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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Gewinnung von
Zellsuspensionen unter anschließender
Beimischung von Zusatzstoffen, insbesondere Schutzmitteln zur Kryokonservierung.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung
beseitigt insbesondere das Erfordernis von Zentrifugieren und anderen aufwendigen
und möglicherweise
kontaminierenden Aufbereitungsschritten.
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Für die klinische
Prüfung
von Impfstoffen gegen Erreger, welche durch zellvermittelte Immunität angewehrt
werden (bzw. des zellulären
Immunstatus von geimpften Individuen), werden die mononukleären Zellen
(PBMCs) aus den Blutproben der Impflinge isoliert. Dazu müssen vor
Ort hochspezialisierte Labors mit entsprechend qualifiziertem Personal
eingerichtet werden. Weiterhin müssen
sämtliche
Gefäße und Reagenzien
pyrogenfrei sein. Die Zellen werden üblicherweise in flüssigem Stickstoff
eingefroren und ebenso transportiert.
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Häufig werden
o.g. klinische Prüfungen
in Entwicklungsländern
(z.B. in Afrika) durchgeführt. Die
Einrichtung von Speziallabors vor Ort, die Rekrutierung geeigenten
Personals sowie der Probentransport in flüssigem Stickstoff erfordern
einen extrem hohen finanziellen und technischen Aufwand. Weiterhin
ist die Isolierung der mononukleären
Zellen unter pyrogenfreien Bedingungen störanfällig; es kann zu Aktivierungen
der Monozyten durch Pyrogene kommen, wodurch die Probe wertlos wird.
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WO
2005-089837 beschreibt eine zwei-Komponenten vorgefüllte Spritze.
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Die
US 5,522,804 beschreibt
eine Spritze zur Aspiration, dem Mischen und der Injektion von Substanzen.
Die Spritze enthält
eine in ihren Kolben integrierte Kammer für Substanzen, die im Anschluss
an die Injektion einer ersten Substanz injiziert werden.
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur
Verfügung
zu stellen, die eine erleichterte, sichere und somit verbesserte
Probenaufbereitung ermöglicht.
Es soll dabei eine Vorrichtung entwickelt werden, mit der insbesondere
individuelle Blutproben gewonnen und mit Zusatzstoffen versetzt
werden können,
so dass die Proben ohne weitere Aufbereitung direkt in der Vorrichtung mit
möglichst
geringem Aufwand und zu möglichst niedrigen
Kosten kryokonserviert und transportiert werden (z.B. für die klinische
Prüfung
von Impfstoffen gegen Erreger, welche durch zellvermittelte Immunität abgewehrt
werden, für
die Bestimmung des individuellen Immunstatus von Patienten).
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Diese
Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird in einem ersten Aspekt dieser
durch eine Vorrichtung zur Aufbereitung einer Blutprobe gelöst, die eine
Probenkammer (12) mit einem Einlass (1), einen beweglichen
Stempel (3) mit einer innerhalb der Probenkammer angeordneten
Stempelplatte mit Poren (2), und eine innerhalb der Probenkammer
(12) liegenden zweite Kammer (5), für ein Probenaufbereitungsmittel,
die über
einen verschließbaren
Einlass (8) mit der Probenkammer (12) verbunden
ist, umfaßt.
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Erfindungsgemäß wurde
eine Vorrichtung entwickelt, in der insbesondere individuelle Blutproben
gewonnen und mit Zusatzstoffen versetzt werden können, so dass die Proben ohne
weitere Aufbereitung direkt in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingefroren
werden können.
Die Monozyten und Lymphozyten der Proben behalten dabei ihre Funktion
bei und werden nicht wesentlich aktierviert. Die Kryokonservierung
und der Transport erfolgen erfindungsgemäß ohne flüssigen Stickstoff. Dadurch
wird mit äußerst geringem
finanziellen und technischen Aufwand die Asservierung von individuellen
Blutproben (z.B. für
die klinische Prüfung
von Impfstoffen) möglich.
