DE202007008905U1

DE202007008905U1 - Zusammensetzung auf Basis eines Extraktes von Aloysia Triphylla

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Publication number: DE202007008905U1
Application number: DE202007008905U
Authority: DE
Original assignee: ANOXYMER GmbH
Current assignee: ANOXYMER GmbH
Priority date: 2007-06-26
Filing date: 2007-06-26
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2017-06-27

Abstract

Zusammensetzung, enthaltend einen Extrakt von Aloysia triphylla, wobei der Extrakt durch ein oder mehrere hydrophile Lösungsmittel gewonnen wird und in Wasser im Wesentlichen vollständig lösbar ist, und hydrolysiertes Kollagen.

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung enthaltend einen Extrakt von Aloysia triphylla und hydrolysiertes Kollagen sowie deren Verwendung.
Für Aloysia triphylla existieren in der Literatur verschiedene synonyme Begriffe: Aloysia triphylla (L'Hérit.) Britt./Lippia citriodora H.B.K./Verbena triphylla L'Herit., Zitronenkraut, Verbenenkraut u.v.a.
Für Extrakte von Aloysia triphylla (Verbenenkraut) fehlen neuere pharmakologische Untersuchungen. Die bekannten Untersuchungen befassen sich in der Regel mit dem ätherischen Öl. Die Blätter der kleinen Sträucher, die man auch Verbenen nennt, enthalten große Mengen dieses ätherischen Öls, dessen Geruch für eine weite Verbreitung als Ziergewächs gesorgt hat.
Die Droge bzw. Extrakte werden in Frankreich traditionell zur symptomatischen Behandlung von Verdauungsbeschwerden einerseits und Nervosität und Schlafstörungen andererseits von den Zulassungsbehörden akzeptiert.
Aloysia triphylla findet bisher in der Lebensmittelindustrie in Form von Genußtees Einsatz. In der Kosmetikindustrie werden die aus der Pflanze gewonnenen ätherischen Öle zur Parfümierung verwendet. Der Einsatz von wässrigen oder ethanolisch-wässrigen (hydrophilen) Extrakten ist nicht bekannt.
Kollagen ist ein bei Menschen und Tieren vorkommendes Strukturprotein des Bindegewebes (genauer: der extrazellulären Matrix). Im menschlichen Körper ist Kollagen mit über 30 % Anteil am Gesamtgewicht aller Eiweiße (Proteine) das am weitesten verbreitete Eiweiß. Es ist der organische Bestandteil von Knochen und Zähnen und der wesentliche Bestandteil von Knorpel, Sehnen, Bändern und Haut. Kollagenfasern besitzen eine enorme Zugfestigkeit und sind nicht dehnbar.
Die Polypeptidketten des Kollagens werden durch die Ribosomen des rauhen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert. Kollagen besteht aus helikalen Peptidketten, die untypischerweise eine linksgängige Helix aufweisen. Drei dieser Helices, welche untereinander Wasserstoffbrücken ausbilden können, umschlingen einander zu einer rechtsgängigen Superhelix. Auffallend an der Primärstruktur (Aminosäuresequenz) des Kollagens ist, dass jede dritte Aminosäure Glycin ist. Ein häufig wiederholtes Sequenzmotiv ist Prolin-Hydroxyprolin-Glycin. Die dichte Wicklung ist auch ausschlaggebend für die enorme Zugfestigkeit von Kollagenfasern.
Gelatine ist die denaturierte Form von fibrillärem Kollagen Typ I, II und/oder III, die meist aus Schlachtabfällen gewonnen wird. Hierbei ist zu beachten, dass Kollagen Typ II vornehmlich im Knorpel vorkommt, Gemische von Kollagen Typ I und III stammen aus Sehnen, Bändern und der Haut.
Zur Zeit sind 28 verschiedene Kollagentypen bekannt (Typ I bis XXVIII). Zusätzlich sind mindestens zehn weitere Proteine mit kollagenähnlichen Domänen zu verzeichnen. Alle Kollagene haben gemein, dass sie aus drei Polypeptidketten aufgebaut sind, die man als Kollagen-Helices bezeichnet und die in Form einer Tripelhelix umeinander gewunden sind. Jede Kollagen-Helix kann in Abhängigkeit des Kollagentyps aus 600 bis 3000 Aminosäuren zusammengesetzt sein und ist mit großen Domänen ausgestattet, die aus sich wiederholenden (repetitiven) G-x-y-Sequenzen aufgebaut sind. Definitionsgemäß werden nur tripelhelikale Moleküle der extrazellulären Matrix (EZM) als Kollagene bezeichnet.
Als körpereigene Substanz ist Kollagen seit langer Zeit im Zusammenhang mit der Behandlung von degenerativen Gelenkserkrankungen etabliert, wobei insbesondere die Behandlung von Arthrosen und arthritischen Formen im Vordergrund steht.
EP 0 254 289 beschreibt Mittel zur Behandlung von Arthrosen, die ein geschmacksloses oder geschmacksneutrales und enzymatisch hydrolysiertes Kollagen mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 bis 80 kDalton enthalten. Das verwendete hydrolysierte Kollagen stammt dabei aus tierischer Haut, tierischen Knochen oder sonstigem ausreichend aufgereinigtem Bindegewebe. Die Hydrolyse des Kollagens erfolgt demgemäß hauptsächlich durch enzymatische Einflüsse, wobei die Bedingungen so gewählt werden, dass ein bestimmter Molekulargewichtsbereich erhalten wird. Je nach Herstellungsbedingungen weisen die Hydrolysate des Kollagens mehr oder weniger Carboxylgruppen bzw. Aminogruppen auf und sie besitzen unterschiedliche isoelektrische pH-Bereiche.
Aus US 6 211 143 ist ein Verfahren zur Steigerung der Knorpelmasse in Gelenken bekannt. Dabei wird hydrolysierte Gelatine mit einem Molekulargewicht zwischen 2 und 100 kDalton oral verabreicht. Zusätzlich kann den Tagesdosen an Gelatine auch noch mindestens ein Vertreter der Vitamin B-Gruppe und/oder eine organische oder anorganische Magnesiumverbindung zugesetzt werden.
