NL8520062A - Bacteriofagen als herkenings- en identificatiemiddelen. - Google Patents

Description

β 5 2 O O 6 2 ! - Bacteriofageii als herkennings- en identificatiemiddelen - j i ; i ·.

i ; | De uitvinding heeft betrekking op het terrein I van de immunologie , verschaft een nieuwe en betrouwbare werkwijze | : voor de identificatie en bepaling van materialen van zowel ; procariotische als eucariotische cellen, en omvat een uitgekozen ^ bacteriofaag die gekoppeld is aan een zichtbaarmakend middel.

Voorts wordt een onderzoekspakket verschaft voor de vlotte bepaling van bacteriën , eucariotische cellen en verschillende i moleculaire materialen.

I Op dit moment worden bijna uitsluitend anti- i ^ lichamen gebruikt voor het identificeren van moleculaire en i cellulaire structuren die zichzelf niet op andere wijze openbaren.

! Zij worden bijvoorbeeld gebruikt om het ene proteïne van het andere, het ene polysaccharide van het andere , of de ene cel van de andere te onderscheiden. De wisselwerking tussen de anti- I 15 i lichamen en de "geïdentificeerde " structuur kan bepaald worden met een aantal verschillende methoden die erop gericht zijn de aanwezigheid van de antilichamen zichtbaar te maken.

In sommige proeven wordt een antilichaam dat aan de te identificeren structuur, cel of vaste fase gebonden is, j 20 .

| direkt zichtbaar gemaakt. Vaker wordt een tweede antilichaam :

i zichtbaar gemaakt en tegen het eerste antilichaam gericht. Boven- I

j dien wordt proteïne A van Staphylococcus aureus , Cowan I-stam, S

| zichtbaar gemaakt , waarna dit zich aan het eerste antilichaam bindt. Een andere groep reagentia die gebruikt wordt om het 25 . . ! antilichaam zichtbaar te maken, wordt voorgesteld door biotme ; en avidine die elkaar herkennen en samen met antilichamen gebruikt kunnen worden. Fluorescerend materiaal, enzymen, radioaktieve |

ί I

I materialen, grote deeltjes, zoals erythrocyten , of korrels zijn i

' gebruikt om het antilichaam direkt of indirekt zichtbaar te I

! 30 ! maken. ; 8520062

V

J

! - 2 - !

Elk van deze methoden heeft tekortkomingen j en beperkingen welke toegelicht kunnen worden aan de hand van ! het gebruik van fluorescerende materialen voor het zichtbaar j

maken van het antilichaam . Als de hoeveelheid door een cel ge- ; 5 bonden antilichaam te klein is , kunnen de fluorescerende I

I reagentia deze niet detecteren. Dit veroorzaakt analytische j problemen, in het bijzonder wanneer men stroomcytometrie met j dubbele laser of bepalingssystemen met fluorescentie gebruikt. Verder is de fluorescentie die verkregen wordt met een antilichaam-! 10 systeem op weefseldelen niet erg helder. Dit probleem kan overwonnen worden door enzymen te gebruiken die aan het antilichaam gekoppeld worden. Een aantal stappen zijn echter altijd vereist ! i bij het kleurproces.

| Oplossingen voor het probleem zijn neergekomen !15 op het gebruik van fluorescerende bacteriën of fluorescerende | korrels. De eerstgenoemde kunnen slechts beperkt gebruikt worden bij fluorescentie-analyse door problemen bij het verwijderen van ! niet-gebonden overmaat bacteriën en ook door een belangrijke verandering in het lichtverstrooiende profiel van het celopper-20 vlak, waardoor stroomcytometrie niet geschikt gebruikt kan worden. De fluorescerende korrels hebben de neiging vast te blijven zitten op cellen, zijn moeilijk te produceren of te duur, en zij zijn ook groot genoeg om veranderingen in het lichtverstrooiende profiel van het celoppervlak te veroorzaken. Bovendien j i25 zijn in bepalingssystemen met fluorescentie waarbij filtratie j en wassingen vereist worden, de overmaat deeltjes of bacteriën j moeilijk, zo niet onmogelijk, te verwijderen. Het gebruik van j i j reagentia zoals bacteriën of colloidaal goud voor gekleurde, ; ! . . : gefixeerde celpreparaten is beperkt tot microscopie. Bijgevolg is i 30 er een behoefte ontstaan aan een andere groep reagentia, die ! | de voordelen van antilichamen combineert met die van deeltjes en j die gebruikt kan worden voor stroomcytometrie voor weefseldelen i of voor bepalingen in de vaste fase voor oplosbare materialen.

i | l i 8520062 'V' ί - 3 - j

I I

j Vaste fasen die gebruikt worden in pakketten voor het bepalen j van antigenen of antilichamen in oplossingen, kunnen hiervoor gebruikt worden, ofwel direkt ofwel in competitieve bepalingen.

Het is niet mogelijk gebleken een reagens te hebben dat alle 5 voordelen van antilichamen, zoals penetreerbaarheid en specifici- ; teit , combineerde met die van deeltjes, zoals zichtbaarheid.

In feite was er een behoefte aan een reagens dat werkt als een antilichaam, maar veel groter is, hoewel niet zo groot,dat het de te identificeren structuren verbergt. Een dergelijk reagens i 10 moet uit sommige structuren, zoals gefixeerde cellen of weefsels, blijven en overmaat reagens moet gemakkelijk verwijderd worden.

Het is waarschijnlijk, dat men gevonden heeft dat bacteriofagen ofwel te klein zijn om als doelmatige dragers te dienen ofwel op een niet-specifieke wijze vast gaan zitten, 15 in het bijzonder door hun trilharen. Het enige waarvoor men bacteriofagen bij identificatieexperimenten gebruikt heeft, is dat men ze als virussen voor hun bacteriële gastheer gebruikt i ' i heeft of dat men antigenen op hun oppervlak aangebracht heeft, I gewoonlijk door een milde chemische koppelingswerkwijze , en j ; 20 vervolgens antilichamen tegen deze antigenen gebruikt heeft om het vermogen van de bacteriofaag|bactetiën te infecteren in | neutraliseringssystemen voor bacteriofagen , te blokkeren. Zo j werden bacteriofagen slechts als levende virussen gebruikt in j I het Amerikaanse octrooischrift 3.171.705 van Haimovich, et al, I 25 en in Amerikaanse octrooischrift 4.104.126 van Young . De ; bacteriofaag werd niet gebruikt als een drager voor antilichamen | ! als een identificatie- en kleuringsreagens. Het is waarschijnlijk, j | dat een deskundige wegens de boven gegeven redenen afgehouden is j ; | | van het gebruik van de faag voor enige andere bepalingen met j | 30 antilichamen. In het Amerikaanse octrooischrift 4.282.315 stelde j Luderer , et al , voor radioaktief gelabelde dierlijke virussen j te gebruiken om receptoren op materialen te detecteren, die | natuurlijke receptoren van deze virussen zijn of dergelijke recep- j i 8520062 j - 4 - i I toren nabootsen. In wezen werden de dierlijke virussen uitgekozen

I I

wegens hun natuurlijke affiniteit voor bepaalde receptormaterialen,j waarna ze verwijderd en vermenigvuldigd werden. Dit werd in ^ wezen opgezet ofwel voor het identificeren van virusreceptoren of- j wel voor heemagglutinatiedoeleinden , dat wil zeggen, dat er een duidelijke overeenkomst was tussen de receptoren voor virus en de geïdentificeerde receptoren. Bacteriofagen , die bacteriële- virussen zijn , zijn niet in deze categorie in aanmerking genomen ^ wegens deze voor de hand liggende redenen. In de eerste plaats worden zij niet gebruikt voor enige bepalingen van de heemaggluti- ; natie of van de remming van heemagglutinatie; deze bepalingen ; zijn gebaseerd op kenmerken van slechts bepaalde dierlijke virussen.

