DE2001265A1 - Bakteriophagen-Protein-Konjugate,deren Herstellung und Verwendung zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen - Google Patents

Bakteriophagen-Protein-Konjugate,deren Herstellung und Verwendung zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen

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DE2001265A1 DE19702001265 DE2001265A DE2001265A1 DE 2001265 A1 DE2001265 A1 DE 2001265A1 DE 19702001265 DE19702001265 DE 19702001265 DE 2001265 A DE2001265 A DE 2001265A DE 2001265 A1 DE2001265 A1 DE 2001265A1
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Joseph Haimovich
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Description

PATENTANWALT DR.-INC. LOTTERHOS
«000 FRANKFURT (MAIN)
ANNASTRASSE 19 FERNSPRECHER: (0611) 555061 TELEGRAMMEi LOMOSAPATENT LANDESZENTRALBANK 50007149 POSTSCHECK-KONTO FFM. 1667
III/Kl/K FRANKFURT (MAIN),
Yeda Research and Development Oo.Ltd., Rehovoth, Israel»
Bakteriophagen-i'rotein-Konjugate, deren Herstellung und Ver·* wendung zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Prdfceinen»
Die Erfindung "betrifft !Conjugate von Bakteriophagen und Proteinen sowie deren Herstellung und die damit ursächlich verbundene Anwendung zum Nachweis und auch zur quantitativen Bestimmung von Fixte inen«
Es wurde gefunden, dass Proteine !covalent an Bakteriophagen gebunden werden können· Hierdurch erhält man eine modifizierte Phagenpräparation, die für den Nachweis und die quantitative Bestimmung von Prteinen bzw. Antiproteinant!körpern auch bei sehr geringer Konzentration verwendet werden kann. Es ist möglich, Antikörper kovalent an Phagen zu binden,und das daraus entstehende Antikörper-Fhagen-Konjugat kann für den Nachweis und die quantitative Bestimmung von Proteinen ver<* wendet werden· Die quantitative Bestimmung kann erfindungs·^ gemäss durchgeführt werden, indem Protein-Phagen durch Anti·· protein inaktiviert werden und Hemmung dieser Inaktivierung bestimmt wird. Nach dieser Methode können Proteinmengen in der Grössenordnung von o,3 Nanogramm/ccm bestimmt werden.
Die chemische Bindung an die Phagen wird erreicht über ein Zwischenglied. Hierzu dient vorzugsweise ein kleines bifunktionellee und chemisch aktives Molekül» das befähigt
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ist, mit beiden Teilen kovalente Bindungen zu bilden. Beispiele für solcbe als Verknüpfungamitte1 geeignete Verbindungen sind * Toluylen-2,4-diisocyanat, Bls-diazobenzidin und Glutaraldehyd.
Für die Grundlagen der nachfolgend beschriebenen Versuche und die Ausgangsmaterialien werden folgende Angaben gemacht:
Bakteriophagen (T4, T2) wurden gezüchtet, gereinigt und nach der von Haimovich et al· in Immunology, 97, 338 (1966) beschriebenen Methode geprüft· Die Bakteriophagen und ihre Gastbakterien Escheridia coli B wurden gezüchtet nach der Methode von Adams (Bacteriophages, Interscience Pub·, N.Y· 1959) und gereinigt nach der Methode von Putnam et al·, JOBiol.Chem·, 179 (19*9)» 3o3. Die Prüfung wurde mittels der von Adams an der angeführten Stelle beschriebenen Doppel— agarschichtmethode durchgeführt, Die Bakteriophagenlösung wurde mit o,o5 m Natriumphosphatpuffer auf pH 6,8 gehalten» Die Lösung enthielt 20 ug/ccm Gelatine· Dieser Puffer wurde verwendet als Verdünnungsmittel für Bakteriophagen und Anti·* sera. Die Bakteriophagen-!!!**—Lösung hatte bei einer Konzen-
11
tration von 10 PE/ccm eine optische Dichte von 1,0 Einheiten bei 260 ιημ und 1 cm Weglänge,
Die verwendeten Antigene wurden teils nach dem Verfahren von Levy et al. (Prov.Soc.ExptUBiol.Med, 103 (1960) 250), hergestellt teils aus dem Handel bezogen.