Überraschenderweise ist nunmehr festgestellt worden, dass Zusammensetzungen, die spezielle Extrakte von Aloysia triphylla, insbesondere Lyophilisate davon, und Kollagen enthalten, unerwartete neue pharmakologische Wirkungen zeigen.
Es ist deswegen die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue und breit anwendbare Zusammensetzung bereitzustellen, die einen Extrakt von Aloysia triphylla und Kollagen umfasst, der insbesondere zur Behandlung zur Hemmung der pathogenen Angiogenese und zur Chemoprävention und Behandlung von chronischen Erkrankung wie insbesondere von Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und Gelenksarthrosen eingesetzt werden kann.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass eine neue Zusammensetzung auf Basis eines mittels hydrophiler Lösungsmittel aus Aloysia triphylla gewonnenen Extraktes und Kollagen, eine breite Vielzahl therapeutischer Anwendungen aufweist, die weder dem Extrakt einerseits noch Kollagen andererseits so bisher zugeschrieben wurden.
Die Zusammensetzung weist einen Extrakt von Aloysia triphylla auf, vorzugsweise den Trockenextrakt, die Urtinktur, den Fluidextrakt oder einer Fraktion desselben bzw. ein Lyophilisat davon. Die Zusammensetzung findet Anwendung als Matrixprotektor zur Hemmung der pathogenen Angiogenese, sowie insbesondere zur Behandlung von chronischen Erkrankungen, vorzugsweise Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und Gelenksarthrosen.
Das Hauptmerkmal des Extraktes von Aloysia triphylla besteht darin, dass der Extrakt durch ein oder mehrere hydrophile Lösungsmittel aus dem pflanzlichen Ausgangsmaterial gewonnen wird und in Wasser im Wesentlichen vollständig lösbar ist.
Der Extrakt zeigt unter anderem eine ausgezeichnete entzündungshemmende Wirkung und kann daher in zahlreichen Gebieten Anwendung finden, z.B. der Medizin etc.
Wie bereits oben angesprochen kann der Extrakt in vielen, bereits bekannten Formen vorliegen, z.B. als Trockenextrakt, Urtinktur, Fluidextrakt, Spezialextrakt oder deren Lyophilisate. Auch umfasst der Begriff „Extrakt" wie hierin verwendet Fraktionen, d.h. wirkstoffhaltige Untergruppen des Extraktes, die z.B. durch weitere Behandlung mit einzelnen hydrophilen Lösungsmitteln gewonnen wurden.
Die Herstellung eines Spezialextraktes von Aloysia triphylla mit hohem Gehalt an Wirkstoffen wird beispielsweise nach Extraktion mit Lösungsmitteln auf Wasser/Alkoholbasis, anschließendem Ausschütteln durch organische Lösungsmittel wie z.B. Aceton, Chloroform, Dichlormethan, Ethylacetat etc. und anschließender chromatographischer Reinigung z.B. an Kieselgel oder RP18-Material erreicht.
Die Herstellung eines komplett wasserlöslichen Spezialextraktes aus Aloysia triphylla ist in 1 dargestellt. Der Herstellungsprozess ist auch in den Beispielen wiedergegeben.
Fluidextrakte und Spezialextrakte (komplett wasserlösliche Extrakte, eingestellt auf einen Mindestgehalt an antioxidativen Oligosacchariden) und deren Herstellung sind im Stand der Technik bekannt. Der Fachmann auf dem Gebiet ist jederzeit dazu in der Lage die Herstellungsbedingungen zu variieren, um zu anwendbaren Zusammensetzungen zu gelangen. Einschlägige Vorschriften sind insbesondere im DAB 2004 oder EAB 4. Ausgabe, 7. Nachtrag zu finden. Weitere einschlägige Fachinformationen sind in Fachbüchern der pharmazeutischen Technologie enthalten, z.B. „Pharmazeutische Technologie„, Rudolf Voigt, 9., völlig überarb. Auflage, oder „Remington's Pharmaceutical Sciences ", Mack Publishing Co., Easton, PA, 18. Ausgabe.
Bei den hier beschriebenen Aloysiaextrakten und deren Fraktionen handelt es sich um Extrakte, die durch wässrige bzw. wässrig-ethanolische Extraktion aus den oberirdischen Pflanzenteilen von Aloysia triphylla gewonnen werden und danach im wesentlichen vollständig in Wasser lösbar sind. Diese Präparationen zeichnen sich durch einen bestimmten Gehalt an nicht flüchtigen, hydrophilen antioxidativen Oligosacchariden aus. Dies ist ein wesentlicher Unterschied zu den ansonsten bisher im Markt verwendeten Aloysiaextrakten, welche durch Wasserdampfdestillation gewonnen werden und die flüchtige, lipophile ätherische Öle enthalten.
Der Begriff „antioxidative Oligosaccharide" wie hierin verwendet bedeutet Oligosaccharide, die z.B. Di-, Tri-, bis Nonasaccharide sind und die mit antioxidativen Gruppen, z.B. Kaffeesäure(n), 3,4-Dihydrophenylethanol, Luteolin etc. substituiert sind. Es sei an dieser Stelle erwähnt, dass nach umfangreichen Forschungarbeiten durch die Erfinder festgestellt wurde, dass diese antioxidativen Gruppen alleine nicht die Wirkung des Gesamtextraktes zeigen. Vielmehr ist es die Mischung der in den erfindungesgemäßen Extrakten vorliegenden antioxidativen Oligosaccharide, die eine optimale Wirkung entfalten.
Die genau verwendeten Ethanol-Wassermischungen, die Extraktionstemperatur, die Extraktionsdauer und die Menge an Auszugsmittel variieren von Charge zu Charge des pflanzlichen Ausgangsmaterials und sind abhängig vom Gehalt der antioxidativen Oligosaccharide und dem Gehalt an unerwünschten Begleitstoffen (wie z.B. Chlorophyll, Carotinoide und andere insbesondere lipophile Bestandteile). Somit muß das Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Extrakte abhängig von der Art des verwendeten pflanzlichen Ausgangsmaterials unter Umständen angepasst werden, was jedoch für den auf dem Gebiet der Phytopharmazie tätigen Fachmann kein Problem darstellen wird.
Zwei wichtige, für das Herstellungsverfahren zu berücksichtigende Kriterien sind Folgende:

a) im Extraktionsverfahren dürfen keine Temperaturen von größer 90 °C angewendet werden, das dies zur Hydrolyse der Wirkstoffe und damit zu einer Verminderung oder gar völligen Beseitigung der Wirkung des Extraktes führen würde.
b) die gewonnen Extrakte müssen im Wesentlichen rückstandsfrei in Wasser lösbar sein.

Falls im Einzelfall die Frage entsteht, ob ein Extrakt die erwarteten (optimalen) Wirkungen aufweist oder nicht, kann der Aloysiaextrakt mit Hilfe des HET-CAM-Assays (unten beschrieben) auf seine Wirkung überprüft und gegebenenfalls eingestellt werden (biologische Standardisierung).
Das erfindungsgemäß einsetzbare Kollagen weist vorzugsweise ein mittleres Molekulargewicht von 1–80 kDa, bevorzugt 2–10 kDa auf. Es handelt sich bei dem Kollagen besonders bevorzugt um enzymatisch hydrolysiertes Kollagen. Gut geeignet ist Kollagen tierischen Ursprungs, wobei das Kollagen z.B. von Rindern, Geflügel oder Schweinen und aus deren Knochen, Häuten und Bindegeweben stammt.
Da mit der vorliegenden Zusammensetzung keinerlei Beschränkung im Hinblick auf eine spezifische Applikationsform verbunden sein sollte, hat es sich als empfehlenswert herausgestellt, in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kaltwasserlösliches Kollagen einzusetzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die folgenden Aspekte und Ausführungsformen:
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen Extrakt von Aloysia triphylla, wobei der Extrakt durch ein oder mehrere hydrophile Lösungsmittel gewonnen wird und in Wasser im Wesentlichen vollständig lösbar ist, und Kollagen enthält. In der vorliegenden Erfindung ist am meisten bevorzugt, dass der Extrakt rückstandsfrei in Wasser lösbar ist, dies kann jedoch im einen oder anderen Fall aufgrund des gewählten Extraktionsverfahrens möglicherweise nicht ganz erreicht werden. Selbstverständlich liegen auch solche Extrakte noch im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Das zur Extraktion eingesetzte hydrophile Lösungsmittel ist vorzugsweise Wasser und/oder Ethanol. Das Lösungsmittel enthält Wasser in einem Bereich von 100% V/V bis 30 % V/V, den Rest bildet in der Regel Ethanol.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Extrakt ein Trockenextrakt, Fluidextrakt oder ein Spezialextrakt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Zusammensetzung, die einen Extrakt, der nach dem Herstellungsverfahren nach 1 herstellbar ist, sowie Kollagen enthält.
Der Extrakt kann auch in lyophilisierter Form vorliegen, um die Lagerung und nachfolgende Auflösung in Wasser (z.B. Aqua ad Injectabilia) so effizient wie möglich zu gestalten.
Die Erfindung betrifft in einem zweiten Aspekt Lebensmittel oder Nutraceuticals, die eine Zusammensetzung wie oben definiert enthalten. Einige Beispiele für die Anwendung des Extraktes im Lebensmittelbereich finden sich in Beispiel 4.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wie oben definierte Zusammensetzung enthält.
Diese pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise zur Verabreichung zur systemischen, insbesondere oralen Verabreichung vorgesehen.
Dabei kann die Zusammensetzung flüssige oder feste Form annehmen. Beispielsweise können die beiden Bestandteile der Zusammensetzung flüssig vorliegen, z.B. der Aloysia-Extrakt als Spissum (Dickextrakt) und das Kollagen in flüssiger Form (d.h. als wässrige Zubereitung). Beide Bestandteile werden lediglich miteinander vermischt und ergeben dann eine flüssige Zubereitung, die zur Einnahme geeignet ist.
Alternativ kann die Zusammensetzung in fester Form vorliegen. Hier bietet sich beispielsweise an, die oben genannte flüssige Zusammensetzung weiter einem Trocknungsschritt (besonders einem Sprühtrocknungsschritt) zu unterwerfen. Die getrocknete pulverförmige Substanz kann dann als solches dem Endverbraucher zur Verfügung gestellt werden. Um diesem die Einnahme zu erleichtern, ist die Zusammensetzung vorzugsweise mit einem Messlöffel oder einer anderen geeigneten Messvorrichtung versehen, die eine genaue Abmessung der jeweils geeigneten Dosis ermöglicht. Vor Gebrauch kann der Patient die pulverförmige Zusammensetzung dann abmessen und vorzugsweise in eine Flüssigkeit (z.B. Wasser) einrühren, um ein leicht applizierbares Getränk herzustellen. Die direkte Verabreichung des Pulvers dürfte aufgrund der großen Gesamtmenge (siehe unten) nur schwer möglich sein, aus demselben Grund sind auch Kapseln, Tabletten und andere perorale Darreichungsformen im vorliegenden Fall eher weniger geeignet.
