DE2011811A1 - .Pr 12.03.69 Japan I8312-69 Zellwandlösendes Enzym und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

¹¹ Zellwandlösendes Enzym μnd Verfahren zu seiner Herstellung "

Priorität: 12.3.1969, Japan, Nr. 18312/69

Die Erfindung betrifft ein neues Enzym, das Zellwände der verschiedensten ,Mikroorganismen auflöst, und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

In letzter Zeit wurden grosstechnische Verfahren zur Hefe- oder Chlorellaherstellung entwickelt. Es wurde versucht, diese Züchtungen von Mikroorganismen als Nahrungsmittel oder Futter zu verwenden. Bei der praktischen Verwendung dieser Mikroorganismen ergeben sich jedoch viele Probleme wegen ihrer schweren Verdaulichkeit.

Aufgabe der Erfindung war es daher, Mittel und Wege zu finden, die Zellwände von Mikroorganismen abzubauen, um die Zellinhaltsstoffe leichter zugänglich zu machen. Die Zellwände von z.B.

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Chlorella, sind besonders stabil und können nur auf mechanischem Wege zerstört werden. Es wurde erfindungsgemäss festgestellt, dass Mikroorganismen der Gattung Micropolyspora, z.B. der Stamm 434, der beim Fermentation Research Institute, Japan, unter der Nr. 276 und bei der A.T.G.C. unter der Nr. 21489 hinterlegt wurde, in der Gärmaische bei aerober Züchtung ein zellwandlösendes Enzym anreichert.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines zellwandlösenden Enzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Mikroorganismus der Gattung Micropolyspora, in einem Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, assimilierbare Stickstoffquellen und essentielle anorganische Salze und organische Nährstoffe enthält, solange gezüchtet wird, bis in der Gärmaische eine wesentliche Menge zellwandlösendes Enzym angereichert ist, und das Enzym aus der Gärmaische isoliert wird.

Der. bevorzug verwendete Mikroorganismum,

/ Stamm 4j54, der das zellwandlösende Enzym der Erfindung

erzeugt, hat folgende taxonomischen Eigenschaften:

A. Morphologische Eigenschaften

1. Luftrayzel

Ungefähr 0,7 - I₁O u Durchmesser. Verzweigt und massig am Nährmedium haftend. Weiss.

2. Substratmyzel

Etwas dünner als das Luftmyzel} ungefähr 0,5 - 0,7 μ Durchmesser, Es neigt dazu, in den Agar-Nährboden einzudringen.

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_ 3 —

3. Bildung von kuppeiförmigen Körpern

Häufig wird eine Aggregation von kleinen, kuppeiförmigen Körpern auf der Oberfläche des Agar-Nährbodens beobachtet.

4. Sporen

Sphärisch oder oval. ■ Ungefähr'0,8 - 1,0 ja Durchmesser. Hauptsächliche Bildung direkt seitlich des Myzels. Manchmal werden einzelne Sporen beobachte^. Hauptsächlich treten sie aber in Ketten von 2-10 Sporen auf. Die Ketten sind gerade; Spiralketten werden nicht beobachtet. Die Sporen sind verhältnismässig einfach in einzelne Sporen zu trennen. Bei der Züchtung unter Schütteln werden keine Ketten, die länger als 2 -3 Sporen sind, "beobachtet. Bei der Keimung der Sporen wird die Bildung von 1-2 Sporenröhren aus einer Spore beobachtet. '

5. Myzelspaltung

Bei Plattenzüchtung nicht beobachtet; aber Myzelbruchstücke von 5 - 20 jx treten oft bei der Herstellung des Abstrichs auf.

6. Zusammensetzung der Zellwand.

Nach Hydrolyse der Zellwand mit 6 η HCl wurde papierchromatographisch festgestellt, dass sie meso-#,£ -Diaminopimelinsäure, Arabinose und Galactose enthält. In der Literatur ist beschrieben, dass die Mikroorganismen der Gattung Micropolyspora dieselbe Zusammensetzung wie oben aufweisen.

B. Physiologische Eigenschaften

ι *

1. Saccharose-Nitrat-Agar*
Kein Wachstum. ·

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2. Glucose-Asparagin-Agar
Kein Wachstum.

3. Glycerin-Asparagin-Agar

Massiges Wachstum. Bildung von engen Schichten an der Oberfläche des Nährbodens. Substratmyzel:, blass-braun. Luftmyzel: weiss.

