-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Trennmaterial für die Reinigung
von HisTag-Proteinen, sowie eine Säule, welche dieses Trennmaterial
enthält.
-
Für die Reinigung
von nativen Proteinen wird die immobilisierte Metallionen-Affinitäts-Chromatographie,
kurz IMAC genannt eingesetzt. Die Methode wurde erstmals 1975 beschrieben
(Porath et al., 1975). Das Prinzip beruht auf der reversiblen Bindung
bestimmter Aminosäuren
(Histidin, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin) an immobilisierte
Metallionen, wie Co2+ oder Ni2+.
Die Immobilisierung erfolgt über eine
chelatisierende Gruppe, die kovalent mit einem Trägermaterial
verbunden ist. Die Bindung zwischen Aminosäureresten eines Proteins und
den Metallionen kann durch Absenkung des pH-Wertes oder durch eine
Verdrängungsreaktion
mit Imidazol aufgehoben werden.
-
Die
IMAC hat sich zu einer der wichtigsten Methoden zur Reinigung von
rekombinanten Proteinen entwickelt, die am N- oder C-Terminus mit
einem Polyhistidin-Peptid fusioniert sind. Man spricht daher von
Polyhistidin-Fusionsproteinen. Es existiert eine Vielzahl von Polyhistidin-Peptiden, die sich
in der Anzahl und Anordnung der Histidinreste und damit in der Affinität zu dem
IMAC-Trennmaterial unterscheiden, z.B. (H)n,
(H–X)n, (H–X3–H
)n, wobei H für Histidin steht und X eine
beliebige Aminosäure
sein kann.
-
Zur
Immobilisierung der Metallionen werden verschiedene chelatisierende
Gruppen verwendet, wie z.B. Iminodiessigsäure (IDA), Nitrilotriessigsäure (NTA),
carboxymethyliertes Aspartat (CM-Asp) und Tris(carboxymethyl)ethylenediamin
(TED). Zweiwertige Metallionen werden von der IDA-Gruppe über drei
koordinative Bindungen festgehalten. Entsprechend spricht man von
einem dreizähnigen
Liganden. NTA und CM-Asp binden Metallionen über vier Koordinationsstellen
und stellen somit vierzähnige
Liganden dar. Bei Tris(carboxymethyl)ethylenediamin (TED) handelt
es sich um einen fünfzähnigen Liganden,
der Metallionen über
fünf Koordinationsstellen bindet.
Je nach Zähnigkeit
der Liganden ergibt sich eine unterschiedliche Anzahl an Bindungsstellen vom
Metallion zum Protein. Der Me-IDA-Chelat-Komplex hat drei Koordinationsstellen übrig, um
die Seitenkette einer Aminosäure,
wie z.B. Histidin, zu binden. Der Me-NTA- und Me-CMAsp-Chelat-Komplex kann
entsprechend zwei und der Me-TED-Chelat-Komplex nur eine Bindung
zum Protein ausbilden.
-
Aus
der Literatur ist bekannt, daß Kapazität und Selektivität entscheidend
von der Zähnigkeit
abhängen.
Mit steigender Zähnigkeit
sinkt die Anzahl der möglichen
Bindungen zum Protein, wobei die Affinität zum rekombinanten Protein
und damit die Kapazität
abnimmt und die Spezifität
zunimmt. Folglich korreliert eine hohe Kapazität mit einer geringen Spezifität und umgekehrt.
Beispielsweise können
mit IDA und NTA rekombinante Proteine in hoher Ausbeute angereichert
werden (hohe Kapazität),
wobei die Eluate jedoch oftmals mit weiteren Proteinen verunreinigt
sind (geringe Spezifität).
Viele Folgeanwendungen, wie z.B. die Proteinkristallisation, erfordern
jedoch besonders reine Eluate, die z.B. mit einem TED-IMAC Material
(hohe Spezifität)
erzielt werden können.
-
Die
feste Bindung zum Protein über
3 bzw. 2 Koordinationsstellen (IDA und NTA) bedingt zudem sehr hohe
Konzentrationen an Imidazol im Elutionspuffer um diese Wechselwirkung
aufzuheben. Aus der Literatur ist jedoch bekannt, daß eine Vielzahl von
Proteinen in Anwesenheit hoher Konzentrationen an Imidazol in ihrer
Struktur oder Aktivität
beeinträchtigt
werden. Insbesondere bei Enzymen ist oftmals eine Hemmung ihrer
spezifischen Aktivität
zu beobachten. Entsprechend ist eine sich an die IMAC anschließende Reinigung
bzw. Umpufferung der Proteine notwendig ( z.B. durch Dialyse oder
Ultrafiltration ) . Für
kommerziell erhältliche
Trennmaterialien wie IDA-Sepha-rose (Amersham Biosciences) und Ni-NTA-Agarose
(Qiagen) werden 500 mM bzw. 250 mM Imidazol empfohlen. Das TED-basierte
Trennmaterial Protino (MACHEREY-NAGEL) mit nur einer Bin dungsstelle
zum Protein benötigt
für die
Elution häufig
weniger als 100 mM Imidazol.
