DE19954713B4

DE19954713B4 - Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen

Info

Publication number: DE19954713B4
Application number: DE1999154713
Authority: DE
Inventors: Lothar Poschen; Peter Klauth; Ralf Dr. Wilhelm
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1999-11-13
Filing date: 1999-11-13
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2019-11-14
Also published as: GB0027557D0; NL1016565A1; GB2357778A; NL1016565C2; DE19954713A1; GB2357778B

Abstract

Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Hybridisierungsraum (1) aufweist, welcher bodenseitig mit einer Fritte (4) und einem auf der Fritte (4) aufliegenden Filter (3) ausgestattet ist, der durch Haltemittel (7) im Randbereich an die Fritte (4) angepresst wird und dass sich unterhalb der Fritte (4) eine Einrichtung zum Absaugen von Flüssigkeit (6) befindet und dass der Hybridisierungsraum (1) in einen temperierbaren massiven wärmeleitenden Block eingelagert ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

In der Umweltmikrobiologie ist der Einsatz fluoreszenzmarkierter Gensonden eine gängige Methode, um Zellzahl und phylogenetische Zuordnung von Bakterien aus Umweltproben zu bestimmen. Bei den Gensonden handelt es sich um DNA-Abschnitte, welche mit einem Fluoreszenzfarbstoff strukturell modifiziert sind. Prinzip dieser Technik ist, daß sich die Gensonden an die ribosomale RNA von Zellen anlagern, die Fluorophore der Gensonde dann mit Licht einer spezifischen Wellenlänge angeregt werden und schließlich deren Emission z.B. mikroskopisch detektiert wird.

Die Methode ist in T. Schwartz, J. Schmitt, H. C. Flemming und U. Obst, 1999, "Die Untersuchung von Biofilmen in Trinkwassersystemen, Wasser, Abwasser", 140(3), 182–190, beschrieben und wird als „FISH" = „Fluorescence In Situ Hybridization" bezeichnet.

Bei der Untersuchung von Zellen mit fluorezenzmarkierten Gensonden müssen folgende Verfahrensschritte vorgenommen werden. Zunächst werden die Zellen immobilisiert bzw. fixiert. Es handelt sich bei der Immobilisierung bzw. Fixierung um einen Vorgang, bei dem die Proteine der Zellen durch Degeneration in ihrer Aktivität soweit eingeschränkt werden, daß sie Nukleinsäuren nicht abbauen. Zu diesem Zweck wird ein Fixativ zugesetzt. Nach einem Verfahren von F. 0. Glöckner, M. F. Fuchs und R. Amann, 1999, "Bacterioplankton Compositions of Lakes and Oceans: a First Comparsion Based on Fluorescence In Situ Hybridization", Appl. Environ. Microbiol. 65: 3721–3726, werden die Zellen mit einem Fixativ versetzt, inkubiert und später auf einem Filter abfiltriert. Zur Filtration werden Standardfilter eines Durchmessers von 25 oder 47 mm eingesetzt. In einem alternativen Verfahren von Amann werden die Zellen mit dem Fixativ versetzt, inkubiert, zentrifugiert, resuspendiert und auf einen speziellen Objektträger mit Vertiefungen aufgetragen und luftgetrocknet. Das Verfahren ist in R. I. Amann, L. Krumholz und D. A. Stahl, 1990, "Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology", J. Bacteriol. 172: 762–770, veröffentlicht.

Die Methode von Amann hat zum Nachteil, daß bei der Trocknung die Lösungen nicht immer homogen verdunsten und sich ringförmige Ansammlungen von Objekten bilden können. Hinzu kommt, daß mehrere Arbeitsschritte wie Zentrifugieren, Resuspendieren und Verdünnen die Zellen beeinträchtigen können, bis hin zu deren Zerstörung. Die Trocknung der Objektträger nimmt viel Zeit in Anspruch, so daß die Proben nicht sofort weiterverarbeitet werden können. Aus diesen Gründen wird in der Regel die Filtermethode nach Glöckner bevorzugt.