4. Bouillon-Agar.

Gutes Wachstum, Luftmyzel:* weiss. Substratmyzel: blass-braun. Kein lösliches Pigment. Das Medium weist eine pulvrige Oberfläche auf.

5. Gelatine-Agar

Leichtes Wachstum an der Oberfläche des Nährbodens nach 4 Tagen bei 5O⁰C. Am 2. Tag kann keine Verflüssigung der Gelatine festgestellt werden, jedoch wird am 4. Tag eine massige Verflüssigung beobachtet.

6. Bennet-Medium

Gutes Wachstum. Luftmyzel: weiss. Substratmyzel: blaß-braun. Lösliches Pigment: schwach braun.

7. Stärke-Agar mit anorganischen Salzen

Kein Wachstum nach 4 Tagen bei 5O⁰C. Keine Stärkeverflüssigung.

8. Stärke-Rinderpepton-Agar

Gutes Wachstum. Luftmyzel: weiss. Substratmyzel: blassgelb-braun. Lösliches Pigment: blass-braun. Stärke ist nach 2 Tagen bei 50⁰C vollständig hydrolysiert.

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-p-

9. Dextrin—Casein-Agar ·

Gutes Wachstum. luftmyzel: gelb-weiss. Lösliches Pigment:
scnwach gelb-braun. ·

10. Nitrat-Medium

Dünnes, filmähnliches Wachstum. Luftmyzel: weiss. Nitrat wird nicht reduziert. -

11. Lackmus-Milch · · ·

Wachstum mit Ringbildung. Peptonisierung wird nach 2 Tagen bei

ο
50 C beobachtet. _r ·

12. Kartoffeischeiben
Kein Wachstum.

13· Cellulose-Asparagin-Medium

Kein Wachstum. Cellulose wird nicht zersetzt.

14. Cellulose-Dextrin-Casein-Medium

Massiges und kolonienähnliches Wachstum. Luftmyzel: weiss. Fast keine Zersetzung der Cellulose wird beobachtet.

C. Wachstumstemperatur

Auf einem Agar-Nährboden wird bei 30 C kein Wachstum, bei 37⁰C schwaches Wachstum, bei 40 bis 45⁰C massiges Wachstum, bei 45 bis 55°C gutes Wachstum, bei 55 bis 60°C massiges Wachstum mit schlechter Haftung des Luftmyzels und bei 65°C schlechtes Wachstum beobachtet.

D. Hitzebeständigkeit der,Sporen

Bei einer 10-minütlgen Hitzebehandlung bei 100⁰C. werden die
Sporen nicht vernichtet. Bei Extraktion der Sporen mit heissem

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Äthanol stellt man die Anwesenheit von 2,6-Pyridindicarbonsäure fest. Dies wird bei bekannten Mikroorganismen der Gattung Micropolyspora nicht festgestellt.

Wie oben beschrieben, ist der erfindungsgemäss verwendete Mikroorganismus hauptsächlich durch seine Morphologie charakterisiert. Einzelne Sporen oder Sporenketten bilden sich sowohl am luftals auch am Substratmyzel_t aber die Sporenketten werden'reichlich gebildet und sind von stabiler Natur. Die mikroskopische Beobachtung des Abstrichs der Myzelien zeigt eine deutliche Zer-" störung derselben. Die Zusammensetzung der Zellwand des Mikroorganismus ist identisch mit der des Mikroorganismus Micropolyspora brevicatena, der im Jahre 1961 als neue Gattung beschrieben wurde. Der erfindungsgemäss verwendete Mikroorganismus ist auch in vielen physiologischen Eigenschaften dem Mikroorganismus Micropolyspora brevicatena ähnlich, aber er unterscheidet sich darin, dass Micropolyspora brevicatena auf Bouillon-Agar schlechtes Wachstum zeigt und ausserdem bei einer Temperatur von 50 C nicht wächst.

Das im Verfahren der Erfindung verwendete Nährmedium enthält geeignete Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und organische Nährstoffe. Die Kohlenstoffquellen können Polymere mit einem verhältnismässig hohen Polymerisationsgrad sein, wie Stärke, Dextran, Dextrin oder Inulin. Zucker mit einem niederen Polymerisationsgrad, wie Monosaccharide, oder Disaccharide, sind nicht geeignet. Als Stickstoffquellen können Ammoniumaulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat oder Ammoniumnitrat verwendet werden. Die anorganischen Salze werden dem Nährmedium zugesetzt, um verschiedene für das Wachstum des Mikroorganismus easentielle

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Elemente zu liefern. Es kann eine geeignete Mischung verschiedener Phosphate, Kaiiumsalze, Magnesiumsalze, Kupfersalze,_r Eisensalze, Mangansalze und Zinksalze verwendet werden. Organische Nährstoffe werden zugesetzt, um Substanzen, wie Vitamine oder Aminosäuren, die zum Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, zuzuführen. Zu diesem Zweck werden z.B. Hefe- oder Malzextrakt verwendet.