Antisera und gereinigte Antikorperpräparationen wurden entweder hergestellt oder aus dem Handel bezogen«.
Kaninchen und Ziegen erhielten zweimal Injektionen von 2 bis 5 ag Antigen in Freund1β Adjuvans (Difco, Detroit, Mich·)· Das Antigen-Adjuvans-Gemisch wurde intradermal an verschiedenen Stellen des Körpers injiziert.
Meerschweinchenantiiinsulinserum wurde von Welcome Foundation Laboratories, Beckenham, England, bezogen. Ziegenantiseru» gegen Meerschweinchenimmunglobulin G wurde von Miles-Yeda Ltd·, Rehovoth, Israel, bezogen· Die iuunoepezifisch· Ieo-
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lierung von Antikörpern wurde ausgeführt mit Immunoadsorbentien, die durch Kupplung von Antigenen mit Bromace ty !.cellulose nach Bobbins et ale (Immunochemistry, 4- (196?) 11) präpariert waren. Die Antikörperkonzentration im Serum wurde bestimmt durch quantitative Präzipitin-Analyse nach Kabat und Mayer's (Experimental Immunochemistry, 2nd Edition, C.CeThomea, 1961)· Die -Proteinkonzentration in der isolierten Antikörper— präparation wurde berechnet aus der Adsorption. Hierbei wurde für 1 mg/ccm Lösung E280nn/'1 '^0 verwendet*
Das als Kupplungsmittel verwendete Toluylen-2,4~diisocyanat wurde von Aldrich, Milwaukee, Wiso, bezogen. Bis-diazobenzidin wurde nach der Vorschrift von Gordon et al«, (JoExp,Mede 108 (1958) 57) hergestellt und aufbewahrt« Glutaraldehyd lieferte Fluka, Schweiz, als 25%ige wässrige Lösung»
Für die Beschreibung der Versuche werden noch folgende Erklärungen gegeben:
Das genannte "Weiche Agar" enthält 10 g Bactotrypton, 6 g Bactoagar, 8 g NaCl, 2 g Natriumzitrat und 3 g Glucose, gelöst in 1 Liter Wasser*
Das "Bodenschichtagar" enthält die gleichen Bestandteile, hat jedoch eine höhere Konzentration von 10 g/le
Als Abkürzungen werden verwendet PPG für 0,05 m Natriumphosphatpuff er, pHI 6,8 mit einem Gdatinegehalt von 20 y,g/ccm· IgG für Immunoglobulin Qt
RNase für Rinderpankreasribonuklease A BSA für Rinderserumalbumin
RSA für Kaninchenserumalbumin
FE für Fleckeneinheiten, d#h„ Flecken, die eine Einheit darstellen«
Inaktivierung von Protein-Phagen-Konjugaten durch Antiprotfeinsera und Antiprotein isolierte Antikörperpräparationen»
o,o5 ecm Antisera oder reine Antikörperpräparationen in verschiedenen Verdünnungen und o,o5 ecm modifizierte Bakterio— phagenlösung (enthaltend 5oo bis 1ooo FE) wurden gemischt und für verschiedene Zeitdauer auf 370C gehalten. Am Ende der Inaktivierungsreaktion wurden 2,5 ecm weiches Agar,
enthaltend 3 x 107 Bakterien, im Reagensglas zugefügt· Dieses Gemisch wurde auf Platten mit einer Bodenschichtagar geschüttet. Nachdem die Platten 10 bis 18 Stunden auf 37°C gehalten worden waren, wurden die Flecken gezählt« Diese Arbeitsweise ist als direkte Plattierung bekannt· Die Inaktivierung modifizierter Phagen mittels der von Jerne et al· in J·Immunolβ 76 (1956) 200, beschriebenen "Decision technique" wurde in ähnlicher Weise durchgeführt mit dem Unterschied, dass die Bakterien dem Reaktionsgemisch am Ende der Inakti— vierungsreaktion zugegeben wurden und die Reagenzgläser während 10 Minuten leicht geschüttelt wurden· Während weiterer 4 Minuten wurde dann ein Hyperimnuineanti-T^—Serum (oder ein entsprechendes Serum für andere Phagen) zugegeben· Die End— konzentration des Antiphagenserums in dem Reaktionsgemisch wurde so gewählt, dass 99»9 % Inaktivierung der modifizierten Phagen innerhalb 4- Minuten Reaktionszeit eintritt« Dann wurde weiches Agar in die Reaktionsgläser gegeben und das Gemisch auf Platten gebracht» Die Komplexinakt i vie rungs·« methode (Goodman et al· Immunochem. 2 (1965) 351; Krummel et al·, J.Immunole 102 (1969}! 772) ist ähnlich der Direktplattierung mit dem Unterschied, dass ein Serum gegen die Globulinfraktion oder gegen das gesamte Serum 10 Minuten vor dem Aufbringen auf Platten dem Reaktionsgemisch zugegeben wird«