| In de tweede plaats is het bekend, dat bacteriofagen gespecialiseerde ^ . structuren hebben, meestal in de vorm van een staart, die gebruikt worden voor de herkenning van de receptor op bacteriën, wat tot infectie leidt. Het is bekend, dat als deze staart zich eenmaal aan zijn receptor bindt, zelfs wanneer het niet op bacteriën maar in oplossing is, het nucleïnezuur uitgedreven wordt en het 20 virus niet-infectieus wordt. Een dergelijke selectiemethode zou onmogelijk in aanmerking hebben kunnen komen volgens de methoden van het octrooischrift van Luderer, et al. Aan de andere kant j zou de bacteriofaag niét voor selectie in aanmerking gekomen zijn : | wat betreft de binding met het proteïne van de kop, aangezien i ' ; | mutaties in de proteïnen van de kop als lethaal voor de bacterio- faag beschouwd worden. Dit kan verklaren , waarom het octrooischrift van Luderer, et al, de bacteriofaag niet als een mogelijk alterna- | tief beschouwde, ondanks het feit, dat bacteriofagen veel goed- | koper te produceren zijn en gemakkelijk in een zeer grote hoeveel- i on heid gevormd worden, bijvoorbeeld orden groter dan dierlijke ! JU j | virussen.

i I

; De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor de identificatie en kwantificering van moleculaire ; j en cellulaire materialen van zowel procariotische als eucariotischë 8520062 ! - 5 -

i I

I cellen, waarbij een proefmonster gecombineerd wordt met een geselecteerde bacteriofaag onder bindingsomstandigheden ter i verkrijging van een conjugaatfase in het proefmonster , welk conjugaat de bacteriofaag omvat, gekoppeld aan het molecuul of de cellen die men tracht te identificeren. Een ^zich tb aanhakend middel wordt voor of na de bindingsstap in de bacteriofaag opgenomen om de herkenning van het proefmateriaal in gebruikelijke analytische bepalingsmethoden sterk te verbeteren. Bij het uitvoeren van de uitvinding kan de bacteriofaag zodanig geselec- 10 teerd worden dat hij met de kop of met de staart bindt. In het | laatste geval, wordt dit teweeggebracht door "uitwendige beeld- j : | vorming" waarbij de bacteriofaag zodanig gemodificeerd wordt | dat hij zich als een antilichaam gedraagt.

In het algemeen worden mutanten van de bacterio-I15 , . . , | faag gebruikt. De werkwijze van de uitvinding kan geschikt gemaakt worden voor de analyse van proteïnen, koolhydraten , ; lectinen , bacteriën van verschillende typen, pathogenen en gemengde moleculaire of cellulaire materialen die in weefsels, cellen of vloeistoffen aanwezig zijn.

20 '

Voorts is het een oogmerk van de uitvinding ! onderzoekspakketten te verschaffen, die de geselecteerde bacterio faag en geschikte proefmiddelen omvatten ter verschaffing van het proefmateriaal in een vorm welke geschikt is voor gebruik in ! elk uitgekozen analytisch instrument.

25 !

De herkenning van een structuur door een

identificatiemiddel zoals een antilichaam kan onderverdeeld wor- I

den in twee delen, de "herkenningsplaats" (intelligence), dat ; | wil zeggen de specifieke plaats die een complementaire structuur j bindt, en de "zichtbaarmaker1!1 (visualizer) , dat wil zeggen ! i 30 | de structuur die op de een of andere wijze zichtbaar gemaakt wordt.j

Zo wordt bijvoorbeeld in het geval van fluorescerende bacterie- \ ί ! korrels die met antilichaam bedekt zijn , de "herkenningsplaats" i verschaft door de aanhechtingsplaats van het antilichaammolecuul en de " zichtbaarmaker " . door de rest van het molecuul met de 8520062 t : I - 6 - i j moleculaire aanhangsels (fluorescerend, radioaktief, enz. ).

Ter verschaffing van een extra "zichtbaarmaker" volgens de | uitvinding worden de antilichamen gekoppeld aan bacteriofagen.

Deze koppeling kan covalent zijn, zoals met glutaaraldehyde ^ of bifunctionele reagentia , of niet-covalent, zoals met hybride- : antilichamen . Ook kunnen volgens de uitvinding de bacteriofagen zodanig geselecteerd en geconstrueerd worden , dat ze de "herkenningsplaats" verschaffen, dat wil zeggen dat ze als antilichamen functioneren, en ook de "zichtbaarmaker" ' dragen. : 10 ...

Bij de identificatie van bacteriën m patholo- | gische vloeistoffen kost het tijd de bacteriën te kweken en | te identificeren en , in vele gevallen , kunnen de bacteriën | niet in cultuur gekweekt worden. Voor deze gevallen worden ! bacteriofagen zichtbaar gemaakt en ofwel met antilichamen bedekt 115 | ofwel op natuurlijke wijze via hun receptor gebonden.

| Bij het uitvoeren van de werkwijze van de i uitvinding worden bacteriofagen gebruikt als de zichtbaarmaker, of de drager van de herkenningsplaats, welke door het antilichaam verschaft wordt. Antilichamen kunnen chemisch aan bacteriofagen 20 ....

gekoppeld worden, waarbij bifunctionele reagentia, zoals glutaar- ; aldehyd of andere covalente of niet-covalente koppelingsmiddelen ; gebruikt worden. Bacteriofagen worden met avidine of biotine ; | bedekt om aan het antilichaam dat respectievelijk biotine of | avidine heeft , te binden. De binding wordt verkregen via !25 ...

| biotme-avidine herkenning. j ] Bacteriofagen dienen als zichtbaarmakers door j i ... . i | aan de te identificeren structuur te binden met behulp van hybride-: ! antilichamen. Deze worden met een aanhechtingsplaats tegen de j bacteriofaag en met de andere tegen een eerste antilichaam of i 30 . . . . . i de te identificeren structuur gericht. De bacteriofaag kan ook aan lectinen of koolhydraten gekoppeld worden voor herkenning van de respectievelijke complementaire structuren, i i .

De door de bacteriofaag verschafte zichtbaar- : 1 8520062 maker wordt met behulp van fluorescerende kleurstoffen, andere i i

! - 7 - I

kleurstoffen, radioaktief isotoop-materiaal, enzymen , of metalen zoals zilver of goud verkregen. De bacteriofaag kan ook ] zodanig gemanipuleerd worden dat hij het geschikte enzym j bevat. | -* Bacteriofagen kunnen zodanig geselecteerd worden; dat ze zowel de herkenningsplaats als de zichtbaarmaker verschaf-j fen door genetische manipulatie, die ze voorziet van een j "aanhechtingsplaats'·':. Na mutatie worden de bacteriofagen vervol- j gens geselecteerd op de eigenschap van de kop aan moleculen j 10 zoals immunoglobulinen of aan glycoproteïnen of proteïnen van ! dierlijke cellen te binden. De mutanten worden bijvoorbeeld verkregen door bestraling met ultraviolet licht van zowel bacteriofaag als bacteriën, gevolgd door de kweek van de bacteriofaag.

De bacteriofaag wordt verzameld, gezuiverd en de selectiedruk 15 wordt toegepast, te weten , binding aan celoppervlakken of aan i # # # ' moleculen die aan een vaste fase gekoppeld zijn. De bacteriofaag wordt direkt of nadat de cel bahendeld is met het antilichaam | dat door de bacteriofaag herkend wordt, fluorescerend gemaakt 1 voor identificatie van het celoppervlak. De lethale aard van kop- 20 mutaties wordt vermeden door zeer grote aantallen deeltjes te-.- j gebruiken en temperatuurresistente mutanten te selecteren, ; waarbij derhalve geselecteerd wordt op zeer zeldzame gevallen ! | die nog verenigbaar zijn met het overleven van de bacteriofaag.