Nach der Fixierung der Zellen folgt als zweiter Verfahrensschritt die Hybridisierung.

Nach dem Verfahren von H. M. Christensen, H. M. Hansen und J. Sorensen, 1999, "Counting and size classification of active soil bacteria by fluorescence in situ hybridization with RNA oligonucleotide probe", Appl. Environ. Microbiol. 65: 1753–1761, erfolgt die Hybridisierung in einem Reaktionsgefäß. Bei der Hybridisierung werden der Zellsuspension die fluoreszenzmarkierten Gensoden zugefügt. Die Hybridisierung erfordert je nach Art der verwendeten Gensonde einen Zeitraum von 30 bis 60 Min. bei einer Temperatur von 40 bis 50°C. Die Temperatur hängt ebenfalls von der gewählten Gensonde ab. Wurden die suspendierten Zellen nach der Methode von Christensen in den Reaktionsgefäßen hybridisiert, so wird eine Zentrifugation durchgeführt, welche aber, wie erwähnt, die Qualität des Zellmaterials vermindert. Nach der Zentrifugation werden die Zellen gewaschen. Zur mikroskopischen Betrachtung werden die Zellen dann abfiltriert und der Filter auf einen Objektträger übertragen. Nach der Methode von Glöckner wird der Filter, welcher sich auf dem Objektträger befindet, mit Hybridisierungslösung überschichtet und in einer feuchten Hybridisierungskammer plaziert. Zum Waschen wird das Filter in ein Glasfläschchen mit Waschpuffer überführt, anschließend getrocknet und auf einen Objektträger zur mikroskopischen Aufnahme aufgezogen. Bei dieser Methode gehen unter optimalen Bedingungen mindestens 10% der Zellen verloren. Der Verlust der Zellen ist jedoch in Umweltproben unkontrolliert.

Das Verfahren ist in der Veröffentlichung F. O. Glöckner, R. Amann, A. Alfreider, J. Pernthaler, R. Psenner, K. Trebesius und K. H. Schleifer, 1996, "An in Situ Hybridization Protocol for Detection and Identification of Planktonic Bacteria System, Appl. Microbiol. 19: 403–406, beschrieben.

Vorrichtungen mit einem Raum, der bodenseitig durch eine Fritte begrenzt wird, auf der ein randseitig angepasster Filter aufliegt und unterhalb der Fritte eine Absaugvorrichtung angeordnet ist, sind aus den Prospekten SM 300/1 und SM 500/1 der Firma Sartorius bekannt.

Die Europäische Patentanmeldung 0 122 581 offenbart eine Filtereinrichtung, die mit einer Vorrichtung kombiniert ist, die geeignet ist, Bakterien auf dem Filter wachsen zu lassen.

Die DE 197 25 894 11 zeigt eine zweistufige Vakuumkammer, die mit Filterelementen bestückt wird und der Plasmidpräparation dient.

