DE19954713A1 - Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt einen Hybridisierungsraum (1), welcher bodenseitig mit einer Fritte (4) und einem auf der Fritte (4) aufliegenden Filter (3) ausgestattet ist, der durch eine Hülse mit Außengewinde, welche in die Kammer (2) eingeschraubt werden kann, über einen Dichtring (8) fixiert wird. Die Kammer (2) ist temperierbar und der Hybridisierungsraum (1) kann lichtdicht abgeschlossen werden. An die Unterseite der Glasfritte (4) schließen sich Mittel zum Absaugen von Flüssigkeiten (6) an.
Description
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Hybridisie
rung von Zellen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
In der Umweltmikrobiologie ist der Einsatz fluoreszenz
markierter Gensonden eine gängige Methode, um Zellzahl
und phylogenetische Zuordnung von Bakterien aus Umwelt
proben zu bestimmen. Bei den Gensonden handelt es sich
um DNA-Abschnitte, welche mit einem Fluoreszenzfarb
stoff strukturell modifiziert sind. Prinzip dieser
Technik ist, daß sich die Gensonden an die ribosomale
RNA von Zellen anlagern, die Fluorophore der Gensonde
dann mit Licht einer spezifischen Wellenlänge angeregt
werden und schließlich deren Emission z. B. mikrosko
pisch detektiert wird.
Die Methode ist in T. Schwartz, J. Schmitt,
H. C. Flemming und U. Obst, 1999, "Die Untersuchung von
Biofilmen in Trinkwassersystemen, Wasser, Abwasser",
140(3), 182-190, beschrieben und wird als "FISH" =
"Fluorescence In Situ Hybridization" bezeichnet.
Bei der Untersuchung von Zellen mit fluorezenzmarkier
ten Gensonden müssen folgende Verfahrensschritte vor
genommen werden. Zunächst werden die Zellen immobili
siert bzw. fixiert. Es handelt sich bei der Immobili
sierung bzw. Fixierung um einen Vorgang, bei dem die
Proteine der Zellen durch Degeneration in ihrer Aktivi
tät soweit eingeschränkt werden, daß sie Nukleinsäuren
nicht abbauen. Zu diesem Zweck wird ein Fixativ zuge
setzt. Nach einem Verfahren von F. O. Glöckner,
M. F. Fuchs und R. Amann, 1999, "Bacterioplankton
Compositions of Lakes and Oceans: a First Comparsion
Based on Fluorescence In Situ Hybridization", Appl.
Environ. Microbiol. 65: 3721-3726, werden die Zellen
mit einem Fixativ versetzt, inkubiert und später auf
einem Filter abfiltriert. Zur Filtration werden Stan
dardfilter eines Durchmessers von 25 oder 47 mm einge
setzt. In einem alternativen Verfahren von Amann werden
die Zellen mit dem Fixativ versetzt, inkubiert, zentri
fugiert, resuspendiert und auf einen speziellen Objekt
träger mit Vertiefungen aufgetragen und luftgetrocknet.
Das Verfahren ist in R. I. Amann, L. Krumholz und
D. A. Stahl, 1990, "Fluorescent-oligonucleotide
probing of whole cells for determinative, phylogenetic
and environmental studies in microbiology",
J. Bacteriol. 172: 762-770, veröffentlicht.
Die Methode von Amann hat zum Nachteil, daß bei der
Trocknung die Lösungen nicht immer homogen verdunsten
und sich ringförmige Ansammlungen von Objekten bilden
können. Hinzu kommt, daß mehrere Arbeitsschritte wie
Zentrifugieren, Resuspendieren und Verdünnen die Zellen
beeinträchtigen können, bis hin zu deren Zerstörung.
Die Trocknung der Objektträger nimmt viel Zeit in An
spruch, so daß die Proben nicht sofort weiterverarbei
tet werden können. Aus diesen Gründen wird in der Regel
die Filtermethode nach Glöckner bevorzugt.
Nach der Fixierung der Zellen folgt als zweiter Verfah
rensschritt die Hybridisierung.