-
Die
Aufgabe der Erfindung liegt darin, ein Trennmaterial für die IMAC
bereitzustellen, das bei hoher Kapazität einen hohen Grad an Selektivität bietet
und zudem die Elution der rekombinanten Proteine unter solch niedrigen
Imidazolkonzentrationen erlaubt, daß eine Beeinträchtigung
der Proteine praktisch ausgeschlossen werden kann und diese ohne weitere
Aufreinigung direkt für
eine Vielzahl von Folgeanwendungen eingesetzt werden können.
-
Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch
gelöst,
daß der
aktive Chelatbildner in nicht sättigender
Konzentration vorliegt, und zwar zweckmäßigerweise von 10 bis 90 %,
vorzugsweise im Bereich von 15 % bis 25 %. Aufgrund der wesentlich niedrigeren
Belegung des Trägermaterials
mit einem oder mehreren Chelatbildnern wird eine erheblich bessere
Kombination von Kapazität
und Selektivität erzielt.
Insbesondere wird bei Chelatbildnern, die von Hause aus eine hohe
Kapazität
haben, die Selektivität
wesentlich heraufgesetzt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Elution
der Proteine mit relativ niedrigen Imidazolkonzentrationen stattfinden
kann, so daß eine
Beeinträchtigung
der Proteine ausgeschlossen und diese ohne weitere Aufreinigung
direkt für
eine Vielzahl von Folgeanwendungen eingesetzt werden können.
-
Als
Chelatbildner für
das vorbeschriebene Verfahren kommen vorzugsweise die oben schon
angegebenen Iminodiessigsäure
(IDA), Nitrilotriessigsäure
(NTA), carboxymethyliertes Aspartat (CM-Asp) und Tris(carboxymethyl)ethylenediamin
(TED) in Frage, aber auch Kombinationen davon.
-
Die
nicht von dem Chelatbildner belegten Stellen können von einer zweiten, inaktiven
Substanz eingenommen werden, beispielsweise Glymo-Silan. Die Reduzierung
der Belegung kann aber auch dadurch erreicht werden, daß die Bindungsstellen
des Chelatbildners teilweise inaktiviert, z.B. hydrolisiert werden.
-
Als
Träger
kommen alle Hart- und Weichgele, beispielsweise Kieselgele oder
Agarose/Sepharose, in Frage. Poröse
Trägermaterialien
sollten eine Porenweite von 100 bis 2000 Å aufweisen. Als Träger haben
sich Partikelträger
bewährt.
Es können
jedoch auch feste Träger,
Membranen oder dergleichen verwendet werden. Im Falle des Partikelträgers sollte
die Partikelgröße bevorzugt
zwischen 30 und 150 μm
betragen.
-
Die
Erfindung bezieht sich des weiteren auch auf eine Säule mit
dem vorbeschriebenen Trennmaterial, wobei das Trennmaterial insbesondere
im Falle eines Partikelmaterials zwischen zwei Fritten eingeschlossen
sein kann.
-
In
der nachstehenden Zeichnung und den anliegenden Abbildungen ist
die Erfindung beispielhaft erläutert.
Es zeigen:
-
1: Elutionsprofil des 6xHis-GFPuv
Proteins in Abhängigkeit
von der IMAC-Matrix. Bestimmung der Proteinmenge über Messung
der Absorption bei 395 nm.
-
2: SDS-PAGE des Elutionsfraktionen aus 1. Färbung der Gele mit Coomassie
Blue.
-
3: Ausbeute an 6xHis-GFPuv
bei unterschiedlichen Expressionsraten und IMAC-Materialien. 5 ml
Kulturen mit unterschiedlichem Gehalt des HisTag-Proteins.
-
4: Elutionsverhalten der
rekombinanten 6xHis Aspartase bei Einsatz unterschiedlicher IMAC-Materialien.
E1, E2 und E3 entsprechen den Elutionsfralktionen 1, 2 und 3 (je
300 μl LEW
Puffer mit 250 mM Imidazol). Analyse mittels SDS-PAGE, Proteinfärbung mit
Coomassie Blue.
-
Ausführungsbeispiele
-
Umsetzung von Kieselgel
mit IDA- und Glymo-Silan
-
Zur
Synthese des IDA-Silans werden 1,0 g Iminodiessigsäure (IDA)
und 1,53 g NaOH in 18 ml Wasser bei 0°C gelöst.
