DE19943911A1 - Einfache, schnelle und kulturunabhängige Methode zur Vorhersage von Isoniazid-Resistenzen bei Mykobakterien - Google Patents
Einfache, schnelle und kulturunabhängige Methode zur Vorhersage von Isoniazid-Resistenzen bei MykobakterienInfo
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Abstract
Die erfolgreiche Therapie und die Kontrolle der Ausbreitung der Tuberkulose und anderer Mykobakterieninfektionen wird durch Resistenzen der Erreger gefährdet. Die Resistenzerkennung wird durch das langsame Wachstum vieler Mykobakterien erschwert. Prinzipiell sind Resistenzen gegen das Antituberkulotikum Isoniazid durch den Nachweis von Mutationen des Kodons 315 im Gen katG kulturunabhängig vorhersagbar. Die dazu bisher benutzten Verfahren sind jedoch für die Routinediagnostik zu aufwendig oder zu wenig sensitiv. Das neue Verfahren ermöglicht eine einfache und schnelle, kulturunabhängige Vorhersage von Isoniazid-Resistenzen direkt aus klinischen Materialien. DOLLAR A Das Problem wird durch den Einsatz geeigneter PCR-Startermoleküle in zwei aufeinanderfolgenden, geschachtelten Polymerasekettenreaktionen gelöst. Mutationen des Kodons 315 im Gen katG werden durch eine Behandlung mit dem Restriktionsenzym AciI nachgewiesen. Für den Nachweis werden apparativ außer einer einfachen Labor-Grundausstattung (temperiertes Wasserbad oder Blockthermostat, Stromquelle) lediglich ein PCR-Gerät und eine einfache (sogenannte Minigel-)Elektrophorese-Kammer benötigt. DOLLAR A Anwendungsgebiet ist die schnelle Isoniazid-Resistenzvorhersage bei Mykobakterien, insbesondere in klinischen Labors mit begrenzter apparativer Ausstattung und begrenzten personellen Kapazitäten.
Description
Die Erfindung betrifft die schnelle und einfache Vorhersage von Resistenzen gegenüber dem
Antituberkulotikum Isoniazid bei Mykobakterien, ohne daß diese zuvor kultiviert werden
müssen. Die Vorhersage kann durch die Verwendung einer sensitiven, geschachtelten
Polymerasekettenreaktions (PCR)-Technik zur Amplifikation eines Teils des Resistenzgens
katG direkt aus klinischem Material, insbesondere Sputum, erfolgen. Ein besonders breites
Spektrum resistenz-anzeigender Mutationen wird durch den Einsatz des Restriktionsenzyms
AciI ermöglicht. Der apparative Aufwand beschränkt sich im wesentlichen auf ein PCR-Gerät,
einen Thermostaten und ein Gelelektrophoresesystem.
Es ist bekannt, daß viele Mykobakterienarten, einschließlich der die Tuberkulose
verursachenden Spezies Mycobacserium tuberculosis, in der Kultur nur sehr langsam wachsen.
In einer Untersuchung von 56 klinischen Laboratorien betrug die benötigte Zeit zwischen
einer Sputumabgabe und der Mitteilung der Resistenzbefunde im Mittel 31 Tage bei
Verwendung radiometrischer Methoden und 44 Tage bei Verwendung konventioneller
Kulturmethoden [Huebner et al. (1993) J. Clin. Microbiol. 31: 771-775]. Im Fall einer
(multi-)resistenten Tuberkulose erschwert diese Verzögerung den frühzeitigen Beginn einer
effizienten Therapie und verlängert die Zeit für eine mögliche Ausbreitung resistenter
Erreger. Die Eindämmung des weltweit, auch in Europa und den USA wachsendenden
Anteils der Infektionen mit (multi-)resistenten Mykobakterien ist von großem
gesundheitspolitischem Interesse. Die frühzeitige Resistenzerkennung hat hierbei eine
besondere Bedeutung.
Es ist bekannt, daß im Unterschied zu anderen Bakteriengattungen das Spektrum an
Resistenzmechanismen bei vielen Mykobakterien, einschließlich M. tuberculosis, stark
eingeschränkt ist. So spielen bei ihnen Resistenzgentransfers durch mobile genetische
Elemente, Inaktivierungsmechanismen oder Efflux-Mechanismen therapeutisch keine oder nur
eine geringe Rolle. Vielmehr sind bei ihnen für die Entstehung von Resistenzen fast
ausschließlich Mutationen in Genen verantwortlich, deren Produkte entweder den Wirkstoff
aktivieren oder selbst Ziel des Wirkstoffs sind. Durch den Nachweis resistenzerzeugender
Mutationen in diesen Genen können deshalb Resistenzen vorhergesagt werden.