Nach dem Verfahren von H. M. Christensen, H. M. Hansen
und J. Sorensen, 1999, "Counting and size classifica
tion of active soil bacteria by fluorescence in situ
hybridization with RNA oligonucleotide probe", Appl.
Environ. Microbiol. 65: 1753-1761, erfolgt die Hybridi
sierung in einem Reaktionsgefäß. Bei der Hybridisierung
werden der Zellsuspension die fluoreszenzmarkierten
Gensoden zugefügt. Die Hybridisierung erfordert je nach
Art der verwendeten Gensonde einen Zeitraum von 30 bis
60 Min. bei einer Temperatur von 40 bis 50°C. Die Tem
peratur hängt ebenfalls von der gewählten Gensonde ab.
Wurden die suspendierten Zellen nach der Methode von
Christensen in den Reaktionsgefäßen hybridisiert, so
wird eine Zentrifugation durchgeführt, welche aber, wie
erwähnt, die Qualität des Zellmaterials vermindert.
Nach der Zentrifugation werden die Zellen gewaschen.
Zur mikroskopischen Betrachtung werden die Zellen dann
abfiltriert und der Filter auf einen Objektträger über
tragen. Nach der Methode von Glöckner wird der Filter,
welcher sich auf dem Objektträger befindet, mit
Hybridisierungslösung überschichtet und in einer
feuchten Hybridisierungskammer plaziert. Zum Waschen
wird das Filter in ein Glasfläschchen mit Waschpuffer
überführt, anschließend getrocknet und auf einen Ob
jektträger zur mikroskopischen Aufnahme aufgezogen. Bei
dieser Methode gehen unter optimalen Bedingungen
mindestens 10% der Zellen verloren. Der Verlust der
Zellen ist jedoch in Umweltproben unkontrolliert.
Das Verfahren ist in der Veröffentlichung
F. O. Glöckner, R. Amann, A. Alfreider, J. Pernthaler,
R. Psenner, K. Trebesius und K. H. Schleifer, 1996, "An
in Situ Hybridization Protocol for Detection and Iden
tification of Planktonic Bacteria System, Appl.
Microbiol. 19: 403-406, beschrieben.
Die nach dem Stand der Technik bekannten Methoden haben
zahlreiche Nachteile. So sind mehrere Arbeitsschritte
unter Verwendung unterschiedlicher Gerätschaften er
forderlich, bei denen Zellmaterial verloren gehen kann,
oder bei denen die Zellen durch mechanische Beanspru
chung, wie beispielsweise durch Zentrifugation oder Re
suspendieren, beschädigt werden können. Bei diesen Ver
fahren werden auch die empfindlichen Genfluoreszenz
sonden ständig der Gefahr der Belichtung ausgesetzt.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, eine Vorrich
tung zu schaffen, mit der eine schnelle Versuchsdurch
führung auf eine für die Zellen beschädigungs- und ver
lustminimierte Weise durchgeführt werden kann. Das Ma
terial soll vor Lichteinflüssen geschützt sein und
unter konstanten und bestimmbaren Temperaturbedingungen
behandelt werden.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf
gabe erfindungsgemäß gelöst mit den im kennzeichnenden
Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es nunmehr
möglich, mit wenigen Arbeitsschritten eine schnelle,
saubere Versuchsdurchführung zu bewirken. Die Vorrich
tung ermöglicht die Verwendung von kleinen Probenmengen
und somit einen geringen Verbrauch an Gensonden und
Zellmaterial.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den
Unteransprüchen angegeben.
