B. Single-Linkage-Clustering und Conceptual Clustering; Cluster-Analyse, wie K-Means-Algorithmus, Fuzzy-Clustering, DBSCAN und OPTICS-Algorithmus; und Ausreißererkennung, wie z.B. lokaler Ausreißerfaktor, einschließen.
  • Das in 66 gezeigte Computersystem 100 ist dazu angepasst, ein hierin beschriebenes Verfahren zu implementieren. Das System 100 umfasst einen zentralen Computer-Server 101, der dazu programmiert ist, die hierin beschriebenen, beispielhaften Verfahren zu implementieren. Der Server 101 enthält eine zentrale Verarbeitungseinheit (CPU, auch „Prozessor“) 105, die ein Einzelkernprozessor, ein Mehrkernprozessor oder eine Vielzahl von Prozessoren zur parallelen Verarbeitung sein kann. Der Server 101 umfasst auch einen Speicher 110 (z.B. Random-Access Memory, Festwert-Speicher, Flash-Speicher); eine elektronische Speichereinheit 115 (z.B. Festplatte); eine Kommunikationsschnittstelle 120 (z.B. Netzwerkadapter) zum Kommunizieren mit einem oder mehreren anderen Systemen; und Peripheriegeräte 125, die Cache-, andere Speicher, Datenspeicher- und/oder elektronische Anzeigeadapter enthalten können. Der Speicher 110, die Speichereinheit 115, die Schnittstelle 120, und die Peripheriegeräte 125 befinden sich über einen Kommunikationsbus (durchgezogene Linien), wie beispielsweise einer Hauptplatine, in Kommunikation mit dem Prozessor 105. Die Speichereinheit 115 kann eine Datenspeichereinheit zum Speichern von Daten sein. Der Server 101 ist mithilfe der Kommunikationsschnittstelle 120 operativ mit einem Computer-Netzwerk („Netzwerk“) 130 gekoppelt. Das Netzwerk 130 kann das Internet, ein Intranet und/oder ein Extranet, ein Intranet und/oder Extranet, das sich in Kommunikation mit dem Internet befindet, ein Telekommunikations- oder Datennetz sein. Das Netzwerk 130 kann in einigen Fällen mithilfe des Servers 101 ein Peer-to-Peer-Netzwerk implementieren, das es Geräten ermöglichen kann, mit dem Server 101 gekoppelt zu werden, um als Client oder als Server zu funktionieren.
  • Die Speichereinheit 115 kann Dateien speichern, wie z.B. Probandenberichte und/oder Kommunikationen mit den Daten über Einzelpersonen oder irgendeinem Aspekt von Daten, die mit der vorliegenden Offenbarung verbunden sind.
  • Der Computer-Server 101 kann über das Netzwerk 130 mit einem oder mehreren Remote-Computersystemen kommunizieren. Das eine oder die mehreren Remote-Computersysteme können zum Beispiel Personal-Computer, Laptops, Tablet PCs, Telefone, Smartphones oder Personal Digital Assistant (PDA) sein..
  • Bei einigen Anwendungen umfasst das Computersystem 100 einen einzelnen Server 101. In anderen Situationen beinhaltet das System mehrere Server, die sich über ein Intranet, Extranet und/oder das Internet in Kommunikation miteinander befinden.
  • Der Server 101 kann dazu eingerichtet sein, hierin bereitgestellte Messdaten oder eine Datenbank, Patienteninformationen vom Probanden, wie zum Beispiel die medizinische Geschichte, die Familiengeschichte, demographische Daten und/oder andere klinische oder persönliche Informationen von potenzieller Relevanz für eine bestimmte Anwendung zu speichern. Solche Informationen können auf der Speichereinheit 115 oder dem Server 101 gespeichert werden und als Daten über ein Netzwerk übertragen werden.
  • Verfahren, wie sie hierin beschrieben sind, können mittels ausführbaren Maschinen- (oder Computerprozessor-) Codes (oder Software) implementiert werden, die an einem elektronischen Speicherort des Servers 101 gespeichert sind, wie beispielsweise in dem Speicher 110 oder der elektronischen Speichereinheit 115. Während der Verwendung kann der Code durch den Prozessor 105 ausgeführt werden. In einigen Fällen kann der Code von der Speichereinheit 115 abgerufen und in dem Speicher 110 für einen leichten Zugriff durch den Prozessor 105 gespeichert werden. In einigen Situationen kann auf die elektronische Speichereinheit 115 verzichtet werden, wobei maschinenausführbare Anweisungen in dem Speicher 110 gespeichert werden. Alternativ kann der Code auf einem zweiten Computersystem 140 ausgeführt werden.
  • Aspekte der hier bereitgestellten Systeme und Verfahren, wie der Server 101, können in der Programmierung verwirklicht sein. Verschiedene Aspekte der Technologie können als „Produkte“ oder „Herstellungsartikel“ typischerweise in der Form eines ausführbaren Maschinen- (oder Prozessor-) Codes und/oder zugehöriger Daten betrachtet werden, die auf einem maschinenlesbaren Speichermediums abgelegt oder verwirklicht bzw. verkörpert sind. Der maschinenausführbare Code kann in einer elektronischen Speichereinheit, einem solchen Speicher (z.B. ROM-Speicher, RAM-Speicher, Flash-Speicher) oder auf einer Festplatte gespeichert sein. Die „Speichermedien“ können irgendeinen oder den gesamten greifbaren Speicher der Computer, Prozessoren oder dergleichen oder zugehörige Module davon umfassen, wie etwa verschiedene Halbleiterspeicher, Bandlaufwerke, Plattenlaufwerke und dergleichen, die für die Softwareprogrammierung jederzeit nicht-flüchtigen Speicher bereitstellen können. Alle oder Teile der Software können zeitweise über das Internet oder verschiedene andere Telekommunikationsnetze übertragen werden. Solch eine Kommunikation kann beispielsweise das Laden der Software von einem Computer oder Prozessor in einen anderen ermöglichen, zum Beispiel von einem Verwaltungsserver oder Hostcomputer in die Computerplattform eines Anwendungsservers. Somit umfasst ein anderes Speichermedium, das die Softwareelemente speichern kann, optische, elektrische Speichermedien und elektromagnetische Wellen, wie sie über physikalische Schnittstellen zwischen lokalen Vorrichtungen, über verdrahtete und optische Festnetze und über verschiedene Luftverbindungen verwendet werden. Die physikalischen Elemente, die solche Wellen tragen, wie verdrahtete oder drahtlose Verbindungen, optische Verbindungen oder dergleichen, können ebenfalls als die Software tragende Medien betrachtet werden. Wie hierin verwendet, können sich, sofern nicht auf nicht-flüchtige, greifbare „Speichermedien“ beschränkt, die Begriffe wie computer- oder maschinen-„lesbares Medium“ auf jedes Medium beziehen, das an der Bereitstellung von Anweisungen an einen Prozessor zur Ausführung beteiligt ist.
  • Die hierin beschriebenen Computersysteme können computerausführbaren Code zum Durchführen von einem der hierin beschriebenen Algorithmen oder Algorithmenbasierenden Verfahren umfassen. In einigen Anwendungen verwenden die hierin beschriebenen Algorithmen eine Speichereinheit, die aus mindestens einer Datenbank besteht.
  • Die Daten, die sich auf die vorliegende Offenbarung beziehen, können über ein Netzwerk oder Verbindungen zum Empfangen und/oder Überprüfen durch einen Empfänger übertragen werden. Der Empfänger kann der Proband, auf den sich der Bericht bezieht, oder dessen Betreuer sein, z.B. ein Gesundheitsfürsorgeanbieter, ein Manager, anderes Gesundheitsfürsorgepersonal oder andere Betreuer; eine Person oder Instituion, die die Analyse durchgeführt und/oder angefordert hat. Der Empfänger kann auch ein lokales oder Remote-System zum Speichern solcher Berichte sein (z.B. Server oder andere Systeme einer „Cloud-Computing“ -Architektur). In einer Ausführungsform umfasst ein computerlesbares Medium ein Medium, das zur Übertragung eines Ergebnisses einer Analyse einer biologischen Probe unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren geeignet ist.
  • Die hierin offenbarten Aspekte der Systeme und Verfahren, wie das Computersystem 101 in 66, können in der Programmierung verwirklicht sein. Die verschiedenen Aspekte der Technologie können als „Produkte“ oder „Herstellungsartikel“ typischerweise in der Form eines Maschinen-(oder Prozessor-)ausführbaren Codes und/oder zugehöriger Daten betrachtet werden, die auf einem Typ eines maschinenlesbaren Mediums verwirklicht oder verkörpert sind. Der maschinenausführbare Code kann auf einer elektronischen Speichereinheit gespeichert werden, wie beispielsweise einem Speicher (einem ROM-Speicher, RAM-Speicher, Flash-Speicher) oder einer Festplatte. Die „Speichermedien“ können irgendeinen oder den gesamten erreichbaren Speicher der Computer, Prozessoren oder dergleichen oder zugehörige Module davon umfassen, wie etwa verschiedene Halbleiterspeicher, Bandlaufwerke, Plattenlaufwerke und dergleichen, die für die Softwareprogrammierung jederzeit nicht-flüchtigen Speicher bereitstellen können. Die gesamte oder Teile der Software können zeitweise über das Internet oder verschiedene andere Telekommunikationsnetze übertragen werden. Eine solche Kommunikation kann beispielsweise das Laden der Software von einem Computer oder Prozessor in einen anderen ermöglichen, zum Beispiel von einem Verwaltungsserver oder Hostcomputer in die Computerplattform eines Anwendungsservers. Somit kann eine andere Art von Medium, die die Softwareelemente tragen kann, optische, elektrische und elektromagnetische Wellen umfassen, wie sie über physische Schnittstellen zwischen lokalen Vorrichtungen, über verdrahtete und optische Festnetzen und über verschiedene Luftverbindungen verwendet werden. Die physikalischen Elemente, die solche Wellen transportieren, wie verdrahtete oder drahtlose Verbindungen, optische Verbindungen oder dergleichen, können ebenfalls als Medien betrachtet werden, die die Software tragen. Die hierin verwendeten Ausdrücke, wie beispielsweise computer- oder maschinen-„lesbares Medium“, beziehen sich auf jedes Medium, das an der Bereitstellung von Anweisungen an einen Prozessor zur Ausführung beteiligt ist, sofern sie nicht auf nicht-flüchtige, greifbare „Speicher“-Medien beschränkt nicht.
  • Daher kann ein maschinenlesbares Medium, wie zum Beispiel computerausführbarer Code, in vielen Formen haben, einschließlich ein greifbares Speichermedium, ein Trägerwellenmedium oder ein physikalisches Übertragungsmedium, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Nicht-flüchtige Speichermedien umfassen zum Beispiel optische oder magnetische Platten, wie beispielsweise irgendeine der Speichervorrichtungen in irgendeinem Computer oder ähnlichem, die zum Implementieren der in den Zeichnungen gezeigten Datenbanken usw. verwendet werden können. Flüchtige Speichermedien umfassen dynamischen Speicher, wie z.B. den Hauptspeicher einer solchen Computerplattform. Greifbare Übertragungsmedien umfassen Koaxialkabel, Kupferdraht und optische Fasern, einschließlich der Drähte, die einen Bus in einem Computersystem umfassen. Trägerwellen-Übertragungsmedien können die Form von elektrischen oder elektromagnetischen Signalen oder akustischen oder Lichtwellen annehmen, wie sie während der Radiofrequenz (RF)- und Infrarot (IR)-Datenkommunikation erzeugt werden. Übliche Formen von computerlesbaren Medien umfassen daher beispielsweise: eine Diskette, eine Festplatte, ein Magnetband, ein beliebiges anderes magnetisches Medium, eine CD-ROM, DVD oder DVD-ROM, irgendein anderes optisches Medium, Lochkarten, irgendein anderes physikalisches Speichermedium mit Lochmustern, ein RAM, ein ROM, ein PROM und EPROM, ein FLASH-EPROM, ein beliebiger anderer Speicherchip oder eine andere Kassette, eine Trägerwelle, die Daten oder Anweisungen transportiert, Kabel oder Verbindungen, die einen solchen Träger transportieren, oder irgendein anderes Medium, von dem ein Computer Programmiercode und/oder Daten lesen kann. Viele dieser Formen von computerlesbaren Medien können an der Übertragung einer oder mehrerer Sequenzen von einer oder mehreren Anweisungen an einen Prozessor zur Ausführung beteiligt sein.
  • Physikochemische Eigenschaften
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Mehrzahl von Sensorelementen eine Vielzahl von Partikeln, besteht im Wesentlichen aus diesen oder besteht gänzlich daraus, wobei sich jeder Partikel durch mindestens eine physikochemische Eigenschaft von den anderen unterscheidet, so dass jedes Sensorelement eine eindeutige Biomolekülkorona-Signatur aufweist, wenn es mit der gleichen Probe in Kontakt gebracht wird.
  • Die physikochemische Eigenschaft des Sensorelements in einem Array bezieht sich beispielsweise auf die Zusammensetzung, Größe, Oberflächenladung, Hydrophobizität, Hydrophilie, Oberflächenfunktionalität (Oberflächenfünktionsgruppen), Oberflächentopographie, Oberflächenkrümmung und Form. Der Begriff Zusammensetzung umfasst die Verwendung verschiedener Arten von Materialien und Unterschiede in den chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften von Materialien, zum Beispiel die Leitfähigkeit des ausgewählten Materials zwischen den Sensorelementen.
  • Die Oberflächenkrümmung wird im Allgemeinen durch die Nanopartikelgröße bestimmt. Daher ändert sich die Oberflächenkrümmung des Partikels im Nanometermaßstab, wenn sich die Größe der Nanopartikel ändert, und diese Änderung der Oberflächenkrümmung beeinflusst die Bindungsselektivität der Oberfläche. Zum Beispiel kann die Oberfläche des Partikels bei einer bestimmten Krümmung eine Bindungsaffinität für einen spezifischen Typ von Biomolekül aufweisen, wobei eine andere Krümmung eine unterschiedliche Bindungsaffinität und/oder eine Bindungsaffinität für ein anderes Biomolekül aufweisen wird. Die Krümmung kann eingestellt werden, um eine Vielzahl von Sensorelementen mit veränderter Affinität für verschiedene Biomoleküle zu erzeugen. Es kann ein Sensor-Array erzeugt werden, das eine Vielzahl von Sensorelementen mit unterschiedlichen Krümmungen (z.B. unterschiedlichen Größen) enthält, was zu einer Vielzahl von Sensorelementen führt, die jeweils eine unterschiedliche Biomolekülkorona-Signatur aufweisen.
  • Die Oberflächenmorphologie kann auch durch Verfahren modifiziert werden, wie durch Strukturieren der Oberfläche, um unterschiedliche Affinitäten bereitzustellen, technische Oberflächenkrümmungen auf mehreren Längenskalen und dergleichen. Die Strukturierung der Oberfläche erfolgt beispielsweise durch Ausbildung der Sensorelemente durch Blockpolymerisation, bei der die mindestens zwei Blöcke unterschiedliche Chemien aufweisen, wobei die Nanopartikel unter Verwendung von Mischungen von mindestens zwei verschiedenen Polymeren und einer Phasentrennung der Polymere während der Polymerisation und/oder Vernetzung der separaten Polymere nach der Phasentrennung ausgebildet werden. Es ist eine eingebrachte Oberflächenkrümmung auf mehreren Längenskalen vorgesehen, beispielsweise durch Verwendung von Pickering-Emulsionen (Sacanna et al. 2007), die durch feinteilige Partikel für die Synthese von Nanopartikeln stabilisiert werden. In einigen Ausführungsformen werden fein geteilte Partikel ausgewählt aus zum Beispiel Silikate, Aluminate, Titanate, Metalloxide, wie Aluminium, Silizium, Titan, Nickel, Kobalt, Eisen, Mangan, Chrom, oder Vanadiumoxide, Carbo Blacks und Nitride oder Karbide, beispielsweise Bornitrid, Borcarbid, Siliziumnitrid oder Siliziumcarbid und anderen.
  • Zum Beispiel können die Sensorelemente, die nanoskalige Sensorelemente enthalten, jeweils so funktionalisiert sein, dass sie unterschiedliche physikochemische Eigenschaften aufweisen. Geeignete Verfahren zum Funktionalisieren der Sensorelemente sind im Stand der Technik bekannt und hängen von der Zusammensetzung des Sensorelements (z.B. Gold, Eisenoxid, Siliciumdioxid, Silber usw.) ab und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, funktionalisiertes Aminopropyl, funktionalisiertes Amin, funktionalisierte Boronsäure, funktionalisierte Carbonsäure, funktionalisiertes Methyl, funktionalisierter N-Succinimidylester, funktionalisiertes PEG, funktionalisiertes Streptavidin, funktionalisierter Methylether, funktionalisiertes Triethoxylpropylaminosilan, funktionalisiertes Thiol, funktionalisiertes PCP, funktionalisiertes Citrat, funktionalisierte Liponsäure, funktionalisiertes Polyethylenimin (BPEI), funktionalisiertes Carboxyl, funktionalisiertes Hydroxyl und dergleichen. In einer Ausführungsform können die Nanopartikel mit einer Amingruppe (-NH2 oder einer Carboxylgruppe (COOH)) funktionalisiert sein. In einigen Ausführungsformen sind die nanoskaligen Sensorelemente mit einer polaren funktionellen Gruppe funktionalisiert. Nicht-einschränkende Beispiele für die polare funktionelle Gruppe umfassen eine Carboxylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Thiolgruppe, eine Cyanogruppe, eine Nitrogruppe, eine Ammoniumgruppe, eine Imidazoliumgruppe, eine Sulfoniumgruppe, eine Pyridiniumgruppe, eine Pyrrolidiniumgruppe, eine Phosphoniumgruppe oder eine beliebige Kombination davon. In einigen Ausführungsformen ist die funktionelle Gruppe eine saure funktionelle Gruppe (z.B. Sulfonsäuregruppe, Carboxylgruppe und dergleichen), eine basische funktionelle Gruppe (z.B. Aminogruppe, cyclische sekundäre Aminogruppe (wie Pyrrolidylgruppe und Piperidylgruppe). eine Pyridylgruppe, Imidazolgruppe, Guanidingruppe usw.), eine Carbamoylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Aldehydgruppe und dergleichen.. In einigen Ausführungsformen ist die polare funktionelle Gruppe eine ionische funktionelle Gruppe. Nicht einschränkende Beispiele für die ionische Funktionsgruppe umfassen eine Ammoniumgruppe, eine Imidazoliumgruppe, eine Sulfoniumgruppe, eine Pyridiniumgruppe, eine Pyrrolidiniumgruppe, eine Phosphoniumgruppe. In einigen Ausführungsformen sind die Sensorelemente mit einer polymerisierbaren funktionellen Gruppe funktionalisiert.. In einigen Ausführungsformen werden die Sensorelemente mit einer polymerisierbaren funktionellen Gruppe funktionalisiert. Nicht einschränkende Beispiele für die polymerisierbare funktionelle Gruppe umfassen eine Vinylgruppe und eine (Meth) acrylgruppe. In einigen Ausführungsformen ist die funktionelle Gruppe Pyrrolidinylacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, Acrylamid, 2-(Dimethylamino)ethylmethacrylat, Hydroxyethylmethacrylat und dergleichen.
  • In anderen Ausführungsformen können die physikochemischen Eigenschaften der Sensorelemente durch Modifikation der Oberflächenladung modifiziert werden. Zum Beispiel kann die Oberfläche modifiziert werden, um eine neutrale Nettoladung, eine positive Nettooberflächenladung, eine negative Nettooberflächenladung oder eine zwitterionische Ladung bereitzustellen. Die Ladung der Oberfläche kann entweder während der Synthese des Elements oder durch Modifikation der Ladung nach der Synthese durch Oberflächenfunktionalisierung gesteuert werden. Bei polymeren Nanopartikeln können Unterschiede in der Ladung während der Synthese durch Verwendung verschiedener Syntheseverfahren, unterschiedlicher geladener Comonomere und in anorganischen Substanzen durch gemischte Oxidationszustände erreicht werden.
  • Nanopartikel
  • In einigen Ausführungsformen sind die Partikel Nanopartikel. In einigen Ausführungsformen sind die Partikel Liposomen. Die Liposomen können ein beliebiges Lipid umfassen, das einen Partikel bilden kann. Der Begriff „Lipid“ bezieht sich auf eine Gruppe von organischen Verbindungen, die Ester von Fettsäuren sind und dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in Wasser unlöslich, aber in vielen organischen Lösungsmitteln löslich sind. Lipide werden üblicherweise in mindestens drei Klassen eingeteilt: (1) „einfache Lipide“, die Fette und Öle sowie Wachse einschließen, (2) „Verbindungslipide“, die Phospholipide und Glycolipide einschließen, und (3) „abgeleitete Lipide“, wie Steroide. In einer Ausfiihrungsform umfasst das Liposom ein oder mehrere kationische Lipide oder anionische Lipide und ein oder mehrere stabilisierende Lipide. Geeignete Liposome sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, zum Beispiel DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-(1'-rac-Glycerol)]), DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan), DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin), CHOL (DOPC-Cholesterin) und Kombinationen davon.
  • Die Lipid-basierte Oberfläche eines Liposoms kann mit einer Teilmenge von Biomolekülen (z.B. Proteinen) einer komplexen biologischen Probe (z.B. Plasma oder irgendeiner Probe mit einer komplexen Mischung von Biomolekülen, wie Proteinen und Nukleinsäure, und mindestens einem von Polysaccharid und Lipid) an einer Lipid-Biomolekül (z.B. Protein)-Schnittstelle, wodurch die Teilmenge von Proteinen gebunden wird, um ein Muster einer Biomolekül (z.B. Protein)-Bindung zu erzeugen..
  • In einer Ausführungsform umfasst das Liposom ein kationisches Lipid. Bei der Verwendung hierin bezieht sich der Begriff „kationisches Lipid“ auf ein Lipid, das kationisch ist oder kationisch wird (protoniert), wenn der pH unter den pK der ionisierbaren Gruppe des Lipids abgesenkt wird, aber bei höheren pH-Werten zunehmend neutraler ist. Bei pH-Werten unterhalb des pK kann das Lipid dann mit negativ geladenen Nukleinsäuren assoziieren. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das kationische Lipid ein zwitterionisches Lipid, das bei pH-Wert-Abnahme eine positive Ladung annimmt. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Liposomen kationisches Lipid. In einigen Ausführungsformen umfasst das kationische Lipid irgendeine eine Anzahl von Lipidspezies, die bei einem selektiven pH, wie einem physiologischen pH, eine positive Nettoladung tragen. Solche Lipide umfassen, sind aber nicht beschränkt auf N, N-Dioleyl-N, N-dimethylammoniumchlorid (DODAC); N- (2,3-Dioleyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA); N, N-Distearyl-N, N-dimethylammoniumbromid (DDAB); N- (2,3-Dioleoyloxy) propyl) -N, N, N-trimethylammoniumchlorid (DOTAP); 3- (N- (N', N'-Dimethylaminoethan) -Carbamoyl)-Cholesterin (DC-Chol), N- (1- (2,3-Dioleoyloxy) propyl) -N-2- (Spermincarboxamido) ethyl) -N , N-Dimethylammoniumtrifluoracetat (DOSPA), Dioctadecylamidoglycylcarboxyspermin (DOGS), 1,2-Dioleoyl-3-dimethylammoniumpropan (DODAP), N, N-Dimethyl-2,3-dioleoyloxy) propylamin (DODMA), N- (1,2-Dimyristyloxyprop-3-yl) -N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE), 1,2-Dioleoyl-sn-3-phosphoethanolamin (DOPE), N- (1- (2, 3-Dioleyloxy) propyl) -N- (2- (spemincarboxamido) ethyl) -N, N-dimethylammoniumtrifluoracetat (DOSPA), Dioctadecylamidoglycylcarboxyspermin (DOGS) und 1,2-Ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC). Die folgenden Lipide sind kationisch und haben eine positive Ladung unterhalb des physiologischen pH-Wertes: DODAP, DODMA, DMDMA, 1,2-Dilinoleyloxy-N, N-dimethylaminopropan (DLinDMA), 1,2-Dilinolenyloxy-N, N-dimethylaminopropan (DLenDMA). In einigen Ausführungsformen ist das Lipid ein Aminolipid.
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Liposom ein oder mehrere zusätzliche Lipide, die die Anordnung von Partikeln während ihres Anordnens stabilisieren. Geeignete stabilisierende Lipide umfassen neutrale Lipide und anionische Lipide. Geeignete stabilisierende Lipide schließen neutrale Lipide und anionischen Lipiden. Der Begriff „neutrales Lipid“ bezieht sich auf irgendeine Anzahl von Lipidspezies, die entweder in ungeladener oder neutraler zwitterionischer Form bei physiologischem pH-Wert vorliegen.. Repräsentative neutrale Lipide umfassen diaclphosphatidylcholines, diacylphosphatidylethanolamines, Ceramide, Sphingomyeline, dihydro Sphingomyeline, Kephaline und Cerebroside. Beispielhafte neutrale Lipide umfassen beispielsweise Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Dioleoyl-Phosphatidylethanolamin (DOPE), Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC), Palmitoyloleoylphosphatidylcholin-Phosphatidylethanolamin (POPE) und Dioleoyl-Phosphatidylethanolamin 4- (N-maleimidomethyl) -cyclohexan-1-carboxylat (DOPE-mal), Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE), dimyristoylphosphoethanolamine (DMPE), Distearoyl-Phosphatidylethanolamin (DSPE), 16-O-monomethylether PE, 16-O-dimethyl PE, 18-1 trans-PE, 1-stearioyl-2-oleoyl-phosphatidyethanol Amin (SOPE) und 1,2-dielaidoyl-sn-glycero-3-phophoethanolamine (transDOPE). In einer Ausführungsform ist das neutrale Lipid 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC).
  • Der Begriff „anionisches Lipid“ bezieht sich auf jedes Lipid, das bei physiologischem pH negativ geladen ist. Diese Lipide umfassen Phosphatidylglycerol, Cardiolipindiacylphosphatidylserin, Diacylphosphatidinsäure, N-Dodecanoylphosphatidylethanolamine, N-Succinylphosphatidylethanolamine, N-Glutarylphosphatidylethanolamine, Lysylphosphatidyglyzerine, Palmitoyloleoylphosphatidylglycerin (POPG) und andere anionische modifizierende Gruppen, die an neutrale Lipide gebunden sind. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Liposom Glycolipide (z.B. Monosialogangliosid GM 1). In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Liposom ein Sterol, wie Cholesterin. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Liposom ein zusätzliches stabilisierendes Lipid, das ein Polyethylenglycol-Lipid ist. Geeignete Polyethylenglycol-Lipide umfassen PEG-modifiziertes Phosphatidylethanolamin, PEG-modifizierte Phosphatidsäure, PEG-modifizierte Ceramide (z.B. PEG-CerC14 oder PEG-CerC20), PEG-modifizierte Dialkylamine, PEG-modifizierte Diacylglycerine, PEG-modifizierte Dialkylglycerole. Repräsentative Polyethylenglycol-Lipide umfassen PEG-c-DOMG, PEG-c-DMA und PEG-s-DMG. In einer Ausführungsform ist das Polyethylenglycol-Lipid N - [(Methoxypoly (ethylenglycol) sub.2000) carbamyl] -1,2-dimyristyloxlpropyl-3-amin (PEG-c-DMA). In einer Ausführungsform ist das Polyethylenglycol-Lipid PEG-c-DOMG).
  • Geeignete Liposomen können feste Lipidnanopartikel (SLN) sein, die aus festem Lipid, Emulgator und/oder Wasser/Lösungsmittel hergestellt sein können. SLN kann eine Kombination der folgenden Bestandteile umfassen, ist jedoch nicht darauf beschränkt: Triglyceride (Tristearin), Partialglyceride (Imwitor), Fettsäuren (Stearinsäure, Palmitinsäure) und Steroide (Cholesterin) und Wachse (Cetylpalmitat). Verschiedene Emulgatoren und ihre Kombination (Pluronic F 68, F 127) wurden zur Stabilisierung der Lipiddispersion verwendet. Geeignete Bestandteile für die Verwendung bei der Herstellung von SNL-Sensorelementen umfassen Phospholipide, Glycerin, Poloxamer 188, Sojaphosphatidylcholin, Compritol, Cetylpalmitat, PEG 2000, PEG 4500, Tween 85, Ethyloleat, Na-Alginat, sind aber nicht darauf beschränkt B. Ethanol/Butanol, Tristearinglycerid, PEG 400, Isopropylmyristat, Pluronic F68, Tween 80, Trimyristin, Tristearin, Trilaurin, Stearinsäure, Glycerylcaprat als Capmul® MCM C10, Theobromaöl, Triglyceridkokosöl, 1-Octadecanol, Glycerinbehenat als Compritol® 888 ATO, Glycerinpalmitostearat als Precirol® ATO 5 und Cetylpalmitatwachs und dergleichen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von halben Partikeln oder besteht im Wesentlichen oder gänzlich daraus, die unterschiedliche geometrische Formen haben, die durch eine Formgebungstechnologie, 3-D-Druck oder 4-D-Druck hergestellt werden können. Geeignete halbe Partikel sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf halbe und teilweise Partikel in jeder beliebigen geometrischen Form, beispielsweise Kugeln, Stäbe, Dreiecke, Würfel und Kombinationen davon. Geeigneterweise weist die Mehrzahl von halben Partikeln in einer Ausführungsform unterschiedliche physikochemische Eigenschaften auf, die durch 3-D-Druck hergestellt werden.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Sensorelemente, einschließlich nanoskaliger Sensorelemente, durch 3-D- oder 4D-Druck hergestellt. Geeignete Verfahren zum 3-D- und 4-D-Drucken von Sensorelementen, einschließlich nanoskaliger Sensorelemente, sind im Stand der Technik bekannt. Geeignete Materialien für den 3D- und 4D-Druck umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. Kunststoffe und synthetische Polymere (z.B. Polyethylenglycoldiacrylat (PEG-DA), Poly (e-caprolacton) (PCL), Poly (propylenoxid) (PPO), Poly (ethylenoxid) (PEO) usw.), Metalle, Pulver, Glas, Keramik und Hydrogele. Geeignete Formen, die durch 3-D- oder 4-D-Druck hergestellt werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf beispielsweise Voll- oder Teilkkugeln (z.B. 3/4 oder halbe Kugeln), Stäbe, Würfel, Dreiecke oder andere geometrische oder nicht-geometrische Formen.
  • 3D-Drucktechniken umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Mikroextrusionsdruck, Tintenstrahl-Bioprinting, lasergestütztes Bioprinting, Stereolithographie, omnidirektionales Drucken und Stempeldrucken.
  • In einigen Ausführungsformen sind die nanoskaligen Sensorelemente Nanopartikel. Geeignete Nanopartikel sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, zum Beispiel natürliche oder synthetische Polymere, Copolymere, Terpolymere (wobei die Kerne aus Metallen oder anorganischen Oxiden einschließlich Magnetkernen bestehen). Zu den geeigneten polymeren Nanopartikeln gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. Polystyrol; Poly(Lysin), Chitosan, Dextran, Poly(Acrylamid) und seine Derivate, wie N-Isopropylacrylamid, N-tert-Butylacrylamid, N, N-Dimethylacrylamid, Polyethylenglykol, Poly(Vinylalkohol), Gelatine, Stärke, abbaubare (Bio-) Polymere Siliciumdioxid und dergleichen.
  • In verschiedenen Ausführungsformen kann der Kern der Nanopartikel ein organischer Partikel, ein anorganischer Partikel oder einen Partikel aufweisen, der sowohl organische als auch anorganische Materialien umfasst. Zum Beispiel können die Partikel eine Kernstruktur aufweisen, die ein Metallpartikel, ein Quantenpunktpartikel, ein Metalloxidpartikel oder ein Kern-Schalen-Partikel ist oder umfasst. Zum Beispiel kann die Kernstruktur ein Polymerpartikel oder ein Partikel auf Lipidbasis sein oder umfassen, und die Linker können ein Lipid, ein Tensid, ein Polymer, eine Kohlenwasserstoffkette oder ein amphiphiles Polymer umfassen. Zum Beispiel können die Linker Polyethylenglycol oder Polyalkylenglycol einschließen, z.B. können die ersten Enden der Linker ein Lipid umfassen, das an Polyethylenglycol (PEG) gebunden ist, und die zweiten Enden können funktionelle Gruppen umfassen, die an das PEG gebunden sind. In diesen Verfahren können die ersten oder zweiten funktionellen Gruppen eine Amingruppe, eine Maleimidgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine Carboxylgruppe, eine Pyridylthiolgruppe oder eine Azidgruppe aufweisen.
  • In bestimmten Ausführungsformen können die Nanopartikel Polymere umfassen, die zum Beispiel Natriumpolystyrolsulfonat (PSS), Polyethylenoxid (PEO), Polyoxyethylenglycol, Polyethylenglycol (PEG), Polyethylenimin (PEI), Polymilchsäure, Polycaprolacton, Polyglycolsäure, Poly (Lactid-co-Glycolid-Polymer (PLGA), Celluloseether) Polymer, Polyvinylpyrrolidon, Vinylacetat, Polyvinylpyrrolidon-Vinylacetat-Copolymer, Polyvinylalkohol (PVA), Acrylat, Polyacrylsäure (PAA), Vinylacetat, Crotonsäure-Copolymere, Polyacrylamid, Polyethylenphosphonat, Polybutenphosphonat, Polystyrol, Polyvinylphosphonat, Polyalkylen, Carboxyvinyl-Polymer, Natriumalginat, Carrageenan, Xanthangummi, Akaziengummi, Arabischer Gummi, Guargummi, Pullulan, Agar, Chitin, Chitosan, Pektin, Karayagummi, Johannisbrotkernmehl, Maltodextrin, Amylose, Maisstärke, Kartoffelstärke, Reisstärke, Tapiokastärke, Erbsenstärke, Süßkartoffelstärke, Gerstenstärke, Weizen Stärke, hydroxypropylierte Stärke mit hohem Amylosegehalt, Dextrin, Levan, Elsinan, Gluten, Kollagen, Molkeproteinisolat, Casein, Milchprotein, Sojaprotein, Keratin oder eine Gelatine oder ein Copolymer, Derivat oder eine Mischung davon mit einschließen.
  • In anderen Ausführungsformen kann das Polymer ein Polyethylen, Polycarbonat, Polyanhydrid, Polyhydroxysäure, Polypropylen, Polycaprolacton, Polyamid, Polyacetal, Polyether, Polyester, Poly(orthoester), Polycyanacrylat, Polyvinylalkohol, Polyurethan, Polyphosphazen, Polyacrylat, Polymethacrylat, Polycyanacrylat sein oder umfassen Polyharnstoff, Polystyrol oder ein Polyamin oder ein Copolymer, Derivat oder eine Mischung davon sein oder umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen stellt die vorliegende Offenbarung Nanopartikel bereit, die biologisch abbaubare Polymere umfassen. Die nicht-einschränkenden beispielhaften biologisch abbaubaren Polymere können Poly-ß-aminoester (PBAEs), Poly (amidoamine), Polyester einschließlich Polymilchsäure-co-glykolsäure (PLGA), Polyanhydride, bioreduzierbare Polymere und andere biologisch abbaubare Polymere sein. In einigen Ausführungsformen umfasst das bioabbaubare Polymer 2- (3-Aminopropylamino) ethanol-endmodifiziertes Poly (1,4-butandioldiacrylat-co-4-amino-1-butanol), (1- (3-Aminopropyl) -4- Methylpiperazin-endmodifiziertes Poly (1,4-butandioldiacrylat-co-4-amino-1-butanol), 2- (3-Aminopropylamino) ethanol-endmodifiziertes Poly (1,4-butandioldiacrylat-co-5-amino- 1-Pentanol), (1- (3-Aminopropyl) -4-methylpiperazin-endmodifiziertes Poly (1,4-butandioldiacrylat-co-5-amino-1-pentanol), 2- (3-Aminopropylamino) ethanol- modifiziertes Poly (1,5-pentandioldiacrylat-co-3-amino-1-propanol) und (1- (3-Aminopropyl) -4-methylpiperazin-endmodifiziertes Poly (1,5-pentandioldiacrylat-co-3-amino) -1-Propanol).
  • Array-Substrate
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Sensor-Array ein Substrat. Ungeachtet der Identität des Sensorelements kann diese Erfindung durch eine Matrix von Sensorelementen ausgeführt werden, die auf einem festen Substrat festgelegt ist, mit diesem verbunden und/oder gekoppelt sind. Das Substrat kann Polydimethylsiloxan (PDMS), Siliciumdioxid, mit Gold oder Gold beschichtetes Substrat, mit Silber oder Silber beschichtetes Substrat, mit Platin oder Platin beschichtetes Substrat, mit Zink oder Zink beschichtetes Substrat, mit Kohlenstoff beschichtetes Substrat und dergleichen umfassen oder daraus zumindest im Wesentlichen bestehen. Der Fachmann kann ein geeignetes Substrat für das Sensor-Array auswählen. In einigen Ausführungsformen bestehen die Sensorelemente und das Substrat aus demselben Element, beispielsweise Gold. In einigen Ausführungsformen bilden das Substrat und die Sensorelemente (z.B. Nanopartikel) einen Chip.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst die Vielzahl von Sensorelementen eine einzelne Oberfläche, Platte oder Chip, die zwei oder mehr einzelne Sensorelemente (Bereiche) mit topologischen Unterschieden enthält, die eine diskrete Biomolekülkoronabildung an jedem einzelnen Element (Bereich) ermöglicht. Die Oberflächenplatte oder der Chip kann so hergestellt werden, um die zwei oder mehr diskreten Elemente (Bereiche) der hierin beschriebenen Verfahren zu umfassen. Die diskreten Bereiche können erhöhte Oberflächen mit unterschiedlichen geometrischen Formen, unterschiedlichen Größen oder unterschiedlichen Ladungen oder anderen topologischen Unterschieden sein, die zu diskreten Sensorelementen mit der Fähigkeit führen, diskrete Biomolekülkoronen zu bilden.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Sensorelemente nicht-kovalent an das Substrat gebunden. Geeignete Verfahren zur nicht-kovalenten Bindung sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, zum Beispiel Metallkoordination, Ladungswechselwirkung, hydrophob-hydrophobe Wechselwirkung, Chelatbildung und dergleichen. In anderen Ausführungsformen sind die Sensorelemente kovalent an das Substrat gebunden. Geeignete Verfahren zum kovalenten Befestigen der Sensorelemente und der Substrate umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, zum Beispiel Klickchemie, Bestrahlung und dergleichen.