Die nach dem Stand der Technik bekannten Methoden haben zahlreiche Nachteile. So sind mehrere Arbeitsschritte unter Verwendung unterschiedlicher Gerätschaften erforderlich, bei denen Zellmaterial verloren gehen kann, oder bei denen die Zellen durch mechanische Beanspruchung, wie beispielsweise durch Zentrifugation oder Resuspendieren, beschädigt werden können. Bei diesen Verfahren werden auch die empfindlichen Genfluoreszenzsonden ständig der Gefahr der Belichtung ausgesetzt.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zu schaffen, mit der eine schnelle Versuchsdurchführung auf eine für die Zellen beschädigungs- und verlustminimierte Weise durchgeführt werden kann. Das Material soll vor Lichteinflüssen geschützt sein und unter konstanten und bestimmbaren Temperaturbedingungen behandelt werden.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es nunmehr möglich, mit wenigen Arbeitsschritten eine schnelle, saubere Versuchsdurchführung zu bewirken. Die Vorrichtung ermöglicht die Verwendung von kleinen Probenmengen und somit einen geringen Verbrauch an Gensonden und Zellmaterial.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Zeichnung zeigt eine beispielhafte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Es zeigt:
1: eine erfindungsgemäße Vorrichtung
Die in 1 dargestellte Vorrichtung zeigt einen Hybridisierungsraum 1, welcher in eine Kammer 2 eingelagert ist. Die Kammer 2 besteht in dieser Ausführungsform aus einem massivem Metallblock. Im Bodenbereich des Hybridisierungsraumes 1 liegt ein Filter 3 auf einer Fritte 4 auf. Unterhalb der Fritte 4 laufen die Wände 5 konisch zu und münden in eine Leitung 6, welche an eine Pumpe angeschlossen werden kann. In die Wand 5 der Kammer 2 ist eine Hülse 7 mit Außengewinde eingeschraubt, welche einen Dichtring 8 auf den Filter 3 preßt und somit den Filter 3 fixiert. Die Wand 5 weist ein Innengewinde zur Aufnahme der Hülse 7 auf. Die Innenwandung der Hülse 7 bildet in diesem Beispiel die Innenwand des Hybridisierungsraumes 1 aus. Der Hybridisierungsraum 1 wird durch einen Deckel 9 abgedeckt, welcher zusätzlich einen abnehmbaren Stopfen 10 aufweist. Unterhalb der Fritte 4 befindet sich ein Metallring 11. Zwischen dem Metallring 11 und der Fritte 4 liegt eine Silikondichtung 12, die vorzugsweise die gleichen Innen- und Außendurchmesser hat, wie der Metallring 11.
Bei der Versuchsdurchführung werden die zu untersuchenden Zellen zunächst mit einem üblichen Fixiermittel fixiert. Die Fixierung kann fakultativ im Hybridisierungsraum 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgen, jedoch kann sie auch gesondert vorgenommen werden. Wird die Fixierung im Hybridisierungsraum 1 durchgeführt, so kann nach Abschluß der Fixierung, die Flüssigkeit, welche das Fixiermittel enthält, über die Leitung 6 abgesaugt werden. Ein Nachspülen ist ebenfalls möglich, indem man Waschlösung auf die am Filter anhaftenden Zellen aufgibt und ebenfalls über Leitung 6 absaugt. Für die Hybridisierung selber wird den Zellen der Hybridisierungspuffer, welcher auch die Gensonden enthält, beigefügt. Die dabei entstehende Zellsuspension wird je nach Verwendung von Hybridisierungsmittel 30 Min. bis 1 h bei einer Temperatur zwischen 45 und 50°C beheizt. Zu Beheizungszwecken befindet sich die Kammer 2, welche aus massivem Metall besteht, bzw. aus wärmeleitendem Material bestehen muß, in einem Thermoblock, wodurch sich der gesamte Block auf die gewünschte Temperatur aufheizt. Nach gewünschter Inkubationszeit oder Hybridisierungsdauer wird die flüssige Phase wiederum über Leitung 6 mittels einer Vakuumpumpe abgezogen. Die auf dem Filter 3 verbleibenden Zellen können durch Aufbringen einer Waschlösung gereinigt werden, die ihrerseits wieder über Leitung 6 abgeführt werden kann. Der Filter 3 verbleibt während der gesamten Arbeitsdauer im Hybridisierungsaum. Vorteilhafterweise können alle Schritte unter vollkommenem Lichtausschluß durchgeführt werden, da der Hybridisierungsraum 1 durch den Deckel 9 mit dem Stopfen 10 lichtdicht verschlossen ist. Hierdurch wird ein Ausbleichen der Fluoreszenz der Gensonden verhindert.