Een ander stel mutanten kan bereid worden j

; 25 door gebruik te maken van de mogelijkheid van de staart om I

aan een specifieke structuur op het oppervlak van bacteriën te j binden. Door mutatie en selectie worden bacteriofagen geselec- j teerd die met hun staart bepaalde structuren kunnen herkennen. | I Dit wordt gedaan met behulp van "uitwendige beeldvorming" ; ! 20 (external imaging) , een niet voor de hand liggende analogie met ; ; inwendige beeldvorming m 1 het anti-idiotype netwerk van anti- j lichamen, zoals besproken is door Urbain, et al., j | i 8520062 - 8 - : ; j f : j Progress in Immunology, 1980, Academic Press, Vol. I p. 81-92.

| Het te identificeren molecuul MX" wordt geïnjecteerd in een ; dier en antilichamen worden ertegen gemaakt. De gezuiverde anti-"X"-antilichamen worden aan een vaste fase gekoppeld en met een zeer groot aantal bacteriëi behandeld. Deze bacteriën j worden uit een voor bacteriofagen gevoelige ouderstam geselecteerd op resistentie tegen bacteriofaag "Y" . Deze tegen bacteriofagen : resistente bacteriën hebben geen receptoren voor de bacteriofaag. Bacteriën die aan deze antilichamen binden , worden geselec- 10 teerd en gekweekt , zodat ze een structuur hebben die "X" nabootst. De selectie van bacteriën die "X"-achtige structuren | kunnen vertonen, kan getoetst worden door hun vermogen gezuiverd ; anti-"X” te binden. Het is zeer onwaarschijnlijk, dat een derge- ! lijke structuur de receptor voor de bacteriofaag kan zijn.

i 15

Deze bacteriën worden vervolgens m ongeveer gelijke gedeelten gemengd met de voor bacteriofagen gevoelige bacteriën welke met UV bestraald waren en behandeld met gemutageniseerde (bijvoorbeeld met UV bestraalde ) bacteriofaag. De mutant-bacteriofagen die uit gevoelige bacteriën tevoorschijn komen en die de recep- ' 20 . .

tor op de voor bcteriofaag resistente bacteriën kunnen herkennen , groeien in deze bacteriën. Derhalve zal alle samenkomende lyse troebel zijn aangezien slechts de voor bacteriofaag gevoelige bacteriën gelyseerd worden , behalve een paar heldere plekken, waarin beide bacteriën als resultaat van de j 25 mutant gelyseerd worden. De plekken worden verwijderd met een ; absorberend materiaal en de mutanten die "X" herkennen, worden gedetecteerd met een '^"-monster dat zichtbaar , dat wil zeggen radioaktief, fluorescerend, enz. gemaakt is. De mutant-bacterio- ' fagen worden op de plaat opgespoord en op hun nieuwe bacteriele ! 30 j gastheer gekloond. Het vermogen van alle klonen om "X" te; j herkennen, wordt bepaald op een vaste fase door competitieve | proeven met vrij "X" en wat betreft competitie door "X" voor ! de infectie van bacteriën door deze mutant-bacteriofaag. Hoewel j f i 8520062 - 9 - : s de herkenning met de staart van de receptor op bacteriën enige overeenkomst met antigeen-antilichaam interakties kan hebben, heeft het herkenningsproces met de bacteriofaag eigen andere kenmerken, die ze tot een verrassende en onverwachte vervanging 5 voor antilichamen maakt. Het is ook onverwacht , dat de bacteriofagen geselecteerd worden wat betreft de gewenste plaats-herkenning, aangezien bekend is , <ht mutaties van de bacteriofaag wat betreft het gastheerbereik tamelijk frequent zijn. j Met behulp van andere genetische manipulaties brengt men de bacteriofagen ertoe een bepaald antigeen te herkennen. Bacteriën worden gebruikt die bepaalde oppervlaktestructuren hebben welke door plasmiden beheerst worden.

Zo wordt bijvoorbeeld het gen voor nX" in het plasmide opgenomen. Bacteriën die MXM op hun oppervlak vertonen , worden vervolgens 15 als boven beschreven geselecteerd. Deze oppervlakteproteïnen of glycoproteïnen bevinden zich op structuren die door de bacteriofaag als receptoren gebruikt worden. Door bacteriofagen te selecteren die deze structuren herkennen als hun infectie- | ! receptoren , worden bacteriofagen verkregen die MXM herkennen.

20 Bijgevolg wordt een uitwendig beeld van het antigeen op bacteriën 1 verkregen. j

In een andere benadering wordt de staart van j de bacteriofaag gemaakt met dezelfde sequenties als zware ! ! en/of lichte immunoglobulineketens, door recombinatie met immuno- j i 25 globulinegenen in plasmiden. Oorspronkelijke bacteriofagen met j j de normale staartsequenties worden door absorptie met natuurlijke gastheren verwijderd. Deze worden gemuteerd en geselecteerd wat betreft'iherkenning van MX" met de boven beschreven methoden, j Een volledige inrichting met zware en lichte ketens wordt ver-| 50 kregen door bacteriën met "X" . op het oppervlak tegelijkertijd j i te infecteren met twee bacteriofagen, waarvan de één V -genpro- j i <£» ! | dukten en de ander V -genprodukten tot expressie brengt. j I ij [ 8520062 ...... ! ! ... ........... i

I I

i - 10 t I

| Een middel voor het uitvoeren van de werkwijze van de uitvinding komt neer op het samenstellen van een pakket, j dat een geschikte bacteriofaag omvat , welke gekoppeld I wordt met een zichtbaarmakendimiddel, voor gebruik bij de iden- j : i 5 tificatie van bacteriën, eucariotische cellen en andere j moleculaire materialen. Een aantal porties van de faag kan verschaft worden, elk in een zodanige hoeveelheid dat deze doeltreffend is bij de beoogde proef.

De volgende voorbeelden dienen als toelichting, ! 10 zonder dat de werkwijze van de uitvinding hiertoe beperkt wordt .

Voorbeeld I~A

Bacteriofagen worden aan monoklonale of I polyklonale antilichamen gekoppeld, nadat ze fluorescerend of | 15 radioaktief gemaakt , of aan peroxydase gekoppeld zijn, en worden als een kleuringsmiddel , of identificatiemiddel , gebruikt. Voor het bepalen van muizenimmunoglobuline G (MIG) wordt de bacteriofaag bedekt met anti-MIG-antilichamen door een koppelingsmiddel , bijvoorbeeld glutaaraldehyd of een ander i 20 bifunctioneel reagens te gebruiken. De faag wordt fluorescerend

gemaakt door koppeling met fluoresceïneisothiocyanaat , rhodamine j of andere fluorescerende kleurstoffen, door behandeling met ethidiumbromide , dat aan het DNA van de faag bindt, of door andere kleurstoffen die aan nucleïnezuren binden. De faag wordt 25 radioaktief gemaakt ofwel door het opnemen van radioaktieve I

i I materialen in het proteïne of nucleïnezuur of met gebruikelijke méthoden voor het koppelen van radioaktieve materialen aan \ proteïnen . In het alternatief wordt een metaal zoals zilver aan de faag volgens gebruikelijke methoden toegevoegd. j ; 30 De bacteriofaagsuspensie werd als volgt bereid: ;

In een proefvoorbeeld werd bacteriofaag T4 gekweekt in YS57-stam van Escherichia coli (Trp, Pro, His)♦ Bacteriën werden j 8520062 ! - 11 - I gekweekt in tryptische sojabroedvloeistof ( DIFCO) en met faag gemengd voor een groot aantal infecties van 0,5 tot 1. Het ; mengsel van bacteriën en bacteriofaag werd geincubeerd in zachte i agar op een voedingslaag van harde agar. Na incubatie gedurende i ^ de nacht werden de bacteriën volledig door de faag gelyseerd en werd de bovenlaag van zachte agar verzameld en met chloroform ! en met 0,01 M EDTA behandeld om het niet-faagmateriaal te precipiteren.

I Na 1 uur bij 37°C werd het mengsel bij 5000 G gedurende 10 | minuten gecentrifugeerd en werd de bovenstaande vloeistof verzameld.! '10 . , j ! Ter verwijdering van vrije nucleinezuren werd de bovenstaande j

| vloeistof bij 37°C gedurende 1 uur behandeld met 20 ug/ml I

\ DNAase en 20 ug/ml RNAase . Om de faag te wassen werden NaCl en j I j j polyethyleenglycol (PEG) toegevoegd tot uiteindelijke concentraties j van 0,5 M respectievelijk 6%, en werd het mengsel gedurende | ,15 ^ | 18 uur bij 4°C geincubeerd· Na centrifugeren bij 8000 G gedurende \ I 30 minuten en opnieuw suspenderen in 0,14 M NaCl„, werd een 1 13 uitemdelijke bacteriofaagconcentratie van ongeveer 10 infectieve j eenheden/ml verkregen. Het absorptieprofiel bij verschillende | golflengten was dat van een zuivere faagpopulatie.

I 20 ! Voor het bekleden met antilichamen werd de vol- : ! '

| gende werkwijze gebruikt. De faag werd m suspensie in 0,1 M

1 i i , , | fosfaatbuffer bij pH 8,5 gemengd met glutaaraldehyd tot een concentratie van 1% en gedurende 1 uur bij 25°C geincubeerd.

i 25

I Overmaat glutaaraldehyd werd verwijderd door de faag met 0,5 M

j NaCl en 6% PEG te precipiteren en opnieuw te suspenderen in buffer bij pH 8,5 . Antilichaam, anti-konijn Ig werd toegevoegd ter verkrijging van 1 mg antilichaam/ 1 mg faagproteïne.