-
Zu
der Lösung
werden tropfenweise 1,776 g 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilane
(Glymo-Silan) zugegeben. Sobald die Temperatur des Reaktionsgemisches
22°C erreicht
hat, wird über
Nacht bei 90°C
im Schüttelwasserbad
inkubiert. Zur Umsetzung des Kieselgels mit IDA- und Glymosilan
im Stoffmengenverhältnis
von ca. 1:5 wird das 7,5 mmol IDA-Silan enthaltende Reaktionsgemisch mit
8,8 g (37,2 mmol) Glymo-Silan versetzt und mit HNO3 auf pH
3 eingestellt (nachfolgend Ansatz A genannt). Zur Synthese eines
klassischen IDA-Silicas wird vergleichend das 7,5 mmol IDA-Silan enthaltende
Reaktionsgemisch ohne Zugabe von Glymo-Silan mit HNO3 auf
pH 3 eingestellt (nachfolgend Ansatz B genannt).
-
Nach
Zugabe von jeweils 20 g Kieselgel mit einer Porenweite von 1000 Å und einer
Partikelgröße von 90
um wird die Suspension für
3 Stunden auf 90°C
erhitzt. Das Kieselgel wird abfiltriert, mit Wasser, Methanol und
Wasser gewaschen. Die Beladung mit Nickel-Ionen erfolgt durch Zugabe
von 80 ml einer 0,1 M NiSO4-Lösung. Die
Suspension wird 1 h geschüttelt.
Das Kieselgel wird abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Methylenchlorid
gewaschen und anschließend
getrocknet.
-
Beispiel 1:
-
Imidazolstufenelution – Test der
Affinität
und Spezifität
-
1
ml Leersäulen
mit Polyethylenfritte werden mit jeweils 40 mg Trennmaterial aus
Beispiel 1 befällt und
eine weitere Fritte oben aufgesetzt. Als Referenz wird zusätzlich ein
mit TED modifiziertes Kieselgel (Macherey-Nagel) verwendet. Das
Trennmaterial wird mit 320 μl
50 mM Tris-HCl,
300 mM NaCl, pH 8 (Puffer LEW) äquilibriert
und mit einem geklärten Escherichia
coli-Lysat, das 500 μg
des rekombinanten Proteins 6xHis-GFPuv enthält, beladen. Bei dem rekombinanten
Protein handelt es sich um eine Variante des „Green fluorescent protein", das mit einem sechs
Histidin enthaltenden Peptid fusioniert ist. Nach Bindung des Proteins
wird das Trennmaterial sukzessiv mit jeweils 800 μl LEW-Puffer
mit ansteigender Imidazolkonzentration (0, 10, 20, 50, 80, 100, 120,
150, 200 und 500 mM) gewaschen. In den Fraktionen wird mittels Absorptionsmessung
bei 395 nm die Menge des eluierten rekombinanten Proteins bestimmt.
Die in den Fraktionen enthaltenden Proteine werden ferner mittels
SDS-PAGE untersucht, um die Reinheit der Eluate vergleichen zu können.
-
Ergebnisse
-
Aus 1 ist zu ersehen, daß bei dem Trennmaterial,
das ausschließlich
mit IDA-Gruppen modifiziert wurde (Ansatz B), relativ hohe Imidazolkonzentrationen
benötigt
werden, um das gebundene Protein zu eluieren. Das Maximum liegt
bei 200 mM. Im Gegensatz dazu liegt bei dem Trennmaterial, das mit
einer Mischung von IDA- und Glymo-Silan umgesetzt wurde (Ansatz
A), das Maximum lediglich bei 60 mM. Das mitgetestete Ni-TED-Trennmaterial hat
bei 20 mM Imidazol sein Maximum. Das Ni-IDA Trennmaterial aus Ansatz
A ähnelt
daher viel stärker dem
klassischen Ni-TED als dem klassischen Ni-IDA Ansatz. Insbesondere
die Affi nität
zum rekombinanten Protein (deutlich hier durch die niedrigen Imidazolkonzentrationen,
die zur Elution notwendig sind) hebt den Ansatz A vom klassischen
Ni-IDA ab.
-
Durch
die SDS-PAGE Analyse kann die Reinheit der Eluate beurteilt werden
(vgl. 2). Als Maß für die Spezifität kann die
Menge der verunreinigenden Proteine herangezogen werden, die vom Trennmaterial
bei niedrigen Imidazolkonzentrationen abgewaschen werden. Während bei
Ni-TED und Ni-IDA (Ansatz A) das rekombinante Protein schon bei
geringen Imidazolkonzentrationen in hoher Reinheit eluiert, werden
beim klassischen Ni-IDA (Ansatz B) zunächst Verunreinigungen abgewaschen
und das Protein erst bei viel höheren
Imidazolkonzentrationen eluiert. Die Spezifität des Ni-IDA aus Ansatz A ist
folglich deutlich höher
als die des klassischen Ni-IDA (Ansatz B).