Das Prinzip ist für
andere Zellsuspensionen ebenfalls einsetzbar.
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Bevorzugt
ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung
die dadurch gekennzeichnet ist, dass die zweite Kammer durch einen
innerhalb der Probenkammer (12) liegenden beweglichen Hohlstempel
(7) gebildet wird, insbesondere durch eine Dichtungsscheibe
(6). Die Dichtungsscheibe (6) wird in einer bevorzugten
Ausführungsform
der Vorrichtung durch geeignete Oberflächengestaltung (z.B. Rauhigkeit) der Überströmkanäle (8)
mitgezogen. Alternativ kann die Dichtungsscheibe über eine
Nut mit dem Hohlstempel (7) verbunden werden. Für den Schritt
5 („Überstand
mit dem Schutzmittel mischen",
siehe unten) würde
dann in einer anderen Ausführungsform
eine bestehende Verbindung zwischen Dichtungsscheibe und Hohlstempel
(z.B. durch Drehen des Stempels) gelöst werden. Bei Verwendung gelangt
zunächst
kein Schutzmittel in die Probe, weil das Volumen des Reservoirs
gleich bleibt und/oder der Einlass (8) geschlossen ist.
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Erfindungsgemäß bevorzugt
ist es, dass die Vorrichtung mit einem Mehrschritt-Fixationsprinzip für den Hohlstempel
in der unteren Stellung versehen ist, wie im folgenden erläutert wird.
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Bevorzugt
ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung
die dadurch gekennzeichnet ist, dass der verschließbare Einlass
(8) der zweiten Kammer (5) durch einen Dreh- und/oder
Durchstechmechanismus mittels des Hohlstempels (7) geöffnet werden kann.
Dadurch gelangt das Schutzmittel (5) durch die Überströmkanäle (8)
in den Überstand
(z.B. Plasma). Durch die Gestaltung der Oberfläche (z.B. Rauhigkeit, keine
feste Verbindung zum Hohlstempel) der Überströmkanäle (8) ist die Dichtungsscheibe
(6) weiterhin beweglich, wenn etwas stärkerer Zug ausgeübt wird.
Alternativ kann in einer Ausführungsform eine
Verbindung zwischen Hohlstempel und Dichtungsscheibe (z.B. über eine
Nut) hergestellt werden, die sich vor dem Mischen des Überstandes
mit dem Aufbereitungsmittel (z.B. Schutzmittel) lösen lässt (z.B.
durch Drehen). Durch mehrfaches Überkopf-Drehen
der Vorrichtung wird ein gleichmäßiges Durchmischen
des Überstandes
mit dem Aufbereitungsmittel (z.B. Schutzmittel) erreicht. In einer
weiteren bevorzugten Ausführung
der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist diese also dadurch
gekennzeichnet, dass die Dichtungsscheibe (6) über eine
Nut mit dem Hohlstempel (7) lösbar verbunden ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführung der
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet,
dass der verschließbare Einlass
(8) Überströmkanäle (8)
mit einer Führung
für die
Dichtungsscheibe (6) umfaßt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführung der
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet,
dass der Stempel (3) beweglich innerhalb des Hohlstempels
(7) gelagert ist. Dabei ist bevorzugt, der Stempel (3)
durch einen Dichtungsring (4) geführt ist.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführung der
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet,
dass der Stempel (3) und der Hohlstempel (7) durch
eine lösbare
Verbindungsklammer (9) mit einander verbunden sind. Die
Verbindungsklammer (9) sorgt für das definierte gleichzeitige
Zurückziehen
beider Stempel (3 und 7), wird bei Bedarf aber
vom Stempel (3) sowie vom Hohlstempel (7) entfernt.
In einer weiteren Ausführungsform
kann abstelle der Verbindungsklammer (9) ein verdrehbarer
Stempel mit einer Nutverbindung oder anderen Arretierung versehen
sein, die dann entsprechend gelöst
wird.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführung der
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet,
dass für
den Hohlstempel (7) innerhalb des ersten Probenraums (12)
ein Anschlag und/oder eine entsprechende Markierung vorgesehen ist.