Die vorliegende Erfindung umfasst also insbesondere auch die erfindungsgemäße Zusammensetzung in Form eines Getränkes, wobei die Art der zuzugebenden Flüssigkeit nicht beschränkt ist. Vorzugsweise ist die Flüssigkeit Wasser, es ist jedoch ebenfalls denkbar Milchprodukte und Fruchtsäfte einzusetzen, soweit diese mit der Zusammensetzung kompatibel sind.
Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Hemmung der pathogenen Angiogenese und zur Chemoprävention und Behandlung von chronischen Erkrankung wie insbesondere Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und Gelenksarthrosen. Unter Krankheiten des rheumatischen Formenkreises werden ätiologisch und pathogenetisch unterschiedliche Krankheitsbilder zusammengefaßt, deren gemeinsame Merkmale Schmerz und Funktionsstörungen am Bewegungsapparat sind. Der rheumatische Formenkreis umfasst Gelenk- und Wirbelsäulenerkrankungen entzündlicher Art (z.B. Polyarthritiden, Spondylitis ankylosans), Gelenk- und Wirbelsäulenveränderungen degenerativer Art (z.B. Arthrosen, Spondylosen), entzündliche und nichtentzündliche Krankheiten der Weichteile sowie systemische Bindegewebs- und Gefäßerkrankungen (Kollagenosen, Vaskulitiden) und Manifestationen von Stoffwechselkrankheiten (z.B. Gicht).
Wie oben angesprochen werden die Extrakte aus der Ganzdroge („Herba") gewonnen, d.h. aus allen oberirdischen Pflanzenteilen (Stengel, Blätter, Blüten). Es können daher auch ätherische Öle in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten sein, sie stellen jedoch nicht den Hauptanteil der Wirkstoffe dar.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zum Schutz des Abbaus von Knorpel in z.B. Gelenken und der extrazellulären Matrix (Matrixprotektor).
Erfindungsgemäß liegt der Extrakt vorzugsweise als Fluidextrakt vor. Wie oben angesprochen liegt die Dosierung der Fluidextrakt-Trockensubstanz zwischen 20 mg und 2 g pro Tag. Eine Ein-Tages-Dosis berechnet für einen erwachsenen Patienten enthält insgesamt ca. 4–12 g der Zusammensetzung. Davon entfallen ca. 1 Gewichtsanteil auf den Extrakt und 6 Gewichtsanteile auf den Kollagenanteil, also ein Gewichtsverhältnis von in etwa 1:6. Der Kollagenanteil kann dabei von ca. 4–10 g schwanken, der Rest der Zusammensetzung wird entsprechend den obigen Angaben aus dem Extrakt gebildet. Die Gewichtsanteile, wie oben angegeben, beziehen sich jeweils auf das Gewicht der Bestandteile in fester (pulver-) Form.
Beispielsweise enthält eine Tagesdosis 1 g Fluidextrakt-Trockensubstanz und 5 g pulverförmiges Kollagen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen finden als Botanical, insbesondere als Arzneimittel, Nutraceutical, Functional Food, Novel Food und Lebensmitteln, mit antioxidativen Eigenschaften, Anwendung.
Der Extraktbestandteil kann weiterhin ein Lyophilisat, das aus einem Extrakt von Aloysia triphylla oder einer Fraktion desselben wie oben definiert hergestellt worden ist, sowie ein Botanical oder Nutraceutical, das einen Extrakt von Aloysia triphylla oder eine Fraktion desselben sein.
Hauptsächlich ist der Einsatz am Menschen vorgesehen, der Einsatz im Veterinär-Bereich ist aber ebenso möglich.
Die Aloysiaextrakte besitzen starke antioxidative Eigenschaften – wie im DPPH-Test nachgewiesen. Überraschenderweise besitzen sie jedoch keine prooxidativen Eigenschaften wie z.B. Vitamin C, die zum Abbau von Glykosaminoglykanen (z.B. Heparin, Chondroitinsulfate, Heparansulfate) führen. Die Extrakte inhibierten den Abbau von Glykosaminoglykanen, der durch freie Eisen-(II)-Ionen und Wasserstoffperoxid hervorgerufen wird (s. 2).
Durch diese neue Wirkung der Aloysiaextrakte sind diese in der Lage den Abbau von z.B. Knorpel bzw. den Abbau der extrazellulären Matrix, die für die Pathogenese einer Reihe von chronischen Erkrankungen essentiell ist, zu verlangsamen bzw. zu stoppen. Für die Induktion der Angiogenese ist der Abbau von Glykosaminoglykane, die Bestandteile der extrazelluären Matrix sind, von wesentlicher Bedeutung. Wirkstoffe oder Extrakte die den Abbau der extrazellulären Matrix verhindern (Matrixprotektoren) sind bis jetzt nicht bekannt.
Die aus den in vitro Versuchen vermuteten pharmakologischen Wirkungen der beschriebenen Aloysiaextrakte sind in vivo durch Hemmung der pathologischen Angiogenese unterschiedlicher Genese an der Chorio-Allantois-Membran (HET-CAM) des bebrüteten Hühnereies belegt worden (s. 4). Desweiteren wird die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufene Irritation an der Chorio-Allantois-Membran gehemmt (s. 5). Die physiologische Angiogenese wird durch die Aloysiaextrakte nicht gehemmt (s. 3).