Wie oben beschrieben, kann als Nährmedium zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eines der verschiedenen Gemische der λ genannten Nährstoffe verwendet werden. Das Nährmedium kann aber auch aus den essentiellen anorganischen Salzen und lebenden Zellen bestimmter Hefen, Chlorella, Pilzen oder Bakterien, die gegenüber dem Enzym der Erfindung empfindlich sind, bestehen. Im letzteren Fall dienen die lebenden Zellen als Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und organische Nährstoffe. Man kann aber bessere Ergebnisse erhalten, wenn z.B. Hefe- oder Malzextrakt dem Nährmedium zusätzlich zu den lebenden Zellen als weitere Quellen für organische Nährstoffe zugesetzt werden.

Bei Züchtungsbegimm wird die Kultur von Micropolyspora sp. Nr.434 im allgemeinen mittels einer Platinöse aus einem Schrägr.öhrchen in sterilisiertem Wasser suspendiert. Mit dieser AnzuchtSuspension wird ein Nährmedium der oben beschriebenen Art angeimpft und üblicherweise 16 bis 48 Stunden bei einer Temperatur von 40 bis 60⁰C unter aeroben Bedingungen gezüchtet.

Das zellwandlösende Enzym reichert sich während der Züchtung in der Gärmaische an. Nach der Entfernung der Myzelien, z.B. durch Abzentrifugieren, kann der Überstand der Gärmaische direkt zum

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Auflösen von Zellwänden verwendet werden oder er kann zur Gewinnung eines pulverförmigen Enzympräparates gefriergetrocknet werden.

Zur Gewinnung eines reineren Enzympräparates wird die erhaltene rohe Enzymlösung mit Ammoniumsulfat ausgesalzen oder zur' Fällung des Enzyms mit Aceton behandelt. Zum Aussalzen versetzt man die Enzymlösung bis zu einem Sättigungsgrad von 0,4 mit Ammoniumsulfat, entfernt den gebildeten Niederschlag, setzt weiteres Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 0,6 zu und gewinnt den dabei entstehenden Enzymniederschlag. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Zugabe von Ammoniumsulfat zur Enzymlösung auf ein Mal vorzunehmen, wobei in diesem Fall bessere Ergebnisse erhalten werden, wenn das Ammoniumsulfat direkt bis zu einem Sättigungsgrad von 0,8 zugesetzt wird. Bei der Acetonfällung wird die rohe Enzymlösung mit Aceton zur Bildung des Enzymniederschlags versetzt. Die besten Ergebnisse erhält man bep. langsamer Acetonzugabe bis zu einer Konzentration von 60 $. Nach ungefähr 1-stündigem Rühren isoliert man den gebildeten Niederschlag. Das so erhaltene Enzym wird in einem geeigneten Puffer, z.B. 0,01 m KH₂PO* -Puffer vom p_H~Wert 7,0 gelöst und anschliessend 20 Stunden gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die in der Dialysiermembran verbleibende dialysierte Lösung enthält hochgereinigtes

Weise,

Enzym und kann auf die gleiche/ wie oben für die rohe Enzymlösung beschrieben ist, gefriergetrocknet werden.

Die so erhaltene Substanz ist ein neues Enzym, das leicht Zellwände verscniedener Mikroorganismen, wie Hefe, Bakterien, Pilze und Chlorella, z.B. Candida rugosa, Candida krusei, Candida utiliß, Candida paeudotropicalis, Candida parapsilosia,

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Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Pichia membranaefaciens, Hansenula anomala und Schizo-saccharomyces pombe, auflöst.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist in folgendem Schema wiedergegeben: ;

Nährmedium )

Anzuchtsuspension

Züchtung

20 Std. bei 5CTC

Abzentrifugieren (5000 U/Min., 10 Min.)

Zellen

Überstand

(Rohe Enzymlösung)

Ac e t onbehandlung

Aussalzen mit
Ammoniumsulfat

Abzentrifugieren (10 000 U/Min.