Na 2 uur incubatie bij 4°C met konijnelymfocietan werden de cellen 30 ...

drie maal gewassen door centrifugeren bij 900 G gedurende 5 minuten.

De binding van de fluorescerende faag werd vergeleken met die van de fluorescerende faag welke bedekt was met ofwel normaal IgG in plaats van antilichamen ofwel met fluoresce- 8520062 ; - 12 - rende anti-Ig-antilichamen. De cellen werden onder de fluorescen- tiemicroscoop beoordeeld. De cellen met macrofaagkarakter (dat wil zeggen groot) bevatten 2-5 % faagdeeltjes zowel in normaal Ig- als anti-Ig-antilichaampreparaten. Van het celpreparaat, I 5 dat behandeld was met met anti-Ig-antilichaam bedekte faag had j échter 47% van de cellen fluorescentie aan het oppervlak , | terwijl de cellen die met normale met Ig bedekte faag behandeld I waren , slechts 1-2 % hadden.

De fluorescentie van het oppervlak was intenser i 10 dan die van dezelfde cellen welke met anti-Ig fluorescerende

I I

! antilichamen behandeld waren. De met anti-Ig-antilichaam bedekte j fagen vertoonden derhalve bindingsspecificiteit en gaven een j

intense fluorescentie. I

| 15 Voorbeeld I-B j | .............

| Geconcentreerde, gezuiverde bacteriofaag wordt | met een heterobifunctioneel reagens behandeld. Anti-allotype- j | antilichaam (anti b^) van het konijn wordt gethioleerd en een brug | tussen de twee wordt gevormd, zodat het antilichaam van het konijn | 20 aan de faag gekoppeld wordt. Ter controle wordt de faag vervolgens j i fluorescerend gemaakt. Het faag-antilichaam-complex wordt vervol- j ? j gens met de cellen gemengd, gewassen en met een microscoop of j i een ander geschikt instrument onderzocht. De mate van fluorescentie wordt bepaald door de mate van gebruik van aminogroepen of faag-| 25 proteïnen.

Voorbeeld I-C

De met antilichaam bedekte faag wordt gebruikt voor het behandelen van gefixeerde weefseldelen. Een lymfe-30 knoopsectie wordt behandeld met een fluorescerend faagpreparaat, gewassen en onder UV-licht onderzocht. In een alternatieve methode wordt beklede faag geopenbaard door toevoeging aan het eind 8520062 - 13 - van het substraat volgens standaardmethoden. Deze methode wordt ook gebruikt voor fagen die geselecteerd zijn om spontaan te binden.

5 Voorbeeld I-D

De faag die geselecteerd is op het herkennen van MIG ofwel met de staart ofwel met de kop, wordt gemengd met een oplossing die MIG-antilichamen , bijvoorbeeld monoklonale antilichamen bevat. Deze faag is fluorescerend of radioaktief.

10 Na wassen door precipitatie met PEG wordt deze gebruikt voor het vervangen van fagen welke chemisch aan antilichaam gekoppeld zijn. De fagen worden met een geschikte koppelingsmethode zichtbaar gemaakt.

15 Voorbeeld II

Bacteriofagen worden bestemd om te worden gebruikt bij snelle diagnose van pathologische materialen die bacteriën bevatten. Gewrichtsvloeistof of exudaat wordt uitgestreken, gefixeerd , fagen worden toegevoegd, en hun aanwezigheid 20 wordt zichtbaar gemaakt met geschikte instrumenten, zoals UV- licht voor fluorescentie , helder veld voor enzymen, enz. Door geautomatiseerde met een computer verbonden scanners te gebruiken wordt de werkwijze zeer snel gemaakt. De binding van fagen door antifaag-antilichamen wordt vermeden door competitieve verzadiging 25 met vrij faagproteïne of door het monster met formaldehyd te behandelen. Zeer kleine aantallen bacteriën worden, zelfs als ze dood zijn, gemakkelijk geïdentificeerd. Door toevoeging in twee stappen van complexe faagsuspensies tegen een groot aantal mogelijke pathogenen , gevolgd door afzonderlijke suspensies in 30 die produkten die positief blijken, kunnen zeldzame microorganis-men stiel, geïdentificeerd worden.

Om de omstandigheden bij de identificatie van bacteriën in pathologische monsters na te bootsen, werd het volgende 8520062 - 14 - experiment uitgevoerd.

T4-bacteriofagen werden gekweekt en gezuiverd zoals in voorbeeld I-A. Verschillende hoeveelheden fluoresceine- i

isothiocyanaat (FITC) , van 0,5 mg tot 8 mg , werden per 1 mg 5 faagprotelne toegevoegd. De faagsuspensie werd met 0,1 M

ingesteld op een pH van 9,3 . FITC werd onder roeren bij 4°C toegevoegd , waarna het roeren gedurende 2 uur voortgezet en ! vervolgens bij 4°C gedurende nog een 20 uur geincubeerd werd.

Overmaat FITC werd verwijderd door de suspensie de dialyseren 10 tegen 0,1 M fosfaatbuffer (pH 8,5 ) gedurende 3 dagen bij 4°C. De uiteindelijke molverhoudingen FITC/proteïne in zeven preparaten waren (1) 3,8, (2) 8,0, (3) 11,3, (4) 18,6, (5) 29,2, (6) 19,3 , en (7) 16,4.

Ter bepaling van de bindingsspecificiteit en 15 het vermogen de aanwezigheid van een microorganisme in een veld te onthullen , werd de T4-faag die in E.coli stam YS57 gekweekt was, beproefd wat betreft binding aan YS57. Als controles werden E.coli USC 106, die een tegen faagresistente mutant van YS57 is , Bacillus globiggi en Salmonella Schottmulleri gebruikt. 20 Om de binding te beproeven werden fagen gedurende 10 minuten bij 25°C gemengd met bacteriën die met formaldehyd gefixeerd waren, en vervolgens drie maal gewassen ter verwijdering van de niet-gebonden faag.

De voor faag gevoelige E. coli YS57 werd intens 25 fluorescerend, zodat zelfs een microorganisme duidelijk onder de fluorescentiemicroscoop gezien kon worden. Faagpreparaten (1) , (2) en (3) , dat wil zeggen tot aan een molverhouding van FITC/ proteïne van 11,3, werden intens fluorescerend gemaakt , en de mutant USC 106, B. Globiggi en S_. Schottmulleri niet.

30 Derhalve werd de faagspecificiteit gehandhaafd op een molverhouding van 11,3, welke gelijk is aan de als regel voor anti-lichamen gebruikte molverhouding. Aangezien de faagdeeltjes echter ongeveer 500 keer meer proteïne hebben dan antilichamen , verschaf- 8520062 - 15 - fen de faagdeeltjes ook die veel grotere totale fluorescentie.

Wanneer verse USC 106 en YS57-stammen van E.coli gebruikt werden (dat wil zeggen niet gefixeerd met formal-dehyd ) bond de faag gelijkelijk aan beide bacteriën.

5 Dit was een onverwachte vondst, die aantoonde dat het preparaat eerst met formaldehyde gefixeerd moet worden. Dit geeft het ! voordeel dat antilichamen vernietigd worden, in het bijzonder natuurlijke antilichamen die in te onderzoeken pathologische preparaten aanwezig kunnen zijn en die de faag kunnen binden.

10

Voorbeeld III-A

De eerste voorwaarde voor het verkrijgen van mutanten van fagen die moleculen en cellen herkennen , is , dat de faag niet van nature al aan dergelijke cellen of moleculen 15 bindt. Derhalve werden fagen als in voorbeeld I-A bereid en fluorescerend gemaakt tot een molaire verhouding van FITC/faag-proteïne van 11,3 . Deze fagen werden beproefd wat betreft hun vermogen om te binden aan complexe cellen , met monoklonale muizeantilichamen behandelde humane lymfocieten , en konijne-20 lymfocieten . Humane raononucleaire cellen werden gezuiverd uit perifeer bloed met behulp van de Ficoll-hypaque methode, gewassen, en bij 4°C gedurende 1 uur geincubeerd met monoklonale anti-humane-T-cellen van de muis, en opnieuw gewassen.