  • Nur zum Zweck der Veranschaulichung, sind in den 23-40 Verfahren zur Befestigung der Sensorelemente, beispielsweise nanoskaliger Sensorelemente, an Substraten gezeigt. Zum Beispiel können die Sensorelemente über die Amidierungsreaktion zwischen den Aminogruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Carbonsäuregruppen auf der Nanopartikeloberfläche (23), über die Ringöffnungsreaktion zwischen den Epoxidgruppen auf der Oberfläche des Siliciumdioxidsubstrats und Aminogruppen auf der Oberfläche der Nanopartikel (24), über die Michael-Additionsreaktion zwischen den Maleimidgruppen auf der Siliciumdioxid-Substratoberfläche und Thiol- oder Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche (25), über die Urethanreaktion zwischen den Isocyanatgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Hydroxyl- oder Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche (26), über die Oxidationsreaktion zwischen den Thiolgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und denen auf der Nanopartikeloberfläche (27), über die „Klick“ -Chemie zwischen Azidgruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Alkingruppen auf der Nanopartikeloberfläche (28), über die Thiol-Austauschreaktion zwischen 2-Pyridyldithio-Gruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Thiolgruppen auf der Nanopartikeloberfläche (29), über die Koordinationsreaktion zwischen Boronsäuregruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Diolgruppen auf der Nanopartikeloberfläche (30), über die UV-Licht-bestrahlte Additionsreaktion zwischen C = C-Bindungen auf der Substratoberfläche und C = C-Bindungen auf der Nanopartikeloberfläche (31) und der gleichen mit einem Substrat (z.B. Silikasubstrat) konjugiert sein. Geeignete Verfahren zum Konjugieren von Sensorelementen an ein Goldsubstrat sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise die Konjugation über Au-Thiolbindungen (32), über die Amidierungsreaktion zwischen den Carbonsäuregruppen auf der Goldsubstratoberfläche und den Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche (33), durch „Klick“ -Chemie zwischen den Azidgruppen auf der Gold-Substratoberfläche und den Alkingruppen auf der Nanopartikeloberfläche (34), über die Urethanreaktion zwischen den NHS-Gruppen auf der Gold-Substratoberfläche und den Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche ( 35), über die Ringöffnungsreaktion zwischen den Epoxidgruppen auf der Goldoberfläche und den Aminogruppen auf der Nanopartikeloberfläche (36), über die Koordinationsreaktion zwischen Boronsäuregruppen auf der Silizium-Substratoberfläche und Diolgruppen auf der Nanopartikeloberfläche (37), über die UV-Licht-bestrahlte Additionsreaktion zwischen C = C-Bindungen auf der Goldoberfläche und C = C-Bindungen auf der Nanopartikeloberfläche (38), über die „Ligand-Rezeptor“ -Wechselwirkung zwischen Biotin auf Goldsubstratoberfläche und Avidin auf der Nanopartikeloberfläche (39), über die „Wirt-Gast“ -Wechselwirkung zwischen a-Cyclodextrin (a-CD) auf der Gold-Substratoberfläche und Adamantin (Ad) auf der Nanopartikel-Oberfläche (40) und dergleichen.
  • In einem anderen Beispiel kann eine sogenannte „Klick-Chemie“ verwendet werden, um die funktionellen Oberflächengruppen an den Kernstrukturen der Nanopartikel zu befestigen (siehe z.B. den Katalog von Sigma Aldrich und US-Patent Nr. 7,375,234 , welche hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen werden). Ein Beispiel ist die 1,3-dipolare Huisgen-Cycloaddition von Alkinen an Azide zu 1,4-disubstituierten 1,2,3-Triazolen. Die Kupfer (I) -katalysierte Reaktion ist mild und sehr effizient, erfordert keine Schutzgruppen und erfordert in vielen Fällen keine Reinigung. Die funktionellen Azid- und Alkin-Gruppen sind im Allgemeinen gegenüber biologischen Molekülen und wässrigen Umgebungen inert. Das Triazol weist Ähnlichkeiten mit dem in der Natur vorkommenden ubiquitären Amidrest auf, ist aber im Gegensatz zu Amiden nicht spaltempfindlich. Darüber hinaus sind sie fast unmöglich zu oxidieren oder zu reduzieren.
  • Die Mehrzahl von Sensorelementen kann auf das Substrat zufällig oder in einem bestimmten Muster angebracht werden. Die Sensorelemente können im Wesentlichen einheitlich positioniert sein. Das Muster der angeordneten Sensorelemente kann gemäß dem Muster variieren, in dem die Sensorelemente an dem Substrat angebracht sind. Jedes Sensorelement ist durch einen Abstand separiert bzw. getrennt. Der Abstand zwischen den Sensorelementen (z.B. Nanopartikeln), die auf dem Substrat angeordnet sind, kann abhängig von der Länge des zum Befestigen verwendeten Linkers oder anderen Herstellungsbedingungen variieren. Gemäß verschiedenen Ausführungsformen kann die Mehrzahl von Sensorelementen auf dem Array mit einem gewünschten Abstand und Muster zwischen Elementen hergestellt werden. Geeignete unterscheidbare Muster sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, parallele Linien, Quadrate, Kreise, Dreiecke und dergleichen. Ferner können die Sensorelemente in Zeilen oder Spalten angeordnet sein. In einigen Ausführungsformen ist das Substrat ein flaches Substrat, in anderen Ausführungsformen ist das Substrat in Form von Mikrokanälen oder Nanokanälen ausgeführt. Nur zu Illustrationszwecken sind geeignete Ausführungsformen in den 15-22 beschrieben. Die Sensorelemente können in Mikrokanälen oder Nanokanälen enthalten sein, die den Fluss der Probe durch die Sensor-Array begrenzen oder steuern. Geeignete Mikrokanäle können im Bereich von 10 µm bis etwa 100 µm liegen.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen nicht einschränkende Beispiele der Mehrzahl von Sensorelementen (a) eine Mehrzahl von Sensorelementen, die aus dem gleichen Material hergestellt sind, sich jedoch in den physikochemischen Eigenschaften unterscheiden, (b) eine Mehrzahl von Sensorelementen, wobei ein oder mehrere Sensorelemente aus einem anderen Material mit gleichen oder unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften hergestellt sind, (c) eine Mehrzahl von Sensorelementenaus, die aus dem gleichen Material mit unterschiedlicher Größe hergestellt sind, (d) eine Mehrzahl von Sensorelementen aus unterschiedlichem Material mit relativ gleicher Größe; (e) eine Mehrzahl von Sensorelementen aus unterschiedlichem Material und mit unterschiedlichen Größen, (f) eine Mehrzahl von Sensorelementenin denen jedes Element aus einem anderen Material hergestellt ist, (g) eine Mehrzahl von Sensorelementen mit unterschiedlichen Ladungen, und anderen. Die Mehrzahl von Sensorelementen kann irgendeine geeigneten Kombination von zwei oder mehr Sensorelementen sein, in denen jedes Sensorelement eine einzigartige bzw. eindeutige Biomolekülkoronen-Signatur bereitstellt. Zum Beispiel kann die Mehrzahl von Sensorelementen ein oder mehrere Liposomen und ein oder mehrere hier beschriebene Nanopartikel einschließen. In einer Ausführungsform kann die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Liposomen mit variierendem Lipidgehalt und/oder variierenden Ladungen (kationisch/anionisch/neutral) sein In einer anderen Ausführungsform kann die Mehrzahl von Sensorelementen ein oder mehrere Nanopartikel enthalten, die aus dem gleichen Material bestehen, aber unterschiedliche Größen und physikochemische Eigenschaften aufweisen. In einer anderen Ausführungsform kann die Mehrzahl von Sensorelementen ein oder mehrere Nanopartikel enthalten, die aus unterschiedlichen Materialien (z.B. Siliciumdioxid und Polystyrol) mit ähnlichen oder unterschiedlichen Größen und/oder physikochemischen Eigenschaften hergestellt sind (z.B. Modifikationen, z.B. -NH2, -COOH-Funktionalisierung). Diese Kombinationen werden nur als Beispiele erläutert und beschränken den Umfang der Erfindung nicht.
  • Der Krümmungswinkel an der Oberfläche der Partikel kann sich abhängig von der Größe der Partikel ändern. D Diese Änderung des Krümmungswinkels ändert wiederum die Oberfläche, an der Proteine anhaften und miteinander auf den Teilchen wechselwirken können. Wie in 58 gezeigt, führt eine Erhöhung der Partikelgröße zu einer Veränderung der Menge an gebundenem Protein und auch beim Muster der Proteine, die an unterschiedlich große Nanopartikel gebunden sind (in diesem Beispiel sind die SDS-PAGE-Analyse von Proteinen an Nanopartikeln mit Durchmessern von 0,1 µm, 3 µm und 4 µm gezeigt).
  • Die Neuheit des Sensor-Arrays besteht darin, dass nicht nur verschiedene Proteine zwischen den verschiedenen Sensorelementen erfasst bzw. detektiert werden können, sondern auch die Fähigkeit, die Gehalte des gleichen Proteins zwischen den verschiedenen Sensorelementen zu vergleichen. Zum Beispiel, um nicht an irgendeine Theorie gebunden zu sein, sondern um die Einzigartigkeit des vorliegenden Sensor-Arrays zu veranschaulichen, wird ein theoretisches Beispiel beschrieben. In einigen Ausführungsformen wird die Probe mit einem ersten Sensorelement A, einem zweiten Sensorelement B und einem dritten Sensorelement C in Kontakt gebracht, wobei jedes Sensorelement eine unterschiedliche Proteinkorona-Signatur (d.h. A', B' und C ') erzeugt. Die Zusammensetzungen jeder Proteinkorona-Signatur A', B' und C' können voneinander verschieden sein. In einigen Ausführungsformen können A', B' und C 'das gleiche Protein aufweisen, aber in einer unterschiedlichen Menge, was zusätzliche proteomische Information bereitstellen kann, die nicht durch Charakterisieren der Probe mit zuvor bekannten Ansätzen erreichbar sind. Mit anderen Worten dient jede einzigartige Korona-Protein-Information von jedem Nanopartikel als eindeutige Variable und liefert daher mehr Daten für die Proteomik. Zum Beispiel kann Albumin in der Proteinkorona-Signatur von nur einem Sensorelement A, in der Signatur von zwei Sensoren, z.B. A und B, B und C oder A und C, oder in allen drei Sensor-Biomolekülsignaturen (A, B, C) gefunden werden. Ferner bestimmt das Sensor-Array nicht nur die Anwesenheit oder Abwesenheit des Proteins, z.B. Albumin, sondern kann auch den Vergleich der Menge des Proteins von einem Sensor zum anderen bestimmen. Zum Beispiel kann Albumin mit der Konzentration X in der Signatur von A, mit der Konzentration von 1/3X in Sensor B und mit der Konzentration von 2X in Sensor C für einen spezifischen Biomolekül-Fingerabdruck gefunden werden. In einem anderen Biomolekül-Fingerabdruck konnte das gleiche Protein, Albumin, in 3 verschiedenen Konzentrationen gefunden werden, zum Beispiel 1/8X in Sensor D, 3X in Sensor E und 1/4 X in Sensor F. Somit gibt eine Mehrzahl von Sensoren nicht nur einen Datenpunkt für die Konzentration eines Proteins, sondern es kann ein Vergleich der Konzentration des Proteins zwischen zwei oder mehr Sensoren erfolgen. Ferner können die Konzentration oder seltene oder wenig abundante Proteine mit der Konzentration eines bekannten Proteins verglichen werden, was weitere Daten bezüglich der Proteinkoronen liefert. Zum Beispiel kann zur Veranschaulichung die Konzentration eines unbekannten Proteins, z.B. Protein Z, mit der Menge eines bekannten Proteins, z.B. Albumin, in den verschiedenen Biomolekülkoronen verglichen werden. Zum Beispiel kann Z in einem Verhältnis zu Albumin von 1:8 an Sensor A, 1:50 an Sensor B und nicht vorhanden an Sensor C ermittelt werden. 12 liefert eine Analyse des Vergleichs von seltenen Proteinen mit der Albuminkonzentration innerhalb von analysierten Proteinkoronen. Somit kann die statistische Analyse sowohl die Anwesenheit eines Proteins, die relative Konzentration zwischen jedem Sensorelement als auch die Konzentration eines seltenen oder wenig-angereicherten Proteins im Vergleich zu einem bekannten Protein einer bestimmten Konzentration bei der Analyse der Daten annehmen.
  • In einigen Ausführungsformen wird ein Kanal durch Lithographie, Ätzen, Prägen oder Formen einer Polymeroberfläche gebildet. Im Allgemeinen kann der Herstellungsprozess einen oder mehrere dieser Prozesse umfassen, und verschiedene Teile des Arrays können unter Verwendung verschiedener Verfahren hergestellt und zusammengebaut oder miteinander verbunden werden.
  • Die Lithographie beinhaltet die Verwendung von Licht oder einer anderen Form von Energie, wie Elektronenstrahlen, um ein Material zu verändern. Typischerweise wird ein polymeres Material oder eine Vorstufe (z.B. Platinenlack, ein lichtbeständiges Material) auf ein Substrat aufgebracht und wird selektiv Licht oder einer anderen Form von Energie ausgesetzt. In Abhängigkeit von dem Platinenlack bleiben belichtete Bereiche des Platinenlacks entweder zurück oder werden in nachfolgenden Verarbeitungsschritten aufgelöst, die allgemein als „Entwickeln“ bekannt sind. Dieser Prozess führt zu einem Muster des Platinenlacks auf dem Substrat. In einigen Ausführungsformen wird der Platinenlack als Vorlage in einem Formprozess verwendet. In einigen Ausführungsformen wird der Platinenlack als Vorlage in einem Formgebungsverfahren verwendet. In einigen Ausführungsformen wird eine polymere Vorstufe auf das Substrat mit Platinenlack gegossen, polymerisiert (d.h. gehärtet) und abgezogen.
  • In einigen Ausführungsformen wird der Platinenlack als Mutterform für einen Ätzprozess verwendet. Zum Beispiel können nach dem Mustern von Platinenlack auf ein Siliziumsubstrat Kanäle in das Substrat unter Verwendung eines tiefen reaktiven Ionenätzprozesses (DRIE) oder eines anderen im Stand der Technik bekannten chemischen Ätzprozesses (z.B. Plasmaätzen, KOH-Ätzen, HF-Ätzen usw.) geätzt werden. Der Platinenlack wird entfernt, und das Substrat wird an ein anderes Substrat unter Verwendung eines der im Stand der Technik bekannten Bonding-Verfahrens (z.B. anodisches Bonden, Kleben, direktes Bonden, eutektisches Bonden usw.) verbunden. Es können nach Bedarf mehrere Lithographie- und Ätzschritte und Bearbeitungsschritte wie Bohren enthalten sein.
  • In einigen Ausführungsformen kann ein polymeres Substrat erwärmt und gegen eine Mutterform für einen Prägeprozess gepresst werden. Die Mutterform kann durch eine Vielzahl von Prozessen gebildet werden, einschließlich Lithographie und Spanen. Das Polymersubstrat wird dann an ein anderes Substrat verbunden, um Kanäle und/oder eine Mischvorrichtung zu bilden. Das Spanen kann bei Bedarf einbezogen werden.
  • In einigen Ausführungsformen wird ein geschmolzenes Polymer oder Metall oder eine geschmolzene Legierung in eine geeignete Form eingespritzt und darf für einen Spritzgussvorgang abkühlen und erstarren. Die Form besteht typischerweise aus zwei Teilen, die es erlauben, das ausgeformte Bauteil zu entfernen. Die so hergestellten Teile können verbunden werden, um das Substrat zu erhalten.
  • In einigen Ausführungsformen kann Opferschichtätzen verwendet werden, um Kanäle zu bilden. Es könenn lithographische Techniken verwendet werden, um ein Material auf einem Substrat zu strukturieren. Dieses Material wird durch ein anderes Material unterschiedlicher chemischer Natur bedeckt. Dieses Material kann Lithographie- und Ätzprozessen oder anderen Bearbeitungsprozessen unterzogen werden. Das Substrat wird dann einem chemischen Mittel ausgesetzt, das das erste Material selektiv entfernt. Es werden Kanäle in dem zweiten Material gebildet, wobei Hohlräume verbleiben, in denen das erste Material vor dem Ätzprozess vorhanden war.
  • In einigen Ausführungsformen werden Mikrokanäle durch Laserbearbeitung oder CNC-Bearbeitung direkt in ein Substrat eingearbeitet. So können mehrere maschinell bearbeitete Schichten miteinander verbunden werden, um das endgültige Substrat zu erhalten.
  • In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 1 µm bis etwa 1000 µm. In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 5 µm bis etwa 500 µm. In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 10 µm bis etwa 100 µm. In einigen Ausführungsformen reichen die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 25 µm bis etwa 100 µm. In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 50 um bis etwa 100 um. In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 75 µm bis etwa 100 µm. In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 10 µm bis etwa 75 µm. In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 10 µm bis etwa 50 µm. In einigen Ausführungsformen reicht die Breite oder Höhe jedes Kanals von etwa 10 µm bis etwa 25 µm.
  • In einigen Ausführungsform ist die maximale Breite oder Höhe eines Kanals etwa 1 µm, etwa 5 µm etwa 10 µm, etwa 20 µm, etwa 30 µm, etwa 40 µm, etwa 50 µm, etwa 60 µm, etwa 70 µm, etwa 80 µm, etwa 90 µm, etwa 100 µm, etwa 250 µm, etwa 500 µm oder etwa 1000 µm.
  • In einigen Ausführungsformen reicht die Breite jedes Kanals von etwa 5 µm bis etwa 100 µm. In einigen Ausführungsform ist die Breite eines Kanals etwa 5 µm, etwa 10 µm, etwa 15 µm, etwa 20 µm, etwa 25 µm, etwa 30 µm, etwa 35 µm, etwa 40 µm, etwa 45 µm, etwa 50 µm, etwa 60 µm, etwa 70 µm, etwa 80 µm, etwa 90 µm oder etwa 100 µm.
  • In einigen Ausführungsformen reicht die Höhe jedes Kanals von etwa 10 µm bis etwa 1000 µm. In einigen Ausführungsformen beträgt die Höhe eines Kanals etwa 10 µm, etwa 100 µm, etwa 250 µm, etwa 400 µm, etwa 500 µm, etwa 600 µm, etwa 750 µm oder etwa 1000 µm. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Höhe des Kanals (der Kanäle), durch die die Probe fließt, etwa 500 µm. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Höhe des Kanals (der Kanäle), durch die die Probe fließt, etwa 500 µm.
  • In einigen Ausführungsformen reicht die Länge jedes Kanals von etwa 100 µm bis etwa 10 cm. In einigen Ausführungsformen ist die Länge eines Kanals etwa 100 µm, etwa 1,0 mm, etwa 10 mm, etwa 100 mm, etwa 500 mm, etwa 600 mm, etwa 700 mm, etwa 800 mm, etwa 900 mm, etwa 1,0 cm, etwa 1,1 cm, etwa 1,2 cm, etwa 1,3 cm, etwa 1,4 cm, etwa 1,5 cm, etwa 5 cm oder etwa 10 cm. In speziellen Ausführungsformen ist die Länge des Kanals (der Kanäle), durch die die Probe fließt, etwa 1,0 cm. In speziellen Ausführungsformen ist die Länge des Kanals (der Kanäle), durch die die Probe fließt, etwa 1,0 cm.
  • Biomolekülkorona-Nanosystem
  • Hier werden Biomolekülkorona-Nanosysteme oder Sensor-Arrays bereitgestellt, die im Wesentlichen aus mehreren Sensorelementen bestehen oder gänzlich daraus bestehen, wobei sich die mehreren Sensorelemente in wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheiden. In einigen Ausführungsformen ist die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Nanopartikeln. In einigen Ausführungsformen sind die Mehrzahl von Nanopartikeln eine Mehrzahl von Liposomen. In einigen Ausführungsformen ist jedes Sensorelement in der Lage, eine Mehrzahl von Biomolekülen in einer komplexen biologischen Probe zu binden, um eine Biomolekülkorona-Signatur zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen weist jedes Sensorelement eine unterschiedliche Biomolekülkorona-Signatur auf.
  • Die Biomolekülkorona-Signatur bezieht sich auf die Zusammensetzung, Signatur oder das Muster verschiedener Biomoleküle, die an jedes separate Sensorelement oder an jedes Nanopartikel gebunden sind. In einigen Fällen ist die Biomolekülkorona-Signatur eine Proteinkorona-Signatur. In einem anderen Fall ist die Biomolekülkorona-Signatur eine Polysaccharid-Korona-Signatur. In noch einem anderen Fall ist die Biomolekülkorona-Signatur eine Metabolit-Korona-Signatur. In einigen Fällen ist die Biomolekülkorona-Signatur eine lipämische Korona-Signatur. Die Signatur bezieht sich nicht nur auf die unterschiedlichen Biomoleküle, sondern auch auf die Unterschiede in Menge, Gehalt oder Anzahl des an das Sensorelement oder den Nanopartikel gebundenen Biomoleküls oder auf Unterschiede im Konformationszustand des Biomoleküls, das an das Sensorelement bzw. Nanopartikel gebunden ist. Es ist vorgesehen, dass die Biomolekülkorona-Signaturen jedes Sensorelements einige der gleichen Biomoleküle enthalten können, unterschiedliche Biomoleküle in Bezug auf die anderen Sensorelemente oder Nanopartikel enthalten können und/oder sich in Gehalt oder Anzahl, Typ oder Konformation des Biomoleküls unterscheiden können. Die Biomolekülkorona-Signatur kann nicht nur von den physikochemischen Eigenschaften des Sensorelements oder des Nanopartikels abhängen, sondern auch von der Art der Probe und der Dauer der Exposition. In einigen Ausführungsformen umfasst die Biomolekülkorona-Signatur die Biomoleküle, die in einer weichen Korona und einer harten Korona vorkommen.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Sensor-Array, besteht im Wesentlichen oder gänzlich aus einem ersten Sensorelement, das eine erste Biomolekülkorona-Signatur erzeugt, und wenigstens einem zweiten Sensorelement oder wenigstens einem Nanopartikel, der wenigstens eine zweite Biomolekülkorona-Signatur erzeugt, wenn das Sensor-array mit einer komplexen biologischen Probe in Kontakt gebracht wird. Ein Biomolekül-Fingerabdruck ist die Kombination der ersten Biomolekülsignatur und der mindestens einen zweiten Biomolekülsignatur. Es ist vorgesehen, dass die Biomolekülsignatur aus mindestens zwei Biomolekülkorona-Signaturen hergestellt werden kann, um so viele verschiedene Biomolekülsignaturen zu untersuchen, z.B. mindestens 1000 verschiedene Biomolekülkorona-Signaturen. Die Biomolekülkorona kann separat für jedes Sensorelement untersucht werden, um die Biomolekülkoronen-Signatur für jedes Element, jeden Nanopartikel oder jedes Liposom zu bestimmen und zu kombinieren, um den Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen, oder die zwei oder mehr Biomolekülkoronen können gleichzeitig analysiert werden, um den Biomolekül-Fingerabdruck auf einmal auszubilden.
  • Der Biomolekül-Fingerabdruck kann zwischen verschiedenen möglichen biologischen Zuständen (z.B. Krankheitszuständen) eines Probanden unterscheiden. In einigen Ausführungsformen ist der Biomolekül-Fingerabdruck der Entwicklung einer Krankheit oder Störung assoziiert und/oder kann einem Krankheitszustand des Probanden assoziiert werden.
  • In einigen Ausführungsformen ist der Biomolekül-Fingerabdruck in der Lage, einen Krankheitszustand für ein Probanden zu bestimmen. Der Begriff „Krankheitszustand“ für einen Probanden, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Fähigkeit des Sensor-Arrays der vorliegenden Technologie, zwischen den verschiedenen Zuständen einer Krankheit bei einem Probanden zu unterscheiden. Dieser Begriff umfasst einen Zustand vor der Erkrankung oder einen Vorläuferzustand einer Krankheit oder Störung (einem Zustand, in dem die Person keine äußeren Anzeichen oder Symptome der Krankheit oder Störung hat, aber in Zukunft die Krankheit oder Störung entwickeln wird) und einen Krankheitszustand, in dem sich der Proband in einem Stadium der Krankheit oder Störung befindet (z.B. ein frühes, mittleres oder spätes Stadium der Krankheit oder Störung). In anderen Worten ist der Krankheitszustand ein Spektrum, das ein auf die Gesundheit des Probanden bezogenes Kontinuum in Bezug auf eine Krankheit oder Störung umfasst. Das Array der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, verschiedene Krankheitszustände eines Probanden durch Bestimmen eines Biomolekül-Fingerabdrucks zu unterscheiden, der mit unterschiedlichen Biomolekül-Fingerabdrücken verglichen werden kann, die verschiedenen Krankheitszuständen des Spektrums und gesunden Probanden assoziiert sind. In einem anderen Beispiel kann der Biomolekül-Fingerabdruck einem Zustand vor der Erkrankung oder einem Krankheitsstadium des Vorläufers assoziiert sein, in dem der Proband zu der Zeit gesund erscheint, ohne äußere Anzeichen oder Symptome einer Krankheit zu zeigen, aber die Krankheit in der Zukunft entwickeln wird. In einem anderen Beispiel kann der Biomolekül-Fingerabdruck anzeigen, dass der Proband die Krankheit hat, und ist durch den jedem Stadium assoziierten, eindeutigen Biomolekül-Fingerabdruck dazu in der Lage, zu unterscheiden, ob sich die Erkrankung in dem frühen, mittleren oder späten Stadium befindet.
  • Wie oben diskutiert, umfasst der Krankheitszustand auch einen Vorläuferzustand einer Krankheit oder Störung. Dieser Vorläuferzustand ist ein Zustand, in dem der Proband keine äußeren Anzeichen oder Symptome der Krankheit oder Störung zeigt (obwohl submakrotische Veränderungen innerhalb der Biomoleküle des Probanden in seinem Blut oder anderen biologischen Flüssigkeiten auftreten können), aber die Krankheit oder Störung in der Zukunft entwickeln wird. Dieser Vorläuferzustand kann auch als ein Zustand beschrieben werden, in dem die ersten pathologischen Veränderungen einer Krankheit gesehen werden, z.B. Veränderungen des Biomolekül-Fingerabdrucks einer biologischen Probe des Patienten.
  • Ein weiteres Beispiel eines biologischen Zustands ist ein gesunder, Kein krankhafter Zustand. Das Array kann auch einen spezifischen Biomolekül-Fingerabdruck bestimmen, der einem gesunden, Kein krankhafter Zustand assoziiert ist, in dem der Proband die Krankheit in der Zukunft nicht entwickeln wird. In diesem Fall erhält der Proband zum Zeitpunkt des Tests keinen Nachweis, dass er entweder die Krankheit bereits hat oder die Krankheit in der Zukunft entwickeln wird.
  • Hier umfasst der Begriff „biologischer Zustand“ jede biologische Eigenschaft eines Probanden, die sich in einer biologischen Probe wie hierin definiert manifestieren kann. Ein biologischer Zustand kann unter Verwendung der hier offenbarten Verfahren nachgewiesen werden, wobei zwei Probanden, die sich im biologischen Zustand unterscheiden, diese Unterschiede in der Zusammensetzung einer Probe manifestieren. Zum Beispiel schließt ein biologischer Zustand eine Krankheitszustands eines Probanden mit ein. Ein Krankheitszustand kann erfasst werden, wenn der Krankheitszustand Veränderungen in der molekularen Zusammensetzung (z.B. der Konzentration von einem oder mehreren Proteinen) einer Probe eines Probanden verursacht, der den Krankheitszustand äußert, im Verhältnis zu einer Probe eines Probanden, der den Krankheitszustand nicht aufweist (d.h., wenn der biologische Zustand ein gesunder Zustand oder kein krankhafter Zustand ist).
  • Ein weiteres Beispiel für einen biologischen Zustand ist das Ausmaß des Ansprechens eines Probanden auf eine bestimmten therapeutischen Behandlung (z.B. die Verabreichung von einem oder einer Kombination von Medikamenten oder Arzneimitteln). In einigen Ausführungsformen ist ein biologischer Zustand das Ansprechen (z.B. in Bezug auf einen bestimmten Schwellenwert für eine Analyse) eines Probanden auf ein bestimmtes Medikament. In einer anderen Ausführungsform ist ein biologischer Zustand das Nicht-Ansprechen (z.B. in Bezug auf einen bestimmten Schwellenwert für eine Analyse) eines Probanden auf ein bestimmtes Medikament. In einigen Ausführungsformen ist das Ausmaß des Ansprechens eines Probanden auf ein Medikament (d.h. der biologische Zustand des Ansprechens auf das Medikament oder der biologische Zustand des Nicht-Ansprechens auf das Medikament) mit Faktoren verbunden, wie der Variabilität des Metabolismus oder die Pharmakokinetik des Medikaments zwischen Probanden.
  • Ein anderes Beispiel für einen biologischen Zustand ist das Ausmaß der Immunantwort, die von einem Probanden gezeigt wird. In einigen Ausführungsformen kann der biologische Zustand eine erhöhte Immunantwort sein. In anderen Ausführungsformen kann der biologische Zustand eine verminderte Immunantwort sein. Die Immunantwort kann aufgrund einer Zeile von Variablen zwischen den Probanden unterschiedlich sein. Zum Beispiel kann sich die Immunantwort zwischen Probanden als Ergebnis einer unterschiedlichen Exposition gegenüber einem exogen eingebrachten Antigen (das z.B. einem Virus oder Bakterien assoziiert ist) unterscheiden, als Folge von Unterschieden in ihrer Anfälligkeit für eine Autoimmunkrankheit oder -störung oder sekundär als Folge einer Reaktion auf andere biologische Zustände eines Probanden (z.B. Krankheitszustände wie Krebs).
  • Andere Beispiele von biologischen Zuständen, die mit einem Biomolekül-Fingerabdruck verknüpft werden können, umfassen die Empfindlichkeit eines Probanden gegenüber nachteiligen Wirkungen, die mit der Verabreichung eines Medikaments verbunden sind, und die Identifizierung des Potentials eines Probanden, eine allergische Reaktion auf die Verabreichung einer bestimmten Zusammensetzung oder Substanz zu zeigen.
  • Die Innovation in diesen Sensor-Arrays und den damit verbundenen Verfahren unterscheidet sich von den derzeitigen Verfahren zum Erkennen oder Messen der An- oder Abwesenheit oder Gehalts bestimmter Biomarker, um in sehr frühen Stadien einer Krankheit vorherzusagen, ob ein Proband eine Vordisposition oder Wahrscheinlichkeit hat, die Krankheit oder Störung zu entwickeln, bevor irgendwelche Anzeichen oder Symptome überwacht oder getestet werden können. Geeigneterweise ist das Array in der Lage, zu unterscheiden, ob die Gesundheit des Probanden dahingehend zu unterscheiden, dass er keine Krankheit oder keine Störung, einen Vorläufer einer Krankheit oder Störung oder bereits die Krankheit oder Störung hat. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Ausführungsformen beschränkt und deckt das Spektrum anderer Krankheitszustände ab, die innerhalb des Kontinuums von Gesundheit und Krankheit eines Probanden auftreten können.
  • Ferner kann die Innovation der vorliegenden erfindungsgemäßen Sensor-Arrays durch die folgenden Beispiele demonstriert werden. Das Sensor-Array der vorliegenden Erfindung ist sehr empfindlich und in der Lage, nicht nur Veränderungen in geringen Mengen von Biomolekülen in einer Probe zu erkennen, sondern kann auch auf Wechselwirkungen zwischen den Biomolekülen beruhen. Zum Beispiel, um nicht an irgendeine Theorie gebunden zu sein, sondern um die Einzigartigkeit des vorliegenden Sensor-Arrays zu veranschaulichen, wird ein theoretisches Beispiel beschrieben. Wenn zum Beispiel biologische Proben von einer Person im Laufe der Zeit gesammelt werden (z.B. vor irgendwelchen Anzeichen und Symptomen der Krankheit, vor dem Krankheitszustand und während früher und mittlerer Stadien einer Krankheit). In diesen Proben kann durch einfaches Messen einer Menge eines Biomoleküls X in der Probe (z.B. Quantifizierung der Menge) festgestellt werden, dass sich die Konzentration über die verschiedenen Krankheitszustände nicht ändert. Somit wäre das Messen des Biomoleküls X kein nützlicher Marker für die Krankheit. Unter Verwendung des vorliegenden Sensor-Array kann sich jedoch, obwohl das Niveau des Biomarkers X das gleiche sein mag, die Wechselwirkung des Biomoleküls X mit anderen Biomolekülen, Y und Z, die Zusammensetzung der Proteinkorona-Signatur, die der Probe assoziiert ist, über die Zeit und die Proben verändern. Zum Beispiel kann der Biomarker X seine Assoziation von der Assoziation mit Biomolekül Y zu Biomolekül Z ändern, oder im Laufe der Zeit führt die Interaktion von X mit Y und Z zu einer Konformationsänderung in X. Diese Art von Veränderungen, die die Gesamtkonzentration nicht verändern, aber den (ein-)eindeutigen Biomolekül-Fingerabdruck ändern, der dem Krankheitszustand assoziiert ist (der das Biomolekül X einschließt), würde die Unterscheidung und Assoziation mit anderen Krankheitszuständen ermöglichen. Dies würde nicht entdeckt werden, wenn man Methoden anwendet, bei denen nur die Quantifizierung von Biomolekülen X in der Probe gemessen wird, da diese Menge während der gesamten Krankheit gleich bleibt. Dies ist eine unerwartet hochspezifische und nützliche Untersuchung, die bisher nicht gesehen wurde. Mit diese Untersuchung können Biomarker einer Krankheit, die zuvor nicht als Biomarker charakterisiert wurden, einschließlich Biomarker-Muster bestimmt werden, da sich diese Marker in absoluten Mengen innerhalb der Proben nicht ändern, aber eine konsistente und messbare Veränderung in Bezug auf die Interaktion mit den Sensorelementen in dem Sensor-Array. Die Fähigkeit, Muster durch Analyse der Biomolekülkorona zu unterscheiden, ermöglicht die Fähigkeit, diese Muster verschiedenen Krankheitszuständen zuzuordnen.
  • Wie oben erläutert, hat das vorliegende Sensor-Array die Fähigkeit, Proteine über eine zehnfache Größenordnung nachzuweisen, was eine höhere Empfindlichkeit als alle zuvor beschriebenen Verfahren darstellt. Die Einzigartigkeit des vorliegenden Sensor-Arrays liegt in der Fähigkeit der Anordnung, Proteine unabhängig von dem Konzentrationsniveau innerhalb der Probe zu erfassen. Die Untersuchung beruht auf der Fähigkeit des Biomoleküls (z.B. Protein), bekannt oder unbekannt, innerhalb der Probe mit den Sensorelementen zu interagieren und unterschiedlich und in unterschiedlichen Mengen mit unterschiedlichen Sensorelementen zu interagieren und auch mit den anderen dem Sensorelement assoziierten Biomolekülen zu interagieren. Dies wiederum ermöglicht die Fähigkeit, Proteine mit geringer Häufigkeit und seltene Proteinen selbst in Gegenwart von reichlich vorhandenen Proteinen (wie Albumin) in der Probe nachzuweisen. Wie in 12 von Beispiel 1 gezeigt, wurde die Fähigkeit des Sensor-Array gezeigt, Konzentrationen in der Größenordnung von 10 selbst in Gegenwart von Proteinen mit hohem Vorkommen nachzuweisen. Darüber hinaus ist das Sensor-Array auch in der Lage, Proteine mit unbekannten/nicht berichteten Plasmakonzentrationen zu detektieren, die bisher mit den derzeitigen Verfahren nicht gefunden wurden. Ein einzigartiges Merkmal des vorliegenden Sensor-Arrays ist u.a. die Fähigkeit des vorliegenden Systems, wenig abundante Proteine und seltene Proteine nachweisen zu können. Das vorliegende Sensor-Array kann verwendet werden, um nicht nur einen Krankheitszustand (keine Krankheit, Vorerkrankung oder Krankheit im Früh- oder Spätstadium) zu bestimmen, sondern in einigen Fällen zwischen Subtypen von Krankheiten zu unterscheiden (z.B. zwischen verschiedenen Krebsarten, z.B. Lungenkrebs, Brustkrebs, Myelom, etc.).
  • Erkennungsverfahren
  • Das vorliegende Sensor-Array kann in einer Vielzahl von hierin beschriebenen Verfahren verwendet werden. Die Fähigkeit, einen einzigartigen Biomolekül-Fingerabdruck für Proben zu bestimmen, stellt ein neuartiges und innovatives Mittel zur Verfügung, um einen spezifischen Krankheitszustand eines Probanden zu messen. Diese Biomolekül-Fingerabdrücke können verwendet werden, um den Krankheitszustand eines Probanden zu bestimmen, eine Krankheit in einem Probanden zu diagnostizieren oder zu prognostizieren oder einzigartige Muster von Biomarkern zu identifizieren, die einem Krankheitszustand oder einer Krankheit oder Störung assoziiert sind. Zum Beispiel ermöglichen die Veränderungen des Biomolekül-Fingerabdrucks in einem Probanden über die Zeit (Tage, Monate, Jahre) die Fähigkeit, eine Krankheit oder Störung in einem Probanden (z.B. Krankheitszustand) zu verfolgen bzw. tracken, die für die Bestimmung eines Biomolekül-Fingerabdrucks breit anwendbar ist, der dem frühen Stadium einer Krankheit oder einer anderen Krankheitszustandes assoziiert werden kann. Wie oben erläutert, ermöglicht die Fähigkeit, eine Krankheit früh zu erkennen, beispielsweise Krebs, noch bevor sie sich vollständig entwickelt oder metastasiert, eine signifikante Zunahme der positiven Ergebnisse für diese Patienten und die Fähigkeit, die Lebenserwartung zu erhöhen und die mit dieser Krankheit verbundene Mortalität zu senken. Daher stellt das Sensor-Array der vorliegenden Erfindung eine einzigartige Möglichkeit bereit, Biomolekül-Fingerabdrücke zu entwickeln, die den Vorstufen oder Vorläuferzuständen der Krankheit assoziiert sind.