Bevorzugt ist für
den Hohlstempel (7) somit ein Anschlag vorhanden, welcher
den Stopp beider Stempel dergestalt garantiert, dass kein Schutzmittel
(5) in den Probenraum gedrückt wird. Der Hohlstempel lasst
sich in einer Ausführungsform durch
Drehen (z.B. um 90°)
in dieser Position fixieren. Die Vorrichtung enthält eine
Markierung für
den Stopp des Stempels (z.B. für
Blut bei etwa 50 % des gesamten Probenvolumens), um die Zellen keinem mechanischen
Druck auszusetzen. Durch Turbulenzen kann es zu einem ersten Übertreten
von Schutzmittel durch die Überströmkanäle sowie
zur Durchmischung mit Überstand
(z.B. Plasma) kommen, was nicht von Nachteil ist, da im nächsten Schritt
ohnehin eine Durchmischung von Schutzmittel und Überstand erfolgt. Bevorzugt
ist eine Vorrichtung, wobei durch weiteres Drehen (z.B. 90°) des Hohlstempels
(7) dieser aus der ersten Halterung gelöst wird und bis zum Anschlag
an die Dichtungsscheibe (6) aus der Vorrichtung herausgezogen
werden kann. Dadurch gelangt das Schutzmittel (5) durch
die Überströmkanäle (8)
in den Überstand
(z.B. Plasma). Durch die Gestaltung der Oberfläche (z.B. Rauhigkeit, keine
feste Verbindung zum Hohlstempel) der Überströmkanäle (8) ist die Dichtungsscheibe
(6) weiterhin beweglich, wenn etwas stärkerer Zug ausgeübt wird.
Alternativ kann eine Verbindung zwischen Hohlstempel und Dichtungsscheibe
(z.B. über
eine Nut) hergestellt werden, welche sich vor dem Mischen des Überstandes
mit dem Schutzmittel lösen
lasst (z.B. durch Drehen). Durch mehrfaches Überkopf-Drehen der Vorrichtung
wird ein gleichmäßiges Durchmischen
des Überstandes
mit dem Schutzmittel erreicht.
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In
einer noch weiteren bevorzugten Ausführung der Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet, dass der Hohlstempel
(7) innerhalb des ersten Probenraums (12), insbesondere
durch eine Drehung, am Anschlag fixierbar ist.
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In
einer noch weiteren bevorzugten Ausführung der Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet, dass der Einlass (1) einen
Schraubdeckel mit einem Gewinde aufweist. Das erleichtert sowohl
das Einfüllen
der Probe, als auch das Verschließen und die weitere Lagerung.
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In
einer noch weiteren bevorzugten Ausführung der Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet, dass die poröse Stempelplatte
(2) eine Porengröße von zwischen
500 nm bis 10 μm,
bevorzugt von zwischen 1 μm
bis 7 μm,
am meisten bevorzugt von 2 μm
bis 5 μm
aufweist. Durch Hineindrücken
des Stempels (3) werden Zellen und Überstand (z.B. Blut und Plasma)
getrennt, weil die Flüssigkeit
durch die poröse
Stempelplatte (3) hindurchtreten kann, die Zellen jedoch nicht.
Zu diesem Zweck wird die Porengröße so gewählt (z.B.
2 – 5 μm), dass
ein problemloser Durchtritt der Flüssigkeit ohne Verstopfen der
Stempelplatte stattfindet, der Durchtritt von Zellen jedoch verhindert wird.