Nachweis von Antiinsulinantikorpern unter Verwendung von radioaktivem Insulin»
Der Nachweis von Antiinsulinantikörpern in den Sera von Diabeteskranken wurde nach der von Welborn et al·, Brit» Med.J. 1 (1967) 719t beschriebenen Methode durchgeführt·
Herstellung von Protein-Bakteriphag-T^-Konjugaten unter Ver-
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wendttng von Toluylen-2,4«diiaocyanat (TDIC) als bifunktionelles Reagenz«
Zu o,3 ecm einer T4~Bakteriophagenlösung (ODIgQ111n » 200) wurden 0,3 ecm einer Lösung von Protein in PPG in verschiedenen Konzentrationen 10 Ms 50 mg/ccm) zugegeben (mit Ausnahme von Insulin, das in 0,3 m Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5t gelöst wurde)· Diesem Gemisch wurden 0,1 ecm einer Lösung von TDIC in Dioxan (0,3 % bis 3,0 % v/v) langsam unter Rühren zugefügt· Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 24°C stehengelassen· Am Ende der Reaktion wurden 5 ecm PP& zugesetzt und dann wurde das Gemisch mit 6 1 o,o5 πι Natriumphosphatpuffer (pH 6,8) dia« lysiert· Ein Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit entfernt« Das Protein-Bakterio·· phagen-Konjugat wurde von dem leichteren, nicht umgesetzten Protein durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugierungen während 1 Stunde bei 20 000 g getrennt· Der Rückstand wurde wieder in PPG: suspendiert« Die Konzentration der Pagenteilchen wurde mittels der Absorption bei 260 ιαμ bestimmt· Die Konzentration der lebensfähigen Phagen wurde bestimmt durch Plattierung von 50-fachen Verdünnungen der Präparationen» Aus den obigen Konzentrationen wurde der Prozentsatz an modifizierten Bakteriophagen, die den Kupplungsprozess über» lebt hatten, ermittelt· Die optimalen Bedingungen für die Kupplung verschiedener Proteine ist aus Tabelle 1 ersieht·· lieh·
gekuppeltes Tabelle 1 überlebende nachgewiesene
Bei Protein Protein TDIC Phagen % ** Antikörper
spiel mg/ccm* % v/v* nanoK/ccm **♦
Rlfiaee 1,1 2
1 BSI 7 0,008 o,o5 2
2 RSA 11 o,2 o,o5 1
3 Rabbit IgG, 17 o,6 o,6 o,5
4 Lyaozym· 9 o,o16 8o,o o,2
5 Insulin 21 o,oo25 o,1
6 17 o,2
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• Endkonzentration im Reaktionsgemisch ** Der Prozentsatz der den Kupplungsprozess überlebenden Phagen wurde berechnet aus der Zahl der eine Einheit bildenden Flecken (PE) und der optischen Dichte der modifizierten Phagen-Präparation*
*** Bei Serumlösungen (von bekanntem Antikörpergehalt), die nach einer Reaktion von 10 Stunden bei 37°C 50 % Inaktivierung ergeben, ist dies die niedrigste Konzentration an nachgewiesenem Antikörper·
tfl Bei Meerschweinchen-Antiinsulin wurde 50 % des Insulin-T4-Konjugates inaktiviert» Reaktionsdauer: 10 Stunden bei
37°C; Endverdünnung 1:10 . Die Konzentration an Antikörpern im Serum konnte nicht bestimmt werden, da durch Antigen keine Antikörper ausgefällt wurden«,
Beispiel 7