10 Min.) -

Niederschlag

Überstand

Pufferlösung

Dialyse |

Dialysierbad

Retentafc

(gereinigte Enzymlösung)

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Abgesehen von den in den untenstehenden Beispielen angegebenen Eigenschaften weist das zellwandlösende Enzym der Erfindung folgende Merkmale auf:

a) Es ist im p_H~Bereich 5,0 - 9,0 stabil. Sein p^-Optimum liegt im Bereich 7,0 - 8,0.

b) Es ist bei einer Temperatur von 40 - 70⁰C, insbesondere 50 6O⁰C, aktiv. .

c) Im wesentlichen ist es bei niederen Temperaturen stabil und

wird bei einer Temperatur von O⁰C nicht inaktiviert. Bei einer

ο
10-minütigen Behandlung bei 100 G wird es inaktiviert.

d) Es ist in Wasser und verdünnten Salzlösungen leicht löslich, aber in Aceton unlöslich.

e) Durch Ag⁺, Cu⁺⁺, Hg⁺⁺, Fe⁺⁺, Zn⁺⁺, Cd⁺⁺ und Ni⁺⁺ wird es

++ ++
stark und durch Mn und Co massig gehemmt, während es durch Mg aktiviert wird.

Das zellwandlösende Enzym der Erfindung ermöglicht es, wertvolle, intrazelluläre Substanzen, z.B. Proteine, Nucleinsäuren Amino-

» säuren, Vitamine und Enzyme, aus Mikroorganismen zu gewinnen. •

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Da3 5 g lebende Zellen von Candida rugosa JF-IOl, 1 g K₂HPO., 0,5 g MgSO,.7H₂O in 1000 ml destilliertem Wasser enthaltende Nährmedium A vom p„-Wert 7,4 wurde mit Micropolysporu sp_s Nr, 434 angeimpft und unter Schütteln 24 Stunden bei 50 - 55"C gezüchtet;. Die lebenden Zellen von Candida rugosa JE'-lOl wurden vol.!kommen aufgelöst. Die entstandene Gärmaische wurde ύζν. iO Minuten bei 5000 U/Min, zentrifugiert. Nach dam Entferuju U-r

Zellen und Sporen wurde eine rohe 'Enzymlösung von starker zellwandlösender Aktivität erhalten.

Eine Zellsuspension, die die in Tabelle I aufgeführten Hefen je-

Q '

weils in einer Konzentration von 10 /ml sowie 0,1 $ K₂HPO. und 0,05 $ MgSO^-TH₂ ⁰ iⁿ destilliertem Wasser enthielt, wurde hergestellt und auf den Pjr-Wert 7,4 eingestellt. Die verwendeten Hefen waren lebende Zellen, die .hergestellt wurden, indem ein Glucose, (NH₄)₂SO^, KH₂PO., MgSO^ .7H₂O, Malzextrakt und Hefeextrakt enthaltendes Nährmedium vom Pjj-Wert 5,4, mit den jeweiligen Hefen angeimpft und 24 Stunden bei 30⁰C unter Schütteln gezüchtet wurde.

Die'erhaltene rohe Enzymlösung wurde auf den p_H-Wert 7,4 eingestellt und zu jeweils 3 ml dieser Lösung wurden jeweils 0,2 ml der oben hergestellten Zellsuspensionen gegeben. Diese Gemische wurden unter leichtem Schütteln 4 Stunden bei 50 G gehalten. Die in Tabelle I aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass grosse Mengen der Hefezellen zerstört und verdaut wurden.

Die Verminderung der Trübung des Reaktionsgemisches, die in Tabelle I angegeben 1st, wurde visuell bestimmt. Das Symbol "+++" bedeutet eine vollständige Auflösung der Zellen, das Symbol "++" eine massige Auflösung der Zellen und das Symbol "+" eine geringe Auflösung.

Der Auflösungsgrad der Zellen Wurde nach folgender Gleichung bestimmt :

St - Sa

Auflösungsgrad (#) _gt

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wobei "St" die ursprüngliche Anzahl der Zellen und "Sa" die Anzahl der im Reaktionsgemisch verbleibenden, nicht aufgelösten Zellen bedeutet.