Eine intakte extrazelluläre Matrix ist wesentlich für ein gesundes Gewebe. Werden die Bestandteile abgebaut kommt es z.B. zur Knorpeldegeneration oder zur Induktion einer pathogenen Angiogenese.
Die Angiogenese ist ein physiologischer differenzierender Gewebeprozeß in der Embryonalentwicklung, nach der weiblichen Regelblutung und bei der Wundheilung. Diese Differenzierung geht von Kapillaren aus, in dem die Basalmembran stellenweise aufgelöst wird, Endothelzellen migrieren und proliferieren, sich zu einer Röhre zusammenschließen und mit benachbarten Proliferationsstellen eine Schleife bilden. Die Basalmembran wird an den neu entstandenen Gefäßen ausgebildet. Dieser Prozeß ist einer Steuerung durch antagonsierende Mediatoren unterworfen. Zu den Angiogenese-stimulierenden Faktoren zählen der Acidic Fibroblast Growth Factor (FGF-1), der Basic Fibroblast growth factor (FGF-2), der Vascular Endothelial growth Factor (VEGF), der Interleukin 1a (IL 1a) u.a. Endogene Inhibitoren stehen diesen stimulierenden Faktoren gegenüber und verhindern beim Gesunden die Angiogenese.
Mit der pharmakologischen Prüfung des Lyophilisates des Fluidextraktes von Aloysia triphylla an der CAM des Hühnerembryos trat völlig überraschend die starke Hemmung der pathogenen Angiogenese auf. Eine membranirritierende oder toxische Wirkung des Extraktes ist nicht beobachtet worden. Nebenwirkungen sind beim Gebrauch von Aloysia triphylla bisher nicht bekannt geworden.
Zur Behandlung der rheumatoiden Arthritis werden in neueren Therapiestrategien Angiogenese-Hemmstoffen gesucht, da bei der Pathogenese die synoviale Proliferation mit einer Neovaskularisierung verbunden ist. Die Unterdrückung der Proliferation von Endothelzellen kann als wichtiges Therapieziel angesehen werden, da hiermit auch eine Reduzierung des pathologisch-immunologischen Prozesses zu erwarten ist.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend durch Abbildungen und Beispiele verdeutlicht. Sie ist hierauf selbstverständlich nicht beschränkt, ihr Schutzumfang wird vielmehr durch die Ansprüche bestimmt.
In den Abbildungen ist folgendes dargestellt:
1 zeigt einen Flow Chart für die Herstellung eines in der Erfindung eingesetzten Extraktes;
2 zeigt die Hemmung des Abbaus von Glykosaminoglykanen (z.B. Chondroitinsulfat A) durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch den erfindungsgemäßen wasserlöslichen Aloysiaextrakt. Das antioxidative Vitamin C beschleunigt im Vergleich den Abbau der Glykosaminoglykanen unter physiologischen Bedingungen (pH-Wert 7,2, 37 Grad Celsius);
3 zeigt den Einfluß eines erfindungsgemäßen wasserlöslichen Aloysiaextrakts auf die physiologische Angiogenese im Vergleich mit Vitamin C; in der linken Abbildung zeigt sich kein anti-angiogener Effekt, in der rechten Abbildung stärkster anti-angiogener Effekt (kapillarfreier Bereich rund um das Pellet).
4 stellt die Hemmung der pathologischen Angiogenese, hervorgerufen durch eine chronische Entzündung, mittels des erfindungsgemäßen wasserlöslichen Extrakts aus Aloysia im Vergleich mit Vitamin C im Het-CAM-Assay dar; die linke Abbildung zeigt die CAM-Irritation durch Laurylsulfat (50μg/Pellet), die rechte Abbildung die Inhibition der Membranirritation durch den Extrakt (50μg/Pellet). Der Vergleich beruht auf einer Hemmung der pathologischen Entzündung hervorgerufen durch eine chronische Entzündung mittels Extrakt (50μg/Pellet); Vitamin C: keine Wirkung.
5 zeigt die Hemmung der durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufenen Irritation an der Chorio-Allantois-Membran im Ring-HET-CAM-Assay; die linke Abbildung zeigt die CAM-Irritation durch Fenton-Reagenz kombiniert mit Vitamin C (50μg/Pellet), die rechte Abbildung CAM-Irritation in Kombination mit Fenton-Reagenz. Der Vergleich beruht auf einer Hemmung der Irritation hervorgerufen durch reaktive Sauerstoffspezies mittels Extrakt (50μg/Pellet); Vitamin C: keine Wirkung.
6 zeigt die Response-Rate gegenüber der Behandlung mit Aloysia triphylla-Extrakt alleine, Kollagen alleine und einer Kombination von Extrakt und Kollagen (erfindungsgemäß).
Beispiele:
Beispiel 1: Herstellung des komplett wasserlöslichen Spezialextraktes aus Aloysia triphylla (s. auch 1)