Lymfoïde cellen van het konijn werden verkregen 25 uit milt en lymfeknopen met behulp van gebruikelijke methöden, gemengd en gewassen.

g

Suspensies die 10 cellen/ml (humaan of van de 12 muis) bevatten, werden behandeld met 10 fluorescerende faagdeeltjes, die als in voorbeeld I-A bereid y maar niet 30 met antilichamen bedekt waren. Na incubatie gedurende 1 uur bij 4°C werden de cellen gewassen en onder de microscoop onderzocht.

Er werd geen fluorescentie van het oppervlak waargenomen, wat er op duidde , dat T4-bacteriofagen , die fluorescerend gemaakt 8520062 - 16 - zijn , niet aspecifiek vast blijven zitten aan MIG , humane | lymfocieten of konijnelymfocieten. Deze verrassende waarneming verschafte de basis voor het selecteren op bacterio-fagen die binden.

5 De selectie van bacteriofagen die aan andere ! structuren binden dan die ze van nature herkennen, wordt op ! twee manieren uitgevoerd: door verschillende bestaande bacterio- : fagen uit verscheidene verzamelingen aan een vergelijkend onder zoek te onderwerpen en door synthetische manipulaties. Een 10 voorbeeld van een vergelijkend onderzoek is het volgende.

Bacteriofaag T4 bindt niet aan verse suspensies van humane of konijne lymfocieten. Om te bepalen of andere structuren van de bloedbestanddelen geïdentificeerd kunnen worden, werden uitstrijkjes bereid van bloedcellen van konijnen en 15 mensen die vervolgens met formaldehyd behandeld werden. Daarna werden de uitstrijkjes gedurende 30 minuten behandeld met een 13 suspensie die 10 T4-faagdeeltjes per ml bevattey. die door behandeling met FITC fluorescerend gemaakt waren. De uitstrijkjes werden gewassen, een dekplaatje werd erop aangebracht, waarna 20 ze on<ler een fluorescentiemicroscoop onderzocht werden.

Een zeer intense fluorescentie werd slechts in het cytoplasma van de leucocieten gezien . De kern , de membraan en de rode bloedlichaampjes waren niet fluorescerend . Deze proef laat zien, dat op de een of andere wijze, via een onbekend en niet voor 25 de hand liggend mechanisme , een structuur in het cytoplasma van de witte bloedlichaampjes door de met FITC gelabelde T4-faag herkend wordt.

De selectie van bacteriofagen wordt ook door middel van synthetische manipulaties uitgevoerd. Bij de bereiding 30 van bacteriofaagmutanten voor hst herkennen van muizeimmunoglobuline (IgG) , worden Escherichia coli-bacteriën, stam YS57 , in petrischalen , als in voorbeeld I-A , bereid, en met UV-licht 8520062 - 17 - bestraald zodat 50-90% van de bacteriën gedood wordt; deze stap wordt uitgevoerd om de DNA-herstelmechanismen op gang te brengen. Een suspensie van T4-bacteriofaag wordt ook met UV-licht behandeld om ongeveer 80% van de bacteriofagen te doden 5 en mutaties te veroorzaken. Bacteriën worden met de bacteriofaag geïnfecteerd en de bacteriofaag wordt gekweekt, verzameld en met chloroform behandeld. De faagsuspensie wordt vervolgens ; geconcentreerd door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultracentrifugeren ter verkrijging van een suspensie met meer 12 10 dan 10 infectieuze eenheden/ml.

De bodem van een plastic petrischaaltje ; wordt met muize-IgG (MIG) bekleed , direkt door incubatie bij 25°C en pH 9,2 gedurende de nacht, of door gebruik van poly-L-lysine als een koppelmiddel. Dit MIG heeft geen antifjaag-15 antilichaamaktiviteit, dat wil zeggen het is ofwel monoklonaal voor een andere specificiteit of het wordt tevoren met faag geabsorbeerd of slechts het Fc-gedeelte wordt gebruikt. De faag wordt aan het schaaltje toegevoegd en gedurende 1 uurbij 37°G geincubeerd. De plaat wordt zorgvuldig gewassen ter verwijdering 20 van niet-gebonden faag. Ter verbetering van de kans de mutanten te verkrijgen , wordt muize-IgG aan deeltjes, erythrocieten, bacteriën of korrels vastgemaakt, ofwel chemisch of door de antilichaamfunctie.

De plaat die met faag behandeld en gewassen 25 is, wordt gebruikt om de faag direkt door toevoegen van bacteriën in zachte agar te kweken. De plaat wordt eerst herhaaldelijk gewassen ter verwijdering van de faag die niet specifiek gebonden is. Om de kans te vergroten kopmutaties te verkrijgen die overleven, wordt de faag ook bij hogere temperaturen, bijvoorbeeld 42°C 30 gekweekt. De faagkolonies worden eruit gehaald en in gevoelige bacteriën gekweekt en 2-3 keer opnieuw^ gekloond.

Als een vooronderzoek naar faagklonen die MIG herkennen , wordt de volgende methode gebruikt. Platen worden 8520062 - 18 - bekleed met MIG zoals hierboven beschreven, ëe ouderstam van de faag wordt naast de mutanten aan verschillende platen toegevoegd, geincubeerd en gewassen , en tenslotte worden bacteriën toegevoegd. Hoewel de ouderstam slechts zeer weinig plekken geeft , geven de mutanten die aan MIG binden , vele plekken en zelfs samenvloeiende lyse van bacteriën.

Voorbeeld III-B

^ Bij een werkwijze die samenhangt met die van voorbeeld III-A worden de faagkolonies opgenomen op een adsorptie-papier. Radioaktief of fluorescerend MIG wordt toegevoegd, geincubeerd om binding van MIG aan de mutant te bevorderen, waarna het geheel gewassen en vervolgens onderzocht wordt met een scanner voor radioaktiviteit respectievelijk met UV-licht. Van de betreffende mutanten wordt teruggegaan naar de oorspronkelijke gel en deze worden gekloond. Ter verkrijging van extra bewijs worden alle gevormde kolonies verzameld en in bacteriën gekweekt, elke kloon in twee buizen, waarvan één met u gelabelde aminozuren bevat. De fagen worden verzameld, met chloroform behandeld, ver- 20 zameld door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultra-centrifugeren , en toegevoegd aan met MIG beklede microputjes.

Na incubatie bij 37°C gedurende een uur worden de putjes gewassen, wordt natriumdedecylsulfaat (SDS)oplossing toegevoegd om ^ gebonden radioaktief materiaal te verwijderen en wordt de c.p.m.

bepaald. De faagkloon die een grotere telling geeft dan de achtergrond wordt vervolgens gekweekt en opnieuw getoetst op het vermogen aan MIG te binden in hetzelfde systeem als hierboven.

Voorbeeld III-C

30 -

De bacteriofaag die binding aan MIG vertoont, wordt zichtbaar gemaakt met behulp van één van de gebruikelijke methoden. De bacteriofaag wordt fluorescerend gemaakt door koppeling met het fluoresceïneisothiocyanaat , rhodamine of andere 8520062 - 19 - fluorescerende kleurstoffen, door behandeling met ethidiumbromide, dat aan het faag-DNA bindt, of door andere kleurstoffen die aan nucleïnezuren binden. De faag wordt radioaktief gemaakt ofwel door opneming van radioaktieve materialen in het proteïne of nucleïne-5 zuur ofwel door gebruikelijke methoden voor het koppelen van radioaktieve materialen aan proteïnen. In een alternatief wordt : een metaal zoals zilver aan de faag volgens gebruikelijke methoden toegevoegd.

Om de waarde als reagens van deze faag te toetsen 10 worden humane lymfoeieten behandeld met MIG anti-humaan-T-cel monoklonale antilichamen. De cellen worden gewassen en daarna wordt bijvoorbeeld de fluorescerende faag toegevoegd. Ter controle wordt de fluorescerende faag toegevoegd aan humane lymfoeieten die niet met het monoklonale antilichaam behandeld zijn. Nadat de 15 lymfoeieten gedurende 30 minuten behandeld zijn, worden zij gewassen en worden de cellen onder de microscoop met UV-licht onderzocht. De intense fluorescerende kleuring van 80-90% van de humane perifere bloedlymfocieten toont aan , dat de faag muize-IgG op het oppervlak van de lymfociet herkent. Het niet-fluoresceren 20 van cellen die met ouderfaag in plaats van de mutant behandeld waren, of tevoren met normaal MIG in plaats van anti-T-cel-antilichaam behandeld waren, geeft een controle. Een andere controle wordt gegeven door het feit dat aangetoond wordt dat gezuiverde humane B-cellen niet fluorescerend worden wanneer zij als de :2B niet-gescheiden perifere bloedlymfocieten behandeld worden.