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Durch
Zurückziehen
des Stempels (3) werden Schutzmittel-haltiger Überstand
und Zellen gemischt. Dabei kann der Überstand als Flüssigkeit
die Poren der Stempelplatte durchdringen und es erfolgt automatisch
eine optimale Durchmischung von Schutzmittel-haltigem Überstand
und Zellsuspension. Die nunmehr Schutzmittel-haltige Zellsuspension kann
unmittelbar in der Vorrichtung eingefroren werden. Nach Lagerung
und Auftauen kann die Zellsuspension durch Druck auf die Stempel
aus der Vorrichtung gewonnen werden.
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In
einer noch weiteren bevorzugten Ausführung der Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet, dass die Stempel (3, 7)
mit einer Sollbruchstelle und/oder einer entsprechenden Markierung
versehen sind oder die Griffe der Stempel (3, 7)
lösbar
vorgesehen sind. Die Vorrichtung kann also mit einer Sollbruchstelle
für die Stempel
versehen sein, die für
die Lagerung abgebrochen werden können. In diesem Fall ist es
auch vorteilhaft, wenn die Vorrichtung an der Anschlussseite einen
Schraubdeckel besitzt, welcher zum Gewinnen der Zellsuspension entfernt
wird.
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In
einer noch weiteren bevorzugten Ausführung der Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung ist diese dadurch gekennzeichnet, dass das Probenaufbereitungsmittel
ausgewählt
ist aus einem Kryokonservierungsmittel, insbesondere DMSO, Hydroxyethylstärke (HES),
wie etwa 10% oder 20% DMSO in PBS oder einem anderen wässrigen
Puffer. Durch mehrfaches Überkopf-Drehen
der Vorrichtung wird ein gleichmäßiges Durchmischen
des Überstandes mit
dem Schutzmittel erreicht. Die Schutzmittel-Menge ist so gewählt, dass
die Zellen in optimaler Weise bei der Kryo-Konservierung geschützt werden.
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In
einem letzten Aspekt der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist diese vollständig Pyrogen frei,
um nicht mit den Messungen zu interferieren.
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Die
Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung
sind unter anderem, dass die z.B. Spritze (als bevorzugte Ausführungsform)
alle nötigen
Mittel enthält,
um vor Ort das Blut für
einen Gefriervorgang vorzubereiten. Dabei sind keine weiteren aufwendigen
Vorrichtungen außer
einem –80°-Kühlschrank oder
anderen geeigneten Einfriergerät
bei Temperaturen von –100°C oder höher erforderlich.
Blutproben können
so mit geringstem Aufwand direkt in der erfindungsgemäßen Vorrichtung
gewonnen werden, das Zusatzstoffen kann schonend zugemischt und
die Proben eingefroren werden. Weiterhin kann die Kryokonservierung
ohne den Einsatz von flüssigem Stickstoff
(z.B. im –80°C-Tiefkühler bzw.
Transport auf Trockeneis) erfolgen. Das Prinzip kann für andere Zellsuspensionen
ebenfalls eingesetzt werden.
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Es
müssen
vor Ort keine hochspezialisierten Labors mit entsprechend qualifiziertem
Personal eingerichtet werden. Weiterhin entfallen sämtliche
Arbeitsschritte sowie die Geräte
und Chemikalien zur Isolierung der Zellen. Dadurch werden Kosten
und Aufwand enorm reduziert (voraussichtlich um 90 % und mehr).
Weiterhin wird die Gefahr von Veränderungen des Zellstatus durch
Manipulation enorm reduziert.
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Besondere
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden nun mit Hilfe der Figuren, der
Bezugszeichenliste und der Beispiele weiter verdeutlicht, ohne dadurch
beschränkt
zu werden.
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1A bis
C zeigt schematisch eine bevorzugte Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung und deren Verwendung bei der Probenentnahme und dem Verschließen der
Vorrichtung.
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2A bis
C zeigt schematisch die bevorzugte Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung aus 1 und deren Verwendung bei der
Entfernung der Klammer, der Filtration und dem Mischen des zellfreien Überstands
mit Probenaufbereitungsmittel (Schutzmittel).