Die Zeichnung zeigt eine beispielhafte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Es zeigt:
Fig. 1: eine erfindungsgemäße Vorrichtung
Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung zeigt einen
Hybridisierungsraum 1, welcher in eine Kammer 2 einge
lagert ist. Die Kammer 2 besteht in dieser Ausführungs
form aus einem massivem Metallblock. Im Bodenbereich
des Hybridisierungsraumes 1 liegt ein Filter 3 auf
einer Fritte 4 auf. Unterhalb der Fritte 4 laufen die
Wände 5 konisch zu und münden in eine Leitung 6, welche
an eine Pumpe angeschlossen werden kann. In die Wand 5
der Kammer 2 ist eine Hülse 7 mit Außengewinde einge
schraubt, welche einen Dichtring 8 auf den Filter 3
preßt und somit den Filter 3 fixiert. Die Wand 5 weist
ein Innengewinde zur Aufnahme der Hülse 7 auf. Die
Innenwandung der Hülse 7 bildet in diesem Beispiel die
Innenwand des Hybridisierungsraumes 1 aus. Der Hybridi
sierungsraum 1 wird durch einen Deckel 9 abgedeckt,
welcher zusätzlich einen abnehmbaren Stopfen 10 auf
weist. Unterhalb der Fritte 4 befindet sich ein Metall
ring 11. Zwischen dem Metallring 11 und der Fritte 4
liegt eine Silikondichtung 12, die vorzugsweise die
gleichen Innen- und Außendurchmesser hat, wie der
Metallring 11.
Bei der Versuchsdurchführung werden die zu untersuchen
den Zellen zunächst mit einem üblichen Fixiermittel fi
xiert. Die Fixierung kann fakultativ im Hybridisie
rungsraum 1 der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgen,
jedoch kann sie auch gesondert vorgenommen werden. Wird
die Fixierung im Hybridisierungsraum 1 durchgeführt, so
kann nach Abschluß der Fixierung, die Flüssigkeit, wel
che das Fixiermittel enthält, über die Leitung 6 abge
saugt werden. Ein Nachspülen ist ebenfalls möglich,
indem man Waschlösung auf die am Filter anhaftenden
Zellen aufgibt und ebenfalls über Leitung 6 absaugt.
Für die Hybridisierung selber wird den Zellen der
Hybridisierungspuffer, welcher auch die Gensonden ent
hält, beigefügt. Die dabei entstehende Zellsuspension
wird je nach Verwendung von Hybridisierungsmittel
30 Min. bis 1 h bei einer Temperatur zwischen 45 und
50°C beheizt. Zu Beheizungszwecken befindet sich die
Kammer 2, welche aus massivem Metall besteht, bzw. aus
wärmeleitendem Material bestehen muß, in einem Thermo
block, wodurch sich der gesamte Block auf die gewünsch
te Temperatur aufheizt. Nach gewünschter Inkubations
zeit oder Hybridisierungsdauer wird die flüssige Phase
wiederum über Leitung 6 mittels einer Vakuumpumpe abge
zogen. Die auf dem Filter 3 verbleibenden Zellen können
durch Aufbringen einer Waschlösung gereinigt werden,
die ihrerseits wieder über Leitung 6 abgeführt werden
kann. Der Filter 3 verbleibt während der gesamten
Arbeitsdauer im Hybridisierungsaum. Vorteilhafterweise
können alle Schritte unter vollkommenem Lichtausschluß
durchgeführt werden, da der Hybridisierungsraum 1 durch
den Deckel 9 mit dem Stopfen 10 lichtdicht verschlossen
ist. Hierdurch wird ein Ausbleichen der Fluoreszenz der
Gensonden verhindert.
Die Kammer 2 der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein
Metallblock, der vorzugsweise aus rostfreiem VA Stahl
besteht. Jedoch kann die Kammer auch aus anderen gut
wärmeleitenden Materialien bestehen. Der Hybridisie
rungsraum 1 ist so konstruiert, daß eine Fritte mit
einem Durchmesser von beispielsweise 25 mm passgenau
eingelegt werden kann. Natürlich ist der Durchmesser
des Hybridisierungsraumes nicht auf die Größe von 25 mm
beschränkt, sondern es können auch andere Ausführungs
formen zum Tragen kommen, beispielsweise sind im Handel
Glasfritten eines Durchmessers von 47 mm erhältlich,
welche zum Einsatz kommen können, so daß der
Durchmesser des Hybridisierungsraumes 1 auch für die
Aufnahme einer derartigen Glasfritte ausgestaltet wer
den kann. Auf die Glasfritte wird der Filter 3 aufge
bracht, der eine Porengröße im Bereich von 0,2 µm bis
0,45 µm aufweisen kann. Jedoch kann die Porengröße je
nach Anwendung unterschiedlich gewählt werden. Als
Materialien für die Filter 3 kommen handelsübliche
Polycarbonat-, Cellulosenitrat- oder Aluminiumoxidfil
ter in Frage.