Voorbeeld IV

De selectie van mutanten door uitwendige beeldvorming vereist de bereiding van bacteriën die faagreceptoren 30 hebben welke een bepaald te identificeren macromolecuul , bijvoorbeeld muize-IgG (MIG), nabootsen. In dit geval wordt MIG in konijn 8520062 - 20 - nen of ratten geïnjecteerd om anti-MIG-antilichamen te induceren.

De volgende methode heeft tot doel een bacteriofaag precies als een antilichaam te laten werken door zijn staart als een aanhechtingsplaats te gebruiken.

5 1) Het anti-MIG-antilichaam wordt met affini- ;

teitschromatografie gezuiverd en aan een vaste fase , zoals de bodem van een petrischaal , gekoppeld door middel van poly-L-lysine. _E. coli. die resistent is voor de faag, wordt gekweekt, gewassen, in fysiologische gebufferde zoutoplossing gesuspendeerd, 10 aan de petrischaal toegevoegd en gedurende een uur bij 4°C

geincubeerd. De petrischaal wordt zorgvuldig gewassen en cultuur-medium wordt toegevoegd. Bacteriën die groeien, worden 4-5 keer blootgesteld aan dezelfde bindingscyclus , elke keer in aanwezigheid van de faag om het faag-resistente karakter van de bacteriën 15 te handhaven. Bij elke blootstelling worden de bacteriën met mutagenen behandeld om het aantal mutanten te vergroten.

2) Bacteriën die geselecteerd worden, worden gekloond en elke kloon wordt getoetst op binding door het anti-MIG-antilichaam met gebruikelijke methoden. De bacteriële 20 mutanten groeien in een sterkere mate dan de ouderstam , wanneer toegelaten wordt dat ze zich hechtenuaan de bodem van de platen die met het antilichaam tegen MIG bekleed zijn, waardoor de mutant een selectief voordeel verkrijgt.

3) De voor faag gevoelige bacteriën worden 25 met UV bestraald, de faag wordt met UV bestraald en vervolgens gemengd met voor faag gevoelige bacteriën voor infectie en vorming van mutanten. De fagen en bacteriën kunnen echter ook eerst gemengd en vervolgens met UV bestraald worden. Deze bacteriën worden in gelijke verhoudingen gemengd met faagresistente 30 bacteriën welke door anti-MIG-antilichamen herkehd worden. De faag lyseert alle voor faag gevoelige bacteriën, maar.tast de faag-resistente bacteriën niet aan. Wanneer een mutantfaag verschijnt, die de MIG-achtige structuur op de faagresistente bacteriën 8520062 * - 21 - herkent, wordt een heldere plek gevormd.

4) De heldere plekken worden verzameld, gekweekt in bij stap 2 verkregen bacteriën, en elke kloon wordt getoetst op zijn wisselwerking met MIG met gebruikelijke competitie- of bindingsproeven. De klonen worden getoetst op hun vermogen hun gastheer te infecteren in aanwezigheid van MIG dat geen antilichaamaktiviteit tegen de faag heeft. Wanneer de faag MIG met zijn staart herkent, bindt de faag aan het - MIG en kan hij zich met hechten aan zijn gastheer. ,Als resultaat heeft geen lyse plaats. Door fragmenten van MIG te gebruiken wordt de precieze herkenningsplaats bepaald.

De binding wordt beproefd op een vaste fase welke bekleed is met MIG, gevolgd door anti-faag antilichaam dat met peroxydase gelabeld is en substraat. De kenmerkende kleur-verandering verschijnt slechts waar de faag gebonden wordt en laat zijn aanwezigheid zien. De faag wordt als in voorbeeld I zichtbaar gemaakt.

Voorbeeld V

Sommige oppervlaktereceptoren of antigenen, op bacteriën worden beheerst door plasmiden. Een voorbeeld is de sexpilus op E.coli. Deze pilus woédt herkend door sexspecifieke fagen, zoals 0X174. Het gen voor het constante gebied van de zware of de lichte keten van MIG wordt in het plasmide dat de sexpilus beheerst , opgenomen. Bacteriën die MIG tot expressie brengen in plaats van of samen met pilusproteïnen , worden geselecteerd door een vaste fase met anti-MIG-antilichamen te gebruiken. Fagen die deze pilus herkennen, worden vervolgens geselecteerd, waarna aangetoond wordt dat ze MIG als hiervoor ^ herkennen. In de eerste stap worden de faagresistente bacteriën geselecteerd door de positieve druk \an het anti-MIG-antilichaam. De faag wordt als in voorbeeld I zichtbaar gemaakt.

8520062 - 22 -

Voorbeeld VI-A

Bacteriofagen worden in bacteriën gekweekt die variabele genen voor een tegen MIG gericht antilichaam in plasmiden hebben. Door recombinatie worden fagen gevormd die ;* in het staartgebied van MIG zware en/of lichte ketens tot expressie brengen. Door gebruik van de werkwijze van voorbeeld II : groeit deze faag bij voorkeur in bacteriën die resistent zijn voor de ouderfaag en die geselecteerd zijn omdat ze op het oppervlak de te identificeren structuur, MIG, hebben.

Deze structuur komt tot expressie op de pilus zoals in voorbeeld III aangetoond is of op andere oppervlakteproteïnen, die als receptoren bij de infectie gebruikt worden.

Voorbeeld VI-B

^ E_. coli-bacteriën die V-genen voor L-ketens van anti-MIG-antilichamen bevatten in plasmiden, worden bereid volgens standaardmethoden. Fagen worden in deze bacteriën gekweekt ter verkrijging van recombinant-DNA. Bij sommige fagen komen de V - of L-genen in de trilharen tot expressie, maar JL ?Π

dit is onverenigbaar met overleven. Dezelfde methode wordt toegepast voor variabele genen van zware ketens. Om de ouderfagen te elimineren worden antilichamen gemaakt die specifiek zijn voor trilharen, en alle fagen die normale trilharen hebben, .· worden door absorptie en precipitatie met hun gastheerbacteriën J geelimmeerd. Zeldzame fagen blijven over, die ofwel onvolkomen zijn ofwel Z- of L-ketens hebben. Zij worden geconcentreerd door ultracentrifugeren en gebruikt om bacteriën te infecteren die MIG, of MIG-achtige structuren, op hun oppervlak tot expressie brengen, zoals hierboven beschrevenuis. Door aantrekking via ^ niet-covalente krachten infecteren de fagen die Ig-genen tot expressie brengen, hun bacteriën. Het resulterende nageslacht wordt gevormd door ,,hybride"-fagen , faagparen die coinfectie blijven veroorzaken. De specificiteit van dit hybride voor MIG

8520062 - 23 - wordt als boven beschreven vastgesteld. De faag wordt als in voorbeeld I zichtbaar gemaakt.

Voorbeeld VII

5 Koolhydraten, ofwel als mono-, oligo- of poly- sacchariden, worden gekoppeld aan bacteriofagen , die daarna fluorescerend of radioaktief gemaakt worden of aan een enzym gekoppeld worden. Deze monsters worden gebruikt om lectinen in oplossing te identificeren, met behulp van een fluorometer, op 10 vaste fase of op cellen. De fagen worden zichtbaar gemaakt zoals in voorbeeeld I beschreven is.

Voorbeeld VIII

Lectinen worden gekoppeld aan bacteriofaag, 15 die zichtbaar gemaakt wordt als in voorbeeld I. Deze conjugaat- fase wordt gebruikt om koolhydraten te bepalen waarvoor de lectinen specifiek zijn, ofwel in oplossing, zoals in voorbeeld VII, of cellen, of op vaste fasen.

2o Voorkeursuitvoeringsvorm

Bij de bereiding van bacteriofaagmutanten voor de herkenning van muize-immunoglobuline (igG) , worden

Escherichia coli-bacteriën bereid in petrischaaltjes en bestraald met UV-licht zodat 50-90% van de bacteriën gedood wordt. Een 25 suspensie van T4-bacteriofagen wordt ook behandeld met UV- licht zodat ongeveer 80% van de bacteriofagen gedood wordt en mutaties veroorzaakt worden. Bacteriën worden geïnfecteerd met de bacteriofaag, en de bacteriofaag wordt gekweekt, verzameld en met chloroform behandeld. De faagsuspensie wordt daarna geconcen- 30 treerd , door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultra- centrifugeren , ter verkrijging van een suspensie van meer 12..

dan 10 infectieuze eenheden/ml.