  • Es versteht sich, dass schon bevor eine Krankheit zu messbaren Anzeichen oder Symptomen übergegangen ist, dass es auf der makroskopischen Ebene Veränderungen im Körper und den biologischen Systemen eines Probanden gibt. In der Lage zu sein, diese frühen Anzeichen einer Vorerkrankung zu erkennen, die durch die Verwendung des Sensor-Arrays der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden. Die Erfinder haben herausgefunden, dass durch Vergleichen des Biomolekül-Fingerabdrucks eines Probanden während verschiedener Zeiten eines Krankheitszustands (z.B. bevor eine Krankheit Symptome gezeigt und entwickelt hat, nach frühen Anzeichen oder Symptomen der Erkrankung und/oder in späten Stadien der Krankheit) einen einzigartigen Biomolekül-Fingerabdruck liefert, der mit den verschiedenen Krankheitszuständen verbunden ist, die mit dem Krankheitsverlauf zusammenhängen. Mit anderen Worten, kann ein Biomolekül-Fingerabdruck bestimmt werden, der es ermöglichen würde, Personen zu identifizieren, die zu einem späteren Zeitpunkt eine Krankheit entwickeln werden. Dies würde eine frühzeitige Überwachung und frühe Behandlung ermöglichen, was das Ergebnis des mit der Krankheit diagnostizierten Patienten erheblich verbessert.
  • In einigen Ausführungsformen wird ein Verfahren zum Erkennen einer Krankheit oder Störung eines Probanden bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) Einholen einer Probe von dem Probanden, (b) In Kontakt bringen mit einem hierin beschriebenen Sensor-Array, und (c) Bestimmen eines der Probe assoziierten Biomolekül-Fingerabdrucks, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck die Gesundheit des Probanden in einem Krankheitszustand differenziert, beispielsweise zwischen dem, dass er keine Krankheit oder Störung, einen Vorläufer einer Krankheit oder Störung oder eine Krankheit oder Störung hat.
  • Der Schritt des Bestimmens eines Biomolekül-Fingerabdrucks, der der Probe assoziiert ist, kann das Erfassen der Biomolekülkorona-Signatur für mindestens zwei Sensorelemente umfassen, wobei die Kombination der mindestens zwei Biomolekülkorona-Signaturen den Biomolekül-Fingerabdruck erzeugt. In einigen Ausführungsformen werden die Biomolekülkorona-Signaturen der mindestens zwei Sensorelemente separat untersucht und die Ergebnisse kombiniert, um den Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen. In einigen Ausführungsformen werden die Biomolekülkorona-Signaturen der mindestens zwei Elemente zur gleichen Zeit oder in der gleichen Probe untersucht.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren zum Bestimmen des Biomolekül-Fingerabdrucks das Erfassen und Bestimmen der biomolekularen Korona-Signaturen der mindestens zwei Sensorelemente. In einigen Ausführungsformen kann dieser Schritt durchgeführt werden, indem die Mehrzahl von Biomolekülen, die an jedem Sensorelement befestigt sind (z.B. durch Trennen der Biomolekülkorona von dem Sensorelement) und Untersuchen der Mehrzahl von Biomolekülen, um die Zusammensetzung der Mehrzahl von Biomolekülkoronen zu bestimmen, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen. Abhängig von der Ausgestaltung des Arrays wird in einigen Fällen die Zusammensetzung jeder Biomolekülkorona-Signatur jedes Sensorelements unabhängig untersucht und die Ergebnisse kombiniert, um den Biomolekül-Fingerabdruck zu erzeugen (z.B. befindet sich jedes Sensorelement in einem getrennten Kanal oder Fach), wobei die spezifische Zusammensetzung der Biomolekülkorona für dieses spezifische Sensorelement separat analysiert werden kann (z.B. entweder durch Ablösen der Biomoleküle und Testen durch Massenspektrometrie und/oder Chromatographie oder durch Erfassen der mehreren Biomoleküle, die noch an dem Sensorelement durch Fluoreszenz, Lumineszenz angebracht sind oder andere Mittel). In einer anderen Ausführungsform befinden sich die mindestens zwei Sensorelemente auf dem gleichen Array und die Zusammensetzung der Biomolekülkoronen für die mindestens zwei Sensorelemente wird gleichzeitig untersucht, indem die Biomolekülkoronen von beiden Sensorelementen in eine Lösung dissoziiert werden und diese Lösung zur Bestimmung einer Biomolekül-signatur untersucht wird. Diese spätere Verfahren wäre das Verfahren der Wahl, wenn eine Chip-Array-Technologie verwendet wird.
  • Verfahren zum Untersuchen der Mehrzahl von Biomolekülen, die die Biomolekülkorona-Signatur oder den Biomolekül-Fingerabdruck ausmachen, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf zum Beispiel Gelelektrophorese, Flüssigchromatographie, Massenspektrometrie, Kernmagnetisierung Resonanzspektroskopie (NMR), Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR), Zirkulardichroismus, Raman-Spektrometrie und eine Kombination davon. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Assay durch Flüssigchromatographie, Massenspektrometrie oder eine Kombination davon.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Sensortest ein nicht-markiertes Array (non-label Array).
  • In einigen Ausführungsformen ist vorgesehen, dass markierte Arrays (labelled Array) verwendet werden können, wobei eine Korona-Signatur bestimmt werden kann als ein Signal einer Änderung (z.B. Fluoreszenz, Lumineszenz, Ladung, farbmetrische Farbstoffe). Ein geeignetes Beispiel ist in 42 und 43 gezeigt. Zum Beispiel kann ein Array chemisch reagierende Färbemittel in einer druckfähigen Formulierung zum Nachweis und zur Identifizierung von Biomolekülen basierend auf den Gleichgewichtswechselwirkungen mit den Biomolekülen und reagierenden Farbstoffen enthalten.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Sensorelement einen Komplex mit einer ersten Komponente und einem Polymerfluorophor oder einer anderen Quencherkomponente, die zu der ersten Komponente chemisch komplementär ist, wobei ein solcher Komplex eine anfängliche Hintergrund- oder Referenzfluoreszenz aufweist. Sobald die erste Komponente mit der Biomolekülkorona in Kontakt kommt, bewirkt sie das Löschen des Fluorophors und diese Änderung der Fluoreszenz kann gemessen werden. Nachdem der Sensor mit einem Laser bestrahlt und/oder angeregt wurde, kann der Effekt und/oder die Änderung der Fluoreszenz für jedes Sensorelement gemessen und mit der Hintergrundfluoreszenz verglichen werden, um den Biomolekül-Fingerabdruck zu erzeugen.
  • Die hierin beschriebenen Sensor-Arrays und Verfahren können verwendet werden, um einen Krankheitszustand zu bestimmen und/oder eine Krankheit oder Störung zu prognostizieren oder zu diagnostizieren. Die betrachteten Krankheiten oder Störungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, zum Beispiel Krebs, kardiovaskuläre Erkrankung, endokrine Krankheit, entzündliche Erkrankung, eine neurologische Erkrankung und dergleichen.
  • In einer Ausführungsform ist die Krankheit oder Störung Krebs. In geeigneten Ausführungsformen sind die hier beschriebenen Sensor-Array und Verfahren nicht nur in der Lage, Krebs zu diagnostizieren (z.B. festzustellen, ob ein Proband (a) keinen Krebs hat, (b) sich in einem vor-Krebs Stadium befindet, (c) sich in einem frühen Stadium von Krebs befindet, (d) sich in einem späten Stadium von Krebs befindet), sondern ist in einigen Ausführungsformen auch in der Lage, die Krebsart zu bestimmen. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, ist ein Sensor-Array, das sechs Sensorelemente umfasst, in der Lage, den Krankheitszustand der An- oder Abwesenheit von Krebs genau zu bestimmen. Zusätzlich zeigen die Beispiele, dass ein Sensor-Array, das sechs Sensorelemente umfasst, in der Lage ist, zwischen verschiedenen Krebsarten (z.B. Lungenkrebs, Glioblastom, Meningiom, Myelom und Bauchspeicheldrüsenkrebs) zu unterscheiden.
  • Die Begriffe „Krebs“ und „Tumor“, wie sie hierin verwendet werden, sind austauschbar und sollen jegliche Krebserkrankung, neoplastische und paraneoplastische Krankheit umfassen, die durch abnormes Wachstum von Zellen gekennzeichnet ist. Der Krebs kann beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Myelom, myeloische Leukämie, Meningiom, Glioblastom, Brustkrebs, Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, Adenokarzinom des Magens, Prostatakrebs, Blasenkrebs, Eierstockkrebs, Schilddrüsenkrebs , neuroendokriner Krebs, Kolonkarzinom, Eierstockkrebs, Kopf- und Halskrebs, Morbus Hodgkin, Non-Hodgkin-Lymphom, Mastdarmkrebs, Harnkrebs, Gebärmutterkrebs, Mundkrebs, Hautkrebs, Magenkrebs, Hirntumoren, Leberkrebs, Kehlkopfkrebs, Speiseröhrenkrebs, Brusttumoren, Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Ewing-Sarkom, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläre Adenokarzinome, Cystandeokarzinom, medulläres Karzinom, Bronchialkarzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallengangkarzinom Noma, Chorionkarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilms-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Endometriumkarzinom, Lungenkarzinom, kleinzelliges Bronchialkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Glioblastome, Neuronome, Kraniopharyngeome, Schwannome, Gliom, Astrozytom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom, Retinoblastom, Leukämie und Lymphome, akute lymphatische Leukämie und akute myelozytische Polyzythämie, multiples Myelom, Waldenström-Makroglobulinämie und schwere Kettenerkrankung, akute nichtlymphozytische Leukämie, chronische lymphatische Leukämie, chronische myeloische Leukämie, akute lymphoide Leukämie im Kindesalter (ALL), thymische ALL, B-Zell-ALL, akute megakaryozytäre Leukämie, Burkitt-Lymphom und T-Zell-Leukämie, kleines und großes nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, akute granulozytäre Leukämie, Keimzelltumoren, Endometriumkarzinom, Magenkrebs, Haarzellenleukämie, Schilddrüsenkrebs und andere Krebsarten, die in der Technik bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Krebs ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Myelom, myeloische Leukämie, Meningiom, Glioblastom, Brustkrebs, Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, Adenokarzinom des Magens, Prostatakrebs, Blasenkrebs, Eierstockkrebs, Schilddrüse Krebs und neuroendokriner Krebs.
  • Wie hierin verwendet, werden die Begriffe „kardiovaskuläre Erkrankung“ (auch Herz-Kreislauf-Erkrankung, HKL) oder „kardiovaskuläre Störung“ verwendet, um zahlreiche Zustände des Herzens, der Herzklappen und Gefäße (z.B. Venen und Arterien) des Körpers zu klassifizieren und umfasst Krankheiten und Zustände einschließlich aber nicht beschränkt auf Atherosklerose, Myokardinfarkt, akutes Koronarsyndrom, Angina, kongestive Herzinsuffizienz, Aortenaneurysma, Aortendissektion, Darmbein- oder Oberschenkelaneurysma, Lungenembolie, Vorhofflimmern, Schlaganfall, transitorische ischämische Attacke, systolische Dysfunktion, diastolische Dysfunktion, Myokarditis, Vorhof-Tachykardie, Kammerflimmern, Endokarditis, periphere arterielle Verschlusskrankheit und koronare Herzkrankheit (KHK). Ferner bezieht sich der Begriff kardiovaskuläre Erkrankung auf Probanden, die letztendlich ein kardiovaskuläres Ereignis oder eine kardiovaskuläre Komplikation haben, wobei sie sich auf die Manifestation eines nachteiligen Zustands bei einem Patienten beziehen, der durch eine kardiovaskuläre Erkrankung hervorgerufen wird, wie plötzlichen Herztod oder akutes Koronarsyndrom, und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Myokardinfarkt, instabile Angina, Aneurysma, Schlaganfall, Herzinsuffizienz, nicht tödlicher Myokardinfarkt, Schlaganfall, Angina pectoris, transitorische ischämische Attacken, Aortenaneurysma, Aortendissektion, Kardiomyopathie, abnorme Herzkatheterisierung, abnormale kardiale Bildgebung, Stent oder Transplantat Revaskularisierung, Risiko eines abnormalen Stresstests, Risiko einer abnormalen Myokardperfusion und den Tod.
  • Wie hierin verwendet, kann die Fähigkeit, kardiovaskuläre Erkrankungen, beispielsweise Atherosklerose, zu erkennen, zu diagnostizieren oder zu prognostizieren, das Bestimmen umfassen, ob sich der Patient in einer Vorstufe einer kardiovaskulären Erkrankung befindet, frühe, moderate oder schwere Formen einer kardiovaskulären Erkrankung entwickelt hat oder ein oder mehrere kardiovaskuläre Ereignisse oder Komplikationen im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen erlitten hat.
  • Die Atherosklerose (auch als arteriosklerotische Gefäßerkrankung oder ASVD bekannt) ist eine kardiovaskuläre Erkrankung, bei der eine Arterienwand als Folge von Invasion und Akkumulation und Ablagerung von arteriellen Plaques, die weiße Blutkörperchen enthalten, an der innersten Schicht der Arterienwände verdickt wird, was zur Verengung und Verhärtung der Arterien führt. Das arterielle Plaque ist eine Ansammlung von Makrophagenzellen oder -trümmern und enthält Lipide (Cholesterin und Fettsäuren), Calcium und eine variable Menge an faserigem Bindegewebe. Zu Erkrankungen, die mit Atherosklerose assoziiert sind, gehören Atherothrombose, koronare Herzkrankheit, tiefe Venenthrombose, Karotisarterienerkrankung, Angina pectoris, periphere arterielle Erkrankung, chronische Nierenerkrankung, akutes Koronarsyndrom, vaskuläre Stenose, Myokardinfarkt, Aneurysma oder Schlaganfall .
  • Zu Veranschaulichungszwecken können die Sensor-Arrays in einer Ausführungsform die verschiedenen Stadien der Atherosklerose unterscheiden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die unterschiedlichen Grade von Stenose in einem Probanden.
  • Ferner zeigen die nachstehenden Beispiele nur zu Veranschaulichungszwecken die Verwendung eines Sensor-Arrays zum Erfassen der unterschiedlichen Zustände der Koronararterienerkrankung. Ein Sensor-Array mit sechs Sensorelementen ist in der Lage, Patienten mit einer KHK, wie sie durch Koronarangiographie diagnostiziert wurden, Patienten mit Symptomen, die gesunde Koronargefäße (NICHT-KHK), Patienten mit Restenose (Wiederauftreten von KHK nach der Behandlung) und gesunden Probanden ohne Risikofaktoren zu unterscheiden (53). Das vorliegende Sensor-Array ist empfindlich genug, um den Unterschied zwischen Personen zu erkennen, die Symptome einer Koronararterienerkrankung, aber keine Arterienstenosen aufwiesen (z.B. Kein KHK gegenüber KHK-Gruppen). Dies bietet einen neuartigen diagnostischen KHK-Test, der als nicht-invasives Screening für Risikopatienten verwendet werden kann.
  • Der Begriff „endokrine Krankheit“ wird verwendet, um sich auf eine Störung zu beziehen, die mit der Dysregulation des endokrinen Systems eines Probanden verbunden ist. Endokrine Erkrankungen können von einer Drüse herrühren, die zu viel oder zu wenig eines endokrinen Hormons produziert, was zu einem hormonellen Ungleichgewicht oder von der Entwicklung von Läsionen (wie Knoten oder Tumoren) im endokrinen System herrühren, die den Hormonspiegel beeinflussen können oder nicht. Zu passenden endokrinen Erkrankungen, die behandelt werden können, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, z.B. Akromegalie, Addison-Krankheit, Nebennierenkrebs, Nebennierenerkrankungen, anaplastischer Schilddrüsenkrebs, Cushing-Syndrom, De-Quervain-Thyreoiditis, Diabetes, follikulärer Schilddrüsenkrebs, Schwangerschaftsdiabetes, Kropfkrankheit, Morbus Basedow, Wachstumsstörungen, Wachstumshormonmangel, Hashimoto Thyreoiditis, Hurthle Cell Schilddrüsenkrebs, Hyperglykämie, Hyperparathyreoidismus, Hyperthyreose, Hypoglykämie, Hypoparathyreoidismus, Hypothyreose, niedriges Testosteron, medullärer Schilddrüsenkrebs, MEN 1, MEN 2A, MEN 2B, Menopause, metabolisch Syndrom, Adipositas, Osteoporose, Schilddrüsenkarzinom, Nebenschilddrüsenerkrankungen, Phäochromozytom, Hypophysenerkrankungen, Hypophysen-Tumoren, Polyzystisches Ovarialsyndrom, Prädiabetes, Silent, Thyreoiditis, Schilddrüsenkrebs, Schilddrüsenerkrankungen, Schilddrüsenknoten, Schilddrüsenentzündung, Turner-Syndrom, Typ-1-Diabetes, Typ 2 Diabetes und dergleichen.
  • Wie hierin erwähnt, bezieht sich entzündliche Erkrankung auf eine Krankheit, die durch unkontrollierte Entzündung im Körper eines Probandens verursacht wird. Eine Entzündung ist eine biologische Reaktion des Probanden auf einen schädlichen Stimulus, der extern oder intern sein kann, wie Pathogene, nekrotisierte Zellen und Gewebe, Reizstoffe usw. Wenn die Entzündungsreaktion jedoch abnormal wird, führt dies zu einer Verletzung des Eigengewebes und kann zu verschiedenen Krankheiten und Störungen führen. Entzündliche Erkrankungen können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf Asthma, Glomerulonephritis, entzündliche Darmerkrankung, rheumatoide Arthritis, Hypersensitivitäten, Adnexitis, Autoimmunkrankheiten, Arthritis; Nekrotisierende Enterokolitis (NEC), Gastroenteritis, Adnexitis (PID), Emphysem, Pleuritis, Pyelitis, Pharyngitis, Angina, Acne vulgaris, Harnwegsinfektion, Appendizitis, Bursitis, Colitis, Zystitis, Dermatitis, Phlebitis, Rhinitis, Tendinitis, Tonsillitis, Vaskulitis, Autoimmunerkrankungen; Zöliakie; chronische Prostatitis, Hypersensitivitäten, Reperfusionsverletzung; Sarkoidose, Transplantatabstoßung, Vaskulitis, interstitielle Zystitis, Heuschnupfen, Parodontitis, Atherosklerose, Psoriasis, ankylosierende Spondylitis, juvenile idiopathische Arthritis, Behcet-Krankheit, Spondyloarthritis, Uveitis, systemischer Lupus erythematodes und Krebs. Zum Beispiel umfasst die Arthritis rheumatoide Arthritis, psoriatische Arthritis, Osteoarthritis oder juvenile idiopathische Arthritis und dergleichen.
  • Neurologische Störungen und neurologische Erkrankungen werden synonym verwendet und beziehen sich auf Erkrankungen des Gehirns, der Wirbelsäule und der Nerven, die sie verbinden. Neurologische Erkrankungen umfassen Hirntumore, Epilepsie, Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, ALS, arteriovenöse Malformation, zerebrovaskuläre Erkrankung, Hirnaneurysmen, Epilepsie, multiple Sklerose, periphere Neuropathie, postherpetische Neuralgie, Schlaganfall, frontotemporale Demenz, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Demyelinisierende Krankheit (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Multiple Sklerose, Devic-Krankheit (d.h. Neuromyelitis optica), zentrale pontine Myelinolyse, progressive multifokale Leukoenzephalopathie, Leukodystrophien, Guillain-Barre-Syndrom, progressive inflammatorische Neuropathie, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, chronisch entzündliche Demyelinisierung Polyneuropathie und Anti-MAG-periphere Neuropathie) und dergleichen. Neurologische Störungen umfassen auch immunvermittelte neurologische Störungen (IMNDs), die Krankheiten umfassen, bei denen mindestens eine Komponente des Immunsystems gegen im zentralen oder peripheren Nervensystem vorhandene Wirtsproteine reagiert und zur Krankheitpathologie beiträgt. IMNDs können die demyelinisierende Erkrankung, paraneoplastische neurologische Syndrome, immunvermittelte Enzephalomyelitis, immunvermittelte autonome Neuropathie, Myasthenia gravis, Autoantikörperassoziierte Enzephalopathie und akute disseminierte Enzephalomyelitis umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • In einem nicht einschränkenden Beispiel stellen die nachstehenden Beispiele ein Verfahren zum Diagnostizieren von Alzheimer in einem Patienten unter Verwendung des hierin beschriebenen Sensor-Array und -verfahren bereit. Das Sensor-Array war nicht nur in der Lage, genau zwischen Patienten mit oder ohne Alzheimer-Krankheit zu unterscheiden, sondern war auch in der Lage, Patienten zu erkennen, die präsymptomatisch waren und mehrere Jahre nach dem Screening eine Alzheimer-Krankheit entwickelt hatten (bestimmt durch Kohortenplasmen). Dies bietet den Vorteil, eine Krankheit in einem sehr frühen Stadium behandeln zu können, sogar vor der eigentlichen Entwicklung der Krankheit.
  • Die Sensor-Arrays und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in einigen Ausführungsformen in der Lage, ein Stadium vor einer Krankheit oder Erkrankung zu erkennen. Ein Stadium vor der Krankheit ist ein Stadium, in dem der Patient noch keine Anzeichen oder Symptome der Krankheit entwickelt hat. Ein präkanzeröses Stadium wäre ein Stadium, in dem der Krebs oder Tumor- oder Krebszellen nicht im Probanden identifiziert werden können. Ein vor-neurologisches Krankheitsstadium wäre ein Stadium, in dem eine Person kein oder mehrere Symptome der neurologischen Erkrankung entwickelt hat. Die Fähigkeit, eine Krankheit zu diagnostizieren, bevor ein oder mehrere Anzeichen oder Symptome der Krankheit vorliegen, ermöglicht eine genaue Überwachung des Probanden und die Fähigkeit, die Krankheit in einem sehr frühen Stadium zu behandeln, was die Aussicht erhöht, die Progression aufzuhalten oder die Schwere der Krankheit einzudämmen.
  • Die Sensor-Arrays und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in einigen Ausführungsformen in der Lage, die frühen Stadien einer Krankheit oder Störung zu erfassen. Frühe Stadien der Krankheit beziehen sich darauf, wann sich die ersten Anzeichen oder Symptome einer Krankheit in einem Probanden manifestieren können. Normalerweise sind Krankheiten, die entweder in der frühen Krankheitsphase oder in den frühen Stadien aufgefangen werden können, einfacher zu behandeln und führen zu einem positiveren Ergebnis für den Patienten. Zum Beispiel können bei Krebs die frühen Stadien einer Krankheit Krebs im Stadium 0 und Stadium 1 einschließen. Stadium-O-Krebs beschreibt den Krebs in situ, was bedeutet, dass der Krebs sich immer noch an dem Ort befindet, an dem er begonnen hat und sich nicht auf das nahe gelegene Gewebe ausgebreitet hat. Dieses Krebsstadium ist oft heilbar, meist durch Entfernung des gesamten Tumors durch eine Operation. Stadium-1-Krebs ist normalerweise ein kleiner Krebs oder Tumor, der nicht tief in nahegelegenes Gewebe hineingewachsen ist und sich nicht in Lymphknoten oder andere Körperteile ausgebreitet hat.. Ferner kann das frühe Stadium einer Krankheit ein Stadium sein, bei dem es keine äußeren Anzeichen oder Symptome gibt. Zum Beispiel kann bei der Alzheimer-Krankheit ein Frühstadium ein Vor-Alzheimer-Stadium sein, in dem keine Symptome festgestellt werden, und der Patient wird noch Monate oder Jahre später Alzheimer entwickeln.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Sensorarrays und Verfahren in der Lage, Zwischenstufen der Krankheit zu erkennen. Zwischenstufen der Krankheit beschreiben Stadien der Krankheit, die die ersten Anzeichen und Symptome durchlaufen haben, und der Patient weist ein oder mehrere Symptome der Krankheit auf. Zum Beispiel werden Krebsarten im Stadium II oder III als Zwischenstufen betrachtet, was auf größere Krebserkrankungen oder Tumore hinweist, die tiefer in nahegelegenes Gewebe hineingewachsen sind. In einigen Fällen können sich Krebserkrankungen im Stadium II oder III auch auf Lymphknoten, aber nicht auf andere Körperteile ausgebreitet haben.
  • Ferner sind die Sensor-Arrays und Verfahren in der Lage, späte oder fortgeschrittene Stadien der Krankheit zu erkennen. Späte oder fortgeschrittene Stadien der Krankheit können auch als „schwer“ oder „fortgeschritten“ bezeichnet werden und weisen in der Regel darauf hin, dass der Patient an mehreren Symptomen und Auswirkungen der Krankheit leidet. Zum Beispiel umfasst ein schweres Krebsstadium Stadium IV, bei dem sich der Krebs auf andere Organe oder Teile des Körpers ausgebreitet hat und manchmal als fortgeschrittener oder metastasierender Krebs bezeichnet wird.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die Verfahren der vorliegenden Technologie das Vergleichen des Protein-Fingerabdrucks der Probe mit einer Gruppe von Protein-Fingerabdrücken, die einer Mehrzahl von Krankheiten und/oder mehreren Krankheitszuständen assoziiert sind, um zu bestimmen, ob die Probe eine Krankheit und/oder Krankheit anzeigt Zustand. Zum Beispiel können Proben von einer Population von Probanden im Laufe der Zeit gesammelt werden. Sobald die Probanden eine Krankheit oder Störung entwickeln, ermöglicht die vorliegende Erfindung die Fähigkeit, die Veränderungen der biomolekularen Fingerabdrücke im Laufe der Zeit im Probanden zu charakterisieren und nachzuweisen, indem sie den Biomolekül-Fingerabdruck der Probe von demselben Probanden vergleicht, bevor sie eine Krankheit entwickelt haben Biomolekül-Fingerabdruck des Probanden, nachdem sie die Krankheit entwickelt haben. In einigen Ausführungsformen können Proben aus Kohorten von Patienten entnommen werden, die alle die gleiche Krankheit entwickeln, was die Analyse und Charakterisierung der Biomolekül-Fingerabdrücke ermöglicht, die den verschiedenen Krankheitsstadien für diese Patienten assoziiert sind (z.B. von der Vorerkrankung bis zu Krankheitszuständen).
  • Nur zu Veranschaulichungszwecken zeigen die Beispiele, dass die Verfahren und Sensor-Arrays der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, nicht nur zwischen verschiedenen Krebsarten, sondern auch zwischen den verschiedenen Stadien des Krebses (z.B. frühen Stadien von Krebs) zu unterscheiden.
  • Es sind Verfahren zur Bestimmung eines Biomolekül-Fingerabdrucks in Verbindung mit mindestens einer Krankheit oder Störung und/oder einem Krankheitszustand vorgesehen. Die Verfahren umfassen die Schritte des Einholens einer Probe von mindestens zwei Probanden, bei denen die mindestens eine Krankheit oder Störung diagnostiziert wurde oder die den gleichen Krankheitszustand aufweisen; in Kontakt bringen jeder Probe mit einer hier beschriebenen Sensor-Array, um einen Biomolekül-Fingerabdruck für jede Sensor-Array zu bestimmen und den Fingerabdruck der mindestens zwei Proben zu analysieren, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen, der der mindestens einer Krankheit oder Störung und/oder dem Krankheitszustand assoziiert ist.
  • Klassifikation einer Biomolekülkorona
  • Das Verfahren zum Bestimmen des Biomolekül-Fingerabdrucks, der der Krankheit oder Störung und/oder dem Krankheitszustand assoziiert ist, umfasst die Analyse der Biomolekül-Fingerabdrücke der mindestens zwei Proben. Diese Bestimmung, Analyse oder statistische Klassifikation wird durch im Stand der Technik bekannte Verfahren durchgeführt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf zum Beispiel einer großen Vielfalt von überwachten und unüberwachten Datenanalyse-, maschinellen Lern-, Deep Learning- und Clustering-Ansätzen, einschließlich hierarchischer Clusteranalyse (HCA), Hauptkomponentenanalyse (PCA), Partielle Fehlerquadrat-Diskriminanzanalyse (PLS-DA), Random Forest, logistische Regression, Entscheidungsbäume, Unterstützungsvektormaschine (SVM), k-nächste Nachbarn, naive bayes, lineare Regression, polynomiale Regression , SVM für Regression, K-Means-Clustering und versteckte Markov-Modelle und anderen. Mit anderen Worten, werden die Biomolekül-Fingerabdrücke jeder Probe miteinander verglichen/analysiert, um mit statistischer Signifikanz zu bestimmen, welche Muster zwischen den einzelnen Fingerabdrücken gemeinsam sind, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen, der der Krankheit oder Störung oder dem Krankheitszustand assoziiert ist.
  • Im Allgemeinen werden Maschinelles Lernen-Algorithmen verwendet, um Modelle zu erstellen, die Klassenbezeichnungen (class labels) basierend auf den Eingabefunktionen, die das Beispiel beschreiben, Beispielen genau zuordnen. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, maschinelles Lernen und/oder Deep-Learning-Ansätze für die hierin beschriebenen Verfahren zu verwenden. Zum Beispiel kann maschinelles Lernen verwendet werden, um den Biomolekül-Fingerabdruck verschiedenen Krankheitszuständen zuzuordnen (z.B. keine Krankheit, Vorläufer einer Krankheit, frühes oder spätes Stadium der Krankheit usw.). Zum Beispiel werden in einigen Fällen ein oder mehrere maschinelles Lernen-Algorithmen in Verbindung mit einem Verfahren der Erfindung verwendet, um Daten zu analysieren, die durch die daraus abgeleiteten Biomolekülkorona- und Biomolekül-Fingerabdrücke erfasst und erhalten werden. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform maschinelles Lernen mit der hier beschriebenen Sensor-Array gekoppelt werden, um nicht nur zu bestimmen, ob ein Proband eine Vorstufe von Krebs oder bereits Krebs hat oder keinen Krebs entwickelt, sondern auch, um die Krebsart zu unterscheiden.
  • Die nachstehenden Beispiele zeigen die Fähigkeit der hier beschriebenen Sensor-Array, den Krankheitszustand für eine Anzahl verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, kardiovaskulärer Erkrankungen und neurologischer Erkrankungen (z.B. Alzheimer-Krankheit) mit statistischer Signifikanz, zu bestimmen. Diese Untersuchung ist nicht auf diese spezifischen Ausführungsformen beschränkt, da die Sensor-Array auf eine Vielzahl von Krankheiten und Krankheitszuständen, wie hierin beschrieben, angewendet werden kann.
  • In einigen Ausführungsformen umfasst das Verfahren das Einholen von Proben von Kontrollprobanden, die mit der Sensor-Array in Kontakt gebracht werden, um einen Kontroll-Biomolekül-Fingerabdruck zu erzeugen. Diese Kontroll-Biomolekül-Fingerabdrücke können dann verwendet werden, um sie mit den Biomolekül-Fingerabdrücken der Probanden mit einer Krankheit oder Störung und/oder einem spezifischen Krankheitszustand zu vergleichen, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen, der für diese Krankheit oder Störung und/oder spezifischen Krankheitszustand spezifisch ist.
  • Das Verfahren kann zum Beispiel das Einholen einer Kontrollprobe von mindestens einem Kontrollprobanden, das in Kontakt bringen der Kontrollprobe mit der Sensor-Array, um eine Mehrzahl von Kontroll-Biomolekülkorona zu erzeugen, und das Untersuchen der Mehrzahl von Biomolekülen jeder Kontroll-Biomolekülkorona umfassen. Das Verfahren kann ferner das Vergleichen der Mehrzahl von Biomolekülen der Mehrzahl von Kontroll-Biomolekülkoronen mit der Mehrzahl von Biomolekülen der Mehrzahl von Biomolekülkoronen von dem Probanden mit der Krankheit oder Störung umfassen, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen, der der mindestens einen Krankheit oder Störung assoziiert ist.
  • Es sind auch Verfahren zur Diagnose oder Prognose einer Krankheit oder Störung vorgesehen. Die Verfahren umfassen das Einholen einer Probe von einem Probanden; das in Kontakt bringen der Probe mit einer Sensor-Array, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu erzeugen, und Vergleichen des Biomolekül-Fingerabdrucks mit einer Zeile von Biomolekül-Fingerabdrücken, die einer Vielzahl von Krankheiten oder Störungen assoziiert sind; und das Diagnostizieren oder Prognostizieren der Krankheit oder Störung.
  • In einigen Ausführungsformen sind Verfahren zum Identifizieren von Mustern von Biomarkern oder spezifischen Biomarkern vorgesehen, die einer Krankheit oder Störung assoziiert sind. Geeignete Verfahren umfassen beispielsweise das Durchführen der oben beschriebenen Verfahren (z.B. Einholen von Proben von mindestens zwei mit der Krankheit oder Störung diagnostizierten Probanden und mindestens zwei Kontrollprobanden; in Kontakt bringen jeder Probe mit der Sensor-Array, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu erzeugen, und Vergleichen des biomolekularen Fingerabdrucks der Probanden mit der Krankheit oder Störung mit dem Biomolekül-Fingerabdruck der Kontrollprobanden, um mindestens ein Muster und/oder einen Biomarker zu bestimmen, der der Krankheit oder Störung assoziiert ist). Geeigneterweise kann das Verfahren mindestens 2 kranke Probanden und mindestens zwei Kontrollprobanden, alternativ mindestens 5 kranke Probanden und mindestens 5 Kontrollprobanden, alternativ mindestens 10 kranke Probanden und mindestens 10 Kontrollprobanden, alternativ mindestens 15 kranke Probanden umfassen und mindestens 15 Kontrollprobanden, alternativ mindestens 20 kranke Probanden und mindestens 20 Kontrollprobanden umfassen und schließt irgendwelche Variationen dazwischen mit ein (z.B. kranke Probanden von mindestens 2 bis 100 und Kontrollprobanden von mindestens 2 bis 100).
  • In einigen Ausführungsformen ermöglichen die Arrays und Verfahren die Bestimmung eines Musters von Biomarkern, die dem Krankheitszustand oder der Erkrankung oder Störung assoziiert sind, oder in einigen Ausführungsformen spezifische Biomarker, die der Krankheit oder Störung assoziiert sind. Es können nicht nur Biomarker identifiziert werden, die einem Krankheitszustand assoziiert sind, beispielsweise die hier aufgelisteten Biomarker, sondern auch neue Biomarker oder Muster von Biomarkern, die einem Krankheitszustand oder einer Krankheit oder Störung assoziiert sind. Wie oben erörtert, können einige Biomarker oder Muster von Biomarkern für eine spezifische Krankheit oder Störung eine Veränderung in einem Biomolekül sein, das der Sensor-Array der vorliegenden Erfindung assoziiert ist und sich von dem unterscheiden, was üblicherweise im Stand der Technik als Biomarker bezeichnet wird. Wie oben erläutert, kann es die Wechselwirkung eines Biomoleküls sein, z.B. Biomolekül X mit anderen Biomolekülen, wie z.B. Biomolekül Y und Z, das zu der Möglichkeit führt, es einem spezifischen Krankheitszustand zuzuordnen und nicht mit irgendeiner Veränderung der absoluten Konzentration von Biomarker X in der Probe über die Zeit oder dem Krankheitszustand korreliert. Somit kann ein Molekül, das im herkömmlichen Sinn nicht als Biomarker betrachtet werden würde, da es die absolute Konzentration in einer Probe von der Vorerkrankung in den Krankheitszustand nicht ändert, angesichts der vorliegenden Offenbarung als ein Biomolekül betrachtet werden, da seine relative Veränderungen, die durch das Array der vorliegenden Erfindung gemessen werden, einem Krankheitszustand assoziiert sind. Mit anderen Worten kann es eine Zunahme oder Abnahme der Wechselwirkung von Biomolekül X (aufgrund der Wechselwirkungen von X mit den Sensorelementen und anderen Biomolekülen in der Probe) mit dem Array sein, die ein Signal dafür liefert, dass ein Biomarker einem Krankheitszustand assoziiert ist.
  • Geeignete Krebs-Biomarker umfassen, sind aber nicht beschränkt auf zum Beispiel AHSG a2-HS-Glycoprotein), AKR7A2 (Aflatoxin B1 aldehyde reductase), AKT3 (PKB γ), ASGR1 (ASGPR1), BDNF, BMP1 (BMP -1), BMPER, C9, CA6 (Carboanhydrase VI), CAPG (CapG), CDH1 (Cadherin-1), CHRDL1 (Chordin-Like 1), CKB-CKM- (CK-MB), CLIC1 (Chlorid-Intrazellular-Kanal) 1), CMA1 (Chymosin), CNTN1 (Contactin-1), COL18A1 (Endostatin), CRP, CTSL2 (Cathepsin V), DDC (Dopadecarboxylase), EGFR (ERBB1), FGA-FGB-FGG (D-Dimer), FN1 (Fibronektin FN1.4), GHR (Wachstumshormonrezeptor), GPI (Glucosephosphatisomerase), HMGB1 (HMG-1), HNRNPAB (hnRNP A/B), HP (Haptoglobin, gemischter Typ), HSP90AA1 (HSP 90α) HSPA1A (HSP70), IGFBP2 (IGFBP-2), IGFBP4 (IGFBP-4), IL12B-IL23A (IL-23), ITIH4 (Inter-α-Trypsininhibitor, schwere Kette H4), KIT (SCF sR), KLK3 -SERPINA3 (PSA-ACT), L1 CAM (NCAM-L1), LRIG3, MMP12 (MMP-12), MMP7 (MMP-7), NME2 (NDP-Kinase B), PA2G4 (ErbB3-bindendes Protein Ebp1), PLA2G7 (LpPLA2/PAFAH), PLAUR (suPAR), PR KACA (PRKA C-α), PRKCB (PKC-β-II), PROK1 (EG-VEGF), PRSS2 (Trypsin-2), PTN (Pleiotrophin), SERPINA1 (al-Antitrypsin), STC1 (Stanniocalcin-1), STX1A (Syntaxin 1A), TACSTD2 (GA733-1-Protein), TFF3 (Trefoil-Faktor 3), TGFBI (ßIGH3), TPI1 (Triosephosphat-Isomerase), TPT1 (Fortilin), YWHAG (14-3-3-Protein γ), YWHAH (B. PSA, Pro-PSA, PHI, PCA3, TMPRSS3: ERG, PCMT, MTEN, Brustkrebsmarker, zum Beispiel epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor-2 (HER2) Onkogen, Melanom-Biomarker BRAF, Lungenkrebs-Biomarker EML4-ALK, A2ML1, BAX, C10orf47, Clorfl62, CSDA, EIFC3, ETFB, GABARAPL2, GUK1, GZMH, HIST1H3B, HLA-A, HSP90AA1, NRGN, PRDX5, PTMA, RABAC1, RABAGAP1L, RPL22, SAP 18, SEPW1, SOX1, EGFR, EGFRvIII, Apolipoprotein AI, Apolipoprotein CIII, Myoglobin, Tenascin C, MSH6, Claudin-3, Claudin-4, Caveolin-1, Gerinnungsfaktor III, CD9, CD36, CD37, CD53, CD63, CD81, CD136, CD147, Hsp70, Hsp90, Rabl3, Desmocollin-1, EMP-2, CK7, CK20, GCDF15, CD8 2, Rab-5b, Annexin V, MFG-E8, HLA-DR, eine miR200 microRNA, MDC, NME-2, KGF, PIGF, Flt-3L, HGF, MCP1, SAT-1, MIP-1-b, GCLM B. OPG, TNF RII, VEGF-D, ITAC, MMP-10, GPI, PPP2R4, AKR1B1, Amy1A, MIP-1b, P-Cadherin, EPO und dergleichen. Zum Beispiel schließen Biomarker für Brustkrebs ein, sind aber nicht beschränkt auf ER/PR, HER-2/neu und dergleichen. Biomarker für kolorektalen Krebs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf zum Beispiel EGFR, KRAS, UGT1A1 und dergleichen. Biomarker, die mit Leukämie/Lymphom assoziiert sind, umfassen CD20-Antigen, CD30, FIP1L1-PDGFRalpha, PDGFR, Philadelphia-Chromosom (BCR/ABL), PML/RAR-alpha, TPMT, UGT1A1 und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Zu Biomarkern, die mit Lungenkrebs assoziiert sind, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, beispielsweise ALK, EGFR, KRAS und dergleichen. Biomarker sind im Stand der Technik bekannt und können zum Beispiel in Bigbee W, Herberman RB. Tumor markers and immunodiagnosis. In: Bast RC Jr., Kufe DW, Pollock RE, et al., editors. Cancer Medicine. 6th ed. Hamilton, Ontario, Canada: BC Decker Inc., 2003; Andriole G, Crawford E, Grubb R, et al. Mortality results from a randomized prostate-cancer screening trial. New England Journal of Medicine 2009; 360(13): 1310-1319; Schröder FH, Hugosson J, Roobol MJ, et al. Screening and prostate-cancer mortality in a randomized European study. New England Journal of Medicine 2009; 360(13):1320-1328; Buys SS, Partridge E, Black A, et al. Effect of screening on ovarian cancer mortality: the Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian (PLCO) Cancer Screening Randomized Controlled Trial. JAMA 2011; 305(22):2295-2303; Cramer DW, Bast RC Jr, Berg CD, et al. Ovarian cancer biomarker performance in prostate, lung, colorectal, and ovarian cancer screening trial specimens. Cancer Prevention Research 2011; 4(3):365-374; Sparano JA, Gray RJ, Makower DF, et al. Prospective validation of a 21-gene expression assay in breast cancer. New England Journal of Medicine 2015; First published online September 28, 2015. doi: 10.1056/NEJMoal510764 gefunden werden, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen sind.
