CN113024655A - 一种高效去除rhNGF前体的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种高效去除rhNGF前体的纯化方法。本发明利用羟基磷灰石介质的复合性分离模式，能够有效的将rhNGF前体物质和目标产物得到分离，产品回收率高，适合大规模工业化生产。

Description

一种高效去除rhNGF前体的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种高效去除rhNGF前体的纯化方法。

背景技术

羟基磷灰石(Ca5(PO4)3OH)2是磷酸钙的一种形式，五个钙双联体(C位点)和一对含羟基的磷三联体(P位点)组按一个重复的几何图形排列，在电子显微照片中可看到重复六边形结构，以它制备的羟基磷灰石分离介质具有独特的分离机理，是唯一直接用于蛋白质和核酸纯化的无机层析填料。该填料具有高度耐碱，生物安全性高的特点。其中磷酸离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有离子交换特性，可有NaCl浓度梯度或者磷酸钠梯度洗脱，另外其中的钙离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属鳌合的方式结合，该结合方式对NaCl不敏感，可由磷酸钠浓度梯度洗脱。因此该填料可以用磷酸钠单梯度洗脱，也可以采用NaCl梯度洗脱后以低浓度磷酸钠缓冲液液平衡，再以磷酸钠浓度梯度洗脱的双梯度洗脱模型，可达到更高的分辨率。

成熟rhNGF蛋白单体仅含有117个氨基酸，在细胞内表达时需要包含其信号肽和前体蛋白序列，所设计的pre-ngf基因为717bp(含终止密码子)，可表达238个氨基酸的preproNGF前体蛋白，prepro NGF经过信号肽切割、二聚体化前导肽切割，形成全长为234个氨基酸的rhNGF成熟蛋白。对于目标产物和与其近似的前提物质目前通常采用疏水层析利用两种物质疏水性的细微差异进行分离，效果不能令人满意，因此通过大量的填料筛选，发现本发明所采用的的羟基磷灰石层析利用其独特的分离原理对上述两种相似物分离效果甚好，能够在后期生产发挥巨大的应用潜能。

发明内容

本发明是为了解决现有离子交换、疏水等层析去除前体物质效果不理想而完成的，其具体去除前体物质的方法包括以下步骤：

1)收获细胞发酵液，后采用离子交换层析、疏水层析等一步或多步分离手段对发酵液上清进行初步纯化，洗脱目标待进一步分离。

2)平衡：使用3～5个柱床体积的平衡缓冲平衡层析柱。

3)上样：将初步分离后的样品溶液脱盐降低溶液的电导率至3～9ms/cm，使目标蛋白充分结合于平衡完毕的层析柱上。

4)平衡液淋洗：继续用平衡液淋洗，去除未结合的杂质，直至紫外吸收趋近于基线。

5)样品淋洗：增加层析缓冲液磷酸盐浓度，淋洗去除跟目标蛋白近似的rhNGF前体，至紫外吸收值趋于恒定。

6)样品洗脱：继续增加层析缓冲液磷酸盐浓度，洗脱目标蛋白rhNGF，得到高纯度纯品。

附图说明

图1羟基磷灰石层析图谱

具体实施方式

以下的实施例意在进一步说明本发明，而无论如何都不意在藉此限制本发明的范围。

实施例1：

收获CHO细胞发酵液后采用离子交换层析、疏水层析等一步或多步分离手段对发酵液上清进行初步纯化，洗脱目标待进一步分离；装填层析柱：采用通用的层析柱装填方式，将填料装填至HiScale 16中，柱床高度10cm；使用5个柱床体积的平衡缓冲平衡层析柱，流速10ml/min；将初步分离后的样品溶液通过稀释，超滤或柱层析脱盐等方式将样品溶液电导率调节至6ms/cm，使目标蛋白充分结合于平衡完毕的层析柱上；继续用平衡液淋洗约2个柱床体积，去除未结合的杂质，直至紫外吸收趋近于基线；提高层析缓冲液磷酸盐浓度至100mM，淋洗去除跟目标蛋白近似的rhNGF前体，直至紫外吸收值趋于恒定；样品洗脱：继续提高层析缓冲液磷酸盐浓度至150mM，洗脱目标蛋白rhNGF，得到高纯度纯品。

Claims (3)

1.一种使用羟基磷灰石层析去除rhNGF前体的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：①样品处理：将CHO细胞培养物先经过一次或多次柱层析，初步纯化，得到待羟基磷灰石层析进一处理的的样品；②样品洗涤：将步骤①所得样品进一步结合于羟基磷灰石层析柱中，用洗涤缓冲液清洗去除结合于柱上的前体物质；③样品洗脱：用洗脱缓冲液对进行了步骤②的层析柱进行洗脱，得到重组人神经生长因子纯品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中所述的洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲液，磷酸盐浓度为100mM～150mM。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤③中所述的洗脱缓冲液同时满足以下条件，以清除前体，并收获目标产物：

a.电导率比步骤②的层析洗涤缓冲液高；

b.缓冲液磷酸盐浓度为150mM～300mM；

c.步骤②的洗涤缓冲液将紫外吸收值降至基线以达到前体物质彻底去除再开始本步洗脱。

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