De bodem van een plastic petrischaaltje wordt - 24 - bekleed met muize-IgG (MIG) , direkt door incubatie bij 25°C en pH 9,2 gedurende de nacht , of door gebruik van poly-L-lycine als een koppelmiddel. Dit MIG heeft geen antifaag-antilichaamwerking,: dat wil zeggen het is ofwel monoklonaal voor een andere specifici- ^ teit, of het wordt tevoren met faag geabsorbeerd of slechts het ; Fc-gedeelte wordt gebruikt. De faag wordt toegevoegd aan het petrischaaltje en bij 37°C gedurende 1 uur geincubeerd. De plaat wordt zorgvuldig gewassen ter verwijdering van eventueel i 10 aanwezige niet-gebonden faag.

De behandelde en gewassen plaat wordt vervolgens gebruikt om de faag direkt te kweken door bacteriën in zachte agar toe te voegen . De plaat wordt eerst herhaaldelijk gewassen ter verwijdering van de faag die niet specifiek gebonden is.

15

Om de kans te vergroten kopmutaties te verkiljgen die overleven, wordt de faag bij een hogere temperatuur (42°C) gekweekt en wordt het selectieproces 2-3 keer herhaald.

Als vooronderzoek naar faagklonen die MIG herkennen, worden platen bekleed met MIG en wordt de ouderstam van de 20 faag tegelijk met de mutanten aan verschillende platen toegevoegd, geincubeerd, gewassen , en worden tenslotte bacteriën toegevoegd.

Hoewel de ouderstam slechts weinig vlekken geeft, geven de mutanten die aan MIG binden vele vlekken en zelfs samenvloeiende lyse van bacteriën.

25

Bij een ermee samenhangende werkwijze worden faagkolonies op een adsorberend papier opgepakt , en wordt

fluorescerend MIG toegevoegd , geincubeerd om binding van MIG

aan de mutant te bevorderen, gewassen en met een scanner met UV- licht beoordeeld. De betreffende mutanten worden in de originele 30 gel teruggezocht en gekloond. De fagen worden verzameld, met chloroform behandeld, door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultracentrifugeren verzameld , en aan microputjes die met MIG bekleed zijn, toegevoegd. Na incubatie bij 37°C gedurende een uur wordt de fluorescentie bepaald en wordt de faag- 0520062 - 25 - kloon die de grootste fluorescentie vertoont , vervolgens gekweekt en opnieuw beproefd op zijn vermogen aan MIG in hetzelfde systeem als hiervoor te binden.

:

De bacteriofaag die binding aan MIG vertoont, i i ·: 5 wordt zichtbaar gemaakt door koppeling met fluoresceïneisothio- cyanaat.

i

Om de waarde als reagens van de faag te toetsen, worden humane lymfocieten behandeld met MIG-anti-humaan-T-cel monoklonale antilichamen. De cellen worden gewassen en de fluoresce-10 rende faag wordt toegevoegd. Ter controle wordt de fluorescerende faag toegevoegd aan humane lymfocieten die niet met het monoklonale antilichaam behandeld zijn. Na behandeling gedurende 30 minuten worden de lymfocieten gewassen en worden de cellen onderzocht onder de microscoop met UV-licht. De intense fluorescerende 15' kleuring kan 80-90% van de humane perifere bloedlymfoeieten duidt op herkenning door de faag van muizerlgG op het lymfocietoppervlak.

Technische toepasbaarheid

De methode volgens de uitvinding is in het 20 bijzonder geschikt voor het verkrijgen van een doeltreffende klinische proefmethode en voor een onderzoekspakket dat doeltreffende hoeveelheden van een geselecteerde bacteriofaag, gekoppeld met een zichthaarmakend middel , omvat. Een dergelijk pakket is niet duur; bruikbaar in de handen van een geschikt getrainde 25 klinische laboratoriumassistent ; en zeer geschikt voor klinisch gebruik , waarbij vele proeven gebruikelijk in een betrekkelijk korte tijdsduur uitgevoerd worden.

; 30 8520062

Claims (22)

1. Werkwijze voor de identificatie en kwantifi-j ; cering van moleculaire en cellulaire materialen die in een proef- j monster aanwezig zijn , bij welke werkwijze men achtereenvolgens: (a) een bacteriofaag kiest die door genetische : 5 of chemische manipulatie aangepast is, zodat hij aan genoemde moleculaire of cellulaire materialen bindt; (b) aan de gekozen bacteriofaag een zichtbaar-makend middel, of analysemiddel, koppelt met een meetbaar signaal, welk analysemiddel afkomstig is uit de groep fluorescerende 10 middelen, radioaktieve isotopen, enzymen, metalen en kleurings- middelen; (c) de moleculaire of cellulaire materialen in het proefmonster combineert met de in stap (b) gekoppelde : bacteriofaag, ter verkrijging van een conjugaatfase in het |l5 proefmonster ; en | (d) de conjugaatfase onderwerpt aan analyse, i waarbij men het meetbare signaal van het gekoppelde analysemiddel | | gebruikt. i , , ,

1. Verbeterde werkwijze voor de identificatie en kwantificering van moleculaire en cellulaire materialen die in een proefmonster aanwezig zijn , bij welke werkwijze men achtereenvolgens: ^ (a) een bacteriofaag selecteert gekenmerkt door het vermogen genoemde moleculaire en cellulaire materialen te herkennen; (b) in de geselecteerde bacteriofaag een zichtbaarmakend middel opneemt, gekozen uit de groep fluoresceren- 1q de middelen, radioaktieve isotopen, enzymen, metalen en kleurmid-delen; (c) het proefmonster combineert met de geselecteerde bacteriofaag onder bindingsomstandigheden ter verkrijging van een conjugaatfase in het proefmonster, welk conjugaat de ^5 geselecteerde bacteriofaag en het erin opgenomen zichtbaarmakend middel samen met het moleculaire en/of cellulaire materiaal omvat; en (d) de conjugaatfase onderwerpt aan analyse, waarbij men het zichtbaarmakende middel gebruikt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de j _ : l20 bacteriofaag geselecteerd wordt op het vermogen via de kop te | binden aan moleculaire of cellulaire materialen en waarbij genoemde ! selectie teweeggebracht wordt ter verkrijging van een conjugaatfa-: se, bij welke werkwijze men voorts achtereenvolgens: (a) de bacteriofaag mengt met bacteriën; 25 (b) het mengsel bestraalt met ultraviolet licht om mutatie van de bacteriofaag teweeg te brengen; (c) de mutantbacteriofaag vermenigvuldigt in j 8520062 i % - 31 - I aanwezigheid van bacteriën ter verkrijging van een populatie van i . i | de mutantbacteriofaag; | (d) de populatie van de mutantbacteriofaag zuivert; ί i- (e) de gezuiverde mutantbacteriofaag bindt aan i een celoppervlak of aan een moleculair materiaal; en (f) de gebonden mutantbacteriofaag in bacteriën j vermenigvuldigt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 , waarbij de bacteriofaag geselecteerd wordt op het vermogen via de kop te binden aan moleculaire of cellulaire materialen en waarbij genoemde binding teweeggebracht wordt ter verkrijging van een conjugaatfase doordat men achtereenvolgens: 25 (a) de bacteriofaag mengt met een aanzienlij ke overmaat bacteriën; (b) het mengsel bestraalt met ultraviolet licht om mutatie van de bacteriofaag teweeg te brengen; (c) mutantbacteriofaag kweekt in aanwezigheid 30 van bacteriën; (d) de gekweekte mutantbacteriofaag zuivert; 8520062 ; - π- j (e) de gezuiverde mutantbacteriofaag bindt aan j 1 een celoppervlak of aan een moleculair materiaal; en i (f) de gebonden mutantbacteriofaag kweekt. j

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij het \ 1Γ1 moleculaire materiaal immunoglobulinen omvat. ! IU