Das getrocknete, geschnittene Pflanzenmaterial von Aloysia triphylla (oberirdische Bestandteile mit oder ohne Blüten, bzw. nur Blätter bzw. nur Stengel), die einen Mindestgehalt an antioxidativen Oligosacchariden enthalten, werden mit Wasser oder mit Wasser/Ethanol-Mischungen (z.B. Wasser/Ethanol = 50/50 (V:V)) bei 40 Grad Celsius über ungefähr 8 Stunden extrahiert. Das Verhältnis von getrocknetem Pflanzenmaterial zu Auszugsmittel kann variieren und beträgt 1:4 bis 1:100 Teile. Die genau verwendeten Ethanol-Wassermischungen, die Extraktionstemperatur, die Extraktionsdauer und die Menge an Auszugsmittel variieren von Charge zu Charge und sind abhängig vom Gehalt der antioxidativen Oligosaccharide und dem Gehalt an unerwünschten Begleitstoffen (wie z.B. Chlorophyll, Carotinoide und andere insbesondere lipophile Bestandteile).
Die exakten Extraktionsbedingungen werden jeweils in Vorversuchen mit Hilfe einer Analytik auf antioxidative Oligosaccharide, die, wie oben angesprochen, mit einem Mindestgehalt in den Extrakten enthalten sein sollen, ermittelt.
Nach der Extraktion wird zur Abtrennung der unlöslichen Bestandteile in einer Durchlaufzentrifuge („Milchzentrifuge") zentrifugiert. Die abgetrennten unlöslichen Bestandteile (Trester) werden verworfen. Der Überstand (bzw. Überlauf) wird auf bis zu 4 Grad Celsius abgekühlt, jedoch mindestens auf 40 Grad Celsius. Nach einer Lagerdauer von bis zu einem Monat werden die sich abscheidenden lipophilen Komponenten (insbesondere Chlorophyll) mittels Filtration entfernt.
Anschließend wird das Filtrat bei 50 bis 90 Grad Celsius im Vakuum auf ca. ein Zehntel bis ein Viertel des Ausgangsvolumens eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird nochmals auf bis zu 4 Grad Celsius abgekühlt, jedoch mindestens auf 40 Grad Celsius. Nach dieser Endklärung werden die sich abscheidenden bzw. ausflockenden Schwebstoffe nach einer Lagedauer von bis zu einem Monat mittels Filtration entfernt.
Das Filtrat wird anschließend mit inertem Material z.B. Maltodextrin bzw. Aerosil versetzt, um eine gewünschte Konzentration an antioxidativen Oligosacchariden im Endprodukt zu erhalten. Die Endtrocknung erfolgt im Vakuumkonzentrator oder auf dem Trockenband bei Temperaturen zwischen 40 bis 90 Grad Celsius. Das getrocknete Material wird anschließend in einer Mühle auf eine gewünschte Korngröße zerkleinert. Das Pulver wird vakuumverpackt. Das Endprodukt, das für die Herstellung von Getränken geeignet ist, löst sich in Wasser ohne Rückstand auf (insbesondere scheiden sich keine farbigen Partikel („schwarze Pünktchen" ab). Das Endprodukt enthält einen Mindestgehalt an antioxidativen Oligosacchariden von ungefähr 10% und erfüllt die Mindestkriterien zur mikrobiologischen Reinheit nach dem lebensmittelrechtlichen Vorschriften und den Arzneibüchern. Die vorgeschriebenen Obergrenzen an Schwermetallen, Herbiziden und Pestiziden werden ebenfalls unterschritten und somit eingehalten.
Beispiel 2: Entzündungshemmende Wirksamkeit des Extraktes von Aloysia triphylla im HET-CAM Test
Als Testpellet wurden dabei 10μl einer Lösung von 50 mg Lyophilisat (der im obigen Beispiel 1 gewonnen Zusammensetzung) in 1 ml Agaroselösung (mit 5mg Laurylsulfat/ml) auf die CAM appliziert. Im Bereich des Testpellets erschien die durch die Entzündung hervorgerufene Angiogenese gegenüber dem Kontrollversuch geringer bis hin zu einer vollständigen Unterdrückung. Dieser Versuchaufbau stellt ein anerkanntes Modell für die in vivo-Überprüfung der Hemmung der Angiogenese dar und belegt die völlig unerwarteten, neuartigen, pharmakologischen Wirkungen der genannten Lyophilisate. Siehe hierzu auch 4.
Der HET-CAM-Test gehört zu einer Reihe von Modellversuchen, die Substanzen auf ihre Hemmung der pathogenen Angiogenese für mögliche therapeutische Anwendungen zu prüfen. Der Vorteil des HET-CAM-Testes liegt darin, dass er zu den in vivo-Versuchen gehört, die eine sichere Aussage über klinische Relevanz zulassen als in vitro-Verfahren. In diesem in vivo-Test liegt das komplexe System der Angiogenese mit all seinen Zellenfunktionen und Mediatoren vor, so dass eine vergleichsweise sichere Aussage über die Hemmwirkung der Angiogenese möglich ist. Der Test ist als Screening-Verfahren zur Ermittlung von Substanzen mit Angiogenese-hemmenden Eigenschaften anerkannt (Svahn, C.M., M. Weber, C. Mattsson, K. Neiger, M. Palm carbohydr. Polym. 18, 9–16 (1992); Hahnenberger r., A.M. Jakobsen, A. Ansari, t. Wehler, C.M. Svahn, U.Lindahl, Glycobioology 3, 567–573 (1993); und Galliardi, A., H. Hadd, D.C. Collins, Cancer Res. 52, 5073–5075 (1992)).
Beispiel 3: Bestätigung der Erlebnisse des HET-CAM-Tests im Tierversuch