Es ist bekannt, daß Mutationen des Codons 315 im Gen katG einen hohen positiven
prädiktiven Vorhersagewert für Resistenzen gegen das Antituberkulotikum Isoniazid (INH)
aufweisen, da sie in INH-sensiblen Isolaten nicht oder nur sehr selten gefunden werden
[Dobner et al. (1997) Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1: 365-369]. Außerdem wurden sie in
mehreren größeren Untersuchungen in über der Hälfte (53-57%) der jeweils untersuchten
INH-resistenten Isolate nachgewiesen [referiert in: Dobner et al. (1997) Int. J. Tuberc. Lung
Dis. 1: 365-369]. Allerdings sind genotypisierende Verfahren zur Vorhersage von Resistenzen
bei Mykobakterien bisher weitgehend auf Forschungslabors beschränkt und werden von
klinischen Labors noch kaum angewendet. Dafür sind hauptsächlich folgende Gründe
verantwortlich:
- 1. Viele Techniken zur Charakterisierung von Resistenzgenmutationen sind apparativ aufwendig und liegen jenseits des methodischen Spektrums, das für die Routinediagnostik in klinischen Labors praktikabel ist. Hierzu gehören insbesondere die DNA-Sequenzierung, die Einzelstrang-Konformationspolymorphismen-Analyse (SSCP), die Heteroduplex-Analyse (HA) und Elektrophoresesysteme mit thermischen oder chemischen Gradienten wie zum Beispiel die Denaturierungsgradienten-Gelelektrophorese (DGGE), die Konstant-Denaturierungs- Gelelektrophorese (CDGE), die Temporal-Temperatur-Gradientenelektrophorese (TTGE) und die Temperaturgradienten-Gelelektrophorese (TGGE). Beispielhaft für zahlreiche Beschreibungen dieser Techniken seien genannt: Telenti et al. (1993) Lancet 341: 647-650; Telenti et al. (1993) Antimicrob. Agents Chemother. 37: 2054-2058; Altamirano et al. (1994) J. Infect. Dis. 169: 1162-1165; Heym et al. (1994) Lancet 344: 293-298; Honore & Cole (1994) Antimicrob. Agents Chemother. 38: 238-242; Takiff et al. (1994) Antimicrob. Agents Chemother. 38: 773-780; Heym et al. (1995) Molec. Microbiol. 15: 235-245; Morris et al. (1995) J. Infect. Dis. 171: 954-960; Whelen et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 556-561; Delgado & Telenti (1996) In: Persing (Hrsg.) PCR protocols for emerging infectious diseases, 138-143, ASM-Press, Washington; Kirschner & Böttger (1996) In: Persing [Hrsg.] PCR protocols for emerging infectious diseases, 130-137, ASM-Press, Washington; Pretorius et al. (1996) S. Afr. Med. J. 86: 50-55; Ohno et al. (1997) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 155: 2057-2063; Scarpellini et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 2802-2806; Sougakoff et al. (1997) Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16: 395-398; Telenti et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 719-723. Alternative Methoden sind das Dideoxy-"Fingerprinting" [Felmlee et al. (1995) J. Clin. Microbiol. 33: 1617-1623; Rys & Felmlee (1996) In: Persing (Hrsg.) PCR protocols for emerging infectious diseases, 112-121, ASM-Press, Washington], der "Line Probe"-Assay [De Beenhouwer et al. (1995) Tubercle Lung Dis. 76: 425-430; Cooksey et al. (1997) J. Clin. Microbiol. 35: 1281-1283; Goyal et al. (1997) Eur. Respir. J. 10: 1120-1124; Rossau et al. (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41: 2093-2098], der "Hybridization Protection"-Assay [Miyamoto (1996) J. Clin. Microbiol. 34: 1323-1326], die struktur-spezifische Endonuklease-Spaltung [Brow et al. (1996) J. Clin. Microbiol. 34: 3129-3137], der Heteroduplex-Assay [Williams et al. (1994) Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2380-2386; Williams et al. (1996) In: Persing (Hrsg.) PCR protocols for emerging infectious diseases, 122-129, ASM-Press, Washington; Nachamkin et al. (1997) Clin. Infect. Dis. 24: 894-900; Williams et al. (1998) Clin. Infect. Dis. 26: 446-450], der RNA-RNA- Duplex-"Mismatch"-Assay [Nash & Inderlied (1996) Antimicrob. Agents Chemother. 40: 1748-1750; Nash et al. (1997) J. Infect. Dis. 176: 533-536] und ein Hybridisierungs-Assay mit fluoreszenzmarkierten Sonden [Piatek et al. (1998) Nat. Biotechnol. 16: 359-363]. Alle genannten Verfahren sind nicht Gegenstand der Erfindung.