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij ! : 5 het moleculaire materiaal immunoglobulinen omvat.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij het moleculaire materiaal aan een vaste fase gekoppeld wordt.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij het j moleculaire materiaal aan een vaste fase gekoppeld wordt.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij het ; cellulaire materiaal oppervlakte-glycoproteïnen van dierlijke ,| ^ cellen omvat.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij het cellulaire materiaal oppervlakte-glycoproteïnen van dierlijke 10 cellen omvat.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de bacteriofaag geselecteerd wordt op het vermogen via de staart te binden aan moleculaire of cellulaire materialen en waarbij genoemde selectie teweeggebracht wordt ter verkrijging van een | 20 conjugaatfase, bij welke werkwijze men voorts achtereenvolgens: ! (a) het moleculaire of cellulaire materiaal in een dierlijke gastheer injecteert voor de bereiding van anti-lichamen daarvoor; (b) de tegen genoemd moleculair of cellulair | 25 materiaal specifieke antilichamen wint en zuivert; I (c) de gezuiverde specifieke antilichamen aan l I een vaste fase koppelt ; (d) de gekoppelde antilichamen behandelt met een aanzienlijke overmaat voor bacteriofaagresistente bacteriën, ! 2q waardoor sommige mutantbacteriën aan de antilichamen binden; | (e) de mutantbacteriën die geselecteerd zijn | door hun vermogen aan genoemde antilichamen te binden, kweekt en ! verzamelt; | 8520062 * ▼ (f) de geselecteerde bacteriofaag bestraalt met ultraviolet j ! licht; | (g) . afzonderlijk een voor de bacteriofaag gevoelige bacterie-! j ! stam bestraalt met ultraviolet licht; 5 (h) de bestraalde bacteriofaag van stap (f) mengt met de bestraalde bacteriën van stap (g); (i) ongeveer gelijke porties van de produkten van stappen (e) en (h) mengt onder omstandigheden voor de ontwikkeling van plekken, | waardoor mutantbacteriofagen gevormd worden en heldere plekken geven; eri I 10 (j) de mutantbacteriofaag uit de heldere plekken wint en deze ! in de bacteriën van stap (e) vermenigvuldigt,waardoor een mutantbacte-: I riofaag geselecteerd wordt, welke aan genoemde moleculaire of cellulaire materialen kan binden. i 1 15 7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij het moleculaire ma teriaal immunoglobulinen omvat.

6. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de bacteriofaag geselecteerd wordt op het vermogen via de staart te binden aan moleculaire of cellulaire materialen en waarbij genoemde binding teweeggebracht wordt ter verkrijging van een conjugaatfase : 15 doordat men achtereenvolgens: (a) het moleculaire of cellulaire materiaal in een dierlijke gastheer injecteert voor de bereiding van anti-! lichamen daarvoor; ! (b) de antilichamen wint . en zuivert; | 20 (c) de gezuiverde antilichamen koppelt aan een ! vaste fase ; | (d) de gekoppelde antilichamen behandelt met een aanzienlijke overmaat bacteriën, welke'bacteriën gekozen worden j | wegens hun resistentie voor de geselecteerde bacteriofaag, waardoor 25 de bacteriën aan de antilichamen binden; (e) door genoemde antilichamen geselecteerde I ; bacteriën kweekt en verzamelt; (f) de geselecteerde bacteriofaag bestraalt met | ultraviolet licht; | 30 (g) afzonderlijk een voor de geselecteerde j bacteriofaag gevoelige bacteriestam bestraalt met ultraviolet | licht; j (h) de bestraalde bacteriofaag van stap (f) mengt ! met de bestraalde bacteriën van stap (g) ; 85 2 0 0 6 2................................ - 28- (i) ongeveer gelijke porties van de produkten van stappen (e) en (h) mengt onder kweekomstandigheden voor de vorming van mutantbacteriofagen, waarbij binding via de staart van de mutantbacteriofaag en de door antilichaam geselecteerde j ; c i • bacteriën een conjugaatfase geeft; en j (j) dat gedeelte van de in stap (i) gekweekte j ; ' j conjugaatfase wint, dat de door antilichaam geselecteerde bacteriën : j van stap (e) kan lyseren, waardoor een conjugaatfase geselecteerd j wordt die mutantbacteriofaag omvat,welke aan genoemde moleculaire | ^ en/of cellulaire materialen kan binden. j

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij het ! moleculaire materiaal immunoglobulinen omvat. ;

8. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het cellulaire materiaal bacteriën omvat.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het te identificeren materiaal bacteriën omvat. ! IC

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het oppervlak van 20 de bacteriën bekleed is met receptoren welke door plasmidfci beheeist worden.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij het te identificeren materiaal bacteriën omvat waarvan het oppervlak bedekt is met antigenen die door plasmiden beheerst worden.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het analysemiddel van stap (b) aan de geselecteerde bacteriofaag gekoppeld wordt na de combinatie met het proefmonster ter verkrijging van een conjugaatfase ; als in stap (c). I 25 11. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de geselecteerde j bacteriofaag chemisch bekleed wordt met antilichamen tegen het te identificeren materiaal.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het zichtbaarmakend middel opgenomen wordt in de geselecteerde 20 ... bacteriofaag na de binding met het proefmonster. :

11. Werkwijze volgens conlcusie 1, waarbij de geselecteerde bacteriofaag chemisch bekleed wordt met antilichamen ; tegen het te identificeren materiaal.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de geselecteerde bacteriofaag aan het te identificeren materiaal via een hybride- i 30 antilichaam gekoppeld wordt.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de : 2S . ... . . ' geselecteerde bacteriofaag aan het te identificeren materiaal via j een hybride-antilichaam gekoppeld wordt.

13. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de geselecteerde bacteriofaag met koolhydraten bekleed wordt, waardoor de conjugaatfase dient voor de identificatie en kwantificering van lectinen.

13. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de j geselecteerde bacteriofaag met koolhydraten bekleed wordt, waardoor1 de conjugaatfase dient voor de identificatie en kwantificering | van lectinen. !

14. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de j______________________________...................................._ ___ ______________________________ i 1520062 * * *

33. I geselecteerde bacteriofaag bekleed wordt met lectinen, waardoor | j de conjugaatfase dient voor de identificatie en kwantificering van j j koolhydraten. ; i j

14. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de j ; geselecteerde bacteriofaag bekleed wordt met lectinen, waardoor de I I j I i 8520062 · -· - i i ; ; i ί___________________________-................................................................................................................................................................................. J ; - 29- I conjugaatfase dient voor de identificatie en kwantificering van ; koolhydraten.

15. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het ; I 5 analysemiddel een fluorescerend middel is. | i |

15. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het zichtbaarmakende middel een fluorescerend middel is. |

16. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het analysemiddel een radioaktieve isotoop is.

16. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het j ^ zichtbaarmakende middel een radioaktieve isotoop is. j

17. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij j het analysemiddel een enzym is. I

17. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het zichtbaarmakende middel een enzym is. j

18. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het analysemiddel een metaal is.

18. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het zichtbaarmakende middel een metaal is. iq 19. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het zichtbaarmakende middel een kleuringsmiddel is.

20. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het cellulaire materiaal van het proefmonster pathogenen in pathalo- ; gische vloeistoffen omvat , en het zichtbaarmakende middel een fluorescerend middel of een enzym is.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij de ! geselecteerde bacteriofaag bekleed wordt met antilichamen die specifiek zijn voor de pathogenen.

22. Pakket voor de identificatie van bacteriën, j 20 eucariotische cellen en andere moleculaire materialen, welk pakket afgemeten, doeltreffende porties geselecteerde bacteriofaag, gekoppeld met een zichtbaarmakendimiddel, omvat. i ! j j i j ; 8520062 I - 30 - I i ; I j i - GEWIJZIGDE CONCLUSIES - ! ! i (ontvangen door het International Bureau op 12 augustus 1985 j (12.08.85); oorspronkelijke conclusies 1,2,6,8-10,15-20 en 22 gewijzigd; andere conclusies niet gewijzigd)

19. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het analysemiddel een kleuringsmiddel is.

20. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het ; ^ cellulaire materiaal van het proefmonster pathogenen in pathologische vloeistoffen omvat, en het analysemiddel een fluorescerend middel of een enzym is.

; 21.Werkwijze volgens conclusie 20, waarbij de geselecteerde bacteriofaag bekleed wordt met antilichamen die I 20 specifiek zijn voor de pathogenen.

: 22. Pakket voor de identificatie van bacteriën, j eucariotische cellen en andere moleculaire materialen, welk pakket afgemeten, doeltreffende portiès geselecteerde bacteriofaag, ! gekoppeld aan een analysemiddel, omvat. 25 t ; i : j ; | . i l ..... ...... __ _________________ ____ i 8520062