Die Ergebnisse des HET-CAM-Assays konnten außerdem in einem Tiermodell der chronischen Entzündung bestätigt werden. Die Wirkung des Extraktes wurde in einem Mäusemodell der durch Dextransulfat hervorgerufenen akuten Kolitis überprüft.
Hier wird in insgesamt 10 Mäusen eine Kolitis durch Dextransulfat induziert. Durch diese Darmentzündung verlieren die Mäuse an Gewicht. Endpunktparameter sind die Feststellung des Mausgewichts, der Darmlänge sowie die Reduktion von bekannten Interleukinen, die Entzündungen hervorrufen.
Nach Gabe von täglich 600 μg wasserlöslichem Aloysiaextrakt (über 10 Tage hinweg) war das Endgewicht von 5 Mäusen nach 10 Behandlungstagen im Vergleich zur Kontrollgruppe (5 Mäuse) signifikant erhöht (p = 0,05). Die Ergebnisse der Behandlung sind in Tabelle 1 dargestellt. Bei den angegebenen Werten handelt es sich um Mittelwerte mit den maximalen Schwankungsbereichen.
Tabelle 1
Die IFN- und IL-10 Werte waren in den MLN-Zellen, gewonnen aus den Lymphknoten, nach Stimulation signifikant abgesenkt.
Diese Ergebnisse der Versuchs an der Maus bestätigen den erfolgreichen Einsatz der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bei chronischen Entzündungen insbesondere des Magen-Darm-Traktes.
Beispiel 4: Herstellung von Lebensmitteln die den erfindungsgemäßen Extrakt enthalten
Ausgangsprodukt: Wasserlösliche Fraktion eines alkoholischen Extraktes aus Aloysia triphylla (wie oben in Beispiel 1 gewonnen), optimiert auf einen Gehalt antioxidativer Oligosaccharide von ca. 10%.)
In Tabelle 2 ist das jeweilige Mischungsverhältnis des Extraktes im Milchprodukt angegeben. Es zeigten sich die in der Tabelle aufgeführten Ergebnisse.
Tabelle 2:
Beispiel 5:
Klinische Studien:
In klinischen Studien wurden 100 Freiwillige mit einer leichten Kniegelenksarthrose untersucht. Die Studie wurde als Studie in 4 Gruppen mit 25 Freiwilligen pro Gruppe durchgeführt. Das Studiendesign war doppelblind, placebo-kontrolliert, randomisiert, unter Beachtung von Einschluss- und Ausschlusskriterien (siehe die am Ende des Beispiels zu findende Studiensynopse).
Jedem Freiwilligen wurde über eine Zeitspanne von sechs Monaten hinweg eine Gesamtmenge von 6g der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verabreicht. Die Auswertung erfolgte gemäß Lequesne- und WOMAC-Score. Die untersuchten Studienendpunkte waren: Mobilität, Steifheit und Schmerz.
Als Vergleichspräparate wurde ein wie in der Anmeldung geschilderter Aloysia-Extrakt verwendet, jeweils mit und ohne Zusatz von Kollagen, weiterhin wurde hydrolysiertes Kollagen alleine verabreicht.
Versuchsergebnisse (Auswertung gemäß T-Test)
Ergebnis: Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wirkt > 60% schneller als Kollagen alleine und > 160% schneller als der Aloysia-Extrakt alleine. Dies wurde auch in der Auswertung gemäß Lequesne bestätigt:
Ergebnis: Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wirkt 50% schneller als Aloysia triphylla Extrakt bzw. Kollagen alleine.
Zusammenfassung der Studienergebnisse:
Die Wirkung setzt bei allen Freiwilligen rasch ein. Die Mobilität wird in der Regel vollständig wiederhergestellt, innerhalb einer kurzen Zeit ist Schmerzfreiheit zu erwarten. Eine Dosis von 6g der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird gut toleriert. Der Geschmack ist für den Verbraucher akzeptabel.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung weist die höchste Response-Rate auf (70% in der 24. Woche). Eine Reaktion ist als signifikante Verbesserung definiert (Score-Differenz > 3,5).
Studiensynopse
1. Titel
Doppelblinde, placebo-kontrollierte, prospektive Studie zur Beurteilung der Wirksamkeit von einem Extrakt von Aloysia triphylla (hergestellt wie in Beispiel 1) und/oder Kollagenhydrolysat bei Patienten mit Kniegelenks- arthrose.
2. Indikation
Gehfähige, männliche und weibliche Patienten mit Kniegelenksarthrose.
3. Studienziele
Optimierung des Allgemeinzustandes (Verbesserung der Symptomatik) leichter Kniegelenksarthrosen.
Primäre Studienendziele:
Beurteilung des Schmerzzustandes und des Funktionsstatus mittels Lequesne-Index und WOMAC-Index (Western Ontario and McMaster Universities).
4. Studiendesign
Doppelblinde, placebo-kontrollierte, randomisierte Kurzzeit-Studie bei Patienten mit Kniegelenksarthrose:
vierarmige Studie: Placebo vs. Extrakt von Aloysia triphylla (s.o.) vs. Kollagenhydrolysat vs. Extrakt + Kollagenhydrolisat mit jeweils 25 Probanden, d.h. Studiengrösse 100 Probanden.
5. Studiendauer