  • Geeigneterweise können diese Verfahren dazu verwendet werden, um Krebs assoziierte Biomarker zu bestimmen. Zum Beispiel ist der Krebs in einer Ausführungsform ein Glioblastom, wobei der Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HABP1, VTNC, CO3, ITIH2, ITIH1, CO7, FHR5, CBPN, ALBU, PLMN, CO4A, PRDX2, VWF, C4BPA, APOB, HBB, CNDP1, CRP, SAA4, APOE, CSCL7 und Kombinationen davon. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs Meningeom, wobei der Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus FCN3, RET4, HABP2, CBPN und Kombinationen davon. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs Bauchspeicheldrüsenkrebs, wobei der Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus KNG1, IC1, CBPB2, TRFE, GELS, CXCL7, HPTR, PGK1, AACT, LUM, APOE, FIBB, APOA2, A1BG, A1AT, LBP, APOA1, H4, FIBG und Kombinationen davon. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs Lungenkrebs und der Biomarker ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus COO, CRP, SAA4, APOA1, A1AT, GELS und Kombinationen davon. In einer anderen Ausführungsform ist der Krebs ein Myelom und der Biomarker ist ALBU.
  • Die Biomarker können auch der kardiovaskulären Erkrankung assoziiert sein, wobei die Biomarker aus dem Stand der Technik bekannt sind und umfassen, ohne aber darauf beschränkt zu sein, das Lipidprofil-, densd Glucose- und Hormonspiegel und physiologische Biomarker basierend auf der Messung von Spiegeln von wichtigen Biomolekülen, wie Serumferritin, Triglycerid zu HDLp (High Density Lipoproteins) - Verhältnis, Lipophorin-Cholesterin-Verhältnis, Lipid-Lipophorin-Verhältnis, LDL-Cholesterin-Spiegel, HDLp- und Apolipoprotein-Spiegel, Lipophorin- und LTP-Verhältnis, Sphingolipide, Omega-3-Index und ST2-Spiegel. Geeignete Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen können in der Technik gefunden werden, zum Beispiel, aber nicht darauf beschränkt, in van Holten et al. „Ciculating Biomarkers for Predicting Cardiovascular Disease Risk; a Systemic Review and Comprehensive Overview of Meta-Analyses" PLoS One, 2013 8(4): e62080, das hierin durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit aufgenommen ist.
  • Biomarker können auch mit einer neurologischen Erkrankung assoziiert sein. Geeignete Biomarker sind im Stand der Technik bekannt und schließen unter anderem ein, sind aber nicht darauf beschränk, z.B. 1-42, t-tau und p-tau 181, α-Synuclein, unter anderem. Siehe z.B. Chintamaneni und Bhaskar „Biomarkers inAlzheimer-Krankheit: A Review“ ISRN Pharmacol. 2012. 2012: 984786. Jun 28, durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen Online 2012 veröffentlicht.
  • Die Biomarker für entzündliche Erkrankungen sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf z.B. Cytokine/Chemokine, Immunverwandte Effektoren, Akute-Phase-Proteine [C-reaktives Protein (CRP) und Serum-Amyloid A (SAA)], reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS), Prostaglandine und Cyclooxygenase (COX) -bezogene Faktoren und Mediatoren wie Transkriptionsfaktoren und Wachstumsfaktoren, zu denen beispielsweise C-reaktives Protein (CRP), S100, LIF, CXCL1, CXCL2, CXCL4, CXCL5, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL23, IL-ß, IL-IRa, TNF, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-21 B. IL-22, IFNγ, CXC11, CXCR4, CXCR5, GM-CSF, GM-CSFR, G-CSF, G-CSFR, EGF, VEGFA, LEP, SAA1, VCAM1, CRP, MMP1, MMP3, TNFRSF1A, RETN, CHI3L1 , antinukleäre Antikörper (ANA), rheumatoider Faktor (RF), Antikörper gegen zyklisches citrulliniertes Peptid (anti-CCP) und für chronische IBD (fäkales Calprotectin) und andere gehören können. Geeignete Biomarker für entzündliche Darmerkrankungen schließen zum Beispiel CRP, ESR, pANCA, ASCA und fäkales Calprotectin ein. Siehe z.B. Yi Fengming and Wu Jianbing, „Biomarkers of Inflammatory Bowel Disease,“ Disease Markers, vol. 2014, Article ID 710915, 11 pages, 2014. doi: 10.1155/2014/710915, das hier durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit mit aufgenommen ist.
  • Die Begriffe „Einzelperson“, „Proband“ und „Patient“ werden hierin synonym verwendet, unabhängig davon, ob der Proband irgendeine Form der Behandlung hat oder gerade durchläuft. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Proband“ im Allgemeinen auf ein beliebiges Wirbeltier, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Säugetier. Beispiele für Säugetiere schließen Primaten, einschließlich Affen und Menschen, Einhufer (z.B. Pferde), Hunde (z.B. Haushunde), Katzen, verschiedene domestizierte Tiere (z.B. Huftiere, wie Schweine, Schweine, Ziegen, Schafe und dergleichen), sowie domestizierte Kleintiere (z.B. Katzen, Hamster, Mäuse und Meerschweinchen) ein. Vorzugsweise ist der Proband ein Mensch.
  • Die hier beschriebenen Arrays und Verfahren können unter einer Anzahl verschiedener Bedingungen verwendet werden, um den gewünschten Biomolekül-Fingerabdruck bereitzustellen. Zum Beispiel können die Größe der Sensorelemente, die Flussrate der Probe durch den Sensor, die Zeit des Inkubierens der Sensor-Array mit der Probe und die Temperatur, bei der die Sensor-Array inkubiert wird, alle verändert werden, um einen reproduzierbaren Biomolekül-Fingerabdruck bereitzustellen. Geeignete Größen des Sensorelements umfassen nanoskalige Sensorelemente, die sich in zumindest einer Richtung weniger als einen Mikrometer erstrecken.
  • Eine geeignete Zeit für das Inkubieren des Arrays oder der Vielzahl von Sensorelementen umfasst mindestens einige Sekunden, z.B. mindestens 10 Sekunden bis etwa 24 Stunden, beispielsweise mindestens etwa 10 Sekunden, mindestens etwa 15 Sekunden, mindestens etwa 20 Sekunden, mindestens etwa 25 Sekunden, mindestens etwa 30 Sekunden, mindestens etwa 40 Sekunden, mindestens etwa 50 Sekunden, mindestens etwa 60 Sekunden, mindestens etwa 90 Sekunden, mindestens etwa 2 Minuten, mindestens etwa 3 Minuten, mindestens etwa 4 Minuten, mindestens etwa 5 Minuten, mindestens etwa 6 Minuten, mindestens etwa 7 Minuten mindestens etwa 8 Minuten, mindestens etwa 9 Minuten, mindestens etwa 10 Minuten, mindestens etwa 15 Minuten, mindestens etwa 20 Minuten, mindestens etwa 25 Minuten, mindestens etwa 30 Minuten, mindestens etwa 45 Minuten, bei mindestens ungefähr 50 Minuten, mindestens ungefähr 60 Minuten, mindestens ungefähr 90 Minuten, mindestens ungefähr 2 Stunden, mindestens ungefähr 3 Stunden, mindestens ungefähr 4 Stunden, mindestens ungefähr 5 Stunden, mindestens ungefähr 6 Stunden, mindestens ungefähr 7 Stunden, mindestens etwa 8 Stunden, mindestens etwa 9 Stunden, mindestens etwa 10 Stunden, mindestens etwa 12 Stunden, mindestens etwa 10 Stunden t 14 Stunden, mindestens etwa 15 Stunden, mindestens etwa 16 Stunden, mindestens etwa 17 Stunden, mindestens etwa 18 Stunden, mindestens etwa 19 Stunden, mindestens etwa 20 Stunden, und umfassen jede Zeit und jeden Schritt dazwischen (z.B. 10 Sekunden, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 Sekunden usw.; 1 Minute, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 , 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 usw.; 1 Stunde, 2 Stunden, 3 Stunden, 4 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden usw.).
  • Ferner kann die Temperatur, bei der der Assay durchgeführt wird, durch den Fachmann bestimmt werden und umfasst Temperaturen zwischen etwa 4 ° C und etwa 40 ° C, alternativ zwischen etwa 4 ° C und etwa 20 ° C von etwa 10 ° C bis etwa 15 ° C, alternativ von etwa 10 ° C bis etwa 40 ° C, beispielsweise bei etwa 4 ° C, etwa 5 ° C, etwa 6 ° C, etwa 7 ° C, etwa 8 ° C, etwa 9°C, etwa 10°C, etwa 11°C, etwa 12°C, etwa 13°C, etwa 14°C, etwa 15°C, etwa 16°C, etwa 17°C, etwa 18°C C, etwa 19 ° C, etwa 20 ° C, etwa 21 ° C, etwa 22 ° C, etwa 25 ° C, etwa 30 ° C, etwa 35 ° C, etwa 37 ° C usw. Geeigneterweise kann die Untersuchung bei Raumtemperatur durchgeführt werden (z.B. bei etwa 37 ° C, beispielsweise von etwa 35 ° C bis etwa 40 ° C).
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können das in Kontakt bringen der Probe mit dem Sensor-Array umfassen. Für das in Kontakt bringen der Probe mit der Sensor-Array kann eine beliebige geeignete Flussrate verwendet werden, in der die Probe über die Sensor-Array fließen kann. Gemäß einigen Aspekten können die Strömungsgeschwindigkeit, die Reynolds-Zahl oder die relativen Querschnittsflächen der Strömungen verändert werden, um einen angemessenen Kontakt zwischen der Probe und der Sensor-Array zu schaffen.
  • Zum Beispiel kann in Ausführungsformen, die einen Nanokanal oder Mikrokanal verwenden, die Querschnittsfläche des ersten Stroms mehr als 1% der Querschnittsfläche des Kanals betragen. In einem anderen Beispiel kann die Querschnittsfläche des ersten Stroms weniger als 90% der Querschnittsfläche des Kanals betragen. Das Querschnittsflächenverhältnis kann 10:1 bis 1:10, 1:5 bis 5:1, 1:3 bis 3:1, 1:2 bis 2:1 oder 1:1 sein.
  • Unter bestimmten anderen Umständen hat der Fluss der Probe über das Array an der Einlassstelle der Probe eine Reynolds-Zahl zwischen 300 und 1.000.000. In einigen Fällen ist die Einlassstelle der Probe ein Nanokanal oder Mikrokanal.
  • Kits
  • Die in Bezug auf Verfahren beschriebenen Aspekte der vorliegenden Offenbarung, können im Zusammenhang mit dem Sensor-Array oder den Kits, die in dieser Offenbarung erläutert sind, verwendet werden. In ähnlicher Weise können auch die in Bezug auf das Sensor-Array beschriebenen Aspekte der vorliegenden Offenbarung im Kontext der Kits verwendet werden, und die in Bezug auf die Kitz beschriebenen Aspekte der vorliegenden Offenbarung können im Kontext der Verfahren und der Sensor-Arrays verwendet werden.
  • Diese Offenbarung stellt Kits bereit. Die Kits können zur Verwendung in den hier beschriebenen Verfahren geeignet sein. Geeignete Kits umfassen ein Kit zum Bestimmen eines Biomolekül-Fingerabdrucks für eine Probe, umfassend ein Sensor-Array, wie es hierin beschrieben ist. Gemäß einem Aspekt stellt das Kit ein Sensor-Array bereit, das wenigstens zwei Sensorelemente umfasst, die voneinander verschiedene physikochemische Eigenschaften aufweisen. Gemäß einigen Aspekten stellen die Kits eine Vergleichsgruppe von Biomolekül-Fingerabdrücken bereit, um den Biomolekül-Fingerabdruck zu verwenden, um einen Krankheitszustand des Probanden zu bestimmen. Gemäß einigen Aspekten sind Anweisungen zur Bestimmung des Biomolekül-Fingerabdrucks enthalten. In einigen geeigneten Ausführungsformen sind die Sensor-Arrays als Chip-Arrays in dem Kit vorgesehen.
  • Gemäß anderen Aspekten werden Kits zum Bestimmen eines Krankheitszustands eines Probanden oder zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Krankheit des Probanden bereitgestellt. Geeignete Kits umfassen ein Sensor-Array, das wenigstens zwei Sensorelemente umfasst, die voneinander verschiedene physikochemische Eigenschaften aufweisen, um einen Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen. Ferner kann das Kit weiterhin eine Vergleichsgruppe von Biomolekül-Fingerabdrücken verschiedener Krankheitszustände oder verschiedener Krankheiten oder Störungen enthalten. Es werden Anweisungen zur Bestimmung des Biomolekül-Fingerabdrucks und der Analyse bereitgestellt.
  • Es sollte für den Fachmann offensichtlich sein, dass neben den bereits beschriebenen, viele zusätzliche Modifikationen möglich sind, ohne von den erfinderischen Ideen abzuweichen. Bei der Auslegung dieser Offenbarung sollten alle Begriffe so weit wie möglich in Übereinstimmung mit dem Kontext interpretiert werden. Variationen des Begriffs „umfassend“ sollten so interpretiert werden, dass sie sich nicht ausschließlich auf Elemente, Komponenten oder Schritte beziehen, so dass sie auch mit Elementen, Komponenten oder Schritte kombiniert werden können, auf die nicht ausdrücklich verwiesen ist. Ausführungsformen, die als bestimmte Elemente „umfassend“ beschrieben sind, werden auch als „im Wesentlichen bestehend aus“ und „bestehend aus“ diesen Elementen erachtet. Die Begriffe „im Wesentlichen bestehend aus“ und „bestehend aus“ sollten im Einklang mit der MPEP und der Auslegung durch den Federal Circuit interpretiert werden. Die Übergangsphrase „im Wesentlichen bestehend aus“ begrenzt den Schutzbereich eines Anspruchs auf die spezifizierten Materialien oder Schritte und diejenigen, die das grundlegende und/oder neue Merkmal der beanspruchten Erfindung nicht wesentlich beeinflussen. „Bestehend aus“ ist ein geschlossener Begriff, der jedes Element, jede Stufe oder Zutat ausschließt, die nicht explizit im Anspruch angegeben sind.
  • Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele sind nur zum Zweck der Veranschaulichung enthalten und sollen den Umfang des Bereichs von Technik und Protokollen, in denen die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können, nicht einschränken, wie dies ein Fachmann erkennen und leicht implementieren können.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1A. Markierungsfreie Sensor-Arrav zur Früherkennung von Krebs
  • Das vorliegende Beispiel stellt eine markierungsfreies (label-freies) Sensor-Array zur Früherkennung verschiedener Krebsarten bereit. Das Sensor-Array besteht aus drei verschiedenen kreuzreaktiven Liposomen mit verschiedenen Oberflächenladungen (d.h. kationisch (DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- (1'-rac-glycerin)), anionisch (DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan) -DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin)) und neutral (CHOL (DOPC-Cholesterin)), deren Proteinkorona-Zusammensetzung sich als Reaktion auf ihre Wechselwirkungen mit dem Plasma von Patienten ändert, die verschiedene Arten von z.B. der Lunge, der Pankreas, ein Myelom, ein Meningiom und ein Glioblastom aufweisen. Obwohl keine einzelne Proteinkorona-Zusammensetzung für irgendeine Krebsart spezifisch ist, liefern die Veränderungen im Korona-Zusammensetzungsmuster einen eindeutigen „Fingerabdruck“ für jede Krebsart.
  • Hartkorona-Profile der Sensor-Array-Elemente unter Verwendung von Plasma von Patienten mit Krebs im frühen, mittleren und fortgeschrittenen Stadium. Die Zusammensetzung der Proteinkorona, die sich auf der Oberfläche von Sensor-Array-Elementen (Nanopartikeln) bildet, hängt stark von den physikochemischen Eigenschaften dieser Nanopartikel ab und kann gleichzeitig stark von der Art der im Spender vorhandenen Krankheit in dem menschlichen Plasma beeinflusst werden, das zur Inkubation verwendet wird. Die Größe und Ladung der Korona-beschichteten Nanopartikel nach der Inkubation mit Plasma von Patienten mit fünf verschiedenen Krebsarten (z.B. Glioblastoma multiforme, Lungenkrebs, Meningiom, multiplem Myelom und Pankreaskarzinom) und gesunden Probanden (siehe Tabelle 1), wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS/Nanosight) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, und die Ergebnisse zeigen, dass die physikochemischen Eigenschaften der Korona-beschichteten Nanopartikel im Wesentlichen von der Art des Krebses abhängen (2A, B). Tabelle 1. Allgemeine Angaben zu Patienten (und deren Krebsarten), deren Plasma in dieser Studie verwendet wurde.
    PATIENTEN-LABEL ALTER GESCHLECHT KREBS STADIUM KATEGORIE DES KREBS STADIUMS
    GESUND 1 43 W ------------------------------ ------------------
    GESUND 2 54 M ------------------------------ ------------------
    GESUND 3 67 W ------------------------------ -----------------
    GESUND 4 69 M ------------------------------ ------------------
    GESUND 5 61 W ------------------------------ ------------------
    PANKREAS 1 81 M TNM: cT4 N+M+ Fortgeschritten
    PANKREAS 2 76 M TNM: cT2 N+ Mäßig
    PANKREAS 3 60 W TNM: cT4 N+ Fortgeschritten
    PANKREAS 4 75 M TNM: cT3 N+M+ Fortgeschritten
    PANKREAS 5 61 W TNM: cT3 N+M+ Fortgeschritten
    PANKREAS 6 71 W TNM: cT3 N+ Fortgeschritten
    PANKREAS 7 61 M TNM: cT3 N+ Fortgeschritten
    PANKREAS 8 67 M TNM: cT3 N+ Fortgeschritten
    LUNGE 1 45 W TNM: TIA N0 MO Früh
    LUNGE 2 24 M TNM: TIA N0 MO Früh
    LUNGE 3 44 W TNM: TIA N0 MO Früh
    LUNGE 4 48 W TNM: TIA N0 MO Früh
    LUNGE 5 40 M TNM: TIA N0 MO Früh
    LUNGE 6 47 W TNM: TIA N0 MO Früh
    LUNGE 7 51 M TNM: TIA N0 MO Früh
    LUNGE 8 52 W TNM: TIA N0 MO Früh
    MYELOM 1 41 W Ausbruch II (52% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-k) Mäßig
    MYELOM 2 60 W Ausbruch I (28% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-k) Früh
    MYELOM 3 57 W Ausbruch I (8% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-k) Früh
    MYELOM 4 63 M Ausbruch I (9% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-k) Früh
    MYELOM 5 75 M Ausbruch II (42% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-k) Mäßig
    MYELOM 6 46 W Ausbruch I (15% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-L) Früh
    MYELOM 7 56 W Ausbruch I (44% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-L) Früh
    MYELOM 8 70 W Ausbruch I (27% Plasmazellen im Knochenmark; monoklonales IgG-L) Früh
    GLIOBLASTOM 1 58 M WHO 4 Fortgeschritten
    GLIOBLASTOM 2 75 M WHO 4 Fortgeschritten
    GLIOBLASTOM 3 76 M WHO 4 Fortgeschritten
    GLIOBLASTOM 4 73 M WHO 4 Fortgeschritten
    GLIOBLASTOM 5 76 W WHO 4 Fortgeschritten
    GLIOBLASTOM 6 62 M WHO 4 Fortgeschritten
    GLIOBLASTOM 7 48 M WHO 4 Fortgeschritten
    GLIOBLASTOM 8 56 M WHO 4 Fortgeschritten
    MENINGIOM 1 82 W WHO 2 Mäßig
    MENINGIOM 2 50 W WHO 2 Mäßig
    MENINGIOM 3 80 M WHO 2 Mäßig
    MENINGIOM 4 67 M WHO 2 Mäßig
    MENINGIOM 5 64 M WHO 2 Mäßig
    MENINGIOM 6 84 M WHO 2 Früh
    MENINGIOM 7 58 W WHO 2 Früh
    MENINGIOM 8 70 M WHO 2 Früh
  • Die quantitative Auswertung des an die Nanopartikel adsorbierten Gesamtproteins wurde über den BCA- oder NanoOrange-Assay durchgeführt, und die Ergebnisse zeigen signifikante Unterschiede in den Mengen an adsorbierten Proteinen nach Inkubation im Plasma von Patienten mit verschiedenen Krebsarten (2B). Die quantitative Bewertung des an der Oberfläche von Liposomen adsorbierten Gesamtproteins zeigt eine starke Abhängigkeit von der Proteinmenge der Krebsart (2B). Es wurde die Proteinkorona-Zusammensetzung an der Oberfläche von drei Liposomen durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) ausgewertet, in der die Häufigkeit von 1800 bekannten Proteinen definiert wurde. Es wurde der Beitrag einzelner Proteine und ihrer Kategorien (d.h. Komplement, Koagulation, Gewebeverlust, Lipoproteine, akute Phase, Immunglobuline und andere Plasmaproteine) zu der Korona-Zusammensetzung definiert (2C, 3A - F). Diese Ergebnisse zeigen einen signifikanten Zusammenhang zwischen der Proteinzusammensetzung und nicht nur der Krebsart, sondern auch der Art des Sensorelements (d.h. der Art des Nanopartikels).
  • Gemäß einer umfangreichen Literatur gibt es beträchtliche Zusammenhänge zwischen der Krebsentwicklung und Variationen in Komplement, Koagulation, Gewebeverlust, Lipoproteinen, Akutphase und Immunglobulinen. Daher können die kreuzreaktiven Wechselwirkungen dieser Proteinkategorien mit Nanopartikeln (ein-)eindeutige „Fingerabdrücke“ für jede Krebsart liefern, was die Identifizierung und Unterscheidung von Krebs erleichtern kann. Folglich würde man erwarten, dass das Proteinkorona-Sensor-Array kreuzreaktiv eine Mehrzahl von Proteinen adsorbiert, die an der Krebsinduktion und -entwicklung beteiligt sind, die zur Krebsidentifikation und - unterscheidung verwendet werden könnten.
  • Entwickeln einer überwachten Klassifikationsanalyse zum Identifizieren und Unterscheiden zwischen Krebsarten unter Verwendung der Ergebnisse des Proteinkorona-Sensor-Arrays. Um zu untersuchen, ob Proteinkorona-Fingerabdrücke (PCFs) verschiedener Sensorelemente als Biosensoren verwendet werden können und einzigartige Muster für verschiedene Krankheiten bilden, wurden fokussierte Klassifikationsansätze auf Proteomdaten der Proteinkorona-Zusammensetzung von drei Liposomen (kationische, anionische, und neutral) angewendet. Die Details zu den Verfahren werden im Abschnitt Verfahren beschrieben. Für die Rangordnung auf der Grundlage der Diskriminanzanalyse mit kleinsten partiellen Quadraten (partial least squares discriminant analysis, PLS-DA) wurde ein weighted-variable importance in the projection (VIP) Score als lineare Projektionsmethode eingeführt und angewendet. Die Auswahl der relevantesten Variablen (Proteine) beim Aufbau des Klassifikationsmodells kann durch eine Menge von abgeleiteten, bewerteten Variablen angeleitet werden. In diesem Zusammenhang wurden die am besten bewerteten Variablen dem Modell einzeln hinzugefügt und der Klassifikationsfehler des PLS-DA-Modells überwacht. Es wurde beobachtet, dass das Klassifikationsmodell den minimalen Fehler aufweist, indem nur die obersten 69 Merkmale verwendet werden (4A). Der neue 69-dimensionale Merkmalsraum wurde erfolgreich verwendet, um 30 Proben, die zu sechs Klassen durch die PLS-DA gehören, mit einer hohen Klassifikationsgenauigkeit (0,97) unter Verwendung von Leave-One-Out und einer 10-fach-Kreuzvalidierung zu unterscheiden ( 4A, B). Die Klassifikationsparameter sind in Tabelle 2 angegeben. Der Beitrag jedes einzelnen ausgewählten Proteins zur Trennung jeder Krebsgruppe (VIP) ist jeweils auf der y-bzw. x-Achse aufgetragen, um eine visuelle Darstellung der relativen Spezifität der Befunde zu liefern (4B - F). Die Proteine mit höheren VIP-Scores könnten als der beste informative oder diagnostische Satz betrachtet werden, um jede Erkrankung von Kontrollproben und unter allen Krebskategorien zu unterscheiden.s Tabelle 2. Klassifikationsergebnisse aus zwei entwickelten und nichtlinearen Modellen für sechs Probengruppen.
    Midelle/ PLS-DA, CPANN (8*8)
    Klassifikationsparameter 10-fach CV, LV=5 10-fach CV
    20 Iterationen
    Spezifität (CV) 1 1.00 1.00
    2 0.96 0.96
    3 1.00 1.00
    4 1.00 1.00
    5 1.00 1.00
    6 1.00 1.00
    Empfindlichkeit (CV) 1 1.00 1.00
    2 1.00 1.00
    3 1.00 0.80
    4 1.00 1.00
    5 1.00 1.00
    6 1.00 1.00
    Klassenfehler (CV) 1 0.00 0.00
    2 0.03 0.02
    3 0.00 0.00
    4 0.00 0.00
    5 0.00 0.00
    6 0.00 0.00
    1) Kontrolle ,2) Glioblastom, 3) Meningeom, 4) Myelom, 5) Pankreas, 6) Lungenkrebs
  • Es wurden dann die PLS-DA und das künstliche neuronales Netzwerk mit Gegenausbreitung (counter propagation artificial neural network, CPANN) als überwachte Klassifikations-, lineare bzw. nichtlineare Ansätze auf die ausgewählten Variablen und ganze Proben angewendet. Es sollte beachtet werden, dass der primäre Datensatz mit allen Variablen vor der Variablenauswahl eine schlechte Unterscheidbarkeit aufweist und nicht in sechs Gruppen unterteilt werden kann.
  • Als nächstes haben wir uns dazu entschieden, ein nichtlineares Klassifikationsverfahren zu nutzen, um die Daten weiter zu verifizieren und zu analysieren. Die Visualisierung des Merkmalsraums kann dabei helfen, die verborgenen Strukturen und topologischen Beziehungen zwischen den Mustern zu verstehen. Um die Dimensionalität des Merkmalsraums zu reduzieren und gleichzeitig die topologische Beziehung in der Datenstruktur zu erhalten, wurde das CPANN (eine überwachte Variante von selbstorganisierenden Karten (maps)/SOM) verwendet, um die Klassenzugehörigkeit der Muster zu lernen und vorherzusagen, wobei gleichzeitig eine zweidimensionale Karte von Neuronen erzeugt und wertvolle Informationen (aus einem nichtlinearen Ansatz) über die Datenstruktur bereitgestellt werden. Die Details zum CPANN sind im Abschnitt Verfahren zu finden. Es wurden verschiedene Größen für die CPANN-Karte mit einer 10-fachen Kreuzvalidierung überprüft, wobei eine Karte mit 64 (8x8) Neuronen aufgrund des minimalen Klassifikationsfehlers ausgewählt wurde (9C). Darüber hinaus spiegelt sich die topologische Struktur der Daten in dem hochdimensionalen Raum in der vom CPANN erzeugten Zuordnungskarte wider (5C, D). Unter Berücksichtigung der Ähnlichkeit der Neuronen zu den Eingangsvektoren kann die Karte in sechs verschiedene Zonen eingeteilt werden, die mit verschiedenen Krebsarten und Kontrollproben in Beziehung stehen. Proben mit der gleichen Klassenbezeichnung werden auf nahe gelegenen oder gleichen Neuronen abgebildet, was bedeutet, dass die ausgewählten Variablen Informationen liefern, die beim Unterscheiden der Proben im Merkmalsraum wertvoll sind. Die relative Position und Orientierung von sechs Zonen auf der Karte kann qualitative Informationen über die Ähnlichkeiten zwischen Krebsarten liefern. Um die Auswirkung der Variablenauswahl auf die Qualität der Kartierung darzustellen, wurde ein weiteres CPANN mit allen 1823 Variablen trainiert, und die resultierende Karte zeigt, dass die ausgewählten Biomarker (Variablen) eine wichtige Rolle bei der Unterscheidung zwischen Krebsarten und ihrer korrekten Klassifikation spielen (5C, D).
  • Auf der Grundlage der erhaltenen Ergebnisse zeigten sowohl lineare als auch nichtlineare Modelle eine hohe Genauigkeit, die von ihren akzeptablen Spezifitäts-, Empfindlichkeits- und Klassenfehlerwerten abgeleitet wurde. In Übereinstimmung mit diesen Befunden war das unüberwachte Clustering (HCA), das auf 69 Markern beruhte, in der Lage, die verschiedenen Arten von Krebs- und Kontrollproben deutlich zu trennen (5E - F). Wie in 5 erkennbar, besteht eine große Ähnlichkeit zwischen den Glioblastom- und Meningeom-Gruppen von Proben, was eine Schwierigkeit bei der Unterscheidung darstellt, die höchstwahrscheinlich mit ähnlichen Plasma-Proteommustern in diesen beiden Gehirntumoren zusammenhängt. Diese Ergebnisse spiegeln die Tatsache wider, dass sich die Plasmakonzentrationen vieler Proteine in der Korona nicht nur bei Probanden mit verschiedenen Krebsarten, sondern auch bei gesunden Probanden beträchtlich unterscheiden.
  • Um die Fähigkeit der Biosensoren zur Mustererkennung zu veranschaulichen, wurde an den Daten eine Zeile von Analysen durchgeführt, die von einzelnen Nanopartikeln erhalten wurden. Wie erwartet, konnte das Muster der krebsspezifischen Fingerabdrücke nicht ausschließlich aus den PCFs jedes Nanopartikels extrahiert werden. Es wurde herausgefunden, dass Mustererkennungstechniken, die auf die Proteinhäufigkeit in der Proteinkorona angewendet wurden, die auf drei verschiedenen Liposomen (kationisch, anionisch und neutral) gebildet wurde, nicht nur Krebszellen von Kontrollproben richtig unterschieden, sondern auch jede Krebesart von den jeweils anderen.
  • Identifizierung von Proteinen mit entscheidenden Rollen bei der Krebserkennung und -unterscheidung als vielversprechende Biomarker für spezifische Krebsarten. Die Verwendung von Biomarkern sowohl vor der Krebsdiagnose (bei der Risikobewertung und beim Screening/bei der Früherkennung) als auch nach der Diagnose (bei der Überwachung der Therapie, der Auswahl zusätzlicher Therapien und der Erkennung von Rezidiven) würde erhebliche therapeutische und gesundheitsökonomische Vorteile bringen. Um die potenzielle biologische Relevanz der 69 ausgewählten Proteine, die kanzeröse Proben unterscheiden, zu verstehen, wurden in PubMed zuvor veröffentlichte Berichte zu Protein-Biomarkern bestimmter Krebsarten manuell druchsucht, die nach verschiedenen Krankheitsstufen hochreguliert oder herunterreguliert sind. Die resultierenden Daten wurden mit den ausgewählten Proteinen im Modell verglichen, um übereinstimmende Marker zu identifizieren und die biologische Relevanz des vorgeschlagenen Modells zu bestimmen. Interessanterweise wurde eine signifikante Anzahl von Biomarkern beobachtet, die für fünf untersuchte Krebsgruppen unter den ausgewählten Prädiktoren spezifisch sind, die als spezifische Krebs-Biomarker berichtet wurden (7B).
  • Die hohe Spezifität der ausgewählten Marker zum Unterscheiden zwischen den fünf Krebsgruppen, die von dem eingeführten Proteinkorona-Sensor-Array-Ansatz herrühren, zeigt eine signifikante Korrelation mit der Arbeit, die heute im komplexen Krebs-Proteomik-Raum durchgeführt werden. Daher bietet diese Strategie nicht nur eine Grundlage für die Krebsvorhersage, sondern setzt diese Versprechen auch in die Realität um. Es ist bemerkenswert, dass die Unterscheidung zwischen verschiedenen Gruppen als Ergebnis mehrerer Prädiktoren (und nicht einzelner Biomarker) auftritt, die sich gleichzeitig systematisch ändern und Muster bilden, die für jede spezifische Krebsart einzigartig sind. Auf der Grundlage dieser Evidenz können die aussagekräftigsten Prädiktoren, die durch das vorgeschlagene Modell ausgewählt wurden und noch nicht als krebsspezifische Biomarker berichtet bzw. in Erwägung gezogen wurden, ein großes Potenzial als neue Biomarkerkandidaten für die Diagnose haben. Um ihre Rolle bei der Krebsentwicklung zu definieren, sollten die Variation und Funktionalität dieser vielversprechenden Kandidaten bei Krebspatienten sorgfältig überwacht werden. Durch die Fokussierung auf die einzigartigen Muster, die von einer großen Anzahl von Probanden über eine Zeile von aussagekräftigen Prädiktoren abgeleitet werden, sollten Forscher in der Lage sein, Krebserkrankungen in verschiedenen Stadien genauer vorherzusagen, als dies mit den derzeitigen Verfahren möglich ist.
  • Kohorten-Datenanalyse. Um die Fähigkeit dieses innovativen Sensor-Arrays für eine sehr frühzeitige Krebserkennung zu untersuchen, wurde Kohortenplasma von gesunden Menschen verwendet, bei denen mehrere Jahre nach der Plasmaentnahme eine der fünf Krebsarten diagnostiziert wurde. Unter Verwendung der Kohortenproben wurde untersucht, ob die hierin vorgeschlagenen Modelle, sowohl lineare als auch nicht-lineare, mit 69 ausgewählten Prädiktoren für die Krebsvorhersage verwendet werden könnten.
  • Zu diesem Zweck wurden die Werte, die sich auf die 69 Variablen beziehen, in das Modell eingegeben und es wurde die Klassenzugehörigkeit jedes Kohortenprobanden unter Berücksichtigung der festgelegten optimalen Parameterwerte vorhergesagt. Es ist bemerkenswert, dass 19 Variablen (Proteine) der 69 Variablen,in dem Proteom-Profil des Proteinkorona-Sensor-Arrays der Kohortenproben fehlten. Daher war ihre Menge in der Validierungsdatenmatrix Null. Interessanterweise lieferten sowohldie linearen als auch die nichtlinearen Modelle gute Vorhersagen für alle fünf Proben. Die beobachtete Abweichung zwischen Trainings- und Kohortenproben (6A, B) wurde höchstwahrscheinlich durch Nullwerte beeinflusst, die für die fehlenden 19 Variablen zur Datenmatrix hinzugefügt wurden. Wie in 6C, D gezeigt, wurden die Kohortenproben in dem korrekten Neuron platziert, das in der CPANN-Karte zu dem Glioblastom gehört.
  • Verfahren
  • Liposome. Cholesterin (Chol) wurde von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. DOPC (Dioleoylphosphatidylcholin), DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin), DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospho-(1'-rac-Glycerin)) und DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) bezogen. Die Liposomen DOPG, DOTAP-DOPE (Molverhältnis 1:1) und DOPC-Chol (Molverhältnis 1:1) wurden durch das Lösen geeigneter Mengen von Lipiden in 9:1 (v/v) Chloroform:Methanol hergestellt. Die Chloroform:Methanol-Mischung wurde durch Rotationsverdampfung eingedampft. Die Lipidfilme wurden über Nacht unter Vakuum gehalten und mit Phosphat-Kochsalzpuffer (PBS) 10 mmol/l (pH 7,4) auf eine endgültige Lipidkonzentration von 1 mg/ml hydratisiert. Die erhaltenen Liposomen-Suspensionen wurden durch Extrusion durch einen 50-nm-Polycarbonat-Karbonatfilter durch den Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) klassiert.
  • Sammlung, Vorbereitung und Lagerung von menschlichem Plasma. Das menschliche Plasma (human plasma, HP) wurde von gesunden und Krebspatienten gesammelt, bei denen ein Glioblastoma multiforme, Lungenkrebs, ein Meningiom, ein multiples Myelom oder ein Pankreaskarzinom diagnostiziert wurde. Die vorliegende Studie wurde von den Ethikkomitees der Sapienza Universität Rom (Glioblastoma multiforme, Meningiom, multiples Myelom), der Universität von Napoli Federico II (Lungenkrebs) und dem Universitätsgelände Bio-Medico di Roma (Pankreaskarzinom) genehmigt. Kurz gesagt, wurde das Blut durch Venenpunktion gesunder Personen und Krebspatienten mittels eines Blutentnahmesystems BD P100 (Franklin Lakes, NJ, USA) mittels Druckknopftechnologie gesammelt, die Blutabfall reduziert und gleichzeitig das Kontaminationsrisiko minimiert. Nach der Gerinnselbildung wurden die Proben bei 1000 x g für 5 Minuten zentrifugiert, um die Blutzellen zu pelletieren, und der Überstand wurde entfernt. Nach dem Bestätigen der Abwesenheit von Hämolyse wurde das von jedem Spender (1 ml) gesammelte Plasma in Aliquots von 200 Mikrolitern aufgeteilt und bis zur Verwendung in markierten Protein-LoBind-Röhrchen bei -80°C gelagert. Zur Analyse wurden die Aliquots bei 4°C aufgetaut und dann bei Raumtemperatur (RT) erwärmen gelassen.