Die Kammer 2 der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein Metallblock, der vorzugsweise aus rostfreiem VA Stahl besteht. Jedoch kann die Kammer auch aus anderen gut wärmeleitenden Materialien bestehen. Der Hybridisierungsraum 1 ist so konstruiert, daß eine Fritte mit einem Durchmesser von beispielsweise 25 mm passgenau eingelegt werden kann. Natürlich ist der Durchmesser des Hybridisierungsraumes nicht auf die Größe von 25 mm beschränkt, sondern es können auch andere Ausführungsformen zum Tragen kommen, beispielsweise sind im Handel Glasfritten eines Durchmessers von 47 mm erhältlich, welche zum Einsatz kommen können, so daß der Durchmesser des Hybridisierungsraumes 1 auch für die Aufnahme einer derartigen Glasfritte ausgestaltet werden kann. Auf die Glasfritte wird der Filter 3 aufgebracht, der eine Porengröße im Bereich von 0,2 μm bis 0,45 μm aufweisen kann. Jedoch kann die Porengröße je nach Anwendung unterschiedlich gewählt werden. Als Materialien für die Filter 3 kommen handelsübliche Polycarbonat-, Cellulosenitrat- oder Aluminiumoxidfilter in Frage.
Der Filter 3 wird durch Haltemittel im Randbereich auf die Fritte 4 aufgedrückt, so daß ein abdichtender Kontakt zustande kommt, welcher einen Durchtritt der Flüssigkeit im Randbereich des Filters unterbindet. In der in 1 dargestellten Ausführungsform wird der Fil ter 3 über einen Dichtring 8 mittels der Hülse 7, welche ein Außengewinde aufweist und die in die Kammer 2 eingedreht wird, auf den Filter 3 aufgedrückt. Die Innenwandung der Hülse 7 bildet somit auch die Wand des Hybridisierungsraumes 1. Die Hülse wird auch als Hybridisierungsrohr bezeichnet. Durch den Deckel 9 wird der Hybridisierungsraum 1 von Lichteinflüssen abgeschirmt. Über den Stopfen 10 ist dennoch die Zugabe von Reagenzien möglich. Durch den Deckel 9 und den Stopfen 10 wird auch die Kontaminationsgefahr verringert.
Durch die Verwendung des Ringes 11, der vorzugsweise aus Metall besteht und der Dichtung 12 ändern sich während des Betreibens der Vorrichtung die Strömungseigenschaften in der Glasfritte 4. Das bedeutet, daß sich die Zellen beim Abnutschen gleichmäßiger auf den Filter 3 verteilen, was für die spätere Auswertung und Differenzierung sehr vorteilhaft ist. Die Dichtung 12 hat vorzugsweise die gleichen Radialquerschnitte wie der Ring 11. Als bevorzugtes Material für den Ring 12 wird Silikon eingesetzt. Die Verwendung des Ringes 11 und der Dichtung 12 ist jedoch fakultativ.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht eine schnelle Versuchsdurchführung mit wenigen Versuchsschritten. Es können kleine Probemengen schonend und verlustfrei unter sterilen Bedingungen präpariert werden, da die erfindungsgemäße Vorrichtung autoklavierbar ist, und der Verbrauch an Gensonden ist geringer als bei herkömmlicher FISH. Je nach Versuchsbedingungen ist die Kammer 2 auf jede gewünschte Temperatur temperier bar. Der Bereich der Temperierbarkeit geht bis ca. 75°C. Übliche Versuchstemperaturen bewegen sich in einer Größenordnung von 40 bis 50°C. Der Filter 3 verbleibt während des gesamten Arbeitsprozesses in der Kammer 2 und die Versuche können unbeschadet durch Lichteinfall vorgenommen werden. Ein Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffes wird somit unterbunden. Insbesondere durch die Ausgestaltung mit der Abführleitung 6 ist eine leichte