August 2003–Juni 2004
(Beginn der Rekrutierung Anfang August 2003, Rekrutierungszeit ca. 6–8 Wochen, Studienende Ende Juli 2004). Die Studie wird über eine Behandlungsdauer von 6 Monaten pro Patient durchgeführt.

6. Ein- und Ausschlußkriterien
Einschlußkriterien:

– Leichte Fälle von Kniegelenksarthrosen;
– Zustand nach Arthroskopie ohne tiefreichende Knorpeldefekte;
– Altersgruppe: keine Einschränkung;
– Geschlecht: männlich + weiblich.

Ausschlußkriterien:

– Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises;
– Keine Infektionen, insbesondere Gelenksinfektionen;
– Schwere Fälle von Kniegelenksarthrosen;
– Band-, Knorpelersatz- und Gelenk-OP's, ausser Arthroskopie;
– Keine Medikation (NSAR, Corticoide, Antibiotika), ausser Lipidsenker, Antihypertonika, Antiarhythmika;
– Keine Vitamine, Mineralstoffe und Phytotherapeutika, insbesondere Pflanzenextrakte aus der Teufelskralle und Artischoke sowie Wobenzym^®, Hyaluronsäure-Injektionen.

7. Studienmedikation

Extrakt:	1× täglich 1g Extrakt (10% Acteosid) oral (entspricht 100 mg Acteosid täglich) + 4 g Cellulose;
Kollagen:	1× täglich 5 g Kollagenhydrolysat oral;
Extrakt + Kollagen:	1× täglich 1 g Extrakt + 5 g Kollagenhydrolysat;
(erfindungsgemäß)
Placebo:	1× täglich 5 g mikrokristalline Cellulose.

8. Vorgehen
Bei Studienbeginn werden von jedem Patienten der BSG-Wert und die radiologischen Daten (Röntgenbilder) erfasst. Evtl wird durch Punktion Synovialflüssigkeit aus dem Kniegelenk gewonnen. Ebenso wird der Schmerzzustand und der Funktionsstatus des Kniegelenks mit Hilfe der entsprechenden Indices bestimmt. Weiterhin erfolgt eine 6 Wochenkontrolle des Schmerzzustandes und des Funktionsstatus des Kniegelenks, d.h. in Woche 6, 12, 18 und 24 nach Studienbeginn.
Das Erfassen des BSG-Wertes (Blutsenkungsgeschwindigkeit) und der radiologischen Daten sowie evtl. biochemischer Parameter aus der Synovia zu Beginn der Studie, dienen als Primärdaten für eine evtl. Langzeitstudie über 3–5 Jahre. Im Rahmen dieser Kurzzeitstudie werden diese Daten nur einmal erfasst.

Claims

Zusammensetzung, enthaltend einen Extrakt von Aloysia triphylla, wobei der Extrakt durch ein oder mehrere hydrophile Lösungsmittel gewonnen wird und in Wasser im Wesentlichen vollständig lösbar ist, und hydrolysiertes Kollagen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das zur Extraktion des Extraktes eingesetzte hydrophile Lösungsmittel Wasser und/oder Ethanol ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Lösungsmittel Wasser in einem Bereich von 100% V/V bis 30 % V/V enthält.
Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Extrakt ein Fluidextrakt oder ein Spezialextrakt ist.
Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Extrakt in lyophilisierter Form vorliegt.
Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zusammensetzung in fester oder flüssiger Form vorliegt.
Zusammensetzung, die einen Extrakt von Aloysia triphylla, der durch das folgende Verfahren herstellbar ist: a) Bereitstellen des getrockneten Krautes von Aloysia triphylla; b) Extrahieren des Krautes mit einem wässrig-alkoholischen Auszugsmittel; c) Zentrifugation und Abtrennen des unlöslichen Rückstandes aus dem Extrakt; d) Filtration des Extraktes zur Abtrennung von Chlorophyll; e) Konzentrieren, Klären und Trocknen des Extraktes; und hydrolysiertes Kollagen enthält.
Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Kollagen ein mittleres Molekulargewicht von 1–80 kDa, bevorzugt 2–10 kDa aufweist.
Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Kollagen um enzymatisch hydrolysiertes Kollagen handelt.
Zusammensetzung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Extraktbestandteil und Kollagen in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr 1:6 vorliegen.
Lebensmittel oder Nutraceutical, das eine Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 110 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 110 und einen oder mehrere pharmazeutische Hilfsstoffe/Trägerstoffe enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, die zur Verabreichung durch zur systemischen, insbesondere oral Verabreichung vorgesehen ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Gesamttagesdosis der Zusammensetzung 4–12 g beträgt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 12–14 zur Hemmung der pathogenen Angiogenese und zur Chemoprävention und Behandlung von chronischen Erkrankungen, vorzugsweise Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises und Gelenksarthrosen.
Lebensmittel nach Anspruch 11, bei dem es sich um ein Getränk handelt.