Herstellung von Ribonuclease-.Bacteriophag«T4-Konjugat mit Bis·· diazobenzidin (BDB) als bifunktionelles Reagenso
Zu 0,1 ecm einer Bakteriophag-T^—Lösung (0Ep60 m " 20°) wurde 0,1 ecm einer Proteinlösung in PPG (10 bis 50. ecm) zugefügt» Diesem Gemisch wurden 0,03 bis 0,1 ecm einer BDB*-Lösung, verdünnt mit PPG auf 1:15» zugesetzt« Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei 240C stehengelasaen, dann verdünnt, dialysiert, zentrifugiert und wie in den vorhergehenden Beispielen geprüft» Die besten Präparation mit der höchsten Empfindlichkeit bezüglich Inaktivierung mit Anti-RHase-Serum erhielt man mit 10 mg/ccm RNase und 0,03 ecm BDB-Lösung·.
Sie Endkonzentration des Proteins im Reaktionsgemisch betrug 4,3 mg/ccm,und 5 % der Phagen überlebten» 12 Nanogramm pro ecm konnten als Antikörper nachgewiesen werden»
Herstellung von Protein-Bakteriophag-T4-Konjugat mit Glutar·· aldehyd als bifunktionelles Reagens.
Zu 0,1 ecm einer Bakteriophag-T4-Lösung (OD 091 cob einer Proteinlösung in PF(S (10 bis 50 mg/ccB) züge«·
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fügt· Diesem Gemisch wurden o,o25 ecm Glutaraldehyd (o,o5 "bis o,2 % v/v) zugesetzt· Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 24eC stehen gelassen, dann verdünnt, dialysiert, zentrifugiert und wie in den vorhergehenden Beispielen geprüft· Die besten Bedingungen zeigt Tabelle 2«,
Tabelle 2
Bei- gekuppeltes Protein überlebende nachgewiesene Anti« spiel Proteinmg/ccm* Phasen % ** körper nanog/ccm ***
8 RNase 4,5 7,4
9 Lysozyme 1o,o 3>6»o o,2
Beispiel 1o
Herstellung von Rinderserumalbumin (BSA)~Bakteriophag-T2«-.Konjmgat und Inaktivierung mit Anti-BSA~Serum
o,3 ecm einer Lösung von Rinderserumalbumin (BSA Worthington) mit einem Gehalt von 25 mg/ccm wurden vermischt mit o,3 ecm Bakteriophag«T2-Lösung in o,o5 m Phosphatpuffer, pH 7»0, der 20 μg/ccm Gelatine enthielt· Der Bakteriophag T2 wurde ebenso wie der Bakteriophag T4 in den vorhergehenden Beispielen präparierte Die Bakteriophagenlösung hatte ein OD ■ 20Oe Zu diesem Gemisch wurden 0,1 ecm einer Lösung von TDIG in Dioxan mit einem Gehalt von 15 mg/ccm zugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden auf 24°C gehalten· Dann folgte zur Dialyse eine zweimalige Behandlung mit je 6 Liter des obengenannten Puffers· Das nicht umgesetzte Protein wurde durch Zentrifugieren des modifizierten Bakterio« phagen während 1 Stunde bei 20 000 g entfernt· Das obenauf Schwimmende wurde abgegossen,und der Bakteriophag wurde in 0,05 m Phosphatpuffer, pH 7fO, gelöst» Von der ursprünglichen Bakteriophagpopulation hatte o,o5 % den Kupplungsprozess überlebt·
Das BBA-Bakteriophagenkonjugat wurde spezifisch inaktiviert durch Anti-BSA-Serum· Zu dessen Herstellung wurden einem Kanin« chen 2 mg BSA emulgiert in Freund's Adjuvans (1 Teil
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BSA-Lösung auf 2 Teile Adjuvans) injiziert. Seren von nicht auf diese Weise behandelten Kaninchen wirkten nicht inaktivierend. Man erhält eine 50%ige Inaktivierung, wenn man 10 Stunden bei 37°C mit dem Anti-BSA-Serum bei einer Verdünnung zu einer Endkonzentration von 2 Nanogramm Antikörper/ ecm reagieren lässt· Der Antikörpergehalt des Serums wurde durch quantitative Präzipitin-Analyse bestimmt· Das Anti-BSA« Serum hat keine Wirkung auf den unmodifizierten Bakteriophag T2O
Beispiel 11
Inaktivierung von Insulin-Bakteriophag-T4~Konjugat.