  • Kohortenplasmaproben. Es wurde menschliches Plasma von gesunden Menschen verwendet, die innerhalb von acht Jahren nach der Plasmaentnahme mit Gehirn-, Lungen- und Pankreaskarzinom diagnostiziert wurden. Die Plasmaproben wurden über die NIH-finanzierte (National Institutes of Health, das US-Gesundheitsministerium) Golestan-Kohortenstudie gesammelt, die vom National Cancer Institute (NCI) in den USA, der Internationalen Agentur für Krebsforschung (IARC) in Frankreich und der Tehran University of Medical Sciences (TUMS) im Iran durchgeführt wurde. Diese Studie umfasste die Sammlung und Lagerung von Plasma von 50.000 gesunden Probanden, von denen über 1.000 in den folgenden Jahren verschiedene Krebsarten entwickelten. Es wurden in dieser Studie die Proben von fünf Probanden pro Krebs verwendet. Diese wichtigen Plasmaproben bieten hier die einzigartige Möglichkeit, die Fähigkeit des innovativen Proteinkorona-Sensor-Arrays zur Früherkennung von Krebs hierin zu erforschen.
  • Größe und Zeta-Potential. Es wurden freie Liposomen mit HP (1:1 v/v) für 1 Stunde bei 37 ° C inkubiert. Anschließend wurden die Proben bei 14000 U/min für 15 Minuten bei 4 ° C zentrifugiert, um Liposom-HP-Komplexe zu pelletieren. Das resultierende Pellet wurde dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und in ultrareinem Wasser resuspendiert. Für Messungen der Größe und des Zeta-Potentials wurden 10 µL jeder Probe mit 990 µL destilliertem Wasser verdünnt. Alle Messungen der Größe und des Zeta-Potentials wurden bei RT unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZS90 (Malvern, U.K.) durchgeführt, der mit einem 5-mW-HeNe-Laser (Wellenlänge λ = 632,8 nm) und einem digitalen logarithmischen Korrelator ausgestattet war. Die normalisierten Intensitätsautokorrelationsfunktionen wurden mit dem CONTIN-Verfahren analysiert, um die Verteilung des Diffusionskoeffizienten D der Partikel zu erhalten. D wird durch die Stokes-Einstein-Gleichung (RH = KBT/6πηD), wobei KBT die thermische Energie und η die Lösungsmittelviskosität ist, in einen effektiven hydrodynamischen Radius RH umgewandelt. Die elektrophoretische Mobilität der Proben wurde mittels Laser-Doppler-Elektrophorese gemessen. Das Zeta-Potential wurde nach der Smoluchowski-Beziehung berechnet (Zeta-Potential = uη/ε), wobei η und ε die Viskosität bzw. die Permittivität der Lösungsmittelphase sind. Die Größe und das Zeta-Potential von Liposom-HP-Komplexen sind als Mittelwert ± Standardabweichung (S.D.) von fünf unabhängigen Messungen angegeben.
  • Protein-Test (Protein Assay). Die Liposom-Formulierungen wurden mit HP (1: 1 v/v) 1 Stunde bei 37 ° C inkubiert. Danach wurden Liposom-HP-Komplexe bei 15.000 x g für 15 Minuten bei 4 ° C pelletiert und dreimal mit PBS gewaschen. Das gewaschene Pellet wurde in 8 mol/l Harnstoff, NH4CO3 50 mmol/l resuspendiert. Es wurden 10 Mikroliter jeder Probe in fünf Vertiefungen einer Mikroliterplatte (multiwell plate) mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Proteinquantifizierung wurde unter Zugabe von 150 Mikrolitern/Vertiefüng eines Protein-Assay-Reagens (Pierce, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) durchgeführt. Die Mikroliterplatte wurde geschüttelt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten inkubiert. Das Absorptionsvermögen wurde mit einem GloMax Discover System (Promega, Madison, WI, USA) bei 660 nm gemessen. Die Hintergrundeffekte wurden richtig korrigiert und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung der Standardkurve berechnet. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.D. von fünf unabhängigen Wiederholungen angegeben.
  • Proteinidentifizierung und -quantifizierung. Das Inkubationsverfahren wurde wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt (Label-free quantitative analysis for studying the interactions between nanoparticles and plasma proteins. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405, 2-3, 635-645, hierin durch Bezugnahme in der Gesamtheit aufgenommen). Die Liposom-Formulierungen wurden mit HP (1:1 v/v) 1 Stunde bei 37 ° C inkubiert. Die Proben wurden 15 min bei 15.000 x g zentrifugiert, um Liposom-HP-Komplexe zu pelletieren. Das Pellet wurde dreimal mit 0 mmol/l Tris HCl (pH 7.4), 150 mmol/l NaCl and 1 mmol/l EDTA gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Pellet luftgetrocknet und im Verdau-Puffer resuspendiert. Der Verdau und die Entsalzung von Peptiden wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Shotgun proteomic analytical approach for studying proteins adsorbed onto liposome surface. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 401, 4, 1195-1202, durch Bezugnahme in der Gesamtheit aufgenommen). Kurz gesagt, wurde das Pellet in 8 mol/l, NH4CO3 50 mmol/l resuspendiert und durch Zugabe von 2 Mikrogramm Trypsin verdaut. Die verdauten Peptide wurden unter Verwendung einer SPE C18-Säule entsalzt, mit einem geeigneten Volumen einer 0,1%-igen Ameisensäurelösung rekonstituiert und bis zur Analyse bei -80 ° C gelagert. Die verdauten Peptide wurden mittels Nano-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), die an eine Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) gekoppelt war, analysiert. Die NanoHPLC-MS/MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Dionex Ultimate 3000 (Dionex Corporation Sunnyvale, CA, USA) durchgeführt, das direkt mit einem hybriden linearen Ionenfallen-Orbitrap-Massenspektrometer (Orbitrap LTQ-XL, Thermo Scientific, Bremen, Deutschland) über eine Nanoelektrospray-Ionenquelle verbunden war. Die Peptidgemische wurden mit einer Accumlaim PepMap 100 C18-Vorsäule (Dionex Corporation Sunnyvale, CA, USA) auf 300 µm ID × 5 mm angereichert, wobei eine vorgemischte mobile Phase aus ddH2O/ACN, 98/2 (v/v) mit 0,1% (v/v) HCOOH mit einer Fließrate von 10 Mikrolitern/Min verwendet wurde. Die Peptidgemische wurden dann durch Umkehrphasen (reversed-phase, RP)-Chromatographie getrennt. Der größte Satz von Peptiden wurde unter Verwendung eines 3-stündigen optimierten LC-Gradienten nachgewiesen, der aus einer mobilen Phase A von ddH2O/HCOOH (99.9/0.1, v/v) und einer mobilen Phase B von ACN/HCOOH (99.9/:0.1, v/v) zusammengesetzt war. Die MS-Spektren eluierender Peptide wurden über einen m/z-Bereich von 350-1700 unter Verwendung einer Auflösungseinstellung von 60.000 (volle Breite bei halbem Maximum bei m/z 400) gesammelt, wobei im datenabhängigen Modus gearbeitet wurde. Die MS/MS-Spektren wurden für die fünf häufigsten Ionen in jedem MS-Scan gesammelt. Weitere Details können an anderer Stelle gefunden werden (Shotgun proteomic analytical approach for studying proteins adsorbed onto liposome surface. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 401, 4, 1195-1202). Für jede experimentelle Bedingung wurden drei unabhängige Proben (biologische Replikate) hergestellt, von denen jede dreifach (technische Replikate) gemessen wurde, was neun Messungen für jede experimentelle Bedingung ergab. Die RAW-Datendateien wurden an Mascot (v2.3, Matrix Science, London, UK) unter Verwendung des Thermo-Finningan LCQ/DECA RAW-Dateidatenimportfilters zur Durchführung von Datenbankrecherchen gegen die nichtredundante Swiss-Prot-Datenbank (09-2014, 546.000 Sequenzen, Homo Sapiens taxonomy restriction) übermittelt. Für die Datenbankrecherche wurde Trypsin als das proteolytische Enzym mit maximal zwei fehlenden Spaltungen spezifiziert. Es wurde eine Carbamidomethylierung als feste Modifikation von Cystein eingestellt, während die Oxidation von Methionin als variable Modifikation gewählt wurde. Die monoisotopische Massentoleranz für Vorläuferionen und Fragmentierungsionen wurde auf 10 ppm bzw. 0,8 Da eingestellt. Als Vorläuferionen wurde der Ladungszustand von +2 oder +3 ausgewählt. Die Proteome-Ausgabedateien wurden an die kommerzielle Software Scaffold (v3.6, Proteome Software, Portland, Oregon, USA) übermittelt. Die Peptididentifikationen wurden validiert, wenn sie eine 95% -Wahrscheinlichkeitsschwelle überschritten, die durch den PeptideproPhet-Algorithmus festgelegt wurde. Die Proteinidentifikationen wurden akzeptiert, wenn sie mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 99,0% etabliert werden konnten und wenigstens zwei (ein-)eindeutige Peptide enthielten. Die Proteine, die geteilte Peptide enthielten und auf der Basis der MS/MS-Analyse allein nicht differenziert werden konnten, wurden gruppiert, um die Sparsamkeitsprinzipien zu erfüllen. Es wurden ungewichtete Spektrumszählungen (USC) verwendet, um die Konsistenz von biologischen Replikaten in der quantitativen Analyse zu bewerten, und normalisierte Spektrums-Zählungen (NCS) wurden verwendet, um die Proteinhäufigkeit abzurufen.
  • Statistische Analyse. Alle statistischen Analysen wurden mithilfe von PLS-, Kohonen- und CPANN-Toolboxen durchgeführt. Die Diagramme wurden mit Microsoft Excel, XLSTAT und MATLAB erstellt.
  • Datenmatrix. Jedes Rohprodukt der Prädiktormatrix (X), das sich auf jedes Einzelperson bezieht, wird von der Abundanz aller Proteine abgeleitet, die von dem Drei-Proteinkorona-Sensor-Array (4A) erhalten wird. In dem Vorverarbeitungsschritt wurden die normalisierten Daten in Matrix X, relative Proteinhäufigkeit (RPA), automatisch skaliert.
  • Klassifikation und Clustering.
  • Partial least squares discriminant analysis (Diskriminanzanalyse mit kleinsten partiellen Quadraten, PLS-DA). Die Partial least squares discriminant analysis bzw. Diskriminanzanalyse mit kleinsten partiellen Quadraten ist ein bekannter multivariater Ansatz, der als lineares Klassifikations- und Dimensionsreduktionsverfahren betrachtet wird, das aus zwei Hauptteilen besteht: einem strukturellen Teil, der nach latenten Variablen als lineare Kombinationen ursprünglicher unabhängiger Variablen sucht (d.h. Datenmatrix, X), welche die maximale Kovariation mit den entsprechenden abhängigen Variablen haben (d.h. Klassenzugehörigkeit, Y). Die gemessenen Komponenten umfassen die latenten Variablen als Scores und Ladungen, die zeigen, wie die latenten Variablen und ihre Originale assoziiert sind. Basierend auf der Fähigkeit von PLSDA, die Dimensionalität der Daten zu reduzieren, ermöglicht es eine lineare Abbildung und grafische Visualisierung der verschiedenen Datenmuster. Die PLS-DA eignet sich besonders gut für stark kollineare und verrauschte Muster. Die Hauptprobleme, die mit dem großen Datensatz in der Proteomik verbunden sind, sind die große Anzahl von überwachten Variablen (d.h. Proteine) und die relativ kleine Anzahl von Proben. Daher kann es unter den Variablen eine hohe Redundanz geben, die viele von ihnen für die Klassifikation uninformativ und irrelevant machen. Auf diese Weise kann das Eliminieren nicht informativer Variablen oder das Finden neuer unkorrelierter Variablen die Vorhersagequalität der Klassifikation verbessern. Da in biomedizinischen Anwendungen wie der vorliegenden Arbeit nicht nur Entscheidungen darüber getroffen werden müssen, ob eine Stichprobe zu einer von mehreren bekannten Gruppen gehört, sondern auch, welche Variablen für die beste Unterscheidung zwischen Klassen am relevantesten sind, ist eine Methode wie PLS- DA ist ein guter Ansatz zum Auffinden unkorrelierter neuer latenter Variablen, während die Variation der Daten erhalten bleibt. zum Finden unkorrelierter neuer latenter Variablen, während die Variation der Daten erhalten bleibt. Die Wichtigkeit der ursprünglichen Variablen für die Erzeugung von latenten Projektionen kann auch durch die variable Wichtigkeit in der Projektions (VIP)-Analyse berechnet werden und kann eine wichtige Rolle bei der Entscheidung über Variablen spielen.
  • Identifizieren der wichtigsten Variablen basierend auf demgewichteten VIP. Die Partial-Least-Squares-Diskriminanzanalyse (PLS-DA) wurde verwendet, um die VIP-Werte zu untersuchen, die den Variablen assoziiert sind. VIP ist ein kombiniertes Maß dafür, wie viel eine Variable zu einer Beschreibung der beiden Datensätze beiträgt: die abhängige Variable (Y) und die unabhängige Variable (X). Die Gewichtungen in einem PLS-Modell reflektieren die Kovarianz zwischen den unabhängigen und abhängigen Variablen, und die Einbeziehung der Gewichtungen ermöglicht VIP, nicht nur zu reflektieren, wie gut die abhängige Variable beschrieben wird, sondern auch, wie wichtig diese Information für das Modell der unabhängigen Variablen ist.
  • Es wurde ein auf dem VIP-Score basierender Ansatz entwickelt, um die beste Teilmenge von Variablen zu identifizieren. VIP-Scores können durch Ausführen von PLS-DA im Datensatz berechnet werden. Bei diesem Ansatz werden VIP-Bewertungen von Variablen 50-mal berechnet, wobei jedes Mal eine zufällige Permutation von Trainings- und Validierungssätzen verwendet wird (die zufälligen Trainingssätze wurden iterativ ausgewählt, indem eine 80-prozentige Abdeckung jeder Klasse von Objekten berücksichtigt wurde). Unter Berücksichtigung der wichtigsten Variablen, der großen VIP-Score-Werte (> 2), können die obersten 200 Variablen bei jeder Wiederholung ausgewählt und zum Top-Variablen-Pool hinzugefügt werden. Danach kann eine Häufigkeit des Auftretens Freqi und ein durchschnittlicher VIP-Score VIPi für jede Variable gemäß dem Top-Variablen-Pool erhalten werden. Daher wird die Auswahl der Variablen i (die einen hohen VIPi -Wert und einen niedrigen VIPi -Wert aufweist) aufgrund der Abhängigkeit von den Trainings- und Validierungssätzen weniger empfohlen. Deshalb kann der VIPi -Wert jeder Variablen mit Freqi gewichtet werden, und die Rangfolge der relevantesten Variablen kann unter Verwendung des gewichteten VIPi erfolgen. Die FIG. zeigt ein schematisches Diagramm des vorgeschlagenen Ansatzes. Die Auswahl der relevantesten Variablen zur Erstellung des Klassifikationsmodells kann wie folgt anhand des erhaltenen Rankings erfolgen: Die hochrangigen Variablen wurden einzeln zu dem Datensatz hinzugefügt und es wurde der Klassifikationsfehler von PLS-DA berechnet, um die minimale Anzahl von relevanten Prädiktoren aufzufinden (4A).
  • Counter-Propagation Artificial Neural Network (CPANN). Das Counter-Propagation Artificial Neural Network (CPANN, ) ist eine überwachte Variante einer selbstorganisierenden Karte (self-organized map), die aus zwei Schichten von Neuronen besteht, die auf einem vordefinierten N×N -Gitter angeordnet sind. Das CPANN kann verwendet werden, um Daten von einem hochdimensionalen Merkmalsraum auf einen niederdimensionalen (typischerweise 2) diskreten Raum von Neuronen abzubilden sowie die Klassenzugehörigkeit der unbekannten Proben vorherzusagen. Die Eingabevektoren (Mustermerkmalsvektor) und entsprechende Klassenmitgliedschaftsvektoren (ein binärer Vektor) werden jeweils der Eingabe- bzw. Ausgabeschicht vom CPANN jeweils überreicht. Die Gewichtskorrektur der Neuronen in beiden Schichten erfolgt auf der Grundlage von kompetitivem Lernen und der Kooperation der Neuronen (siehe Tabelle 3). Daher können ähnliche Eingabevektoren auf dieselben oder benachbarte Neuronen abgebildet werden und umgekehrt. Die endgültige Zuordnungskarte (association map) zeigt die Struktur der Daten im Merkmalsraum und bewahrt den Abstand der Muster im niederdimensionalen Gitter der Neuronen. 9C zeigt eine hochwertige Zuordnungskarte vom CPANN unter Verwendung von top bewerteten Biomarkern. Entsprechend den verschiedenen Regionen für jede Klasse ist das Risiko eines Klassifikationsfehlers minimiert. Die richtige Größe der Karte kann durch Durchführen einer 10-fachen Kreuzvalidierung bei verschiedenen Kartengrößen bestimmt werden. Das trainierte CPANN kann dazu verwendet werden, einer unmarkierten (unlabeled) Probe eine Klassenzugehörigkeit zuzuordnen. Das Vorhandensein redundanter und nichtinformativer Variablen in Trainingsdaten beeinflusst die Qualität der Karte und erhöht das Risiko eines Klassifikationsfehlers (5C). Der Prozess ist ein nichtlineares Mapping, mit dessen Hilfe ein hochdimensionales Eingabeobjekt auf einem zweidimensionalen Neuronengitter visualisiert werden kann. Es ist ein selbstorganisiertes Verfahren und löst das Problem der Klassifikation auf transparente Weise. Weitere Details zum CPANN-Verfahren finden Sie in den folgenden Referenzen.
  • Hierarchische Clusteranalyse (HCA). Die hierarchische Clusteranalyse ist ein unüberwachtes Verfahren, das häufig verwendet wird, um ganze heterogene, große Datensätze, wie sie oft in der Proteomik verwendet werden, zu bestimmten und homogenen Clustern zu untersuchen und zu visualisieren. Die Strategien für hierarchisches Clustering können in zwei Kategorien unterteilt werden: agglomerative und spaltende Methoden. Die agglomerative Methode trennt zuerst jedes Objekt in seinem eigenen individuellen Cluster und kombiniert dann die Cluster sequentiell. Ähnliche Objekte oder Cluster werden zusammengeführt, bis jedes Objekt nur zu einem Cluster gehört. Die spaltende Methode dagegen beginnt mit allen Objekten in einem großen Cluster und unterteilt sie schrittweise in kleinere Cluster, bis sich jedes Objekt in einem einzelnen Cluster befindet. Schließlich werden die Objekte in einem Dendrogramm organisiert, dessen Zweige die definierten Cluster sind. Um in der Clusteranalyse homogene Teilmengen zu identifizieren, sollten die beiden wichtigen Begriffe Ähnlichkeit (Bestimmen eines numerischen Werts für die Ähnlichkeit zwischen Objekten und Konstruieren einer Ähnlichkeitsmatrix) und Verknüpfung (Verbinden eines Objekts mit einer Gruppe oder nicht) definiert werden. Hier wurde das agglomerative hierarchische Clustering mit dem fürthest-neighbor linkage-Algorithmus für die unbeaufsichtigte Analyse basierend auf den ausgewählten Variablen angewendet.
  • Kohortenproben-Vorhersage. Die Vorhersagefähigkeit von sowohl linearen als auch nichtlinearen Variablen mit 69 ausgewählten Prädiktoren wurde durch eine Kohortenprobenanalyse bewertet. Zu diesem Zweck wurden die Werte, die sich auf 69 Variablen beziehen, in das Modell eingegeben und es wurde die Klassenzugehörigkeit jedes Kohortenobjekts bei den festen optimalen Parameterwerten vorhergesagt. Die 19 Variablen (Proteine) im Proteomikprofil des hier vorliegenden Proteinkorona-Sensor-Arrays von Kohortenproben wurden nicht detektiert, und es wurde für diese Variablen Null in der Validierungsdatenmatrix berücksichtigt. Interessanterweise liefern sowohl die linearen als auch nichtlinearen Modelle gute Vorhersagen für alle fünf Proben. Der Abstand zwischen den Trainings- und Kohortenproben, die in 6A gezeigt sind, hängt höchstwahrscheinlich mit Nullwerten zusammen, die der Datenmatrix für diese 19 fehlenden Variablen hinzugefügt wurden. Es wurde der Effekt von ersetzten Nullwerten auf abwesende Variablen durch Löschen dieser 19 Proteine aus beiden Datenmatrizen der Trainings- und Vorhersagesätze untersucht, dann wurde das PLS-DA-Modell aufgebaut und es wurden die Kohortenproben vorhergesagt. Wie erwartet, wurde kein großer Abstand zwischen den Kohorten- und Trainingsproben beobachtet. Tabelle 3. Korrelationskoeffizient der CPANN-Gewichtungskarte für jede Variable in den sechs Klassen.
    Biomarker ID CC(1)Kontrolle CC(2)Glioblastom CC(3)Meningiom CC(4)Myelom CC(5)Pankreas CC(6)Lunge
    1323 -0.16 0.04 0.80 -0.41 0.16 -0.51
    1282 -0.47 -0.04 0.11 0.90 -0.03 -0.37
    1518 -0.22 0.76 -0.12 -0.12 -0.15 0.05
    742 0.38 -0.06 -0.21 -0.72 -0.03 0.58
    1462 -0.14 -0.25 -0.17 -0.20 -0.12 0.89
    1373 -0.30 -0.13 -0.10 0.98 -0.21 -0.16
    1466 -0.37 0.03 0.84 -0.31 0.14 -0.37
    1313 -0.28 0.03 0.59 -0.05 0.37 -0.68
    1630 0.97 -0.23 -0.31 -0.26 -0.19 -0.19
    815 -0.33 -0.15 -0.24 0.65 -0.45 0.61
    882 -0.16 -0.16 -0.25 -0.13 -0.16 0.91
    1284 -0.47 -0.01 0.42 0.74 -0.34 -0.28
    891 -0.37 -0.05 -0.33 0.55 -0.34 0.68
    954 -0.19 -0.10 -0.25 -0.20 0.99 -0.20
    782 -0.37 -0.32 -0.39 0.66 0.02 0.50
    820 -0.34 -0.24 -0.43 0.36 0.02 0.72
    1556 -0.18 -0.09 -0.25 -0.19 0.98 -0.20
    1286 0.41 -0.35 0.18 -0.31 -0.51 0.40
    868 0.15 -0.28 -0.44 0.16 -0.32 0.72
    1308 0.42 0.26 -0.38 -0.45 -0.31 0.46
    881 -0.12 -0.09 -0.30 -0.18 0.98 -0.24
    848 -0.47 -0.04 -0.07 0.72 -0.49 0.47
    1267 0.56 -0.01 -0.01 -0.61 -0.44 0.39
    950 -0.18 -0.13 -0.26 -0.14 0.96 -0.20
    1561 0.95 -0.24 -0.35 -0.28 -0.10 -0.17
    856 -0.33 -0.18 -0.21 0.64 -0.43 0.60
    895 -0.03 -0.16 -0.32 -0.20 -0.13 0.87
    1270 -0.60 0.65 0.57 -0.08 -0.02 -0.37
    1476 0.42 -0.11 -0.39 -0.32 -0.32 0.65
    1416 0.59 -0.05 -0.10 -0.61 -0.36 0.40
    786 -0.15 -0.19 -0.32 0.02 0.94 -0.25
    751 -0.38 -0.23 -0.36 0.33 0.05 0.70
    1316 0.81 -0.04 -0.43 -0.35 -0.22 0.11
    1351 0.87 -0.35 -0.21 -0.05 -0.36 -0.12
    992 0.90 -0.24 -0.29 -0.21 -0.17 -0.18
    1272 -0.45 0.37 0.74 -0.17 0.07 -0.51
    1363 -0.63 0.12 0.81 -0.12 0.05 -0.19
    1486 -0.33 0.66 0.07 -0.18 -0.26 0.22
    1496 -0.18 -0.08 -0.24 -0.18 0.93 -0.19
    96 -0.23 -0.13 -0.22 -0.18 0.92 -0.11
    1294 -0.23 -0.08 0.01 0.78 -0.08 -0.37
    1027 -0.18 0.69 -0.02 -0.26 -0.05 -0.02
    1007 -0.29 -0.11 0.86 -0.08 -0.23 -0.23
    1362 -0.21 -0.11 -0.05 -0.23 0.87 -0.25
    1302 0.29 -0.32 -0.37 0.75 -0.20 -0.19
    802 -0.51 -0.22 -0.15 0.55 0.57 -0.13
    1265 -0.37 0.33 0.67 -0.17 0.16 -0.59
    1489 -0.45 0.10 0.78 -0.20 0.03 -0.26
    878 -0.09 -0.26 -0.32 0.85 -0.06 -0.08
    1338 -0.45 0.82 0.12 -0.07 -0.05 -0.16
    826 0.18 0.40 0.38 -0.55 0.02 -0.47
    1424 -0.19 -0.21 -0.32 -0.09 0.09 0.77
    335 -0.20 -0.10 -0.27 -0.15 0.93 -0.16
    879 -0.20 -0.03 -0.19 -0.21 0.89 -0.20
    1305 -0.57 0.14 0.78 0.14 -0.03 -0.43
    978 -0.12 -0.15 -0.25 -0.09 -0.17 0.82
    769 -0.01 -0.36 -0.58 0.42 0.01 0.56
    1567 -0.16 0.58 -0.15 -0.16 0.18 -0.14
    35 0.60 -0.31 -0.39 -0.37 -0.13 0.46
    1632 -0.15 -0.12 0.64 -0.10 -0.16 -0.19
    1431 0.53 -0.35 0.42 -0.44 -0.24 -0.16
    788 -0.45 0.11 -0.13 0.87 -0.22 -0.03
    1333 -0.40 -0.10 -0.32 0.03 0.69 0.22
    1357 0.47 0.01 -0.56 -0.14 -0.30 0.50
    997 -0.16 -0.13 -0.22 -0.12 -0.16 0.83
    1325 0.68 -0.19 0.04 -0.41 -0.44 0.13
    1275 -0.45 0.50 -0.08 0.52 0.05 -0.34
    1315 -0.15 0.34 0.66 -0.62 0.08 -0.33
    1545 -0.12 -0.05 -0.26 -0.15 -0.21 0.85
  • Für jede Variable kann der Korrelationskoeffizient der entsprechenden Gewichtungskarte mit dem Zuordnungskartenmuster berechnet werden.
  • CC = 0: zeigt keine Korrelation zwischen Biomarker und der zugehörigen Klasse an.
  • 1> CC (i)> 0: Übereinstimmung zwischen der Biomarker-Intensität und der Krebs-bezogenen Klasse.
  • 0 <CC <-1: eine inverse Korrelation zwischen Biomarkerwert und krebsbezogener Klasse. Die CC-Werte > 0,5 oder <-0,5 sind farbig hervorgehoben. Zum Beispiel korreliert die Gewichtskarte des Biomarkers 1282 stark mit dem Krebs-Klasse-4-Muster in der Assoziationstabelle und kann ein wichtiger Biomarker für die Proben von Patienten mit Myelom sein.
  • Beispiel 1B. Tiefenanalyse des menschlichen Proteoms mit Multi-Nanopartikel-Proteinkorona-Charakterisieruns und maschinellem Lernen ermöglichen eine genaue Identifizierung und Unterscheidung von Krebs in frühen Stadien.
  • In einer zweiten Ausführungsform können die kollektiven Proteinkorona-Daten für eine gegebene Plasmaprobe, die von Proteinkorona-Profilen einzelner Nanopartikel abgeleitet sind, verschiedene Arten von Krebsarten identifizieren und unterscheiden, indem Maschinelles Lernen (z.B. ein Random-Forest-Ansatz) zur Analyse verwendet wird, um die Daten zu analysieren. Es wurde das wie in Beispiel 1A beschriebene Sensor-Array verwendet und die gesammelten Daten wurden fernee durch Maschinelles Lernen in weiteren Einzelheiten analysiert. Dieses Sensor-Array (d.h. das Proteinkorona-Nanosystem) hat Krebs eindeutig und zuverlässig identfiziert und ermöglicht die Unterscheidung zwischen verschiedenen Krebsarten. Dieses System kann verwendet werden, um Krebsarten unter Verwendung von Blindplasmaproben vorherzusagen. Es hat die Fähigkeit zur sehr frühen Erkennung durch die Verwendung des Plasmas gesunder Menschen in bestehenden Kohorten, bei denen mehrere Jahre nach der Plasmaentnahme Krebs diagnostiziert wurde, um einen prä-Krebs-Biomolekül-Fingerabdruck zu bestimmen.
  • 1 zeigt einen schematischen Überblick über die Verwendung des Sensor-Arrays (Nanopartikelsystem) zur Verwendung von Multi-Proteinkorona-Proteomik zur Erkennung von Krebs bei bekannten Krebspatienten und zur Vorhersage von Krebs unter Verwendung von Blindplasma- und Kohortenproben.
  • ERGEBNISSE
  • Proteinkorona-Profile des Nanosystemes unter Verwendung von Plasma von Patienten mit Krebserkrankungen in frühen, mittleren und fortgeschrittenen Stadien
  • Dieses Proteinkorona-Nanosystem besteht aus drei verschiedenen kreuzreaktiven Liposomen mit verschiedenen Oberflächenladungen [anionisch (DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- (1'-rac-glycerin))], kationisch (DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan) -DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin)) und neutral (CHOL (DOPC-Cholesterin))], deren Proteinkorona-Profile nach der Exposition gegenüber dem Plasma gesunder Personen oder Patienten gemessen wurden, die eine von von fünf Krebsarten hatten: Lunge, Pankreas, ein Myelom, ein Meningiom oder ein Glioblastom.
  • Es wurde dreifach eine Proteomanalyse an jedem Patienten (5 Patienten/Gruppe) für jedes der drei Liposomen (siehe 2A, B für die Details über die Größe und Ladung der Liposomen) in unserem Proteinkorona-Nanosystem durchgeführt (d.h. Gesamtversuche: 3*(29)*3=261). Obwohl, wie auch in Beispiel 1A beschrieben, keine einzelne Proteinkorona-Zusammensetzung spezifisch für irgendeinen Krebsart ist, lieferte die kollektive Proteinkorona-Zusammensetzung für eine gegebene Plasmaprobe, die von verschiedenen Liposomen abgeleitet wurde, einen (ein-)eindeutigen „Fingerabdruck“ für jede Krebsart.
  • Obwohl die Zusammensetzung der Proteinkorona, die sich auf der Oberfläche von Liposomen bildet, stark von ihren physikochemischen Eigenschaften abhängt, kann sie auch stark durch die eindeutige Art, die einzigartige Konzentration und Konformation von Proteinen und anderen Biomolekülen in einem gegebenen Plasma eines Patienten beeinflusst werden. Die Größe und Ladung von Korona-beschichteten Liposomen wurde mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS/Nanosight) nach Inkubation mit Plasma von Patienten mit fünf verschiedenen Krebsarten (siehe Tabelle 1) und gesunden Probanden untersucht. Die Ergebnisse bestätigten, dass die physikochemischen Eigenschaften der Korona-beschichteten Nanopartikel über verschiedene Krebsarten hinweg variierten (2A, B).
  • Die quantitative Auswertung des an die Liposomen adsorbierten Gesamtproteins wurde über die BCA (Bicinchoninsäure) oder NanoOrange-Assays durchgeführt, und die Ergebnisse bestätigten signifikante Unterschiede in den Mengen an adsorbierten Proteinen nach Inkubation in Plasma von Patienten mit verschiedenen Krebsarten (3A-F). Die quantitative Auswertung des Gesamtproteins, das auf der Oberfläche von Liposomen adsorbiert wurde, zeigte die Abhängigkeit der Proteinmenge von der Krebsart (3A-F). Es wurde die Proteinkorona-Zusammensetzung an der Oberfläche von drei Liposomen durch Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) bewertet, in der 876 bekannte Proteine definiert waren. Es wurden die Beiträge einzelner Proteine und ihrer Kategorien (d.h. Komplement, Koagulation, Gewebeverlust, Lipoproteine, akute Phase, Immunglobuline und andere Plasmaproteine) zu der Korona-Zusammensetzung definiert (3A-F). Die Ergebnisse zeigten Assoziationen zwischen der Proteinzusammensetzung und nicht nur der Krebsart, sondern auch der Art der Liposomen. Der hinter dieser Variation liegende Mechanismus besteht darin, dass das hohe Verhältnis von Oberfläche zu Volumen der Nanopartikel eine einzigartige Möglichkeit für ein breites Spektrum von menschlichen Plasmaproteinen (sehr häufig vorkommende Proteine, weniger häufig vorkommende Plasmaproteine und sehr seltene Proteine) bietet, an der Korona-Zusammensetzung mitzuwirken, ohne der Notwendigkeit, sehr häufig vorkommende Proteine zu depletieren, und ohne eine direkte Korrelation mit den Plasmaproteinkonzentrationen. Darüber hinaus können in diesem System Konformationsänderungen in Plasmaproteinen System auch die Proteinkorona-Zusammensetzung verändern, indem die Wechselwirkungsstelle von Proteinen mit Nanopartikeln signifikant verändert wird. Diese Eigenschaften machen das Proteinkorona-Profil (ein-)eindeutig gegenüber anderen Ansätzen, die für die Analyse von Proteinen in menschlichem Plasma entwickelt wurden.
  • Die Proteinkorona-Zusammensetzungen an der Oberfläche von Liposomen enthielten ein breites Spektrum von menschlichen Plasmaproteinen, einschließlich sehr häufig vorkommender Proteine (z.B. Albumin, Transferrin, Komplementproteine, Apolipoproteine und Alpha-2-Makroglobulin) und sehr seltener Proteine (definiert als as <100 ng/ml), wie transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 Protein (~ 10 ng/ml), Fructose-Bisphosphat-Aldolase A (~ 20 ng/ml), Thioredoxin (~ 18 ng/ml) und L-Selektin (~ 92 ng/ml). Es wurden auch 388 Proteine ohne eine bekannte vorherige Plasmakonzentrationen (http://plasmaproteomedatabase.org/) identifiziert. Die erhaltenen Proteininformationen wurden dann mittels eines Maschinelles Lernen-Ansatzes analysiert, um die Fähigkeit unseres Proteinkorona-Nanosystems für eine robuste und genaue Krebsdetektion zu untersuchen.
  • Entwicklung eines Klassifikators zur Erkennung und Unterscheidung zwischen Krebsarten unter Verwendung von Proteinkorona-Nanosystem-Ergebnissen.
  • Um die Fähigkeit des Proteinkorona-Nanosystems zur Erkennung verschiedener Krebserkrankungen zu bewerten, wurden proteomische Daten verwendet, die von den drei verschiedenen Liposomen an 29 Plasmaproben (5 Patienten von jeweils 5 Krebsarten und 4 gesunde Proben) gesammelt wurden, um einen Klassifikator zu trainieren, im Speziellen ein Algorithmus, der Array-Messungen von einem Patienten empfängt und eine von sechs Markierungen (labels) (entweder eine der fünf Krebsarten oder der gesunden Proben) ausgibt. Vor dem Training des Klassifikators wurden die Rohdaten der 3 Nanopartikel zuerst über eine Tensor-Faktorisierung mit niedrigem Rang entnotiert, die in einem nachfolgenden Abschnitt ausführlich diskutiert wird. Dieses Entrauschen mindert implizit die signifikante Variabilität, die bei einzelnen Koronaelementen beobachtet wird. Es wurde dann ein random forest classifier, ein bekannter nichtlinearer Klassifikations-Algorithmus, auf die resultierenden entrauschten Daten trainiert.
  • Es wurde die Genauigkeit dieses Klassifikators an 16 Blindproben (je 3 Patienten von 5 Krebsarten und 1 gesunde Probe) untersucht. Es wurde die Gesamtklassifikationsgenauigkeit für die Aufgabe der korrekten Assoziation dieser Blindproben zu einer der sechs Markierungen sowie die Empfindlichkeit und Spezifität für jede der fünf Krebsarten separat gemessen (Tabelle 4). Aufgrund der relativ geringen Anzahl von Plasmaproben (insgesamt 45) und um die Robustheit der Ergebnisse sicherzustellen, wurde dieses Verfahren durch (Training eines zufälligen Random Forest-Klassifikators an 29 Proben und Messung der Genauigkeit, Empfindlichkeiten und Spezifitäten an den verbleibenden 16 Proben) insgesamt 1000-mal durchgeführt. Die Trainings- und Testsätze in jeder der 1000 Wiederholungen des Experiments wurden zufällig aus allen Klassengeschichteten Partitionen der Daten ausgewählt. Dieser Ansatz erlaubt es, unverzerrte Schätzungen des p-Werts für die hier angegebenen Klassifikationsgenauigkeiten zu berechnen (siehe Tabelle 4). Insbesondere zeigt die letzte Zeile von Tabelle 4, dass die durchschnittliche Gesamtgenauigkeit über die 1000 Wiederholungen 96,2% betrug, oder äquivalent dazu einen Gesamtfehler von 3,8%. Es wurde auch ein p-Wert von 0,04 für die Nullhypothese beobachtet, so dass der Gesamt-Klassifikationsfehler niedriger als 87,5% ist, und daher kann diese Nullhypothese mit 95% Sicherheit zurückgewiesen werden. Die Empfindlichkeiten für die fünf individuellen Krebsarten liegen zwischen 87,4% und 100,0%, die individuellen Spezifitäten liegen zwischen 97,0% und 100,0%. Tabelle 4. Gesamt-Klassifikationsgenauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität. Die Gesamtklassifikationsgenauigkeit für Proteinkorona-Nanosysteme mit ein, zwei und drei Liposomen (Spalte 2). Sowohl die Klassifikationsgenauigkeit als auch die zugehörigen p-Werte verbessern sich mit zusätzlichen Liposomen. Die individuelle Sensitivität und Spezifität für Glioblastom-, Lungen-, Meningeom-, Myelom- und Pankreaskarzinome (Spalten 3 - 12) zeigen ebenfalls, dass sich die Sensitivität und Spezifität mit zusätzlichen Liposomen verbessern. Experimentelle Ergebnisse werden über 1000 unabhängige Züge eines Trainingssatzes mit 29 Plasmen gemittelt, mit Auswertung der restlichen 16 Plasmen. Die p-Werte sind für die Nullhypothese eines Klassifikationsfehlers niedriger als 87,5%.