Tabelle I

Stamm

Candida rugosa JF-IOl Candida krusei IAM 4801 Candida krusei IAM 4489 Candida utilis IAM 4215 Candida utilis IAM 4295 Candida pseudotropicalis IAM 4829 Candida parapsilosis IAM 4488 Candida lipolytica IAM 4947 Saccharomyces cerevisiae IAM 4009 Saccharomyces cerevisiae IAM 4308 Saccharomyces chevalieri IAM 4801 Pichia membranaefaciens IAM 4025 Hansenula anomala IAM 4668 Schizosaccharomyces pombe IAM 4879

Verminderung der Trübung im Reaktions gemisch	Zeilauflö sungsgrad, i»
++	81
++	90
+++	100
+++	>90
+++	86
+++	83
+++	92
+++	93
+	42
+	. 61
++	81
+ I	77
++	86
+	65

Beispiel 2

Ein ICg befeuchtete Zellen von Chlorella ellipsoidea Tamiya sowie 1 g K₂HPO^, 0,5 g MgSO^ .7H₂O und 1 g Hefeextrakt in 1000 ml destilliertem Wasser enthaltendes Nährmedium B vom p„-Wert 7,4 wurde 3 Minuten bei 120 C sterilisiert, mit Micropolyspora sp. Hr. 434 angeimpft und 24 Stunden bei 50⁰C gezüchtet. Die Myzelien des Stammes Nr. 434 und die nicht aufgelösten Chlorella-

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zellen wurden durch Ab*zentrifugieren entfernt. Man erhielt eine rohe Enzymlösung, die eine starke Aktivität sowohl gegenüber lebenden als auch hitzebehandelten (bei 98 C, 3 Minuten) ChIorel— lazellen aufwies.

Zu 3,0 ml der so .erhaltenen rohen lösung wurden 0,2 ml einer Suspension von Chlorellazellen (3 x IO /ml) gegeben, und das Gemisch wurde 18 Stunden bei 50 C leicnt geschüttelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II wiedergegeben, -wobei die -Trü-bung als optische Dichte (OD) bei 530 mu wiedergegeben ist. Eine Standardlösung wurde hergestellt, indem die Chlorellasuspension-mit der entsprechenden Menge Phosphatpuffer vom p_H-Wert 7,4 anstelle der Enzymlösung versetzt wurde. ' < '

Tabelle II '

	Zellen	Reaktions zeit, Std.	Trübung	'0,70
Chlorellazellen	Zellen	3	Standard- .Reaktions lösung gemisch	0,56
Lebende Zellen		19	0,78	0,77
Lebende Zellen		3	0,77	0,58
Hitzebehandelte	19	0,84
Hitzebehandelte		0,80
Beispiel 3

Die gemäss Beispiel 1 erhaltene rohe Enzymlösung wurde bis zu einem Sättigungsgrad von 0,4 mit Ammoniumsulfat versetzt. Der erhaltene Niederschlag wurde entfernt und weiteres Arnmoniumsulfat wurde bis zu einem Sättigungsgrad von 0,6 zugesetzt. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und in tioütiLiiertem Wasser suspendiert« Die Suspension wurde in einem Behälter aus regenerierter Cellulose dialysiert. Man erhielt das gereinigte Enzym i,is Retentat.

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SADORIGtHAt

Das gereinigte Enzym wurde zu einer Plüssigkeitsprobe gegeben, die hitzebehandeltes Myzel von Aspergillus oryzae IAM-2024 enthielt. Wach vierstündigem Stehen des Gemisches bei 5O⁰G waren die meisten Zellwände des Myzels zerstört.

2,0 ml der gemäss Beispiel 3 erhaltenen Enzymlösung wurden zu

0,3 ml einer Zellsuspension (10 /ml) von Escherichia coli IAM-1264 gegeben, die 3 Minuten bei 90⁰C hitzebehandelt worden waren. Nach Einstellen des p„-Wertes auf 7,4 wurde das Gemisch 4 Stunuen bei 50 C stehen gelassen. Es wurden ungefähr 70 i> der Zellen zerstört.

Beispiel 4

Ein 20 g Stärke, 2 g (NH₄^SO₄, 2 g KH₂PO₄, 5 g K₂HPO₄, 2 g MgSO₄.7H₂O, 0,006 g GuSO₄.5H₂O, 0,001 g FeSO₄.7H₂O, 0,008 g MnGIp.4HpO, 0,002 g ZnSO..7H₉O und 10 g Hefeextrakt in 1000 ml destilliertem Wasser enthaltendes Nährmedium C vom ρ,,-Wert 7,4 wurde mit Micropolyspora sp. Nr. 434 angeimpft und 24'Stunuen bei 50 C unter Schütteln gezüchtet. Die Gärmaische wurde 10 Minuten bei 5 000 U/Min, zentrifugiert, und das Myzel und die Sporen des Stammes Nr. 434 wurden entfernt. Man erhielt eine rohe Enzymlösung mit einer starken zellwandlösenden Aktivität.