Die Inaktivierung von Insulin-Bakteriophag-T4~Konjugat wurde " mittels Meerschweinchenantiinsulinserum durchgeführt. Die PrüfergebnissB bei der Direktplattierung und bei der Komplexinaktivierung waren identisch. Nach beiden Methoden zeigte sich, dass selbst bei hohen Antikörperkonzentrationen 5 % Phagen überlebten« Die Inaktivierung wurde auch mit Serum von Diabeteskranken, die Insulininjektionen erhalten hatten, durchgeführt. Mit ^OOO^fachverdünntem Humanserum erhielt man eine 50%ige Inaktivierung» Das gleiche Serum bindet 25 % radioaktives Insulin beim Athanol«Fällungstest (Welborn et al„, Brit.MedoJ· 1 (196?) 719). Das Serum eines anderen Diabeteskranken, das nur 10 % radioaktives Insulin gebunden hatte, führte zu einer 50%igen Inaktivierung von Insulin«T4 nach fc einer Inkubation von 2 Stunden bei einer Verdünnung von 1:200« Insulin-T4 wurde nicht inaktiviert durch Seren von normalen Individuen bei einer Endverdünnung von 1:10·
Mit den vorstehenden Ausführungen ist nachgewiesen, dass Prote~ ine kovalent an Bakteriophagen gebunden werden können, und dasar diese modifizierten Phagenpräparationen für den Nachweis und die Bestimmung von so geringen Mengen wie 0,2 ng/ccm Anti·· protein-Antikörper brauchbar sindo
Mit den meisten an Bakteriophagen gebundenen Proteinen wird der grösste Teil der Phagenpopulation während des Kupplungsprozes«
ti
ses inaktiviert (vgl.Tabelle 1 und 2)Ȇberlebende Phagen werden
wirksam durch Antiprotein-Antiserum inaktiviert» Lagerung bis zu einem Jahr vermindert bei einigen Präparationen die Konzentration an lebensfähigen Phagen, während dies bei anderen Prä·» parationen (Insulin-T4; Lysozyme-T4) nicht der Pail ist« Nur bei BSA«.T4 zeigte sich eine Abnahme der Inaktivierungs» empfindlichkeit»
Die Inaktivierung von Protein-Bakteriophagen-Konjugaten mittels Proteinantikörpern kann durch Zugabe von freiem Protein gehemmt werden, wie nachfolgend gezeigt wird«
Die Hemmung der Inaktivierung von Protein-Bakteriophagen-Konjugaten wurde mittels der eingangs genannten Komplex-Inaktivie« rungsmethode durchgeführt mit dem Unterschied^ dass o,o75 ecm Antiserum (bei einer Verdünnung,wie sie zur 9O~ bis 95%igen Inaktivierung der Phagen nach 2 Stunden Inkubation bei 370C erforderlich ist) mit 0,025 ecm des hemmenden Proteins gemischt und die Mischung 24 bis 48 Stunden bei 4°G stehengelassen und dann mit 0,05 ecm Protein-Bakteriophagen-Konjugat versetzt wurde* Die Konzentration des Insulins in Humanseren wurde durch Radio«Immuno«Prüfung nach Haies und Rändle bestimmt,Die Insulinkonzentration wird entweder in Gewicht pro Volumen oder in Internationalen Einheiten ausgedrückt;« Die Korrelation zwischen dieeen beiden Messarten ist 25 Internationale Einheiten pro 1 mg Insulin» Im Fall von Insulin wurden 0,025 ecm Humanserum anstelle von Insulinlösung zugegeben (Humaninsulin wurde in dem Serum gelöst)0 Das als Verdünnungsmittel und zum Vergleich die·· nende Humanserum hatte (bestimmt durch Sadio-Immuno«JPrüfung) einen sehr niedrigen Insulingehalt (weniger als 0,2 ng/ccm)#Es führte nicht zur Inaktivierung von Insulin«Bakteriophag««T4« Konjugat· Wenn während des Inhibierungeversuchs das hemmende Protein vor der Zugabe der Phagen zugesetzt wird, wird daa Ausmasflß der Inaktivierung des Protein-Phagen-Konjugates vermin·· dert, entsprechend der Inaktivierung bei niedrigeren Antikörperkonzentrationen als sie ursprünglich im Versuchsgefäss vorhanden waren«