    Glioblastom Lunge Meningeom Myelom Pankreas
    Arraygröße Genauigkeit Empf. Spez. Empf. Spez. Empf. Spez. Empf. Spez. Empf. Spez.
    Eins 86.0 (0.43) 80.1 96.5 85.9 98.4 83.9 96.3 88.1 97.1 89.6 97.7
    Zwei 92.4 (0.18) 89.6 97.5 94.0 99.5 91.6 96.2 99.9 99.6 85.8 99.9
    Drei 96.2 (0.04) 100.0 98.9 94.0 100.0 98.5 97.0 100.0 100.0 87.4 99.5
  • Der Wert von Multi-Liposomen im Proteinkorona-Nanosystem
  • Um die Wichtigkeit des Einschlusses von Multi-Liposomen in das Proteinkorona-Nanosystem zu bewerten, wurde das gesamte Klassifikationsverfahren unter Verwendung von 1000 verschiedenen Teilen der Daten in Trainings- und Testproben überführt, wobei diesmal Daten verwendet wurden, die nur von einem einzelnen Liposom gemessen wurden. Dies wurde für jedes der drei Liposome durchgeführt und die Ergebnisse sind in der ersten Zeile von Tabelle 4 angegeben. Im Vergleich zu dem gesamten Array, das alle drei Liposomen einschließt, zeigten die Einzel-Liposomen-Arrays eine signifikant niedrigere Genauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität. Das Verfahren wurde auch für Sätze von zwei Liposomen (es gibt drei solcher einzigartigen bzw. eindeutigen Sätze) wiederholt durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in der zweiten Zeile von Tabelle 4 angegeben. Die Zwei-Liposomen-Systeme sind genauer als ein Ein-Liposom-System, aber immer noch schwächer als das gesamte Array von drei Liposomen. Insgesamt zeigt dies den Wert von Änderungen im Korona-Zusammensetzungsmuster zwischen verschiedenen Liposomen und die Notwendigkeit, solche Mehrfachbeobachtungen einzubeziehen.
  • Wichtigkeit von Variable und Protein sowie Stabilität
  • Das Random-Forest-Modell liefert auch einen Wichtigkeits-Score für jede Variable (d.h. jedes Liposomen-Protein-Paar). Dieser Score misst im Wesentlichen, wie wichtig diese Variable bei der Unterscheidung von Patienten mit verschiedenen Krebsarten war. Auf einem individuellen ‚Baum‘ des Random-Forest wird der Wichtigkeits-Score einer beliebigen Variablen, die zum Aufbau des Baumes verwendet wird, als der Anteil des Trainingssatzes definiert, der in den ‚Blättern‘ von Knoten liegt, die diese Variable verwenden (Variablen, die nicht beim Konstruieren des Baums erhalten einen Score von Null). Dann ist die GesamtWichtigkeit des Scores für eine Variable der Durchschnitt ihrer Wichtigkeits-Scores für jeden Baum.
  • Für verschiedene biologische Proteinfamilien (die gleichen wie die in 3A-F verwendeten) wurde die GesamtWichtigkeit bei der Unterscheidung verschiedener Krebsarten (10A, (a) - (c)) berechnet. Die Ergebnisse legen nahe, dass verschiedene Proteinfamilien beim Nachweis verschiedener Krebsarten wichtig sind. Zum Beispiel waren Akute-Phase-Proteine beim Nachweis von Meningeomen relativ wichtig, und Lipoproteine waren beim Nachweis von Glioblastomen relativ wichtig. Bemerkenswerterweise unterschieden sich diese Variabilität von der Variabilität des Prozentsatzes jeder Kategorie, die an die Liposomen adsorbiert war (10A, (d) - (f)). Interessanterweise stimmen diese Ergebnisse mit der biologischen Funktion dieser Proteinkategorien gut überein. Zum Beispiel ist es gut akzeptiert, dass der Lipidmetabolismus im Glioblastom im Vergleich zum gesunden Gewebe wesentlich verändert ist, was der Hauptgrund für die beobachteten wesentlichen Veränderungen in der Wechselwirkung von Lipoproteinen mit Liposomen sein kann ( 2C und 10A). Einzelheiten über die Anzahl identifizierter Proteine und einzigartiger bzw. eindeutiger Proteine in der Korona-Zusammensetzung verschiedener Liposomen und ihre Kombinationen sind in 10B dargestellt.
  • Es wurden auch die wichtigsten Gesamtproteine (10C und Tabelle 5) berechnet. Diese Proteine wurden in Kombinationen von allen drei Liposomen nachgewiesen, was wiederum die kritische Rolle von Multi-Liposomen im Nanosystem zeigt. Es wird auch die Robustheit dieser Menge von „wichtigen“ Proteinen über die Klassifikatoren hinweg bewertet, die aus den zuvor diskutierten 1000 Teilen von Trainingsdaten abgeschätzt werden. Genauer gesagt, zeigt 10B das 25. bis 75. Perzentil der Wichtigkeits-Scores für die 30 wichtigsten Proteine im Durchschnitt. Diese zeigen, dass die Reihe wichtiger Proteine gegenüber der Aufteilung der für das Modelltraining verwendeten Daten beständig ist. Unter diesen wichtigsten Proteinen (siehe Tabelle 5) wurden für einige erkannt, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Krebsentwicklung spielen. Zum Beispiel sind Ficoline (sowohl Ficolin 2 als auch Ficolin 3) Serum-Mustererkennungs-Moleküle mit opsonischen Eigenschaften mit einer beträchtlichen Fähigkeit, die Komplementaktivierung zu regulieren. Die Serumkonzentrationen von Ficolin 3 sind bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom höher als bei gesunden Probandinnen. Darüber hinaus wurde Ficolin 3 in einer differentiellen Proteom-Analyse von Prostatakrebs-Serum identifiziert, was auf eine Rolle dieses Proteins bei Prostatakrebs hindeutet. Andererseits ist es gut bekannt, dass Apolipoprotein A2 und seine Isoformen in Prostatakrebs-Serum in erhöhter Zahl vorkommen und dass sich die Konzentration von Akut-Phasen-Proteinen (z.B. Komplement-Proteinen) bei Vorliegen entzündlicher Erkrankungen, wie etwa Krebs, um ≥ 25% verändern können. Ein klarer Zusammenhang zwischen Krebs und dem hämostatischen System ist seit langem dokumentiert. Die Hämostase moduliert den Blutfluss durch Regulierung der Adhäsion von Blutplättchen und der Ablagerung von Fibrin. Mehrere an der Hämostase beteiligte Proteine wurden mit der Regulation der Angiogenese in Verbindung gebracht. Unter diesen ist Fibrinogen das Hauptprotein im Hämostase-Prozess und wurde in vielen Tumoren gefunden. Es moduliert die Angiogenese und das Tumorwachstum und wurde mit der Metastasenbildung in Verbindung gebracht. Tatsächlich wurden die Plasmaspiegel von Fibrinogen verwendet, um klinische Ergebnisse bei Patienten mit nicht-metastasiertem Nierenzellkarzinom vorherzusagen und Fernmetastasen bei einem Pankreaskarzinom vorherzusagen. Tabelle 5. Informationen über die wichtigsten Gesamtproteine, die sich bei Kombinationen aller drei Liposomen nachweisen lassen. * Die Konzentrationen sind Werte, die unter Verwendung der Spektralzählung aus der Plasma-Proteom-Datenbank (www.plasmaproteomedatabase.org) bezogen wurden.
    Uniprot-Eintragsname Proteinbeschreibung Funktion Menge im Plasma *
    FCN3 Ficolin-3 Komplementaktivierung, Lectin-Weg 1 μg/ml
    SAA4 Carboxypeptidase N-Katalysatorkette chemoattraktierende Aktivität 30μg/ml
    CBPN Carboxypeptidase N-Katalysatorkette schützt den Körper vor vasoaktiven und entzündlichen Peptiden, die C-terminales Arg oder Ly enthalten 720 ng/ml
    APOA2 Apolipoprotein A2 akute Entzündungsreaktion, Lipidtransport 750 μg/ml
    CO7 Komplement- Komponente C7 Regulator der angeborenen und adaptiven Immunantwort 2.6 μg/ml
    FHR5 Komplementfaktor H-verwandtes Protein 5 Komplement-Aktivierung, alternativer Weg 11 ng/ml
    COF1 Cofilin-1 Aktin-Zytoskelett-Organisation 140 ng/ml
    HABP2 Hyaluronan-bindendes Protein 2 Serin-Typ-Endopeptidase-Aktivität 1.1 μg/ml
    IGHG1 Immunoglobulin heavy constant gamma 1 Antigenbindung N.A.
    IGHG3 Immunoglobulin heavy constant gamma 3 Antigenbindung N.A.
    IGHG2 Immunoglobulin heavy constant gamma 2 Antigenbindung N.A.
    RET4 Retinol-bindendes Protein 4 Retinoltransporteur 580 μg/ml
    VTNC Vitronectin Zelladhäsion 35 μg/ml
    GRP78 Glukose-reguliertes Protein mit 78 kDa ATPase-Aktivität 100 ng/ml
    KV118 Ig kappa chain V-I region WEA Antigenbindung N.A.
    CPN2 Carboxypeptidase N subunit 2 Regulation der Komplementaktivierung 2 μg/ml
    COL11 Collectin-11 Mannose-Bindung, Komplementaktivierung N.A.
    MASP1 Mannan-binding lectin serine protease 1 Komplementaktivierung, Lectin-Weg 240 ng/ml
    FIBB Fibrinogen beta chain Hämostase 706 μg/ml
    FIBA Fibrinogen alpha chain Hämostase 2.5 mg/ml
    C1S Complement C1s subcomponent Regulation der Komplementaktivierung 50 μg/ml
    FGL1 Fibrinogen-like protein 1 Hämostase 2.3 ng/ml
    VWF von Willebrand-Faktor Hämostase 110 μg/ml
    CO6 Complement component C6 Regulation der Komplementaktivierung 40 μg/ml
    IGHA1 Immunoglobulin heavy constant alpha 1 Antigenbindung N.A.
    IGLL5 Immunoglobulin lambda-like polypeptide 5 Antigenbindung N.A.
    CO8A Complement component C8 alpha chain Regulation der Komplementaktivierung 70-90 μg/ml
    K1C14 Keratin, type I cytoskeletal 14 struktureller Bestandteil des Zytoskeletts 210 ng/ml
    CRP C-reactive protein Komplementaktivierung, klassischer Weg 2 μg/ml
    CO8G Complement component C8 gamma chain Regulation der Komplementaktivierung 1.1 μg/ml
  • Um die Rolle der wichtigen Proteine, die durch unseren maschinellen Lernen-Ansatz identifiziert wurden, weiter zu untersuchen, wurde nach ihnen in der Open-Targets-Datenbank, einer Plattform zur therapeutischen Zielidentifikation und -validierung, recherchiert. Diese Datenbank berechnet einen Krankheitsassoziations-Score für jedes Protein auf der Grundlage von Beweisen aus verschiedenen anderen Datenbanken (einschließlich including GWAS Catalog, UniProt, Gene2Phenotype, Cancer Gene Census, IntOGen, Europe PMC, and Reactome), um einen Score auf einer Skala von 0 (niedrigster) bis 1,0 (höchster) für die Krankheitsassoziation abzuleiten. Von den aufgeführten Proteinen haben drei starke Assoziationen mit Krebs. Hyaluronan-bindendes Protein hat eine sehr starke allgemeine Assoziation (1,0) mit Krebs, Fibrinogen Beta-Kette hat eine mäßig starke Assoziation (0,4) mit Lungenkrebs; während Keratin, Typ 1 Zytoskelett 14 stark (0,72) mit Prostatakrebs assoziiert ist. Fast alle anderen Proteine in Tabelle 5 haben eine gewisse schwache Assoziation (0,05 - 0,4) mit verschiedenen Krebsarten. Daher haben die Proteine insgesamt eine Verbindung mit bekannten Krebsassoziationen.
  • Überwindung der Variabilität bei Einzelmessungen mit Tensor-Faktorisierung
  • Aufgrund der signifikanten Variabilität der Patientenpopulationen zusammen mit dem durch Messfehler eingeführten Rauschen wurde herausgefunden, dass irgendein einzelnes Protein für die Klassifikation unzureichend war. Für jedes der 100 am häufigsten vorkommenden Proteine (mit 3 * 100 = 300 Variablen) wurden die durchschnittlichen absoluten z-Scores der Proteinkonzentration in der beobachteten Korona bei Patienten jeder Krebsart berechnet. Ein höherer z-Score für eine Krebsart an einem gegebenen Protein zeigt an, dass dieses Protein beim Nachweis dieser Krebsart nützlich sein kann. 11 (blaue Balken) zeigt ein Histogramm dieser durchschnittlichen absoluten z-Scores für jede Krebsart und die gesunde Gruppe. Es wurden auch die durchschnittlichen absoluten z-Scores für die Proteinkonzentration gemessen, die zuvor mit diesen spezifischen Krebsarten in Verbindung standen, die in dem gleichen Histogramm in 10 gezeigt sind (hellgraue Balken). Bei all diesen Hunderten von Variablen hat nur ein einziges einzelnes Protein einen absoluten z-Score über 2,0 und nur bei einer einzigen Krebsart (Myelom), was darauf hindeutet, dass ein einzelnes Protein für eine genaue Klassifikation nicht ausreicht.
  • Die Tensor-Zerlegung, die der Konstruktion einer zufälligen Random Forest-Struktur hier vorausgeht, dient effektiv der Berechnung einer kleinen Anzahl gewichteter Mittelwerte der Proteinzusammensetzung in der beobachteten Korona einer gegebenen Probe. Dieser Mittelwert gilt für alle Proteine und Nanopartikel in einer gegebenen Plasmaprobe und dient dazu, die Variabilität in der beobachteten Konzentration eines gegebenen Proteins abzumindern. Zum Beispiel ist in 11 (lange, schwarze Balken) ist der durchschnittliche absolute z-Score für einen dieser gewichteten Mittelwerte für jede Krebsart aufgetragen. Die absoluten z-Scores dieser gewichteten Mittelwerte sind signifikant höher als die jeder einzelnen Variablen. Zusätzlich zu der Intuition, die dafür sorgt, dass der Ansatz hier Variationen in einem einzelnen Protein über Proben hinweg mit der gleichen Indikation überwindet, wirkt sich dieses Entrauschen auch wesentlich auf die Klassifikationsfähigkeit hier aus. Bei fehlendem Entrauschen würde das bloße Training eines Random-Forest-Klassifikators auf die Roh-Korona-Daten eine Klassifikationsgenauigkeit von 94% (bei einem p-Wert von 0,07) im Gegensatz zu 96,2% (bei einem p-Wert von 0,04) ergeben, wie es in der Tabelle 4 angegeben ist. Für die in Tabelle 7 aufgeführten Kohorten-Daten konnte die Klassifikationsgenauigkeit von 92% (bei einem p-Wert von 0,04) auf 94,1% (bei einem p-Wert von 0,01) erhöht werden.
  • Abhängigkeit der Klassifikationsgenauigkeit von Daten
  • Die abschließende Bewertung der 45 Nicht-Kohorten-Patienten hatte den Wert von Daten. Der ursprüngliche Klassifikator wurde an 5 Proben pro Krebsart trainiert. Um den Wert der Einbeziehung von mehr oder weniger Trainingsdaten zu messen, wurde das Klassifikationsverfahren (Aufteilen der Daten in Trainings- und Testproben, Training eines Klassifikators an den Trainingsproben und Messung der Leistung an den Testproben, alles 1000-mal durchgeführt) für eine variierende Anzahl von Trainingsproben pro Klasse von vier bis sechs widerholt (Tabelle 6). Die Klassifikationsgenauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität nahmen mit steigender Anzahl von Trainingsproben zu. Mit den sechs Trainingsproben pro Klasse erreicht die Gesamtgenauigkeit 96,8% (d.h. einen Gesamtfehler von 3,2%). Dies deutet stark daraufhin, dass die Genauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität weiter zunehmen werden, wenn mehr Daten in das Training des Klassifikators einbezogen werden. Tabelle 6. Die Klassifikationsgenauigkeit verbessert sich mit mehr Daten. (Spalte 2) Allgemeiner Klassifikationsfehler, wenn der Trainingssatz aus vier, fünf und sechs Proben von jedem Krebs und den zugehörigen p-Werten besteht. Sowohl der Klassifikationsfehler als auch die zugehörigen p-Werte verbessern sich mit zusätzlichen Proben von jedem Krebs. (Spalten 3-12) Die Empfindlichkeit und Spezifität für Glioblastom-, Lungen-, Meningeom-, Myelom- und Pankreaskarzinome, wenn der Trainingssatz aus vier bis sechs Proben besteht. Die experimentellen Ergebnisse sind über 1000 unabhängige Züge eines Trainingssatzes mit vier gesunden Patienten und vier bis sechs Patienten mit jeder Krebsart gemittelt. Die p-Werte sind für die Nullhypothese von mindestens zwei Klassifikationsfehlern.
    Glioblastom Lunge Meningiom Myelom Pankreas
    # Proben Genauigkeit Empf. Spez. Empf. Spez. Empf. Spez. Empf. Spez. Empf. Spez.
    vier 94.4 (0.14) 98.8 98.1 91.2 100.0 93.0 96.7 100.0 99.9 88.0 98.4
    fünf 96.2 (0.04) 100.0 98.9 94.0 100.0 98.5 97.0 100.0 100.0 87.4 99.5
    sechs 96.8 (0.01) 100.0 99.4 96.6 100.0 98.9 97.0 100.0 100.0 87.8 99.6
  • Probenahme von Plasmaproteinen mit geringer und hoher Abundanz mit Liposomen ohne die Notwendigkeit einer Proteinverarmung
  • Das Multi-Liposomen-Proteinkorona-Nanosystem erzeugt unter Verwendung von maschinellen Lernen-Techniken ein einzigartiges „Fingerabdruck“-Proteinmuster für jede Krebsart und für gesunde Einzelpersonen. Bei der Suche nach dem Mechanismus, der der einzigartigen Fähigkeit der Proteinkorona bei der Krebsidentifikation und -unterscheidung zugrunde liegt, wurde die Korona-Zusammensetzung für den Beitrag sowohl von Proteinen mit hoher als auch mit niedriger Abundanz gründlich analysiert und diese Ergebnisse mit der Konzentration von Korona-Proteinen in menschlichem Plasma verglichen. In dieser Hinsicht wurde der Beitrag jedes Proteins (z.B. Protein X) zu der Korona-Zusammensetzung und dem Plasma in Bezug auf Albumin unter Verwendung von (Gesamtpeptide von Albumin in der Proteinkorona)/(Gesamtpeptide von Protein X in der Proteinkorona) und (Konzentration von Albumin im Plasma)/(Konzentration von Protein X im Plasma) standardisiert. Es ist bemerkenswert, dass die Konzentrationen identifizierter Korona-Proteine im Plasma manuell unter Verwendung einer Online-Proteom-Datenbank (http://plasmaproteomedatabase.org/) durchsucht wurde. Da die Gesamtpeptide des Albumins in der Proteinkorona proportional sind zum Gesamtgewicht des Albumins in der Proteinkorona, ist die Aufteilung dieser Peptide in die Peptide von Protein X vergleichbar mit dem Verhältnis der Albumin-Konzentration zur Konzentration von Protein X im Plasma. Wie in 12 gezeigt, wurde herausgefunden, dass die Plasmakonzentrationen über 10 Größenordnungen variieren (in der Log-Log-Skala), während die Liposomen dieselben Proteine über 4-5 Größenordnungen erkennen. Mit anderen Worten wurde gezeigt, dass die Proteinkorona-Zusammensetzung eine große Fähigkeit zum Konzentrieren einer großen Auswahl von Proteinen mit niedriger Abundanz (≤100 ng/mg) und sehr seltenen Proteinen ((≤10 ng/mg) aufweist. Dies bedeutet, dass das Einholen von Daten über in hoch abundante Proteine in der Proteinkorona den Nachweis von Peptiden nicht beeinträchtigt, die von weniger abundanten Proteinen stammen. Es ist erwähnenswert, dass es sich bei den meisten der nachgewiesenen Proteine um niedrig abundante, seltene oder unbekannte/nicht-berichtete Proteine handelt. Die Beteiligung der Proteine mit geringer Abundanz in der Korona-Zusammensetzung ist hauptsächlich auf den Austausch von Korona-Proteinen mit geringer Affinität für Proteine mit höherer Affinität und langsamerer Adsorptionskinetik zurückzuführen.
  • Der Nachweis von Proteinen mit geringer Häufigkeit in menschlichem Plasma erfordert die Abreicherung von sehr hoch abundanten Proteinen und Post-Abreicherung-Plasma-Fraktionierungs-Strategien. Unter Verwendung dieser Abreicherungs-Strategien war die Plasma-Proteomik jedoch nicht robust genug für die Krebsfrüherkennung. Die mit diesem System erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Proteinkorona-Zusammensetzung im Gegensatz zu menschlichen Plasmaproteinen eine große Anzahl von weniger abundanten und sehr seltenen Plasmaproteinen enthält, ohne dass eine Abreicherung erforderlich ist (was eine unbeabsichtigte Abreicherung von Proteinen mit niedrig-abundanten Proteinen/Biomarkern bewirkt). Zusätzlich wurden einige Proteine in der Proteinkorona gefunden, deren Konzentrationen im menschlichen Plasma unbekannt sind/nicht berichtet werden, was aufgrund ihrer sehr geringen Konzentration im menschlichen Plasma möglich ist. Genauer gesagt sind es anionische, neutrale und kationische Liposomen für 323, 189 und 155 von Proteinen mit unbekannter/nicht beschriebener Plasmakonzentration. Der Beitrag dieser Proteine zur Proteinkorona ist durch die rechteckige Box rechts in 12 angedeutet.
  • Die Verwendung von Multi-Liposomen (mit ausgeprägten Oberflächeneigenschaften) stellt eine einzigartige Möglichkeit dar, die Erkennungstiefe der wenig abundanten Proteine und sehr seltenen Proteine zu erhöhen (siehe 12), was die Empfindlichkeit, Spezifität und Vorhersagegenauigkeit des Proteinkorona-Nanosystems beträchtlich erhöht. Jedes Liposom lieferte verschiedene Muster von beigesteuerten Proteinen mit einer starken Abhängigkeit von der Krebsart.
  • Krebserkennung und Unterscheidung zwischen Kohortenproben
  • Um schließlich die Fähigkeit des Proteinkorona-Nanosystems zu untersuchen, Krebs in sehr frühen Stadien zu erkennen, wurde Kohorten-Plasma (eingeholt von der NIHfinanzierten Golestan-Kohortenstudie, Einzelheiten sind im Verfahrensabschnitt erläutert) von gesunden Menschen verwendet, die mehrere Jahre nach der Plasmaentnahme mit Pankreas-, Lungen- und Gehirntumoren diagnostiziert worden sind. Es wurde dem gleichen Verfahren gefolgt und 1000 Experimente durchgeführt. In jedem Experiment wurden die Daten in 12 (jeweils 4 für 3 Krebsarten) Trainingsproben und 3 Testproben (jeweils eine für 3 Krebsarten) aufgeteilt. Die Beobachtungen wurden über das oben beschriebene Verfahren entrauscht und dann wurde ein zufälliger Random-Forest-Klassifikator mit den Trainingsproben trainiert. Schließlich wurde die Gesamtgenauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität an den Testproben gemessen (Tabelle 7). Die Gesamtgenauigkeit betrug 94,1% (eine Fehlerrate von 5,9%) mit einem p-Wert von 0,01 für die Nullhypothese einer Gesamtgenauigkeit von <66,7% (daher mit 95% er Konfidenz abgelehnt). Die Empfindlichkeiten in den drei Krebsarten lagen zwischen 83,2% und 100,0%, und die Spezifitäten reichten von 91,6% bis 100,0%. Diese relativ hohen Werte legen nahe, dass das Proteinkorona-Array Krebsarten in ihren frühesten Stadien erfolgreich nachweisen kann. Tabelle 7. Gesamtklassifikationsgenauigkeit, Empfindlichkeit und Spezifität für Kohortenproben. (Spalte 2) Die Gesamtklassifikationsgenauigkeit für ein, zwei und drei Liposomen. Sowohl der Klassifikationsfehler als auch die zugehörigen p-Werte verbessern sich mit der Zugabe von Liposomen zum Nanosystem. (Spalten 3-8) Die Empfindlichkeit und Spezifität für Gehirn-, Lungen- und Pankreaskarzinom. Auch hier verbessert sich die Empfindlichkeit und Spezifität mit der Zugabe von Liposomen. Experimentelle Ergebnisse werden über 1000 unabhängige Züge eines Trainingssatzes mit 12 Patienten gemittelt, mit einer Auswertung der verbleibenden 3 Patienten. Die p-Werte sind für die Nullhypothese einer Klassifikationsgenauigkeit < 66,7%.
    Arraygröße Genauigkeit Gehirn Lunge Pankreas
    Empf. Spez. Empf. Spez. Empf. Spez.
    Eins 75.4 (0.23) 74.7 86.1 90.7 90.9 60.8 86.9
    Zwei 80.5 (0.11) 92.3 89.7 76.3 92.1 73.1 88.9
    Drei 94.1 (0.01) 100.0 100.0 83.2 99.6 99.2 91.6
  • Die gleichen Experimente wurden auch mit kleineren Teilmengen von Liposomen durchgeführt, einschließlich jedes Liposoms einzeln, und allen drei einzigartigen Sätzen von zwei Liposomen. Wiederum wurde gezeigt, dass die Gesamtgenauigkeit, Empfindlichkeiten und Spezifitäten dramatisch zunehmen, wenn die Anzahl der Liposomen zunimmt, was wiederum die Wertigkeit des Array-Systems zeigt.
  • DISKUSSION
  • Keine frühere Studie, die die Proteinkorona oder irgendeinen anderen Ansatz zur Fraktionierung des Plasma-Proteoms verwendet, hat ein gleichzeitiges Multi-Krebs-Screening mit akzeptabler Spezifität, Empfindlichkeit und Vorhersagegenauigkeit ermöglicht. Dies ist das erste Mal, dass ein Sensor-Array mit der Spezifität, Empfindlichkeit und Vorhersagegenauigkeit nicht nur für Krebs, sondern auch für spezifische Krebs-Subtypen entwickelt wurde.
  • Es wurde gezeigt, dass die Fraktionierung des Plasma-Proteoms durch die Proteinkorona nicht mit der Abundanz spezifischer Plasmaproteine in Zusammenhang steht und stattdessen über viele Faktoren einschließlich der Proteinaffinität für die Nanopartikeloberfläche über einen weiten Bereich von Kräften, einschließlich Coulomb-Kräften, London Dispersionskräften, Wasserstoffbrückenbildung-Acidität und -Basizität, Polarisierbarkeit, Valenzelektronen und den Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen beteiligten Proteinen, in der Korona-Struktur erfolgt. Es wurde gezeigt, dass die Proteinkorona-Zusammensetzung dynamisch ist und anfänglich von hoch abundanten Proteinen, einschließlich Albumin, Immunglobulin und Fibrinogen dominiert wird, die zusammen mit 19 anderen Proteinen über 99% der Proteinmasse im Plasma-Proteom ausmachen. Die verbleibenden 1% des Plasma-Proteoms umfassen mehr als 10.000 Proteine. Eine Teilmenge dieser Proteine mit höheren Affinitäten und/oder niedriger Absorptionskinetik für die Nanopartikeloberfläche konkurriert bei der Aufnahme in die Korona-Zusammensetzung mit den Proteinen mit hoher Abundanz. Neben dem Austausch der Proteine mit höherer Bindungsaffinität durch solche mit geringerer Bindungsaffinität an der Oberfläche von Nanopartikeln, besteht die Möglichkeit für einen Beitrag anderer niedrigaffiner Proteine in der äußeren Proteinkorona-Schicht aufgrund ihrer günstigen Protein-Protein-Wechselwirkungen mit der bereits gebildeten Proteinkorona-Schicht. Dies bedeutet, dass die ausgetauschten, niedrig abundanten Proteine in der Lage sein könnten, die Bildung der Proteinkorona auf die Adsorption von Proteinen mit niedrigerer Abundanz zu richten.
  • Hierin wird zum ersten Mal die relative Konzentrationsfähigkeit der Proteinkorona bei der Anreicherung von Proteinen mit geringer Abundanz (definiert als <100 ng/ml) analysiert, was zeigt, dass viele dieser Proteine Konzentrationen von <10 ng/ml aufweisen und sich 1 pg/ml annähern. Noch wichtiger ist, dass viele dieser Proteine eine entscheidende Rolle bei der Krebsidentifikation und -unterscheidung durch maschinelles Lernen-Ansätze spielen. Die Rolle der Proteinkorona bei der Konzentration einer breiten Spektrum von Proteinen mit geringer Abundanz und sehr seltenen Proteinen kann einen großen Beitrag zur Überwindung der Hauptgründe für den begrenzten Erfolg aktueller Massenspektrometrie-Techniken (einschließlich LC-MS/MS) bei der Krebsfrüherkennung leisten, da diese Techniken Proteine in einem dynamischen Bereich von 4-6 Größenordnungen nachweisen können. Mit anderen Worten ermöglicht die Proteinkorona-Zusammensetzung die Probennahme über einen großen dynamischen Bereich des Plasma-Proteoms, was die Tiefe der Proteinabdeckung ohne Proteinabreicherung wesentlich verbessern kann. Da die aus einem einzelnen Nanopartikel gewonnene Proteinkorona höchstens einige hundert verschiedene Proteine (eine kleine Teilmenge des gesamten Proteoms) ausmacht, wird postuliert, dass die Verwendung von Multi-Nanopartikeln mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften zusätzliche Dimensionen der proteomischen Information schaffen könnte: 1) ermöglicht jedes weitere Nanopartikel mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften möglicherweise die Rekrutierung von zusätzlichen einzigartigen Proteinen mit geringer Abundanz (12), 2) nehmen Korona-Proteine, die mit mehr als einer Nanopartikeloberfläche überlappen, an unterschiedlichen Korona-Beitragsprozentsätzen teil und verändern somit die Konzentration und Identität anderer teilnehmender Korona-Proteine, und 3) dienen sowohl einzigartige als auch überlappende Korona-Proteininformationen von jedem Nanopartikel als einzigartige Variablen und liefern daher mehr Daten für diesen maschinellen Lernansatz. Die Kombination von mehr Nanopartikeln für die Plasmafraktionierung und die Proteom-Analyse liefert wesentlich mehr Informationen für die Erkennung und Unterscheidung von Krebs, mit überlegener Empfindlichkeit, Spezifität und Vorhersagegenauigkeit im Vergleich zu weniger Nanopartikeln (Tabelle 4). Konzeptionell ähnelt dieser Multi-Nanopartikel-Ansatz dem olfaktorischen System, bei dem die Spezifität der Geruchsstofferkennung aus dem Muster der Antworten von mehreren hundert hoch kreuzreaktiven olfaktorischen Rezeptoren stammt, wobei jeder Rezeptor unvollständige Informationen liefert, aber die Kombination bei der Identifizierung eines gegebenen Geruchsstoffs hochspezifisch ist (d.h. bei Menschen können ~ 400 aktive Rezeptoren ~ 10.000 Geruchsstoffe erkennen und unterscheiden, und bei Hunden können ~ 1.200 aktive Rezeptoren ~ 1.000.000 Geruchsstoffe erkennen). Ähnliche Ansätze wurden auch von anderen Forschern verwendet, um verschiedene Familien von Analyten, verschiedenen Nahrungsmitteln und Getränken, pathogenen Bakterien und Pilzen, Biomolekülen und sogar Nanopartikeln selbst nachzuweisen und zu unterscheiden.
  • Es wurden drei verschiedene kreuzreaktive Liposomen (mit negativen, neutralen und positiven Oberflächenladungen) verwendet, deren Proteinkorona-Profile nach der Exposition gegenüber dem Plasma einzelner Patienten gemessen wurden, die eine von fünf Krebsarten hatten: Lunge, Pankreas, Myelom, Meningeom oder Glioblastom. Um den Krebs anhand der Ergebnisse des Proteinkorona-Nanosystems zu identifizieren und zu unterscheiden, wurden gut definierte Random-Forest-Maschinenlernen- Ansätze verwendet. Es wurden 1000 verschiedene Sätze von Proben als Trainingsproben (d.h. Plasmen mit bekannten Krebsarten und gesunden Zuständen) oder Testproben (d.h. Blind-Plasmen) bezeichnet, um sicherzustellen, dass das Proteinkorona-Nanosystem robust und zur Krebserkennung mit ausgezeichneter Vorhersagegenauigkeit geeignet ist. Obwohl keine Proteinkorona-Zusammensetzung aus einem einzelnen Nanopartikel spezifisch mit akzeptabler Vorhersagegenauigkeit war für irgendeine bestimmte Krebsart (d.h. 86,0% mit einem p-Wert von 0,43 für den Klassifikationsfehler kleiner als 87,5%), wurde herausgefunden, dass das Muster der Korona-Zusammensetzung, das von den Multi-Liposomen abgeleitet wird, einen einzigartigen „Fingerabdruck“ mit ausgezeichneter Vorhersagegenauigkeit (d.h. 96,2% mit einem p-Wert von 0,04 für den Klassifikationsfehler von weniger als 87,5%) für jede Art von Krebs liefert. Diese Ergebnisse, die auf der tiefen Analyse des menschlichen Proteoms unter Verwendung von Multi-Liposomen-Proteinkorona-Charakterisierung und maschinellem Lernen basiert, bestätigten die Absicht dieses Systems zur eindeutigen Identifizierung und Unterscheidung von Krebs und zur fehlerfreien Unterscheidung von gesunden Probanden mit ausgezeichneter Spezifität (von 97,0 % bis 100,0%).
  • Um die Fähigkeit des Proteinkorona-Nanosystems für eine sehr frühe Erkennung von Krebs zu untersuchen, wurden Kohortenplasmaproben verwendet. Diese Proben wurden von gesunden Personen gesammelt, bei denen 8 Jahre nach der Plasmaentnahme Lungen-, Pankreas- oder Gehirntumore diagnostiziert wurden. Die Ergebnisse des Proteinkorona-Nanosystems, bei dem das Plasma von 15 Patienten in der Kohortenstudie verwendet wurde, zeigten, dass unser Ansatz selbst in diesen prä-diagnostischen Kohortenproben, bei denen eine Krebserkennung mit aktuellen Alternativen nicht möglich war, Krebs eindeutig identifizieren und unterscheiden konnte. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen zu den frischen Plasmaproben ergab die Multi-Liposom-Plasmaprobe eine überragende Klassifikationsgenauigkeit (94,1% vs. 75,4%) und Spezifität [d.h. Gehirn (100,0% vs. 86,1%), Lunge (96,6% vs. 90,9%). ) und Pankreas (91,6% vs. 86,9%)] im Vergleich zu Einzel-Liposomen-Proben. Es ist bemerkenswert, dass die Proteinkorona-Profile der Kohortenproben im Vergleich zu den früheren frischen Krebsproben unterschiedlich waren. Dies liegt hauptsächlich an der langgefrorenen Lagerung (etwa 10 Jahre) der Kohortenproben, da die Proben zum Zeitpunkt des Screenings gesunder Einzelpersonen gesammelt wurden. Es wird zunehmend akzeptiert, dass die Langzeitlagerung von Plasmaproben die Konzentration und Integrität einer Teilmenge von Proteinen stark beeinflussen kann, was wiederum die Proteinkorona-Zusammensetzung verändert und die Empfindlichkeit dieses Proteinkorona-Nanosystems verringert. Daher kann die maximale Empfindlichkeit des Nanosystems bei Verwendung von frischem Plasma entweder im Rahmen eines Krebs-Screenings oder einer Krebs-Aufarbeitung nach der Diagnose realisiert werden. Der Wert in der letzteren Situation kann sein, dass Änderungen des Proteinkorona-Musters über die Zeit wertvolle Informationen liefern können, die für ein frühes Tumorrezidiv oder das Vorliegen einer Restkrankheit nach Tumorresektion relevant sind.
  • Zusammenfassend wird ein Machbarkeitsnachweis vorgestellt, dass das Multi-Nanopartikel-Proteinkorona-Nanosystem ein beträchtliches Potenzial zur Erhöhung der Tiefe der Proteinerkennung und somit eine einzigartige Fähigkeit zur genauen Erkennung und Unterscheidung von Krebs sogar in ihren frühesten Stadien aufweist, wenn bekannte Technologien die Krankheit nicht erkennen. Das Multi-Nanopartikel-Proteinkorona-Muster, das aus diesem Proteinkorona-Nanosystem stammt, liefert einen einzigartigen multivariaten „Fingerabdruck“ für die Krebserkennung, was nicht möglich ist, wenn nur die Proteinkorona eines einzigen Nanopartikels analysiert wird. Darüber hinaus stellt das Proteinkorona-Muster die kollektive Anreicherung eines breiten Spektrums von Plasmaproteinen (einschließlich sowohl abundanter als auch seltetener Proteine) unter Verwendung bestimmter Nanopartikel dar und unterscheidet es deutlich von anderen multivariaten Vollplasma-Proteomansätzen, die keine geeigneten Ergebnisse für die Krebserkennung im Frühstadium liefern. Die Tiefe der Proteinerkennung (die Haupteinschränkung der Proteinanalyse in menschlichem Plasma) und die Vorhersagegenauigkeit des Nanosystems können durch die Verwendung zusätzlicher Nanopartikel mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften weiter verbessert werden. Das erfolgreiche prädiktive Ergebnis des maschinellen Lern- und Proteinkorona-Charakterisierungs-Ansatzes sowohl für blinde Frischplasmen als auch für retrospektive Kohortenplasmen bietet eine geeignete Grundlage für spätere zukünftige Krebsstudien. Darüber hinaus kann der Nutzen des Multi-Nanopartikel-Proteinkorona-Nanosystems auch bei anderen wichtigen Erkrankungen des Menschen angewendet werden, bei denen die Früherkennung sowohl die Langlebigkeit als auch die Lebensqualität signifikant verbessern kann.
  • Die Liposomen wurden wie in Beispiel 1A beschrieben hergestellt.
  • Die Sammlung, Vorbereitung und Lagerung von menschlichem Plasma wurde wie in Beispiel 1A beschrieben durchgeführt.
  • Die Kohorten-Plasmaproben wurden wie in Beispiel 1A beschrieben hergestellt.
  • Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Die Liposomen-Formulierungen wurden durch das zuvor beschriebene TEM charakterisiert. Kurz gesagt, wurden 10 µl jeder Probe auf Formvar-beschichtete Gitter aufgebracht, unter Verwendung von 1%igen Uranylacetat negativ gefärbt, mit ultrareinem Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Die Messungen wurden mit einem Zeiss Libra 120 durchgeführt und die Bildanalyse wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.
  • Die Größe und das Zeta-Potential wurden wie in Beispiel 1A erläutert bestimmt.
  • Der Protein-Assay bzw. -Test wurde wie in Beispiel 1A beschrieben durchgeführt.
  • Die Proteinidentifikation und -quantifizierung wurde wie in Beispiel 1A durchgeführt. Es wurden ungewichtete Spektrumszählungen (USC) verwendet, um die Konsistenz von biologischen Replikaten in der quantitativen Analyse zu bewerten, und es wurden standardisierte Spektrumszählungen (NCS) verwendet, um die Proteinabundanz abzuleiten.
  • Statistische Analyse. Alle statistischen Analysen des Haupttextes wurden in Python mit den Paketen scikit-learn, numpy und scipy durchgeführt. Die Abbildungen und Grafiken wurden mit dem Bokeh-Paket in Python zusammen mit Microsoft Excel, XLSTAT und MATLAB erstellt.
  • Datenmatrizen. Für alle 60 Plasmaproben (45 Nicht-Kohorte und 15 Kohorte), bezeichnet als i = 1, ..., 60, wurde eine Datenmatrix Xi (mit 3 Zeilen und ~ 900 Spalten) erzeugt, so dass jede Zeile der Matrix der Proteinabundanz eines einzelnen Nanopartikels entspricht, wie sie aus dem Proteinkorona-Nanosystem erhalten wird. Als Vorverarbeitungsschritt wurde die Proteinabundanz in relative Proteinabundanzen (RPA) umgewandelt, indem die Zeilen aller Matrizen standardisiert wurden.
  • Klassifikation und Clustering
  • Tensor-Faktorisierung. Die Daten wurden als Drei-Modi- bzw. dreidimensionaler Tensor behandelt, wobei die ersten beiden Modi Nanopartikeln und Proteinen entsprechen und der dritte Modus Plasmaproben entspricht. Dies ist im Wesentlichen äquivalent zum übereinander Stapeln der Beobachtungsmatrizen, die jedem Abtastwert Xi entsprechen. Die Daten wurden über eine Tensorfaktorisierung mit niedrigem Tucker-Rang (135, 136, 137) unter Verwendung des in Python für dieses Projekt implementierten Codes (für die akademische Verwendung auf Anfrage verfügbar) entrauscht. Jede Matrix Xi wird durch eine Tensorzerlegung approximiert, die die Form X i ∼ U S i V T ,
    Figure DE202017107858U1_0001
    annimmt, wobei U eine Matrix ist, deren Zeilen als latente Merkmale angesehen werden können, die jedem der Nanopartikel entsprechen, und wobei ähnlich dazu V eine Matrix ist, deren Zeilen als latente Merkmale angesehen werden können, die jedem der Proteine entsprechen; Diese latenten Merkmale werden über alle Datenmatrizen hinweg geteilt. Schließlich ist jede Si eine Matrix, die Wechselwirkungen zwischen Nanopartikel- und Proteinmerkmalen codiert, wobei diese zwischen den Proben eindeutig sein dürfen. Diese Zerlegung wurde in zwei Schritten geschätzt: Es wurden (a) U und V über eine gekürzte Singulärwertzerlegung auf der Modus-1- und Modus-2-Dekonvolution des Tensors geschätzt, und dann mit diesen Schätzungen (b) jede Si-Matrix über eine Berechnung der Methode der kleinsten Quadrate getrennt angeglichen.
  • Random-Forest-Klassifikation. Das Random-Forest-Modell ist ein bekannter maschineller Lernalgorithmus zur Klassifikation. Ein Random-Forest besteht aus mehreren Entscheidungsbäumen, die jeweils einfache Klassifikationsentscheidungen basierend auf relativ wenigen Variablen treffen. Diese Bäume werden mit verschiedenen zufällig ausgewählten Teilmengen von Variablen erzeugt (oder „trainiert“), so dass es wahrscheinlich ist, dass keine zwei Bäume identisch sind. Bei einer neuen Probe wird jeder Baum von oben nach unten durchlaufen, bis unten eine Zeile von Trainingsproben erreicht wird. Die Verwendung des gesamten Random-Forestes für die Klassifikation bedeutet, dass die mehreren Entscheidungsbäume auf ein Label”abstimmen” (in diesem Fall eine von fünf Krebsarten oder gesund), wobei die Stimmen jedes Baums aus den Labeln des unteren Satzes von Trainingsbeispielen stammen. Für diesen eigenen Algorithmus bestand jeder Random-Forest aus 1000 Entscheidungsbäumen und wurde mit dem scikit-learn-Paket trainiert. Die Wichtigkeits-Scores wurden ebenfalls unter Verwendung des gleichen Pakets berechnet.
  • BEISPIEL 2. Zusätzliche Sensor-Array Konstruktion zur Erkennung von Krankheiten
  • Es wird ein Sensor-Array hergestellt, das aus 12 verschiedenen kreuzreaktiven Nanopartikeln besteht, einschließlich dreier Liposomen, drei superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln und sechs Gold-Nanopartikeln. Diese Arten von Liposomen (DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerin)), DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan) -DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin) und CHOL (DOPC-Cholesterin) mit negativen, neutralen und positiven Oberflächenladungen werden gemäß der früheren Erläuterungen synthetisiert. Es werden ultra-einheitliche PEG-beschichtete superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit einer Größe von 20 nm und verschiedenen PEG-Molekulargewichten (d.h. 300, 3.000 und 6.000) werden von Micromod® bezogen. Die Goldnanopartikel mit einer Kerngröße von ~ 2 nm und verschiedenen Oberflächenfunktionalitäten werden synthetisiert.
  • Alle Nanopartikel weisen die gleiche Größe auf, haben jedoch unterschiedliche Oberflächeneigenschaften, von denen erwartet wird, dass sie signifikant unterschiedliche Proteinkorona-Zusammensetzungen als Reaktion auf das Plasma von Patienten bilden, die verschiedene Krebsarten entwickeln. Das Sensor-Array tastet die Fähigkeit des Proteinkorona-Sensor-Arrays ab, Krebsarten über die Plasmaproteine des Patienten zu identifizieren und zu unterscheiden, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist.
  • Es werden Proben aus einem breiten Spektrum von Krebsarten untersucht, einschließlich Lunge, Pankreas, Myelom, Meningiom, Glioblastom, Plattenepithelkarzinom des Ösophagus und Magenadenokarzinom. Es wurden Proteinkorona-Arrays basierend auf verschiedenen Nanopartikeln (Liposomen, Eisenoxid und Gold) entwickelt, um die Unterschiede im Biomolekül-Fingerabdruck bei verschiedenen Krebsarten zu untersuchen. Das Sensor-Array wird auch die Identifizierung von Proteinen ermöglichen, die Marker für bestimmte Krebsarten sind, einschließlich neuer und unbekannter Biomarker für verschiedene Krebszelltypen. Die Mustererkennung, die basierend auf den verschiedenen Arten von Krebs oder dem Stadium von Krebs bestimmt werden kann.
  • Es wird ein breites Spektrum von menschlichen Plasmen von gesunden Menschen analysiert, bei denen später, mehrere Jahre nach der Plasmaentnahme verschiedene Krebsarten diagnostiziert wurden. Die Plasmaproben wurden durch eine NIH-finanzierte Kohortenstudie, die Golestan Cohort Study, die vom National Cancer Institute (NCI) in den USA, der Internationalen Agentur für Krebsforschung (International Agency for Research on Cancer, IARC) in Frankreich und der Tehran University of Medical Sciences (TUMS) im Iran durchgeführt wurde, gesammelt. Diese Studie umfasste die Sammlung und Lagerung von Plasma von 50.000 gesunden Probanden. Über 1.000 dieser Probanden entwickelten in den folgenden Jahren verschiedene Krebsarten. Die Proben werden bei IARC gespeichert und von unserem Team zur Analyse verwendet. Diese wichtigen Plasmaproben bieten hier eine einzigartige Gelegenheit, die Fähigkeit dieses innovativen Proteinkorona-Sensor-Arrays für die Früherkennung von Krebs zu untersuchen. Darüber hinaus werden hier die Proteine untersucht und identifiziert, die für die Identifizierung und Unterscheidung dieser Krebsarten nützlich sind.
  • Wir glauben, dass die Ergebnisse der Anwendung dieses innovativen Sensor-Arrays auf Kohortenplasmaproben nicht nur bei der Erkennung und dem Screening von Krebs in frühen Stadien hilfreich sein werden, sondern auch bei der Identifizierung neuer Proteinmarker, die an der Krebsentwicklung beteiligt sind. Diese Sensor-Array-Komponenten haben im Vergleich zu anderen entwickelten Verfahren eine spezifischere Fähigkeit, Fingerabdrücke für eine große Mehrzahl von Proteinen in einer unspezifischen, kreuzreaktiven Weise zur Identifizierung und Unterscheidung von Krebs zu liefern.
  • Die harten Korona-Profile der Sensor-Array-Elemente werden mit Plasma von Patienten mit Krebserkrankungen im mittleren und fortgeschrittenen Stadien untersucht:
  • Die Zusammensetzung der Proteinkorona, die sich auf der Oberfläche von Sensor-Array-Elementen bildet, ist stark abhängig von den physikochemischen Eigenschaften dieser Nanopartikel und kann gleichzeitig stark von der Art der im Spender des menschlichen Plasmas zur Inkubation vorliegenden Krankheit beeinflusst werden. Zur Herstellung der Korona-beschichteten Nanopartikel werden die 12 Nanopartikel mit menschlichem Plasma (getrennt) von neun Krebsarten (Lunge, Pankreas, Myelom, myeloische Leukämie, Meningiom, Glioblastom, Brust, Plattenepithelkarzinom des Ösophagus und Adenokarzinom des Magens) inkubiert und aus freien Proteinen über einen wohldefinierten Zentrifugations-Ansatz isoliert. Die Zentrifugation wird üblicherweise bei 13000 g für 30 Minuten bei 15 ° C durchgeführt. Der Überstand wird entfernt und die gesammelten Partikel werden erneut in 500 Mikrolitern PBS dispergiert. Das Verfahren wird wiederholt, um die lose angehefteten Proteine zu entfernen. Um die lose anhaftenden Proteine von der Oberfläche von Nanopartikeln zu entfernen, werden die gesammelten Nanopartikel in kaltem PBS (15° C) redispergiert und durch Zentrifugation gesammelt. Die Größe und Ladung der Korona-beschichteten Nanopartikel wird dann unter Verwendung von DLS/Nanosight bestimmt und mit ihren anfänglichen Werten verglichen, die im Puffer erhalten wurden. Die quantitative Bestimmung des gesamten an die Nanopartikel adsorbierten Proteins erfolgt über den BCA- oder NanoOrange-Assay, während die qualitative Shotgun Proteomics-Analyse die auf der Oberfläche der 12 Nanopartikel adsorbierten Proteine identifiziert. Kurz gesagt, werden nach der Abtrennung von Proteinen von der Oberfläche von Nanopartikeln (gemäß dem Protokoll (Saha, K.; Rahimi, M.; Yazdani, M.; Kim, S. T.; Moyano, D. F.; Hou, S.; Das, R.; Mout, R.; Rezaee, F.; Mahmoudi, M. ACS nano 2016, 10, (4), 4421-4430), das hier durch Bezugnahme mit aufgenommen ist) Proteine in eine Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) injiziert. Die Proteine werden aus den resultierenden Daten durch eine Auswahlprüfung relevanter Datenbanken identifiziert.Um die Gesamtzahl der LC-MS/MS-Spektren für alle Peptide zu erhalten, die einem übereinstimmenden Protein zugeschrieben sind, wird der semi-aPolydispersity Index aus der kumulativen Anpassung der quantitativen Bewertung der Proteinmenge durch Spektralzählung (SpC) durchgeführt. Die normalisierten SpC (NpSpC)-Mengen jedes Proteins, die in den LC-MS/MS-Spektren identifiziert wurden, werden unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: N p S p C k = ( S p C ( M w ) k ∑ t = 1 n ( S p C ( M w ) t ) ) × 100
    Figure DE202017107858U1_0002
    wobei NpSpCk der normalisierte Prozentsatz der spektralen Zählung (d.h. einer Grobzählung von Ionen) für Protein k ist, SpC die spektrale Zählung ist und Mw das Molekulargewicht (in kDa) des Proteins k ist.
  • Entwickeln einer überwachten und unüberwachten Clusteranalyse, um unter Verwendung der Ergebnisse des Sensor-Arrays Krebsarten zu identifizieren und zu unterscheiden:
  • Um zu untersuchen, ob Proteinkorona-Fingerabdrücke (protein corona fingerprints, PCFs) verschiedener Sensorelemente als Biosensoren verwendet werden können und einzigartige Muster für verschiedene Krankheiten (Biomolekülkorona-Signatur) bilden, wurden fokussierte Klassifikationsansätze auf proteomische Daten von drei Liposomen-Proteinkorona-Zusammensetzungen (kationisch, anionisch und neutral), wie in Beispiel 1 beschrieben, angewandt.
  • BEISPIEL 3. Konjugation von Nanopartikeln an das Substrat, um Sensor-Arrays herzustellen.
  • In der praktischen Umsetzung dieser Erfindung s können verschiedene Arten von Partikeln als nanoskalige Sensorelemente verwendet werden. Ferner sind verschiedene Verfahren zur Konjugation der nanoskaligen Sensorelemente an das Substrat vorgesehen. Zusätzlich können die nanoskaligen Sensorelemente in verschiedenen Mustern an dem Substrat angebracht sein.
  • Spezifische Beispiele für unterschiedliche Konfigurationen von Sensorelementen auf verschiedenen Substraten sind beispielhaft in 15-43 dargestellt.
  • BEISPIEL 4. Sensor-Array, das Siliciumdioxid und Polystyrol-Nanopartikel zum Screening auf Krebs umfasst
  • Dieses Beispiel zeigt, dass ein Sensor-Array der vorliegenden Erfindung mit anderen als den in Beispiel 1 verwendeten Nanopartikeln immer noch in der Lage ist, Krebsproben gegenüber gesunden Patientenproben nachzuweisen.
  • Unter Verwendung des Versuchsprotokolls von Beispiel 1 wurde ein Sensor-Array unter Verwendung von funktionalisierten Siliciumdioxid- und Polystyrolpartikeln entworfen. In diesem Beispiel wurden insgesamt sechs Nanopartikel verwendet: zwei Nanopartikelarten, d.h. Polystyrol (P) und Siliciumdioxid (S), mit drei unterschiedlichen Oberflächenfunktionalisierungen, d.h. keiner, einer Aminmodifizierung und einer Carboxylmodifikation (P-NH2, P-COOH, S-NH2 and S-COOH).
  • Die Charakterisierung von freiliegendenen Polystyrol- und Siliciumdioxidnanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung (keine, Aminmodifikation (NK2) und Carboxylmodifikation (COOH)) ist in den 44A - 44D gezeigt, die ihre Größen, DLS und Zeta-Potential der freiliegenden Partikel und TEM-Bilder zeigen. Die Charakterisierung von Proteinkorona-beschichteten Polystyrol- und Siliciumdioxid-Nanopartikeln mit unterschiedlicher Funktionalisierung wird in den 45A - 45D mit ihren Größen, DLS, dem Zeta-Potential und TEMs der mit der Proteinkorona beladenen Polystyrol- und Siliciumdioxid-Nanopartikel gezeigt.
  • Das 6-Nanopartikel-Sensor-Array wurde mit dem Plasma gesunder Personen oder Patienten mit Mastdarmkrebs, Brustkrebs, Blasenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Uteruskrebs, Eierstockkrebs, Nierenkrebs (5 Patienten pro Krebs) wie in 46 dargestellt nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, in Kontakt gebracht. Die Proteinkorona-Profile von Polystyrol- und Silizium-Nanopartikeln (100 nm) wurden mittels SDS PAGE analysiert. Ein Vergleich der Proteinkorona von einfachen, Amin-modifizierten und Carboxyl-modifizierten Partikeln durch SDS PAGE ist in 47 gezeigt.
  • Die Proteinkorona-Profile für gesundes Plasma für Polystyrol- und Silizium-Nanopartikel (100 nm), die durch SDS PAGE analysiert wurden, sind in 48 gezeigt. Ein Vergleich der Proteinkorona von einfachen, Amin-modifizierten und Carboxyl-modifizierten Partikeln.
  • Die Daten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben analysiert. Die statistischen Analyse- und Clusterbildungsergebnisse sind in 49 dargestellt. Wie dargestellt, können die gesunden Einzelpersonen im Vergleich zu den Krebspatienten identifiziert und klassifiziert werden (die gesunden Kontrollproben befinden sich im Bezugsraum gegenüber den Krebspatientenproben, wie in 49 zu erkennen ist).
  • Dieses Beispiel zeigt, dass dieses Sensor-Array, das ein Array mit sechs Nanopartikeln verwendet, einen Patienten mit Krebs von einer gesunden Einzelperson unterscheiden und erkennen kann.
  • Materialien: Drei unterschiedlich funktionalisierte Silizium-Partikel wurden von Kisker-Products erworben (https://www.kisker-biotech.com/), drei unterschiedlich funktionalisierte Polystyrolpartikel wurden von Polyscience, Inc. (http://www.polysciences.com/) erworben. Alle Partikel hatten die gleiche Größe (100 nm). Ihre Morphologie, Durchschnittsgröße, Polydispersitätsindex (PDI) und Zeta-Potential wurden durch TEM-, DLS- und Zeta-Potentialmessungen bestimmt.
  • Experimentelle Information: 1 Stunde Inkubation in 50% menschlichem gesundem Plasma. SDS PAGE: 4-20% Acrylamid, 45 min 40 mA/Gel. Färbung: Colloidal Blue Coomassie über Nacht. Verwendete Nanopartikel: 0,5 mg).
  • Beispiel 5. Proteinkorona-Sensor-Array-Nanosystem identifiziert eine Koronararterienerkrankung
  • Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist die häufigste Art von Herzkrankheit und stellt sowohl bei Männern als auch bei Frauen die häufigste Todesursache dar. Diwe Früherkennung der KHK ist für das Vermeiden von Tod, zum Verlängern des Überlebens und Verbessern der Lebensqualität der Patienten entscheidend. Dieses Beispiel beschreibt das nicht-invasive Sensor-Array-Nanosystem mit sechs Nanopartikeln zur ultrapräzisen Erkennung von KHK unter Verwendung spezifischer PC-Mustererkennung. Während die PC eines einzelnen Nanopartikels nicht die erforderliche Spezifität bietet, liefern die multivariaten PCs über sechs verschiedene Nanopartikel mit unterschiedlichen Oberflächenchemien die erwünschte Information, um selektiv jeden zu untersuchenden kardiovaskulären Zustand zu unterscheiden.
  • Die KHK ist ein chronischer Zustand, der während der Adoleszenz beginnt und allmählich während des gesamten Lebens der betroffenen Person fortschreitet. Es ist durch das Vorhandensein von atherosklerotischen Plaques in den Koronararterien gekennzeichnet. Die Genese der Atherosklerose liegt in der Dysfunktion des Endothels: Unter Stressfaktoren und inflammatorischen Faktoren (z.B. oxidativem Stress und hämodynamischen Kräften) exprimieren Endothelzellen Oberflächenadhäsionsmoleküle, die zirkulierende Leukozyten und Lipoproteine niedriger Dichte (LDL) induzieren, die Cholesterin enthalten.5 Diese Ereignisse induzieren die Bildung atherosklerotischer Plaques, die die Koronararterie verengen und dadurch den Blutfluss beeinträchtigen. Abhängig von der Geschwindigkeit der Plaque-Entwicklung und der Schwere der Arterienverstopfung können die Symptome zum Myokardinfarkt führen.5
  • Eine genaue und rechtzeitige Diagnose von KHK bei Risikopersonen ist sehr wichtig, um sofort eine Ad-hoc-Therapie zu beginnen und weitere Komplikationen zu vermeiden. Die Koronarangiographie ist bis heute die genaueste und vertrauenswürdigste Methode zur KHK-Diagnose. Jedoch ist das Einführen eines Katheters in eine Arterie des Arms (oder des Halses oder der oberen Hüfte) bis zum Herzen invasiv, teuer und verursacht viele Nebenwirkungen, einschließlich Infektionen, Verletzung der Katheterarterie, Allergien und einer starken Blutung. Daher besteht ein dringender Bedarf, neue Tests für die KHK-Erkennung zu entwickeln. Während einige entzündliche Biomarker als für die Diagnose nützlich beschrieben wurden, wird jedoch unglücklicherweise keiner von ihnen in der klinischen Praxis verwendet, was den noch immer vorherrschenden Bedarf an neuen diagnostischen Tests unterstreicht. Die Erfinder haben als ein neues Werkzeug zur Diagnose von KHK einen nanobasierten Bluttest entwickelt.
  • Wie in den vorherigen Beispielen für Krebs gezeigt, agieren personalisierte PCs als Fingerabdruck eines gegebenen Plasmazustands. Dieses Beispiel verwendet den gleichen Ansatz, um die Bildung des atherosklerotischen Plaques durch seine induzierten Änderungen der Plasmazusammensetzung genau zu definieren. In der Tat geben die Plaque-assoziierten Zellen (z.B. Schaumzellen, Makrophagen, Mastzellen, Monozyten und T-Zellen) ein weites Sprektrum von Biomolekülen (z.B. Cytokine, Proteasen und vasoaktive Biomoleküle) in das Blut ab 22 und können so Änderungen im Muster der PC-Zusammensetzung an der Oberfläche von verschiedenen Nanopartikeln in Bezug auf das PC von Patienten ohne Plaquebildung induzieren.
  • Dieses Beispiel analysierte die um Nanopartikel gebildete PC unter Verwendung von Plasma, abgeleitet von i) Patienten, bei denen KHK nach einer Koronarangiographie diagnostiziert wurde (KHK), ii) Patienten mit Symptomen, die eine Koronarangiographie hatten und deren Herzkranzgefäße gesund waren (NICHT-KHK), iii) einer Restenose (Wiederauftreten der KHK nach der Behandlung) und iv) gesunden Freiwilligen ohne Risikofaktoren Herz-Kreislauf-Erkrankungen (z.B. Familienanamnese, Tabakkonsum, Fettleibigkeit, Bluthochdruck) für (KONTROLLE).
  • Um ein breiteres Spektrum an adsorbierten Proteinen zu erhalten, verwendete das Beispiel sechs im Handel erhältliche Nanopartikel als Sensor-Array-Elemente mit unterschiedlicher Zusammensetzung und Oberflächenchemie und/oder Funktionalisierung, wodurch ein 6-Nanopartikel-PC-basiertes Sensor-Array geschaffen wurde, dasals einfacher und nicht-invasiver diagnostischer Test verwendet werden kann. Dieser neuartige diagnostische KHK-Test wird als prä-nicht-invasives Screening für Risikopatienten eingesetzt. Bemerkenswerterweise zeigten diese Ergebnisse, dass PC-Muster die extrem genaue Unterscheidung zwischen KHK-, NICHT-KHK-, Restenose- und Kontrollpatienten ermöglichten und somit ein neuartiges, präzises, nicht-invasives, nie zuvor entwickeltes Werkzeug zur blutbasierten Diagnose von KHK lieferten.
  • Ergebnisse
  • In diesem Beispiel wurden insgesamt sechs Nanopartikel verwendet: zwei Nanopartikel-Typen, d.h. Polystyrol (P) und Siliciumdioxid (S), mit drei verschiedenen Oberflächenfunktionalisierungen, d.h. keiner, einer Aminmodifizierung und einer Carboxylmodifikation (P-NH 2, P-COOH , S-NH 2 und S-COOH), wie in 50 beschrieben. Es wurden die Größe, das Zeta-Potential und die Morphologie von Nanopartikeln vor und nach der Inkubation im Plasma gemessen, um Unterschiede in den Ergebnissen zwischen der synthetischen Identität von freiliegenden Nanopartikeln und ihrer entsprechenden biologischen Identität (PC-beschichtete Nanopartikel) zu vergleichen. Eine dynamische Lichtstreuungsanalyse zeigte, dass freiliegendene Nanopartikel, wie durch den Polydispersitätsindex ≤ 0,02 gezeigt, alle hochgradig monodispers waren und homogen in der Größe von etwa 100 nm, im Bereich von 93 nm bis zu 120 nm (50A). Nach einer 1-stündigen Inkubation mit Plasma von Patienten nahmen die Größen aller Nanopartikel aufgrund der Anwesenheit einer Schicht adsorbierter Proteine (PC) zu, deren Dicke und Zusammensetzung nachweislich von der Proteinkonzentration, den Oberflächeneigenschaften und der Größe der Nanopartikel abhängig war. Alle freiliegendenen Nanopartikel wiesen eine negative Oberflächenladung auf (50B), wobei diejenigen, die funktionalisiert wurden, aufgrund des Beitrags von positiven Amingruppen etwas weniger negativ waren als andere. Diese Ergebnisse entsprachen den Spezifikationen des Lieferanten und anderer Studien. Die Modifizierung mit Amingruppen war nicht ausreichend, um die Oberflächenladung von Siliciumdioxid- und Polystyrol-Nanopartikeln, die durch alle negativ geladenen Reste auf ihren Oberflächen gekennzeichnet sind, bei physiologischem pH-Wert zu verändern.
  • Sobald sie dem Plasma ausgesetzt waren, wurden aufgrund der Ladung der meisten Plasmaproteine bei physiologischem pH alle Oberflächenladungen weniger negativ (von -5 mV bis -25 mV). Insgesamt zeigten die physikochemischen Eigenschaften der PC-beschichteten Nanopartikel ähnliche Tendenzen, wobei sie immer größer und weniger negativ als ihre freiliegenden Gegenstücke waren, unabhängig von dem für die Inkubation verwendeten Plasma. Bei Inkubation mit NICHT-KHK-Plasma zeigten die P- und S-Nanopartikel jedoch eine Größenzunahme von ≈ 85 nm, die größer als die unter Verwendung von Plasma anderer Bedingungen (40-50 nm) gezeigte Größe war. Auf der anderen Seite war die PC-Dicke von S-NH2-Nanopartikeln, die mit KHK-Plasma inkubiert wurden, größer (≈ 40 nm) als jene, die aus der Inkubation derselben Nanopartikel mit anderen Plasmatypen (≈ 30 nm) stammten. Eine Transmissionselektronenmikroskopie zeigte, dass die Nanopartikel ihre Morphologie und Struktur nach Inkubation im Plasma nicht veränderten (50C). Darüber hinaus wurde eine Zunahme der Größe nach dem Beschichten beobachtet, wodurch die durch dynamische Lichtstreuung erhaltenen Ergebnisse bestätigt wurden. Die Proteinkonzentrationen verschiedener PCs wurden mittels eines Bradford-Assay bewertet, was zeigt, dass insgesamt alle Silizium-Nanopartikel weniger Proteine im PC adsorbieren als die Polystyrol-Nanopartikel (51A). Diese Beobachtung wurde durch eine Analyse von PCs durch 1D-SDS PAGE bestätigt. Es wurden Fünf Patienten mit KHK, NICHT-KHK und ohne Risiko für eine KHK (KONTROLLE) zum Sammeln von Plasma verwendet und es wurden die für alle Nanopartikel erhaltenen PCs auf Comassie-gefärbten SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt (51B). Die Gele wurden durch eine Densitometrie analysiert und Unterschiede in der Menge an Proteinen in den KHK-, NICHT-KHK- und KONTROLL-PCs des gleichen Nanopartikels nachgewiesen (51C, Pfeile). In einigen Fällen wurde auch das Vorhandensein und/oder das Fehlen einiger Proteine in spezifischen PCs (51C, blaue Pfeile) beobachtet. Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Bildung von Atherosklerose-Plaques Veränderungen in der Plasmazusammensetzung und folglich Unterschiede in der PC induziert. Die Proteinkorona wurde mittels LC-MS/MS-Analyse analysiert. Es wurden mehr als 150 Proteine in jeder PC-beschichteten Nanopartikelprobe identifiziert. Zusätzlich wurden spektrale Zählwerte verwendet, die die Gesamtzahl der Fragmentierungsspektren für alle auf ein spezifisches Protein zurückgeführten Peptide repräsentieren, um Informationen über die Häufigkeit der Proteine und folglich den prozentualen Beitrag jedes identifizierten Proteins in den PCs zu erhalten. Die Unterschiede in dem prozentualen Beitrag der 20 am häufigsten vorkommenden Proteine in den PCs sind in 52 angegeben. Die Ergebnisse zeigten einen Zusammenhang zwischen der PC-Zusammensetzung, dem Plasmazustand, der Art des Nanopartikels und der Oberflächenfunktionalisierung.
  • Die Daten, die von allen Proben erhalten wurden, wurden gesammelt, analysiert und klassifiziert: Es wurde ein Schlüssel für jede Messung durch Verketten von Nanopartikeln, Oberflächenmodifikation, Art von Plasma und einem Label erzeugt. Die Proteine, die mit weniger als 2 Peptiden identifiziert wurden, wurden nicht berücksichtigt, und es wurde ein TIBCO Spotfire Analyst 7.6.1 verwendet, um die Daten so zu pivotieren, dass die Zeilen durch die Proteinzugehörigkeit identifiziert wurden, die Spalten durch den Schlüssel und dieWerte, die den prozentualen Beitrag enthielten.
  • Neben der mathematischen Analyse wurde das Vorhandensein von exklusiven Proteinen in der Korona einer gegebenen Bedingung analysiert. Um dies zu erreichen, wurden Venn-Diagramme erstellt, die die Erforschung von gemeinsamen und einzigartigen Proteinen in großen Datenmengen von Proteinen oder Genen ermöglichen. Die PCs jedes Nanopartikels wurden für insgesamt 6 Klassifikationen getrennt analysiert. Es wrude nach exklusiven Proteinen gesucht, indem Proteine verglichen wurden, die allen 5 von den Patienten abgeleiteten PCs für KHK, NICHT-KHK und KONTROLLE gemeinsam sind. Die Ergebnisse zeigen, dass für jeden Nanopartikel, der in dieser Studie verwendet wird, verschiedene spezifische Proteine ausschließlich in spezifischen PC-Mustern identifiziert werden. Unter diesen wurden verschiedene Proteine, die an der Regulation der Komplementaktivierung beteiligt sind (complement factor H related protein 3, complement component C8 gamma), ausschließlich im PC-Muster von KHK-Patienten identifiziert. Dieses Ergebnis stimmt mit der kürzlich beschriebenen Rolle der Komplementaktivierung in der Pathogenese von kardiovaskulären Erkrankungen (Entwicklung von Atherosklerose, Plaqueruptur und Thrombose) überein. Ein anderes Beispiel ist das Apolipoprotein (a), das als ein attraktiver Biomarkerkandidat für die Verwendung in der klinischen Praxis der KHK gilt, der hier ausschließlich im PC-Muster von KHK-Patienten nachgewiesen wurde. Das Apolipoprotein (a) ist der Hauptbestandteil von Lipoprotein (a) und ist dafür bekannt, dass es einer proteolytischen Spaltung unterzogen wird und seine Fragmente in atherosklerotischen Plaques akkumulieren.
  • Es wurde die Genauigkeit des Ansatzes bei der Unterscheidung von Patienten mit KHK und NICHT-KHK durch Analysieren von 9 Blindplasmaproben (3 für jede Bedingung und 3 für die Kontrolle) bestätigt. Die PC wurde um die 6 Nanopartikel dieses PC-Sensor-Array-Nanosystems gebildet. Anschließend wurden die Proteine in den PCs durch LC-MS/MS (Hintergrundinformationen) identifiziert und die Ergebnisse mit den gleichen Klassifikations- und Clustering-Ansätzen analysiert.
  • Die statistische und Datenanalyse ist in 54 graphisch dargestellt, die die diskrete Isolierung der Klassifikation von KHK, NICHT-KHK und KONTROLLE (kein Risiko einer KHK) zeigt.
  • Zusammenfassend wurde die Genauigkeit eines PC-Sensor-Arrays mit 6 Nanopartikeln zur Erkennung einer KHK demonstriert. Das in dieser Arbeit entwickelte PC-Sensor-Array-Nanosystem erwies sich auch bei der Unterscheidung von KHK, Restenose, NICHT-KHK und gesunden Einzelpersonen als empfindlich und genau, was wiederum sein großes Potenzial als Technologieplattform für den klinischen Einsatz zeigt. In der Tat hatte die NICHT-KHK-Gruppe von Patienten, die in dieser Arbeit untersucht wurden, trotz der Anwesenheit von vielen Symptomen, die typischerweise mit atherosklerotischer Plaque verbunden sind, keine Obstruktion in ihren Arterien.
  • Die PC-Muster, die sich aus dieser Plattform ergeben, stellen einen einzigartigen multivariaten Fingerabdruck dar, der genauer und breiter ist als jene, die unter Verwendung der PCs eines einzelnen Nanopartikels erhalten wurden. Der hier vorgestellte Ansatz kann von großem Wert sein, um nicht nur KHK, sondern auch verschiedene andere menschliche Krankheiten zu erkennen und die Lebensqualität vieler Patienten zu verbessern. Insbesondere aufgrund der Nicht-Invasivität des Tests wird erwartet, dass ein solcher Test bereitwilliger und häufiger als eine Angiographie von Patienten eingesetzt wird. Im Gegensatz zur Angiographie ist dieser Test einfach zu verabreichen und hat keine Nebenwirkungen, so dass Patienten den Zustand der Arterien von den ersten Symptomen an überprüfen und aufgrund der Früherkennung signifikant reduzierte KHK-Komplikationen haben.
  • Verfahren
  • Nanopartikel. Es wurden drei unterschiedlich funktionalisierte Silizium-Partikel von Kisker-Products erworben (https://www.kisker-biotech.com/) und drei unterschiedlich funktionalisierte Polystyrolpartikel von Polyscience, Inc. (http://www.polysciences.com/) erworben. Alle Partikel hatten die gleiche Größe (100 nm). Ihre Morphologie, Durchschnittsgröße, Polydispersitätsindex (PDI) und Zeta-Potential wurden durch TEM-, DLS- und Zeta-Potentialmessungen charakterisiert.
  • Proteinkoronabildung. Die PCs wurden durch Inkubieren von 0,5 mg Nanopartikel in deionisiertem H2O mit dem gleichen Volumen an menschlichem Plasma hergestellt. Die Inkubation wurde bei 37 ° C unter Rühren für 1 Stunde durchgeführt. Unmittelbar nach der Inkubation wurde die Zentrifugation bei 14.000 U/min und 10° C für 30 Minuten durchgeführt, um ein Pellet zu bilden. Als nächstes wurde das Pellet gewaschen und in 200µl Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 4° C suspendiert. Die Zentrifugationsmaßnahmen wurden dreimal unter den gleichen vorherigen Bedingungen wiederholt. Das Pellet der PC-beschichteten Nanopartikel wurde in 8M Harnstoff, 50 mM Ammoniumbicarbonat resuspendiert, um später SDS-PAGE-Gele und LC/MSMS-Analysen durchzuführen, oder in deionisiertem H2O resuspendiert, um später die Größe und das ζ-Potential zu analysieren.
  • Charakterisierung von Nanopartikeln. Die Größe und das ζ-Potential von freiliegendenen und Proteinkorona-beschichteten Nanopartikeln wurden durch Verdünnen von 10 µl jeder Probe in insgesamt 1 ml destilliertem Wasser bestimmt. Die Messungen wurden unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZS90 (Malvern, UK) durchgeführt. Größen- und Oberflächenladungswerte sind als Mittelwert ± S.D. (Standardabweichung) von drei unabhängigen Messungen angegeben.
  • Proteinkonzentrationstest. Die Menge an Proteinen innerhalb der Korona wurde durch ein Bradford-Assay (Bio-rad) unter Verwendung von Rinderserumalbumin bei einer bekannten Konzentration als Standard zum Aufbau einer 5-Punkt-Standardkurve (R2=0.99) bestimmt. Die Proteinkonzentrationen werden als Durchschnitt von drei Experimenten ± S.D aufgenommen.
  • 1D-SDS-PAGE-Gele. Die Proteine in der Korona wurden in 8M Harnstoff, 50 mM Ammoniumbicarbonat gelöst. Es wurde eine gleiche Menge von Laemmli-Puffer 2X zu dem Pellet hinzugefügt und für 5 Minuten bei 90 ° C erhitzt, bevor es auf ein 4-20% Mini-PROTEAN ® TGX TM Precast Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) für 1h bei 120V geladen und aufgelöst wurde. Die Proteine wurden über Nacht mit Coomassie Brilliant Blue (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) gefärbt, gefolgt von einem ausgedehnten Waschen in ultrareinem Wasser.
  • Massenspektrometrie/Statistik/PLS-DA. Die Massenspektrometrie, statistische Analyse und PLS-DA wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
  • BEISPIEL 6. Ein Multi-Nanopartikel-Proteinkorona-Test zur Erkennung der Alzheimer-Krankheit in einem frühen Stadium
  • Die Pathologie der Alzheimer-Krankheit beginnt Jahrzehnte vor dem Nachweis klinischer Symptome. Die Notwendigkeit einer genauen und nicht-invasiven Früherkennung der Alzheimer-Krankheit nimmt rapide zu. Um dieses Problem anzugehen, wurde ein hochmodernes Sensor-Array-Nanosystem entwickelt, das winzige Veränderungen von Plasmaproteinmustern erfolgreich erkennt und Clustering-Techniken zur Bestimmung der Alzheimer-Krankheit einsetzt. Die entwickelte Technologie kann auch in der Zukunft zur Diagnose anderer Krankheiten verwendet werden, da das Sensor-Array einzigartige Fingerabdrücke für jede Veränderung des Plasmaproteoms aufgrund von Krankheiten erzeugt und empfindlich genug ist, um solche Änderungen im Gegensatz zu derzeitigen Technologien zu erfassen.