Der Filter 3 wird durch Haltemittel im Randbereich auf
die Fritte 4 aufgedrückt, so daß ein abdichtender Kon
takt zustande kommt, welcher einen Durchtritt der Flüs
sigkeit im Randbereich des Filters unterbindet. In der
in Fig. 1 dargestellten Ausführungsform wird der Filter
3 über einen Dichtring 8 mittels der Hülse 7, wel
che ein Außengewinde aufweist und die in die Kammer 2
eingedreht wird, auf den Filter 3 aufgedrückt. Die
Innenwandung der Hülse 7 bildet somit auch die Wand des
Hybridisierungsraumes 1. Die Hülse wird auch als
Hybridisierungsrohr bezeichnet. Durch den Deckel 9 wird
der Hybridisierungsraum 1 von Lichteinflüssen ab
geschirmt. Über den Stopfen 10 ist dennoch die Zugabe
von Reagenzien möglich. Durch den Deckel 9 und den
Stopfen 10 wird auch die Kontaminationsgefahr verrin
gert.
Durch die Verwendung des Ringes 11, der vorzugsweise
aus Metall besteht und der Dichtung 12 ändern sich wäh
rend des Betreibens der Vorrichtung die Strömungseigen
schaften in der Glasfritte 4. Das bedeutet, daß sich
die Zellen beim Abnutschen gleichmäßiger auf den Filter
3 verteilen, was für die spätere Auswertung und Diffe
renzierung sehr vorteilhaft ist. Die Dichtung 12 hat
vorzugsweise die gleichen Radialquerschnitte wie der
Ring 11. Als bevorzugtes Material für den Ring 12 wird
Silikon eingesetzt. Die Verwendung des Ringes 11 und
der Dichtung 12 ist jedoch fakultativ.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht eine
schnelle Versuchsdurchführung mit wenigen Versuchs
schritten. Es können kleine Probemengen schonend und
verlustfrei unter sterilen Bedingungen präpariert wer
den, da die erfindungsgemäße Vorrichtung autoklavierbar
ist, und der Verbrauch an Gensonden ist geringer als
bei herkömmlicher FISH. Je nach Versuchsbedingungen ist
die Kammer 2 auf jede gewünschte Temperatur temperierbar.
Der Bereich der Temperierbarkeit geht bis ca.
75°C. Übliche Versuchstemperaturen bewegen sich in
einer Größenordnung von 40 bis 50°C. Der Filter 3
verbleibt während des gesamten Arbeitsprozesses in der
Kammer 2 und die Versuche können unbeschadet durch
Lichteinfall vorgenommen werden. Ein Ausbleichen des
Fluoreszenzfarbstoffes wird somit unterbunden. Insbe
sondere durch die Ausgestaltung mit der Abführleitung 6
ist eine leichte Reinigung der Kammer 2 mit ihrem
Hybridisierungsraum 1 möglich. Die geometrische Aus
gestaltung ist nicht auf die des Ausführungsbeispiels
begrenzt, vielmehr können die Kammer 2 und die Filter 3
auch andere Geometrien annehmen. Jedoch können die
beispielhaft gezeigten Hybridisierungsvorrichtungen in
im Handel erhältliche Thermoblöcke eingepaßt werden und
sind daher besonders praktikabel. Die erfindungsgemäßen
Hybridisierungsvorrichtungen sind so ausgestaltet, daß
mehrere davon in die nach dem Stand der Technik bekann
ten Thermoblöcke aufgenommen werden können. Die Kammer
2 kann auf einfache Weise gereinigt bzw. sterilisiert
werden. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung
ist nicht auf die Hybridisierung mit Fluoreszenzfarb
stoffen begrenzt, vielmehr können auch radioaktive
Markierungen und Färbungen von Materialien mit anderen
Farbstoffen vorgenommen werden.