Das Ausmaes der Hemmung wurde berechnet aus dem Ausmass der
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Inaktivierung in Gegenwart und in Abwesenheit von hemmende* Protein«
Zum Beispiel führt Antilysozymserum bei einer Endverdünnung von 3e10 bei Reaktion mit Lysozym-T4-Konjugat einer -^nfangskonzentration von 6000 FE/ccm nach 2 Stunden bei 370O zu einer Abnahme der überlebenden Phagen auf 490 FE/ccm. In Gegenwart von freiem Lysozym in einer Endkonzentration von 5<»6.10"~ mg/ccm und unter den gleichen Bedingungen der ursprünglichen Antikörper- und Phagenkonzentrationen vermindert sich die Konzentration der überlebenden Phagen auf 1700 FE/ccm. Dieses Ausmass der Inaktivierung ist gleich dem, das man mit nur 20 % der ursprünglichen Antikörperkonzentration erreicht. Es werden also 80 % der im ftagensglas vorhandenen Antikörper blockiert, was einer 80%igen Inhibition entspricht«, Die Ergebnisse der Inaktivierungshemmung bei Protein-Bakteriophagen-Konjugaten mittels der entsprechenden freien Proteine bei verschiedenen Konzentrationen sind in Tabelle 3 wiedergegeben0
Tabelle 3
Nachweis und quantitative Bestimmung von Proteinen durch Hemmung der Inaktivierung von Protein-Bakteriophagen-Konjugaten
Protein-Bakte- Für die in % angegebene Hemmung erforderliche ri»phagen-Kon- Antigenkonzentration in ng/ccm .jugate 25% 50% 75 % 90%
RSA.-T4 2,0 8,0 40 800
BNase-T4 0,4 3,0 60 200
Lyeoaym-T4 0,4 1,0 4,0 10
IgG-T4 0,05 0,3 1,5 5,0
Insulin-T4 0,05 0,15 0,4 0,7
Aus der Tabelle geht hervor, dass so geringe Mengen wie o,o5 ng/ccm Insulin oder KaninchenigG einwandfrei bestimmt werden können (25%ige Hemmung)·
In einer Reihe von Humanseren wurde die Insulinkonzentration sowohl durch die Inaktivierungshemmung bei Insulin-T4 als auch
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durch die Radio-Immuno-Prüfung bestimmt« Die Ergebnisse zeigt Tabelle 4«
Tabelle
Serum Nr« Insulinkonzentration in uu/ml
Inhibition Radio-Immuno-Prüfung
34 150 250
13 126
15
170
350
42
35
40
187
>200
24 138
66 >200
35 26
Bei den meisten der geprüften Seren zeigte sich eine gute Ueber— einstimmung. Zur Insulinbestimmung mittels Inaktivierungshemmung bei Insulin-T4 wurde bei Seren mit hohem Hormongehalt (100-300 uu/ccm) das Serum 3-fach und 10-fach mit normalem Serum verdünnt und dann geprüft« Die zur Bestimmung der Insulinkonzentration verwendeten Seren wurden auch bezüglich einer Inaktivierungswirkung auf Insulin~T4-Konjugate geprüft. Es wurdfe keine Inaktivierung festgestellt«
Versuche mit anderen Bakteriophagen-Typen, wie T2, führten zu gleichen Ergebnissen«