-
Beispiel 2: Reinigung
von unterschiedlich stark exprimiertem rekombinantem GFPuv im 96er
Maßstab.
-
Die
Versuche werden in einer 96-Kammer Filtrationseinheit unter Gravitation
durchgeführt.
Die Kammern der Filtrationseinheit werden alternativ mit folgenden
Trennmaterialien befällt:
50 mg Ni-IDA (Ansatz A) und 50 mg Ni-IDA (Ansatz B). Das Säulenbettvolumen
beträgt
bei allen Trennmaterialien 100 μl.
Die Filtrationseinheit wird auf einem Deep Well Block platziert.
Das Trennmaterial wird durch Zugabe von 500 μl LEW-Puffer (50 mM Tris-HCl,
300 mM NaCl, pH 8) pro Kavität äquilibriert
und mit 1 ml Escherichia coli-Lysat beladen. Die Lysate wurden aus
5 ml Expressionskulturen mit unterschiedlicher Expressionsrate gewonnen,
die einen unterschiedlichen Gehalt an rekombinantem Protien (6xHis-GFPuv)
aufweisen. Nach Waschen des Trennmaterials mit 2× 800 μl LEW-Puffer wird das rekombinante
Protein jeweils dreimal mit 250 μl
Elutionspuffer (LEW-Puffer mit 250 mM Imidazol) eluiert. Die Gesamtmenge
des eluierten 6xHisTag-GFPuv wird mittels Fluoreszenzmessung (Anregung:
360 nm, Emission: 530 nm) bestimmt.
-
Ergebnisse
-
Mit
dem neuartigen Ni-IDA-Trennmaterial (Ansatz A) können aus 5 ml Expressionskulturen
im 96er Maßstab
wesentlich höhere
Ausbeuten erzielt werden als mit klassischem Ni-TED. Beispielsweise beträgt die Gesamtausbeute
aus einer Expressionskultur mit einem Gehalt von 100 mg 6xHisTag-GFPuv pro 1 l Kultur,
bei Ni-TED 200 μg
(3). Bei Ni-IDA (Ansatz A) wird
eine ca. doppelt so hohe Ausbeute von 365 μg erzielt. Auch wenn die Spezifität des Ni-IDAs
(Ansatz A) der des klassischen Ni-TEDs ähnelt, so erlaubt das IDA-basierte
Trennmaterial doch wesentlich höhere
Ausbeuten und Kapazitäten, ähnelt in
diesen Eigenschaften daher mehr dem klassischen Ni-IDA.
-
Beispiel 3:
-
Reinigung
von polyhistidinmarkierter Aspartase
-
Die
Kammern einer 96-Kammer-Filtrationseinheit (Einsatz unter Gravitation)
werden mit folgenden Trennmaterialien befüllt: 50 mg Ni-IDA (Ansatz A),
50 mg Ni-IDA (Ansatz B), 100 μl
Ni-NTA-Agarose. Die Ni-NTA Agarose wird als Beispiel für ein Weichgel
in den Versuchen mitgeführt.
Das Säulenbettvolumen
beträgt
bei allen drei Trennmaterialien 100 μl. Die Filtrationseinheit wird
auf einem Deep Well Block platziert. Das Trennmaterial wird durch
Zugabe von 500 μl
LEW-Puffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 8) pro Kavität äquilibriert
und mit 1 ml Escherichia coli-Lysat aus 1 ml Kultur beladen. Bei
dem rekombinanten Protein handelt es sich um die Aspartase aus E.
coli, die mit einem sechs Histidin enthaltenden Peptid fusioniert
ist. Nach Waschen des Trennmaterials mit 2× 800 μl LEW-Puffer wird das rekombinante Protein
jeweils dreimal mit 300 μl
Elutionspuffer (LEW-Puffer mit 250 mM Imidazol) eluiert. Anschließend werden
die einzelnen Fraktionen mittels SDS-PAGE analysiert.
-
Ergebnisse
-
Die
SDS-PAGE-Analyse zeigt, wie sich das eluierte HisTag-Protein auf drei
Elutionsfraktionen verteilt (vgl. 4).
Mittels Ni-IDA (Ansatz A) wird nicht nur die höchste Gesamtausbeute erzielt,
das rekombinante Protein wird darüber hinaus hauptsächlich in
der ersten Fraktion eluiert. Dies erlaubt ein Auf konzentrieren
des Zielproteins.
-
Im
Gegensatz zu klassischen Ni-TED oder klassischen Ni-NTA kann mit dem
neuartigen Ni-IDA-Trennmaterial (Ansatz A) das rekombinante Protein
in hoher Ausbeute und Konzentration gereinigt werden.