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3A zeigt
schematisch eine bevorzugte Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
aus 1 und 2 und deren Verwendung bei Durchmischung
der Gesamtprobe mit dem Probenaufbereitungsmittel (Schutzmittel).
Nicht gezeigt sind weitere Schritte des Einfrierens bei zwischen –70°C und –100°C ohne flüssigen Stickstoff
in einem Kühlschrank
oder auf Trockeneis.
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4 zeigt
eine weitere bevorzugte Vorrichtung der vorliegenden Erfindung,
bei der die zweite Kammer (5) mittels einer Durchstechvorrichtung
(13) geöffnet
wird. Die zweite Kammer (5) wird vom Probenraum (12)
in diesem Fall durch eine Membran (14) getrennt (A). Bei
Bewegung des Stempels (3) nach oben wird die Membran (14)
oder andere Trennwand durch die Durchstechvorrichtung (13)
durchstoßen
oder nach oben gedrückt,
während
die Filtration stattfindet (B). Dabei wird das Schutzmittel in die
Probenkammer (12) freigesetzt und bei Zurückziehen des
Stempels (3) mit dem Plasma gemischt.
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Beispiel
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Schritt 1: Probenentnahme
(1A und B)
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Die
Probenentnahme (z.B. Blut mit Gerinnungshemmern) erfolgt wie mit
einer üblichen
Spritze. Dichtungsring (4) und bewegliche Dichtungsscheibe
(6) garantieren den erforderlichen Unterdruck zum Aufziehen
der Probe. Wären
diese Teile nicht vorhanden, würde
beim Zurückziehen
der Stempel kein Unterdruck im Probenraum (12) entstehen,
da Luft durch die poröse
Stempelplatte (2) in den Probenraum (12) gelangen
würde.
Die Dichtungsscheibe (6) wird durch geeignete Oberflächengestaltung
(z.B. Rauhigkeit) der Überströmkanäle (8) mitgezogen.
Alternativ kann die Dichtungsscheibe über eine Nut mit dem Hohlstempel
(7) verbunden werden. Für
den Schritt 5 („Überstand
mit dem Schutzmittel mischen",
siehe unten) würde
dann die Verbindung zwischen Dichtungsscheibe und Hohlstempel (z.B.
durch Drehen des Stempels) gelöst werden.
Die Verbindungsklammer (9) sorgt für das definierte gleichzeitige
Zurückziehen
beider Stempel (3 und 7). Es gelangt kein Schutzmittel
in die Probe, weil das Volumen des Reservoirs gleich bleibt. Für den Hohlstempel
(7) ist ein Anschlag vorhanden, welcher den Stopp beider
Stempel dergestalt garantiert, dass kein Schutzmittel (5)
in den Probenraum (12) gedrückt wird. Der Hohlstempel lässt sich
durch Drehen (z.B. um 90°)
in dieser Position fixieren (z.B. durch eine Nut im Anschlag, Notwendigkeit
für Fixierung,
siehe Schritt 4).
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Schritt 2: Kanüle entfernen,
Vorrichtung verschließen (1C)
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Nach
dem Entfernen der Luer-Lock-Kanüle (10)
wird die Vorrichtung mit einem handelsüblichen Luer-Lock-Deckel (1)
verschlossen. Das Verschließen
ist Voraussetzung für den
Schritt 4 (siehe dort), dient jedoch auch dem Schutz der Probe.
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Schritt 3: Klammer entfernen
(2A)
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Die
Verbindungsklammer (9) wird von vom Stempel (3)
sowie vom Hohlstempel (7) entfernt.
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Schritt 4: Zellen vom Überstand
trennen (2B)
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Durch
Hineindrücken
des Stempels (3) werden Zellen und Überstand (z.B. Blut und Plasma)
getrennt, weil die Flüssigkeit
durch die poröse
Stempelplatte (2) hindurch treten kann, die Zellen jedoch nicht.
Zu diesem Zweck wird die Porengröße so gewählt (z.B.