- 2. Alle bisherige, wissenschaftlich rezensierte Untersuchungen zur Charakterisierung von Mutationen im Gen katG, die bei Isoniazid-resistenten Mykobakterien gefunden werden und die mit technisch einfachen Mitteln, insbesondere der Restriktionsfragmentlängen- Polymorphismenanalyse nach vorangegangener Polymerasekettenreaktion (PCR-RFLP), benötigten Bakterienkulturen als Ausgangsmaterial [Cockerill et al. (1995) J. Infect. Dis. 171: 240-245; Dobner et al. (1997) Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1: 365-369; Nachamkin et al. (1997) Clin. Infect. Dis. 24: 894-900; Temesgen et al. (1997) Mol. Cell. Probes 11: 59-63; Sreevatsan et al. (1998) Mol. Diagn. 3: 81-91]. Der angestrebte Zeitgewinn durch die Anwendung molekularer Resistenzvorhersagetechniken wird hier zum größten Teil wieder aufgehoben, da die Primärkultivierung meistens länger dauert als die anschließende Resistenztestung auf oder in antibiotikahaltigen Medien.
- 3. Die Tauglichkeit eines anderen, bereits 1996 beschriebenen PCR-RFLP Protokolls zum Nachweis von katG-Mutationen aus Kulturmaterial, das auch zum direkten Nachweis aus Sputum geeignet sein soll [Uhl et al. (1996) In: Persing (Hrsg.) PCR protocols for emerging infectious diseases, 144-149, ASM-Press, Washington; PCT WO 98/50585] konnte bisher nicht in einer wissenschaftlich begutachteten Versuchsreihe nachgewiesen werden. Dafür können zwei Hauptschwierigkeiten verantwortlich gemacht werden: (a) Die verwendete PCR- Technik besteht lediglich aus einem einzigen Lauf. Erfahrungen mit PCR-Protokollen zum Nachweis von Mykobakterien aus Sputum haben jedoch gezeigt, daß mit einer einfachen PCR, ohne weitere Maßnahmen wie z. B. Sondenhybridisierung oder nested PCR, aus diesem Material keine befriedigende Sensitivität zu erzielen ist [Schröder et al. (1995) Pneumologie 49: 502-504; Rodriguez et al. (1997) APMIS 105: 612-616]. (b) Die mit Kodon 315 überlappende MspI-Restriktionsschnittstelle wird erst durch eine bestimmte Mutation dieses Kodons, nämlich von AGC (Wildtyp) nach ACC, erzeugt. Diese ist zwar wahrscheinlich die häufigste, aber nicht die einzige Isoniazid-Resistenz anzeigende Mutation dieses Kodons. Vielmehr sind bereits 4 weitere Mutationen (AAC, ACA, ATC und CGC) bekannt [Musser et al. (1996) J. Infect. Dis. 173: 196-202; Haas et al. (1997) Antimicrob. Agents Chemother. 41: 1601-1603], die nicht mit jener Methode nachweisbar sind.
Die Nachteile des Standes der Technik können somit wie folgt zusammengefaßt werden:
Bisher war der Nachweis von mehr als einer bestimmten Mutation des Kodons 315 im Gen katG direkt aus Sputum nur mit apparativ aufwendigen und teuren Methoden (DNA- Sequenzierung, SSCP) möglich. Einfache Techniken, wie z. B. PCR-RFLP, konnten nur aus Kulturmaterial durchgeführt werden oder konnten nur einen einzigen Mutationstyp nachweisen.
Bisher war der Nachweis von mehr als einer bestimmten Mutation des Kodons 315 im Gen katG direkt aus Sputum nur mit apparativ aufwendigen und teuren Methoden (DNA- Sequenzierung, SSCP) möglich. Einfache Techniken, wie z. B. PCR-RFLP, konnten nur aus Kulturmaterial durchgeführt werden oder konnten nur einen einzigen Mutationstyp nachweisen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches und schnelles Verfahren zu schaffen, mit dem ein
breites Spektrum von Isoniazid-Resistenz erzeugenden Mutationen des Kodons 315 im Gen
katG von Mykobakterien, insbesondere M. tuberculosis, kulturunabhängig direkt aus
klinischem Material, vor allem Sputum, sensitiv nachgewiesen werden kann.