  • Wie in den vorherigen Beispielen erläutert, ändert sich die Zusammensetzung von PCs basierend auf dem Plasma-Proteom, das als eine Folge von Krankheit verändert werden kann, was zu „personalisierten Proteinkoronen“ (PPCs) führt. Die PPCs können jedoch keine robuste und präzise Möglichkeit zur Früherkennung von Krankheiten bereitstellen, hauptsächlich aufgrund der großen Überlappung der ähnlichen Proteine in der Proteinkorona-Zusammensetzung. In dieser Studie wurde mithilfe der PPCs, die sich um eine Multi-NP-Plattform mit sechs Nanopartikeln gebildet haben, ein Fingerabdruckmuster für den robusten und präzisen Nachweis von AK mit beispielloser Vorhersagegenauigkeit und -spezifität bereitgestellt. Der entwickelte Sensor-Array-Test unterscheidet erfolgreich zwischen Patienten mit und ohne AK (Alzheimer-Demenz) sowie Patienten, die einige Jahre später eine AK entwickelten (unter Verwendung von Kohortenplasmen). Diese Beispiele stellen eine durchführbare, nicht-invasive Alternative zur derzeitigen AK-Erkennung dar, die es ermöglicht, eine beispiellose Früherkennung und Behandlung bereitzustellen.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Sensor-Array-Test besteht aus der Inkubation von Plasmaproben mit 6 verschiedenen Nanopartikeln. Letztere sind 100 nm große Polystyrol- und Silizium-Nanopartikel, jeweils mit einstellbaren Oberflächenchemien (einfach, mit Amino und Carboxyl konjugiert, die hier im Folgenden als P, P-NH 2, P-COOH, S, S-NH 2, S-COOH bezeichnet werden) und einer engen Größenverteilung, wie dies in Beispiel 5 für die KHK-Analyse beschrieben ist. Als erster Machbarkeitsnachweis wurden die Größe, Oberflächenladung und Morphologie der Nanopartikel vor und nach der PC-Bildung untersucht, um nach Unterschieden zwischen AK- und Kontrollplasma zu suchen. Es wurde eine Nanopartikel-Tracking-Analyse (Nanosight) zur Charakterisierung der Größe der Nanopartikel angewendet. Während einer solchen Analyse beleuchtet ein Laserstrahl die Nanopartikel, aus denen das gestreute Licht durch ein optisches Mikroskop sichtbar gemacht wird. Währenddessen wird ein Video von einer Kamera aufgenommen, die auf den Strahl ausgerichtet ist und die Bewegung der Nanopartikel zeigt (30-60 Frames/Sek.). Vor der Inkubation im Plasma waren alle Nanopartikel homogen in der Größe (58, die Polystyrol-Nanopartikel 90-100 nm, die Siliciumdioxid-Nanopartikel 80-100 nm) mit einer negativen Oberflächenladung, die mit den vom Hersteller bereitgestellten übereinstimmt (Tabelle 8). Nach 1 Std. Inkubation bei 37 ° C unter Rühren im Plasma wurden die PC-beschichtete Nanopartikel durch Zentrifugation gewonnen, gefolgt von umfangreichen Waschvorgängen, um ungebundene und lose anhaftende Proteine zu entfernen. In allen Fällen wurde eine Zunahme der Größe von PC-beschichteten Nanopartikeln und eine breitere Größenverteilung gezeigt, was auf eine weniger homogene Population hinweist (54, Streudiagramm). Die durchschnittliche Zunahme der Größe betrug 30 nm, was eine Dicke der PC-Schicht von 15 nm anzeigt, was mit den in der Literatur 1 berichteten Daten und mit dem, was unter Verwendung von Plasma von gesunden Freiwilligen beobachtet wurde, übereinstimmt (die Daten sind nicht gezeigt). Das Vorhandensein von Plasmaproteinen auf der Oberfläche der Nanopartikel induzierte eine Änderung ihrer Ladung, die weniger negativ wurde und die für die Plasmaproteine typischen Werte erreichte (-20 mV bis -0 mV in Tabelle 8). Tabelle 8: Zeta-Potentiale von Nanopartikeln, die frei sind oder nach einem Kontakt mit Plasma.
    Zeta-Potenziale (mV) Freie Nanopartikel Gesundes Plasma AK-Plasma
    P -42.27 ± 0.54 -20.36 ± 1.54 -26.56 ± 2.14
    P-NH2 -27.57 ± 1.63 -29.81 ± 1.55 -30.62 ± 0.74
    P-COOH -49.38 ± 1.1 -34.87 ± 0.78 -27.02 ± 0.71
    S -53.72 ± 1.05 -23.22 ± 1.55 -21.23 ± 0.54
    S-NH2 -46.44 ± 0.86 -24.26 ± 0.95 -21.21 ± 0.38
    S-COOH -56.77 ± 0.14 -28.37 ± 0.87 -25.69 ± 1.31
  • Es wurden leichte Unterschiede in der Oberflächenladung des gleichen Nanopartikels, das mit AK-Plasma und gesundem Plasma inkubiert wurde, beobachtet (Tabelle 8). Diese Unterschiede waren jedoch nicht wesentlich und daher für die Unterscheidung zwischen verschiedenen Plasmabedingungen nicht geeignet. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde auch dazu verwendet, um die Morphologie von Nanopartikeln zu bewerten, die nach der PC-Bildung unverändert blieben. In der Tat hatten sowohl vor als auch nach der Inkubation mit Plasma alle Nanopartikel eine runde homogene Form (55). Es wurde das Vorhandensein einer dünnen Proteinschicht, die mit einer Zunahme der Größe von PC-beschichteten Nanopartikeln verbunden ist, durch die von Nanosight erhaltenen Ergebnisse bestätigt (55).
  • Die mit den Partikeln assoziierten PCs wurden durch eine Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgelöst und später durch Färbung mit Coomassie Brilliant Blue (56) sichtbar gemacht. Im Allgemeinen hatten die 6 Nanopartikel durch die visuelle Auswertung der Bahnen unterschiedliche PC-Muster, was für die besten Leistungen dieses Ansatzes erwartet wurde und erwünscht war. Die Silizium-Nanopartikel schienen weniger Proteine auf ihrer Oberfläche zu adsorbieren als die Polystyrol-Nanopartikel. In den meisten Proben war das PC von einfachem Polystyrol stärker angereichert mit Proteinen als andere bei einem Molekulargewicht von etwa 60 kDa, das höchstwahrscheinlich auf Albumin zurückzuführen ist. Dies galt sowohl für das Plasma der AK-Patienten als auch für das Kontrollplasma ( 56, Pfeile). Die densitometrische Analyse der mit jedem PC assoziierten Bereiche bestätigte, dass die Silizium-Nanopartikel im Allgemeinen geringere Mengen an Proteinen adsorbieren, jedoch auch, dass eine höhere Anzahl von Proteinen ihre PCs bildet: So ist zum Beispiel mehr als ein Bereich in Höhe von Albumin für Polystyrol-Nanopartikel-PC vorhanden (56, Pfeile). Auf der anderen Seite wurden mehrere Unterschiede in den PPC-Profilen von AK-Patienten und gesunden Einzelpersonen festgestellt, insbesondere im Fall von Siliciumdioxid-Nanopartikeln (56, Pfeile). Diese Unterschiede waren jedoch nicht statistisch signifikant und nicht ausreichend, um zwischen den beiden untersuchten Patientengruppen genau zu unterscheiden. Um die PCs genauer zu untersuchen und die genaue Identität und Menge der Proteine zu kennen, die die verschiedenen PCs bilden, wurden alle Proben durch Massenspektrometrie analysiert. Es wurde eine spektral-zählende labelfreie Analyse, die für das quantitative Profiling der PCs um die Nanopartikel weit verbreitet ist 2-4, verwendet, um den prozentualen Beitrag jedes Proteins in den PCs zu bestimmen. Diese Berechnung wurde sechs Mal für jeden Plasmapatienten durchgeführt (getrennt mit jedem Nanopartikel inkubiert), was die Bildung eines AK-spezifischen PC-Profils ermöglichte, das aus der Kombination des Beitrags der PCs für sechs Nanopartikeln abgeleitet wurde. Tabelle 9 beschreibt die verwendete Patientenpopulation. Tabelle 9: Informationen der Patienten, von denen in diesem Beispiel das Plasma verwendet wurde.
    Label Patienten-Nr. Fall-ID Alter bei Exzision Geschlecht Größe (cm) Gewicht (kg) BMI Jahr der Exzision Klinische Diagnose (Patient)
    A 1 104668 90+ W 157 70 28.4 2016 Hysterektomie (1960), Alzheimer-Krankheit (2015)
    B 2 104663 87 M 165 49 18 2016 Alzheimer-Krankheit (2016)
    C 3 104664 79 W 160 60 23.44 2016 Alheimer-Krankheit (2016)
    D 4 104662 87 W 2016 Alzheimer-Krankheit (2014)
    E 5 104666 83 M 180 92 28.4 2016 Alheimer-Krankheit (2016)
    F 6 104659 89 W 160 72 28.13 2016 Alzheimer-Krankheit (2015)
    G 7 104667 77 M 173 72 24.06 2016 Alzheimer-Krankheit (2016)
    H 8 104658 70 M 173 70 23.39 2016 Alzheimer-Krankheit (2016)
    I 9 104660 85 M 188 72 20.37 2016 Alheimer-Krankheit, Alzheimer-Demenz (2016)
    K 10 104657 73 M 152 84 36.36 2016 Alzhaimer-Krankheit (2009) Radikulopathie, Halsschlagader-Stenose
    L 11 56393 83 W 170 69 23.88 2009 Vorhofflimmern (1999), Hypothyreose, virale Enzephalitis (1934) Fraktur des linken Fußes (1991), Beckenringfraktur (1978), Hysterektomie (1999), Katarakt (1999), Alzheimer-Krankheit (2009)
  • Fazit
  • Diese Arbeit stellt eine Proof-of-Concept-Studie für die Entwicklung eines MNPC-Bluttests für die Diagnose von AK dar. Der MNPC-Test zeigte eine beispiellose Vorhersagegenauigkeit und Spezifität. Während einzelne blutbasierte Tests auf Biomarkern häufig mit falsch-positiven Ergebnissen verbunden sind und daher weitere Analysen zur Bestätigung der Diagnose erfordern, erfasst dieser Ansatz hier die Wechselwirkungen aller hochaffinen Proteine mit dem Satz von 6 Nanopartikeln und ermöglicht so die Erstellung eines hoch spezifischen PC-Fingerabdrucks einer bestimmten Krankheit. Die Nanopartikel wirken als Nano-Konzentrator von Plasmaproteinen auf ihrer Oberfläche (jedes Nanopartikel konzentriert die Plasmaproteine mit einer höheren Affinität hin zu seiner Oberfläche): Dies hilft bei der Entdeckung von Proteinen, deren Spiegel sich in pathologischen Zuständen in Bezug auf einen gesunden Zustand nur geringfügig verändern. Diese kleinen Veränderungen können sowohl zu Plasmaproteinen mit hoher Abundanz als auch mit geringer Abundanz gehören. In dieser Studie hier wird über eine relativ kleine Anzahl von Patienten berichtet, da das Plasma jedes Patienten 6 Mal unter Verwendung verschiedener Nanopartikel analysiert wurde, und so sind die für jeden Patienten erhaltenen Ergebnisse 6-mal spezifischer als bei einer einzelnen Analyse.
  • Materialien und Verfahren
  • Nanopartikel. Die Silikapartikel (einfach, Amino- und Carboxyl-konjugiert) wurden von Kisker-Products (https://www.kisker-biotech.com/) erworben. Die Polystyrol-Partikel (einfach, Amino- und Carboxyl-konjugiert) wurden von Polyscience, Inc. (http://www.polysciences.com/) erworben. Laut Hersteller hatten alle Partikel die gleiche Größe (90-100 nm). Ihre Morphologie, Durchschnittsgröße und ihr Zeta-Potential wurden wie später in diesem Abschnitt beschrieben charakterisiert.
  • Personalisierte Proteinkoronabildung.
  • Die PCs wurden durch Inkubieren von 0,5 mg Nanopartikeln in deionisiertem H2O mit dem gleichen Volumen an menschlichem Plasma erzeugt. Die Inkubation wurde bei 37° C unter Rühren für 1 Stunde durchgeführt. Unmittelbar nach der Inkubation wurden die PC-beschichteten Nanopartikel durch Zentrifugation (14.000 U/min und 10° C für 30 Minuten) und ausgiebigem Waschen in kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zum Entfernung ungebundener oder schwach gebundener Proteine gewonnen. Das Pellet von PC-beschichteten Nanopartikeln wurde in 8M Harnstoff, 50 mM Ammoniumbicarbonat für SDS-PAGE-Gele und LC/MSMS-Analyse oder in entionisiertem H2O für dynamische Lichtstreuung und ζ-Potentialanalysen resuspendiert.
  • Physikalisch-chemische Charakterisierung der Nanopartikel. Die Größe wurde mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (Nanosight, Malvern, UK) gemessen. Die Software berechnet die Größe nach ζ-Potential von freiliegendenen und PC-beschichteten Nanopartikeln mit einem Zetasizer Nano ZS90 (Malvern). Die Nanopartikel wurden vor der Analyse in Wasser auf eine Konzentration von 50 µg/ml verdünnt. Die Größen- und Oberflächenladungswerte sind als Mittelwert ± Standardabweichung von drei unabhängigen Messungen angegeben. Für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden Proben und Gitter mit 1% Uranylacetat gelabelt. Es wurde ein Tecnai G2 Spirit BioTWIN-Transmissionselektronenmikroskop mit einer AMT 2k-CCD-Kamera verwendet.
  • Eindimensionale Gelelektrophorese. Die personalisierten Proteinkoronen wurden in 8M Harnstoff, 50 mM Ammoniumbicarbonat gelöst. Es wurde eine gleiche Menge von Laemmli-Puffer 2X zu dem Pellet hinzugefügt und für 5 Minuten bei 90° C erhitzt, bevor es auf ein 4-20% Mini-PROTEAN ® TGX TM Precast Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) für 1h bei 120V geladen und aufgelöst wurde. Die Proteine wurden über Nacht mit Coomassie Brilliant Blue (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) gefärbt, gefolgt von einem ausgiebigen Waschen in ultrareinem Wasser. Die densitometrische Analyse der Bandenintensitäten wurde von ImageJ durchgeführt (Website: imagej.nih.gov/ij/).
  • Proteinidentifikation und -quantifizierung durch Massenspektrometrie. Die Proteine wurden mit 10 mM Dithiothreitol (Sigma) für 1 Stunde bei 56° C reduziert und dann mit 55 mM Iodacetamid (Sigma-Aldrich, St. Loius, MO, USA) für 1 Stunde bei 25° C im Dunkeln alkyliert. Die Proteine wurden dann mit modifiziertem Trypsin (Promega, Madison, WI, USA) bei einem Enzym/Substrat-Verhältnis von 1:50 in 100 mM Ammoniumacetat, pH 8,9, bei 25°C über Nacht verdaut. Die Trypsinaktivität wurde durch Zugabe von Essigsäure (99,9%, Sigma-Aldrich) auf eine Endkonzentration von 5% gestoppt. Die Peptide wurden unter Verwendung von C18 SpinTips (Protea, Morgantown, WV) entsalzt, dann vakuumzentrifugiert und bis zum Tag der Analyse bei -80° C gelagert. Die Peptide wurden durch Umkehrphasen-Chromatographie (HPLC) (Thermo Fisher, Waltham, MA Easy nLC1000) unter Verwendung einer Vorsäule (hergestellt im Haus, 6 cm of 10 µm C18) und einer selbstpackenden 5 µm -Spitzen-Analysesäule (12 cm of 5 µm C18, Neues Ziel) über einen 140-minütigen Gradienten vor einem Nano-Elektrospray mit einem QExactive Massenspektrometer (Thermo Fisher) getrennt. Das Lösungsmittel A war 0,1% Ameisensäure und das Lösungsmittel B war 80% MeCN/0,1% Ameisensäure. Die Gradientenbedingungen waren 2-10% B (0-3 min), 10-30% B (3-107 min), 30-40% B (107-121 min), 40-60% B (121-126 min), 60-100% B (126-127 min), 100% B (127-137 min), 100-0% B (137-138 min), 0% B (138-140 min) und das Massenspektrometer wurde in einem datenabhängigen Modus betrieben. Die Parameter für die Voll-Scan-MS waren: Auflösung von 70.000 über 350-2000 m/z, AGC 3e6 und maximale IT 50 ms. Dem vollständigen MS-Scan ist eine MS/MS für die oberen 10 Vorläuferionen in jedem Zyklus mit einer NCE von 28 und einem dynamischen Ausschluss von 30 s gefolgt. Die Rohdatenspektraldatendateien (.raw) wurden mit Proteome Discoverer (Thermo Fisher) und Mascot Version 2.4.1 (Matrix Science) durchsucht. Die Mascot-Suchparameter waren: 10 ppm Massentoleranz für Vorläuferionen, 15 Millimasseneinheiten (mmu) für die Fragment-Ionen-Massentoleranz, 2 verpasste Spaltungen von Trypsin, die feste Modifikation war eine Carbamidomethylierung von Cystein, die variablen Modifikationen war eine Methioninoxidation. Es wurden nur Peptide mit einem Mascot-Score ≥ 25 wurden in die Datenanalyse einbezogen. Das spektrale Zählen wurde durchgeführt, indem die Gesamtzahl der für die Fragmentierung jedes Proteins ausgewählten Peptide summiert wurde.
  • BEISPIEL 7. Die Größe der Partikel beeinflusst die Menge an gebundenem Protein
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Verwendung von Nanopartikeln unterschiedlicher Größe, die aus dem gleichen Material hergestellt sind, einen unterschiedlichen biomolekularen Fingerabdruck für jede Größe bereitstellen. Es wurden Silizium-Nanopartikel mit drei verschiedenen Durchmessern (100nm (0.1 µm), 3 µm and 4 µm) mit der gleichen Plasmaprobe inkubiert. Die Kügelchen wurden durch SDS-PAGE analysiert. Wie in 58 dargelegt, sind umso mehr Proteine in der Biomolekül-Signatur enthalten, je größer die Kügelchen sind. Außerdem hat jede Kügelchengröße eine unterschiedliche Biomolekülkorona-Signatur und daher ermöglicht allein die Kombination verschiedener Größen von Nanopartikeln die Entwicklung eines unterschiedlichen Biomolekül-Fingerabdrucks. Wie gezeigt, gibt es deutliche Unterschiede in dem Muster oder den Proteinen zwischen den drei unterschiedlich großen Kügelchen.
  • Ein Sensor-Array kann unter Verwendung von Nanopartikeln unterschiedlicher Größe hergestellt werden, die jeweils einen unterschiedlichen biomolekularen Fingerabdruck ergeben.
  • BEISPIEL 8: Sensor-Array kann einen Biomolekül-Fingerabdruck bereitstellen, der Nukleinsäuren umfasst
  • Das Sensor-Array und die assoziierte Biomolekülkorona-Signatur zusammen mit den Proteinen enthält Nukleinsäuren, die die Biomolekülkorona bilden. Dieses Beispiel zeigt die Zusammensetzung von Nukleinsäuren, die sich an Siliciumdioxid-Nanopartikel mit neutralen Oberflächen-Nanopartikeln binden. Die Nanopartikel wurden mit Plasma inkubiert und es wurden die assoziierten Nukleinsäuren analysiert (59). Die 60 und 61 zeigen die Analyse der Nukleinsäure in allen Proben und ihren Gehalt im Plasma (die Nukleinsäuremenge im Plasma betrug 33,8 pg/µl). Es wurde der Nucleinsäuregehalt der mit den Nanopartikeln assoziierten Biomolekülkoronen analysiert. Entweder wurden die Proteine mit Harnstoff aus Nanopartikeln dissoziiert und anschließend die Nukleinsäuren analysiert (62, Nukleinsäuremenge 14,0) oder die Proteine nicht von der Korona dissoziiert und die Nukleinsäuren analysiert (63, 14,4 pg/µl). Alternativ dazu, können die Nanopartikel mit Nukleinsäuren inkubiert werden, die mit einem Plasma-Kit aus dem Plasma aufgereinigt und dann mit den freiliegendenen Partikeln inkubiert wurden (64, Nukleinsäuremenge 13,2 pg/gl).
  • Die Ergebnisse zeigten die Fähigkeit von Nanopartikeln bei der Adsorption von Nukleinsäure in der biomolekularen Korona-Zusammensetzung.
  • Bezugszeichenliste
    • 1 Proteinkorona-Muster-Ansatz für Krebserkennung Von links nach rechts: Plasma von Probanden wird gesammelt. Die Proteinkorona-Bildung ist einzigartig zu den physikochemischen Eigenschaften der Nanopartikel. Verschiedene Krankheiten haben eine einzigartige Proteinkorona-Zusammensetzung. Maschinenlernen identifiziert die wichtigen Proteine. Statistische Analyse validiert die Maschinenlernen-Ergebnisse.
    • 2C Klassifikation identifizierter Korona-Proteine Von links nach rechts: Kontrolle, Glioblastom, Meningiom, Lunge, Pankreas, Myelom. Von oben nach unten: anionisch, neutral, kationisch.
    • 13 Beispiele von Sensor-Array-Elementen Von links nach rechts: (1) Liposomen: Verschiedene Oberflächenspannungen/Funktionalisierungen, verschiedene Größen, verschiedene Lipid-Zusammensetzungen und Konjugationen z.B. Cholesterol. (2) Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel mit verschiedenen Oberflächenspannungen/Funktionalisierungen (3) Gold-Nanopartikel, verschiedene Oberflächenspannungen/Funktionalisierungen, verschiedene Größen, verschiedene Formen.
    • 14 Bildung der Protein-Korona In vitro/ex vivo: Die Partikel werden mit Serum, Plasma und/oder biologische Flüssigkeiten des Patienten inkubiert. Die koronabeschichteten Partikel werden gesammelt und gelagert. In vivo: Die Partikel werden in einen Modellorganismus injiziert. Die koronabeschichteten Partikel werden gesammelt.
    • 15A Konjugation von Nanoobjektmaterialen an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten. Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 15B. Konjugation von Nanoobjektmaterialen an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 16A. Protein-Korona-Sensor-Array-Chips mit Nanokrümmung Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 16B. Protein-Korona-Sensor-Array-Chips mit Nanokrümmung Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 17A. Konjugation von Nanoobjektmaterialien an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten). Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 17B. Konjugation von Nanoobjektmaterialien an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposome), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 18A. Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro-/Nano-Fluid-Chips mit Nanokrümmungen Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 18B. Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro/Nano-Fluid-Chips mit Nanokrümmungen Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 19A. Konjugation von zufällig angeordneten Nano-Objektmaterialien an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten). Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 19B. Konjugation von zufällig angeordneten Nano-Objektmaterialien an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 20A. Protein-Korona-Sensor-Array-Chips mit zufällig angeordneten Nanokrümmungen Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 20B. Protein-Korona-Sensor-Array-Chip mit zufällig angeordneten Nanokrümmungen Rechts von oben nach unten: Substrate (z.B. Silizium und Gold), verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 21A. Konjugation von zufällig geordneten Nanoobjektmaterialien an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten). Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 21B. Konjugation von zufällig angeordneten Nanoobjektmaterialien an Substrate Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen), Linker zwischen Nanopartikeln und Substraten (z. B. Polymere mit Thiolgruppen und Klick-Chemie-Komponenten). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 22A. Protein-Korona-Sensor-Arrays Mikro/Nano-Fluidik-Chips mit zufällig angeordneten Nanokrümmungen Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), Unterschiedliche Nanopartikel-Typen (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Ganz rechts: Vor Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 22B. Protein-Korona-Sensor-Array-Mikro/Nano-Fluid-Chips mit zufällig angeordneten Nano-Krümmungen Rechts von oben nach unten: Substrate mit Mikro-/Nano-Kanälen (z.B. Silizium und Gold), Verschiedene Korona-beschichtete Nanopartikel (z.B. Gold, Silizium, Polystyrol, Eisenoxid und Liposomen). Nach Wechselwirkung mit Plasma-Proteinen.
    • 41. Analyse-Ansätze Von links nach rechts: Dissoziation von Proteinen der Arrays. Protein-Analyse (z.B. LC-MS/MS). Analyse der Protein-Korona-Sensor-Array-Daten mit überwachten und unüberwachten Ansätzen zur Erkennung und Unterscheidung von Krankheiten.
    • 42. Sensor-Array mit Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Funktion Es könnten unterschiedliche Arten von Fluoreszenz- und Lumineszenz-Nanopartikel (entweder mit intrinsischer oder mit Farbstoffmarkierung) genutzt werden.
    • 43. Sensor-Array mit Fluoreszenz- oder Lumineszenz-Funktion Es könnten unterschiedliche Arten von Fluoreszenz- und Lumineszenz-Nanopartikel (entweder mit intrinsischer oder mit Farbstoffmarkierung) zum Auslesen genutzt werden.
    • 44D. TEM-Bildgebung Morphologische und strukturelle Charakterisierung von blanken NPs, die mit Uranylacetat gefärbt werden. In diesem Beispiel wurde menschliches gesundes Plasma verwendet.
    • 45D. TEM-Bildgebung Morphologische und strukturelle Charakterisierung von blanken NPs, die mit Uranylacetat gefärbt werden. In diesem Beispiel wurde menschliches gesundes Plasma verwendet.
    • 58. SDS-PAGE Analyse Links: Von Silizium NPs mit (0,1. 3,4 µm) Durchmesser wurde das gleiche Volumen angereichert. Es wurden zwei unterschiedliche Zentrifugationsprotokolle für Nano- und Makropartikel verwendet. Rechts: Von Silizium NPs mit (0,1. 3, 4 µm) Durchmesser wurde die gleiche Menge (10 µg) angereichert, nachdem die Gesamtproteinkonzentration durch den Bradford-Test bestimmt wurde.
    • 59. Nukleinsäuren in der biomolekularen Korona Es wurde von gesundem menschlichen Plasma isolierte DNA als Kontrolle verwendet. Die Wirkungen der Nukleinsäuren auf die NP-Oberfläche wurden unter Verwendung von drei verschiedenen, in der Figur beschriebenen, Protokollen analysiert. NP: Nanopartikel (Silizium), BK: Biomolekulare Korona, DNA-Isolations-Kit: ab156893 DNA-Isolations-Kit - Plasma/Serum - Abcam.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (60)

  1. Sensor-Array mit einer Mehrzahl von Sensorelementen, wobei die Mehrzahl von Sensorelementen sich in wenigstens einer physikochemischen Eigenschaft voneinander unterscheiden, wobei die Mehrzahl von Sensorelementen wenigstens zwei Sensorelemente aufweist, und wobei jedes Sensorelement dazu in der Lage ist, zum Erzeugen einer Biomolekülkorona-Signatur eine Mehrzahl von Biomolekülen in einer Probe zu binden, wobei jedes Sensorelement eine von den anderen verschiedene Biomolekülkorona-Signatur aufweist.
  2. Sensor-Array nach Anspruch 1, wobei die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Biomolekülkorona-Signaturen erzeugt, wenn sie von der Probe kontaktiert werden, wobei die Kombination der Mehrzahl von Biomolekülkorona-Signaturen einen Biomolekül-Fingerabdruck für die Probe erzeugt.
  3. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Biomolekülkorona-Signatur wenigstens ein Protein, wenigstens ein Polypeptid, wenigstens ein Lipid, wenigstens ein Metabolom, wenigstens ein Oligonukleotid oder eine Kombination davon aufweist.
  4. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei ein erstes Sensorelement eine erste Biomolekülkorona und ein zweites Sensorelement eine zweite Biomolekülkorona erzeugt, wenn das Sensor-Array mit der Probe in Kontakt gebracht wird.
  5. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die wenigstens eine physikochemische Eigenschaft aus einer Gruppe bestehend aus Zusammensetzung, Größe, Oberflächenladung, Hydrophobie, Hydrophilie, Oberflächenfunktionalität, Oberflächentopographie und Form ausgewählt ist.
  6. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Sensor-Array ferner ein Substrat aufweist.
  7. Sensor-Array nach Anspruch 6, wobei die Sensorelemente kovalent mit dem Substrat verbunden sind.
  8. Sensor-Array nach Anspruch 6, wobei die Sensorelemente nicht-kovalent mit dem Substrat verbunden sind.
  9. Sensor-Array gemäß einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei sich das Substrat in einem bestimmten Muster an die Mehrzahl von Sensorelementen bindet.
  10. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Partikeln ist.
  11. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Partikeln ist, die auf einem Substrat festgelegt sind.
  12. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Sensorelemente organische Partikel, nicht-organische Partikel oder eine Zusammensetzung davon sind.
  13. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Sensorelemente Partikel sind und die Partikel ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus Nanopartikeln, Mikropartikeln, Mizellen, Liposomen, Eisenoxid, Graphen, Siliciumdioxid, proteinbasierten Partikeln, Polystyrol-, Silber- und Goldpartikeln, Quantenpunkten und deren Kombination.
  14. Sensor-Array nach Anspruch 13, wobei die Partikel Liposome sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerin), DOTAP (1,2-Dioleiyl-3-trimethylammonium-propan) - DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin), CHOL (DOPC-Cholesterin) und Kombinationen davon.
  15. Sensor-Array gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Halbpartikeln unterschiedlicher Formen aufweist, die durch ein Formgebungsverfahren hergestellt sind.
  16. Sensor-Array nach Anspruch 15, wobei die Mehrzahl von Halbpartikeln in einer Form vorliegen, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Kugeln, Stäben, Würfeln und Kombinationen davon.
  17. Sensor-Array gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Mehrzahl von Sensorelementen eine Mehrzahl von Halbpartikeln mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften (z.B. Kugeln, Stäbe und Würfel) aufweist, die durch 3-D-Druck gefertigt sind.
  18. Sensor-Array nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Sensor-Array wenigstens 2 bis wenigstens 100 Sensorelemente aufweist.
  19. Sensor-Array gemäß einem der Ansprüche 2 bis 18, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck einer Krankheit oder Störung assoziiert ist.
  20. Sensor-Array nach Anspruch 19, wobei die Krankheit oder Störung Krebs, eine kardiovaskuläre Erkrankung, eine endokrine Erkrankung, eine entzündliche Erkrankung oder eine neurologische Erkrankung ist.
  21. Sensor-Array nach Anspruch 20, wobei die Krankheit Krebs ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lungenkrebs, Pankreaskarzinom, einem Myelom, myeloischer Leukämie, einem Meningiom, einem Glioblastom, Brustkrebs, einem Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, einem Adenokarzinom des Magens, Prostata-, Blasen-, Eierstock-, Schilddrüsen- und Neuroendokrinekrebs.
  22. Kit zum Diagnostizieren oder Prognostizieren einer Krankheit oder Störung, wobei der Kit aufweist: ein Sensor-Array gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21.
  23. Kit zum Bestimmen und/oder Erfassen von wenigstens einem Biomarker, der einer Krankheit oder Störung assoziiert ist, aufweisend wenigstens ein Sensor-Array nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
  24. Sensor-Array nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Krankheit eine koronare Herzkrankheit (KHK) ist.
  25. Sensor-Array nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Krankheit eine neurologische Krankheit ist.
  26. Sensor-Array nach Anspruch 25, wobei die Krankheit die Alzheimer-Krankheit ist.
  27. Sensor-Array, aufweisend eine Mehrzahl von Partikeln mit Oberflächen, die unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften aufweisen, wobei sich Proteine einer komplexen biologischen Probe an die Mehrzahl von Partikeln binden, wenn die komplexe biologische Probe der Mehrzahl von Partikeln ausgesetzt wird, wobei ein Bindungsmuster der Proteine aus der Mehrzahl von Partikeln von der physikochemischen Eigenschaft einer Oberfläche des Partikels abhängt.
  28. Sensor-Array nach Anspruch 27, wobei die komplexe biologische Probe Proteine und Nukleinsäuren und wenigstens eines von Lipiden und Polysacchariden aufweist.
  29. Sensor-Array nach Anspruch 28, wobei die komplexe biologische Probe Plasma ist.
  30. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei die Proteine, die sich an die Mehrzahl von Partikeln binden, einen Biomolekül-Fingerabdruck der komplexen biologischen Probe definieren.
  31. Sensor-Array nach Anspruch 30, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck einem biologischen Zustand eines Probanden assoziiert ist, der die komplexe biologische Probe bereitstellt.
  32. Sensor-Array nach Anspruch 31, wobei sich der Biomolekül-Fingerabdruck von einem zweiten Biomolekül-Fingerabdruck einer komplexen biologischen Probe eines zweiten Probanden unterscheidet, der den biologischen Zustand nicht ausdrückt.
  33. Sensor-Array nach Anspruch 32, wobei der biologische Zustand ein Krankheitszustand des Probanden ist.
  34. Sensor-Array nach Anspruch 33, wobei der Proband keine körperlichen Symptome einer Krankheit oder Störung zeigt, die dem Krankheitszustand assoziiert sind.
  35. Sensor-Array nach Anspruch 33, wobei der Proband mit einer Erkrankung oder Störung diagnostiziert wird, die dem Krankheitszustand assoziiert ist.
  36. Sensor-Array nach Anspruch 34 oder 35, wobei der Krankheitszustand wenigstens einer von Krebs, einer kardiovaskulären Erkrankung, einer endokrinen Erkrankung, einer entzündlichen Erkrankung oder einer neurologischen Erkrankung ist.
  37. Sensor-Array nach Anspruch 36, wobei der Krankheitszustand Krebs ist und die Krebsart ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Lungenkrebs, Pankreaskarzinom, Darmkrebs, Myelom, myeloische Leukämie, Meningiom, Glioblastom, Brustkrebs, Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, Magenadenokarzinom, Prostata-, Blasen- Ovarial-, Schilddrüsen-, neuroendokrinen Krebs und Kombinationen davon.
  38. Sensor-Array nach Anspruch 37, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck der Probe bezeichnend ist für die Krebsart.
  39. Sensor-Array nach Anspruch 36, wobei der Krankheitszustand eine neurologische Krankheit ist und die neurologische Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Alzheimer-Krankheit, Gehirntumoren, Epilepsie, Parkinson-Krankheit, ALS, arteriovenöse Malformation, zerebrovaskuläre Erkrankung, Hirnaneurysmen, Epilepsie, multiple Sklerose, periphere Neuropathie, Post-Herpes-Neuralgie, Schlaganfall, frontotemporale Demenz, demyelinisierende Krankheit, multiple Sklerose, Devic-Krankheit, zentrale pontine Myelinolyse, progressive multifokale Leukoenzephalopathie, Leukodystrophien, Guillain-Barre-Syndrom, fortschreitende inflammatorische Neuropathie, Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, chronische entzündliche demyelinisierende Polyneuropathie, und anti-MAG-periphere Neuropathie.
  40. Sensor-Array nach Anspruch 39, wobei der Krankheitszustand eine neurologische Krankheit ist und die neurologische Erkrankung die Alzheimer-Krankheit ist.
  41. Sensor-Array nach Anspruch 39 oder 40, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck der Probe bezeichnend ist für die neurologische Erkrankung.
  42. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 27 bis 41, wobei die Oberflächen der Mehrzahl von Partikeln Liposomen aufweisen.
  43. Sensor-Array nach Anspruch 42, wobei die Liposomen feste Lipide aufweisen.
  44. Sensor-Array nach Anspruch42, wobei die Liposomen wenigstens eines von DOPG (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerin), DOTAP (1,2-Dioleiyl-3-trimethylammonium-propan), DOPE (Dioleoylphosphatidylethanolamin), CHOL (DOPC-Cholesterin) und Kombinationen davon aufweisen.
  45. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 42 bis 44, wobei eine lipidbasierte Oberfläche jedes Liposoms die Proteine der komplexen biologischen Probe an einer Lipid-Protein-Grenzfläche kontaktiert, wodurch die Proteine an das Liposom gebunden werden.
  46. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 27 bis 45, wobei die Mehrzahl von Partikeln Nanopartikel aufweist.
  47. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 27 bis 45, wobei die Mehrzahl von Partikeln Kügelchen aufweist.
  48. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 27 bis 47, wobei die Mehrzahl von Partikeln mit einem Substrat konjugiert ist.
  49. Sensor-Array nach Anspruch 48, wobei die Mehrzahl von Partikeln kovalent an das Substrat gebunden ist.
  50. Sensor-Array nach Anspruch 48, wobei die Mehrzahl von Partikeln nicht-kovalent an das Substrat gebunden ist.
  51. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 27 bis 50, wobei die verschiedenen physikochemischen Eigenschaften wenigstens eines von Oberflächenladung, Zusammensetzung, Größe, Hydrophobie, Hydrophilie, Oberflächenfunktionalität, Oberflächentopographie und Form umfassen.
  52. Sensor-Array nach einem der Ansprüche 30 bis 51, wobei die Mehrzahl von Partikeln ferner wenigstens eines von einem Lipid, einer Nukleinsäure oder einem Polysaccharid binden.
  53. Sensor-Array nach Anspruch 52, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck ferner ein Vertreter ist für das wenigstens eine Lipid, Nukleinsäure oder Polysaccharid, das sich an die Mehrzahl von Partikeln bindet.
  54. Sensor-Array, aufweisend eine Mehrzahl von Liposomen, wobei sich die Mehrzahl von Liposomen in wenigstens einer Proteinbindungseigenschaft unterscheiden, die durch eine lipidbasierte Oberfläche jedes Liposoms definiert ist, wobei die lipidbasierte Oberfläche jedes Liposoms eine Teilmenge von Proteinen einer Probe an einer Lipid-Protein-Grenzfläche kontaktiert, wodurch die Teilmenge von Proteinen zum Erzeugen eines Proteinbindungsmusters gebunden wird, wobei sich das Proteinbindungsmuster eines ersten Liposoms von dem Proteinbindungsmuster eines zweiten Liposoms unterscheidet, das sich von dem ersten Liposom in zumindest der einen Proteinbindungseigenschaft unterscheidet.
  55. Sensor-Array nach Anspruch 54, wobei die Proteine, die sich an die Mehrzahl von Liposomen binden, einen Biomolekül-Fingerabdruck der Probe definieren.
  56. Sensor-Array nach Anspruch 55, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck der Probe charakteristisch ist für einen biologischen Zustand eines die Probe liefernden Probanden.
  57. Sensor-Array nach Anspruch 56, wobei der biologische Zustand des Probanden ein Krankheitszustand ist.
  58. Sensor-Array nach Anspruch 57, wobei der Krankheitszustand Krebs ist.
  59. Sensor-Array nach Anspruch 58, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Lungenkrebs, Pankreaskarzinom, Kolonkarzinom, Myelom, myeloische Leukämie, Meningiom, Glioblastom, Brustkrebs, Plattenepithelkarzinom des Ösophagus, Adenokarzinom des Magens, Prostata-, Blasen-, Eierstock-, Schilddrüse-, neuroendokrinem Krebs und Kombinationen davon.
  60. Sensor-Array nach Anspruch 59, wobei der Biomolekül-Fingerabdruck ferner repräsentativ ist für wenigstens eines von einem Lipid, einer Nukleinsäure und einem Polysaccharid, das sich an die Mehrzahl von Liposomen bindet.
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