2 – 5 μm), dass
ein problemloser Durchtritt der Flüssigkeit ohne Verstopfen der
Stempelplatte stattfindet, der Durchtritt von Zellen jedoch verhindert wird.
Die Vorrichtung enthält
eine Markierung für
den Stopp des Stempels (z.B. für
Blut bei etwa 50 % des gesamten Probenvolumens), um die Zellen keinem mechanischen
Druck auszusetzen. Der Hohlstempel bleibt in seiner Zwischenstellung
fixiert (siehe Schritt 1). Durch Turbulenzen kann es zu einem ersten Übertreten
von Schutzmittel durch die Überströmkanäle sowie
zur Durchmischung mit Überstand
(z.B. Plasma) kommen, was nicht von Nachteil ist, da im nächsten Schritt
ohnehin eine Durchmischung von Schutzmittel und Überstand erfolgt.
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Schritt 5: Überstand
mit Schutzmittel mischen (2C)
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Durch
weiteres Drehen (z.B. 90°)
des Hohlstempels (7) wird dieser aus der ersten Halterung
gelöst
und kann bis zum Anschlag an die Dichtungsscheibe (6) aus
der Vorrichtung herausgezogen werden. Dadurch gelangt das Schutzmittel
(5) durch die Überströmkanäle (8)
in den Überstand
(z.B. Plasma). Durch die Gestaltung der Oberfläche (z.B. Rauhigkeit, keine
feste Verbindung zum Hohlstempel) der Überströmkanäle (8) ist die Dichtungsscheibe
(6) weiterhin beweglich, wenn etwas stärkerer Zug ausgeübt wird.
Alternativ kann eine Verbindung zwischen Hohlstempel und Dichtungsscheibe
(z.B. über eine
Nut) hergestellt werden, welche sich vor dem Mischen des Überstandes
mit dem Schutzmittel lösen lässt (z.B.
durch Drehen). Durch mehrfaches Überkopf-Drehen
der Vorrichtung wird ein gleichmäßiges Durchmischen
des Überstandes
mit dem Schutzmittel erreicht. Die Schutzmittel-Menge ist so gewählt, dass
die Zellen in optimaler Weise bei der Kryo-Konservierung geschützt werden.
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Schritt 6: Schutzmittel-haltigen Überstand
mit Zellen mischen (3A)
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Durch
Zurückziehen
des Stempels (3) werden Schutzmittel-haltiger Überstand
und Zellen gemischt. Wie bei Schritt 4 kann der Überstand als Flüssigkeit
die Poren der Stempelplatte durchdringen. Dabei erfolgt automatisch
eine optimale Durchmischung von Schutzmittel-haltigem Überstand und Zellsuspension.
Die nunmehr Schutzmittel-haltige Zellsuspension kann unmittelbar
in der Vorrichtung eingefroren werden. Nach Lagerung und Auftauen kann
die Zellsuspension durch Druck auf die Stempel aus der Vorrichtung
gewonnen werden. Die Vorrichtung kann mit einer Sollbruchstelle
für die
Stempel versehen sein, welche für
die Lagerung abgebrochen werden können. In diesem Fall ist es
vorteilhaft, wenn die Vorrichtung an der Anschlussseite einen Schraubdeckel
besitzt, welcher zum Gewinnen der Zellsuspension entfernt wird.
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- 1
- Luer
Lock-Anschluss für
Kanüle
und Deckel
- 2
- Stempelplatte
mit Poren
- 3
- Stempel
- 4
- Dichtungsring
- 5
- zweite
Kammer mit Probenaufbereitungsmittel (Schutzmittel)
- 6
- bewegliche
Dichtungsscheibe
- 7
- Hohlstempel
- 8
- Einlass, Überströmkanäle mit Führung für bewegliche
Dichtungsscheibe
- 9
- Verbindungsklammer
- 10
- Luer
Lock-Kanüle
- 11
- verschließbarer Einlass
- 12
- erste
Probenkammer
- 13
- Durchstechvorrichtung
- 14
- Membran