In der mit einem Filter 3 bestückten, temperierten Kam
mer 2 werden 2 ml vorgewärmter Hybridisierungspuffer
mit einem entsprechenden Anteil Gensonden vorgelegt.
Nun wird eine adäquate Menge fixierter Zellen hinzugegeben.
Nach einer Hybridisierungsdauer von einer Stunde
wird die Flüssigkeit abgesaugt, die Temperatur der Kam
mer 2 auf die gewünschte Waschtemperatur reguliert und
mit 2 ml Waschpuffer aufgefüllt. Nach einer Stunde ist
auch dieser Schritt vollzogen und der Waschpuffer wird
abgenutscht. Nun wird noch einmal mit 2 ml Puffer ge
waschen und der Filter 3 ist fertig zur mikroskopischen
Untersuchung. Ist noch eine Gegenfärbung erwünscht, so
kann diese ebenfalls in der Kammer 2 durchgeführt wer
den.
Durch diese Methode verbleibt der Filter 3 während des
gesamten Vorgangs in der Hybridisierungskammer 2. Dies
hat zum Vorteil, daß eventuell vom Filter abgelöste
Zellen durch abnutschen wieder aufgefangen werden. Des
weiteren erspart dies einige Arbeitsschritte, wie das
Aufziehen auf einen Objektträger während der Hybridi
sierung, das Überführen des Filters 3 in ein Gläschen
etc.. Gerade beim Arbeiten mit spröden Aluminiumoxid
filtern ist dies sehr wichtig, da diese durch mehrere
Überführungsschritte sehr schnell zum Brechen neigen.
Die Temperatur der Kammer kann durch den Thermoblock
beliebig variiert werden. Die Hybridisierungskammer 2
ist so bemessen, daß bis zu vier Stück gleichzeitig in
einen Thermoblock (z. B. Blockheater, Fa. Stuart
Scientific) bei Temperaturen bis ca. 75°C betrieben
werden können. Eine eventuell mit Farbstoff ver
schmutzte Glasfritte kann schnell ausgewechselt werden.
Claims (7)
1. Vorrichtung zur Hybridisierung von Zellen,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie einen Hybridisierungsraum (1) umfaßt, welcher bodenseitig mit einer Fritte (4) und einem auf der Fritte (4) aufliegenden Filter (3) ausge stattet ist, der durch Haltemittel (7) im Rand bereich an die Fritte (4) angepreßt wird und
daß sich unterhalb der Fritte (4) eine Einrichtung zum Absaugen von Flüssigkeit (6) befindet.
daß sie einen Hybridisierungsraum (1) umfaßt, welcher bodenseitig mit einer Fritte (4) und einem auf der Fritte (4) aufliegenden Filter (3) ausge stattet ist, der durch Haltemittel (7) im Rand bereich an die Fritte (4) angepreßt wird und
daß sich unterhalb der Fritte (4) eine Einrichtung zum Absaugen von Flüssigkeit (6) befindet.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Hybridisierungsraum (1) in eine tempe
rierbare Kammer (2) eingelagert ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Haltemittel (7) eine Hülse mit Außenge
winde ist, die in die Kammer (2) eingeschraubt wird
und der Filter (3) über den Anpreßdruck mittels
einer Dichtung (8) auf der Fritte (4) fixiert.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Hybridisierungsraum (1) lichtdicht ab
schließbar ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Filter (3) eine Porengröße von 0,2 µm
bis 0,45 µm aufweist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Filter (3) aus Polycarbonat, Aluminiumoxid
oder Cellulosenitrat besteht.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß sich unterhalb der Fritte (4) ein Ring (11)
befindet, der von der Fritte (4) durch einen Dicht
ring (12) getrennt wird.
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DE10223884B4 (de) * | 2002-05-29 | 2004-06-03 | Christian Germer | Variable Mehrfach-Filtrations- und Inkubationsvorrichtung zur Aufarbeitung mikrobiologischer und vergleichbarer Proben |
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