Eine weitere Versuchsreihe wurde mit Kaninchen-Immunoglobulin G (RGG) durchgeführt· Die Inaktivierung der RGG«-Phagen mittels Anti-RGG wurde gehemmt mittels RGG» 0,2 ecm RGG, (1 ng/ccm) wurden gemischt mit 0,2 ecm verdünntem Anti-RGG-Serum (2 ng Antikörper/ccm) und 3 ,Stunden bei 370C stehengelassen. RGG-Phagen-Konjugate (0,2 ecm mit 500 FE) wurden zugefügt, und danm wurde das Gemisch 20 Stunden auf 37°C gehalten. In Parallelversuchen wurde anstelle von RGG-Lösung nur Puffer zugesetzt. Die modifizierten Phagen wurden in Abwesenheit von RGG in
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einem Ausmass von 70 % inaktiviert. In Gegenwart von RGG in der angegebenen Konzentration wurden hingegen ur 40 % der Phagen inaktiviert· Höhere Konzentrationen an RGG im Reaktionsgemisch hemmten die Inaktivierung der RGG-Phagen in höherem Ausmasse Eine vollständige Hemmung wurde mit 30 ng/ccm erreicht»
Selbstverständlich gestattet die Erfindung Abwandlungen bezüglich der Arbeitsweise und der verwendeten Stoffe, z.B# hinsichtlich der Art der Phagen, des Verknüpfungsmittels, des Proteins und auch des gebundenen Antiproteins. Die erfindungs· gemässen Präparationen und Prüfungen sind auch für Proteinhormone, Toxine, Enzyme usw« anwendbar·
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ORIGINAL INSPECTED

Claims (8)

-13-Patentansprüche
1) Bakteriophagen-Protein-Konjugat, in dem das Protein chemisch an den Bakteriophagen gebunden ist«
2) Bakteriophagen-Protein-Konjugat, in dem das Protein kovalent über das Zwischenglied eines bifunktionellen Moleküls an den Bakteriophagen gebunden ist»
3) Bakteriophagen—Protein-Konjugat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein über Toluylen-2J4«diisocyanat» Bis-diazobenzidin oder Glutaraldehyd an den Bakteriophagen gebunden ist·
4) Bakteriophagen-Protein-Konjugat nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass der Bakteriophag T4 oder T2 ist»
5); Bakteriophagen-Protein.Konjugat nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Immunoglobulins Bindorpankreaaribonuclease, Hinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Lysozym, Insulin, ein entsprechender Antiprotein-Antikörper, ein Proteinhormon, ein Toxin oder ein Enzym ist«
6) Verfahren zur Herstellung von Bakteriophagen-Protein-Konjugaten, dadurch gekennzeichnet, dass Bakteriophagen in Gegenwart von bestimmten Mengen eines bifunktionellen Moleküls mit dem Protein umgesetzt werdenβ
7)) Verwendung von Bakteriephagen-Protein-Konjugaten zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen, dadurch gkennzeichnet, dass die zu bestimmenden Proteine oder Antiprotein-Antikörper kovalent an die Phagen gebunden werden und die Inaktivierung des Phagen-Konjugates mittels des entsprechenden Protein-Antigens oder im Falle von Phagen-Antigen-Konjugaten mittels des Proteins bestimmt wird«.
8) Verwendung von Bakteriophagen-Protein-Konjugaten zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass die Hemmung der Inaktivierung des Bakterio» phagen-^rotein-Konjugates mittels Antiprotein-Antigen durch den Zusatz von vorher bestimmten Mengen des Proteins bestimmt wird·
109822/2187
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