Die rohe Enzymlösung wurde bis zu einem Sättigungsgrad von Ο,β mit Ammoniumsulfat versetzt und das Gemisch wurde 4-5 Stunden bei 5 G gerührt. Der entstandene braune Niederschlag wurde bei 10 000 U/Min, abzentrifugiert, in 90 ml 0,01 m Phospiiutpui'f or vom ρ,,-Wert 7,0 gelöst und 20 Stunden bei 5°C gegen den gleichen 0,01 m Phosphatpuffer dialysiert. Im Dialysiorbehälter blieb eine gereinigte Enzymlöüung zurück. Diese Loi-uiv,

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wurde lyophilisiert. Man erhielt 195 mg reines Enzym in Pulverform.

Beispiel 5

Die gemäss Beispiel 4 erhaltene rohe Enzymlösung wurde bei 5°C unter Rühren mit eiskaltem Aceton "bis zu einem Acetongehalt von 60 io versetzt. Das Rühren wurde 4 his 5 Stunden fortgesetzt. Der gebildete Niederschlag, wurde IO Minuten bei 10 Ö00 U/Min, abzentrifugiert und in 90 ml 0,01 m Phosphatpuffer vom p„-Wert 7»0 gelöst. Die entstandene Lösung wurde 20 Stunden gegen den gleichen 0,01 m Phosphatpuffer bei 5°C dialysiert. Das Retentaf bestand aus gereinigter Enzymlösung.

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Claims (8)

- 16 Patentansprüche

1. Zellwandlösendes Enzym aus Micropolyspora sp., dadurch gekennzeichnet, dass es

a. in einem p„-Bereich von 5,0 - 9,0 stabil ist, das p„-Optimum in einem Bereich von 7,0 - 8,O¹ liegt,

b. in einem Temperaturbereich von 40 — 70⁰G, insbesondere von 50 60 C aktiv ist,

c. im wesentlichen bei niedrigen Temperaturen stabil ist, bei einer Temperatur von 0 C nicht inaktiviert wird, bei einer 10-minütigen Behandlung bei 100 G inaktiviert wird,

d. leicht in Wasser und verdünnten Salzlösungen löslicn , aber in Aceton unlöslich ist,

e. stark durch Ag⁺, Cu⁺⁺, Hg⁺⁺, Pe⁺⁺, Zn⁺⁺, Gd⁺⁺ und Ni⁺⁺ und massig durch Mn und Co ⁺ gehemmt wird, durch Mg⁺⁺ aktiviert wird und

f. zumindest gegenüber Candida rugosa, Candida krusei,. Candida utilis, Candida pseudotropicalis, Candida parapsilosis, Candida lipolytica, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Pichia membranaefaciens, Hansenula anomala und Sciiizosaccharomyces pombe zellwandlösende Aktivität aufweist.

2. Zellwandlösendes Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es in Pulverform vorliegt.

3. Verfahren zur Herstellung des zellwandlösenden Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dasa man einen Mikroorganismus der Gattung Micropolyspora in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen, assimilierbare Stickstoffquellen und essentielle anorganische Salze und organische Nährstoffe ent-

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haltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen solange züchtet, bis sich eine wesentliche Menge des zellwandlosenden Enzyms in der Gärmaische angereichert hat, worauf man das Enzym aus der Gärmaische nach an sich bekannten Methoden isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3", dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung 16 - 24 Stunden bei einer Temperatur von 40 - J)O⁰C.durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4', dadurch ge-

man
kennze ichnet, dass /das aus der Gärmaische isolierte

Enzym gefrieitrocknet«

6. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene rohe Enzym durch Zugabe von Ammoniumsulfat aus einer Lösung aussalzt und eine Lösung des erhaltenen Niederschlags in einer Bialysiermembran dialysiert und das Retentat gegebenenfalls gefriertrocknet.

7. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das erhaltene rohe Enzym in einer Lösung mit Aceton bis zu einem Gehalt von 60 fo versetzt und eine Lösung des erhaltenen Niederschlags in einer Dialysiermembran dialysiert und das Hetentat gegebenenfalls gefriertrocknet.

8. Verfahren nach Anspruch 3 bis 7» dadurch gekennzeichnet, dass man Micropolyspora A.T.C.G. 21489 verwandet.

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