Reinigung der Kammer 2 mit ihrem Hybridisierungsraum 1 möglich. Die geometrische Ausgestaltung ist nicht auf die des Ausführungsbeispiels begrenzt, vielmehr können die Kammer 2 und die Filter 3 auch andere Geometrien annehmen. Jedoch können die beispielhaft gezeigten Hybridisierungsvorrichtungen in im Handel erhältliche Thermoblöcke eingepaßt werden und sind daher besonders praktikabel. Die erfindungsgemäßen Hybridisierungsvorrichtungen sind so ausgestaltet, daß mehrere davon in die nach dem Stand der Technik bekannten Thermoblöcke aufgenommen werden können. Die Kammer 2 kann auf einfache Weise gereinigt bzw. sterilisiert werden. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist nicht auf die Hybridisierung mit Fluoreszenzfarbstoffen begrenzt, vielmehr können auch radioaktive Markierungen und Färbungen von Materialien mit anderen Farbstoffen vorgenommen werden.
Ausführungsbeispiel:
In der mit einem Filter 3 bestückten, temperierten Kammer 2 werden 2 ml vorgewärmter Hybridisierungspuffer mit einem entsprechenden Anteil Gensonden vorgelegt. Nun wird eine adäquate Menge fixierter Zellen hinzuge geben. Nach einer Hybridisierungsdauer von einer Stunde wird die Flüssigkeit abgesaugt, die Temperatur der Kammer 2 auf die gewünschte Waschtemperatur reguliert und mit 2 ml Waschpuffer aufgefüllt. Nach einer Stunde ist auch dieser Schritt vollzogen und der Waschpuffer wird abgenutscht. Nun wird noch einmal mit 2 ml Puffer gewaschen und der Filter 3 ist fertig zur mikroskopischen Untersuchung. Ist noch eine Gegenfärbung erwünscht, so kann diese ebenfalls in der Kammer 2 durchgeführt werden.
Durch diese Methode verbleibt der Filter 3 während des gesamten Vorgangs in der Hybridisierungskammer 2. Dies hat zum Vorteil, daß eventuell vom Filter abgelöste Zellen durch abnutschen wieder aufgefangen werden. Des weiteren erspart dies einige Arbeitsschritte, wie das Aufziehen auf einen Objektträger während der Hybridisierung, das Überführen des Filters 3 in ein Gläschen etc.. Gerade beim Arbeiten mit spröden Aluminiumoxidfiltern ist dies sehr wichtig, da diese durch mehrere Überführungsschritte sehr schnell zum Brechen neigen.
Die Temperatur der Kammer kann durch den Thermoblock beliebig variiert werden. Die Hybridisierungskammer 2 ist so bemessen, daß bis zu vier Stück gleichzeitig in einen Thermoblock (z.B. Blockheater, Fa. Stuart Scientific) bei Temperaturen bis ca. 75°C betrieben werden können. Eine eventuell mit Farbstoff verschmutzte Glasfritte kann schnell ausgewechselt werden.

Claims

Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Hybridisierungsraum (1) aufweist, welcher bodenseitig mit einer Fritte (4) und einem auf der Fritte (4) aufliegenden Filter (3) ausgestattet ist, der durch Haltemittel (7) im Randbereich an die Fritte (4) angepresst wird und dass sich unterhalb der Fritte (4) eine Einrichtung zum Absaugen von Flüssigkeit (6) befindet und dass der Hybridisierungsraum (1) in einen temperierbaren massiven wärmeleitenden Block eingelagert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass das Haltemittel (7) eine Hülse mit Außengewinde ist, die in die Kammer (2) eingeschraubt wird und den Filter (3) über den Anpressdruck mittels einer Dichtung (8) auf der Fritte (4) fixiert.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Hybridisierungsraum (1) lichtdicht abschließbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter (3) eine Porengröße von 0,2 μm bis 0,45 μm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter (3) aus Polycarbonat, Aluminiumoxid oder Cellulosenitrat besteht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich unterhalb der Fritte (4) ein Ring (11) befindet, der von der Fritte (4) durch einen Dichtring (12) getrennt wird.