Dieses Problem wird durch die Gegenstände der Ansprüche 1 bis 7 gelöst.
Nach dem bisherigen Stand der Technik war die technisch einfache Isoniazid-
Resistenzvorhersage mittels PCR-RFLP nur aus Kulturmaterial praktikabel [Cockerill et al.
(1995) J. Infect. Dis. 171: 240-245; Dobner et al. (1997) Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1: 365-369;
Nachamkin et al. (1997) Clin. Infect. Dis. 24: 894-900; Temesgen et al. (1997) Mol.
Cell. Probes 11: 59-63; Sreevatsan et al. (1998) Mol. Diagn. 3: 81-91]. Im Vergleich zu einem
bereits für Sputum beschriebenen PCR-RFLP-Protokoll zur Vorhersage von Isoniazid-
Resistenzen [Uhl et al. (1996) In: Persing (Hrsg.) PCR protocols for emerging infectious
diseases, 144-149, ASM-Press, Washington; PCT WO 98/50585], für die in der
wissenschaftlichen Literatur noch kein Anwendungsbeispiel bekannt ist, führen die hier
beschriebenen Primer in der hier beschriebenen geschachtelten PCR zu einer wesentlichen
Sensitivitätssteigerung, die es erstmals erlaubte, die Mutationsnachweise direkt aus klinischem
Material ohne vorherige Bakterienkultur zu führen [Rinder et al. (1999) Molec. Diagn. 4: 145-152].
Die hohe Sensitivität wird vor allem durch die hier beschriebenen Primer (Sequenzen
1-4) bedingt, die speziell für den Einsatz in einer geschachtelten ("nested") PCR entwickelt
wurden. Dadurch wird zusätzlich die Notwendigkeit weiterer Techniken und Materialien
vermieden, wie dies zum Beispiel bei "Southern"-Blots oder ELISA-Techniken zur
Sensitivitätssteigerung der PCR-Produktnachweise notwendig wäre.
Ein Vorteil bei der Verwendung von AciI als Restriktionsenzym, das bereits von Dobner et
al. (1997); Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1: 365-369, vorgeschlagen wurde, dort allerdings nach
einer einfachen PCR-Reaktion und nach vorheriger Kultivierung der Mykobakterien,
gegenüber einem bereits beschriebenen Einsatz von MspI [Uhl et al. (1996) In: Persing
(Hrsg.) PCR protocols for emerging infectious diseases, 144-149, ASM-Press, Washington;
PCT WO 98/50585] liegt darin, daß vom Wildtyp des Codons 315 (AGC) bislang 5
Isoniazid-Resistenz hervorrufende Mutationen (ACC, AAC, ACA, ATC und CGC) bekannt
sind, von denen nur die erste erkannt wird, da die MspI-Erkennungssequenz (CCGG) unter
Beteiligung der letzten beiden Nukleotide des Codons 315 erst durch diese Mutation erzeugt
wird. Dagegen ist die AciI-Erkennungssequenz (GCGG) Teil der Wildtyp-Sequenz des Codons
315, so daß hier die ersten 4 der 5 genannten Mutationen erkannt werden können, die einen
Anteil von über 99% an allen bekannten Mutationen dieses Kodons besitzen (Tabelle 1).
Diese Restriktionsschnittstelle muß also nicht etwa erst durch eine bestimmte Mutation
entstehen. Vielmehr zeigt ihr Verschwinden eine von mehreren nachzuweisenden Mutationen
an.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, daß zwei weitere, ebenfalls im Amplifikat enthaltene
AciI-Schnittstellen als interne Kontrolle für die Restriktionsreaktion dienen. Dadurch kann das
Fehlen von Restriktionsprodukten aufgrund einer resistenzerzeugenden Mutation von einer
mißlungenen Restriktions-Reaktion unterschieden und dadurch falsch-positive Ergebnisse
vermieden werden.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile erlauben somit auch nicht-spezialisierten, klinischen
Routinelabors die schnelle und kulturunabhängige Vorhersage von Resistenzen gegen
Isoniazid. An Geräten wird außer der üblichen Laborgrundausstattung, dazu gehören ein
temperierbares Wasserbad oder ein Blockthermostat sowie eine Stromquelle, lediglich ein
PCR-Gerät, das heutzutage bereits in vielen klinischen Labors vorhanden ist, und eine
Gelektrophoresekammer, wobei bereits ein preiswertes "Minigel"-Format für Agarosegele
ausreicht, benötigt. Trotzdem können über 99% von Isoniazid-Resistenz erzeugenden
Mutationen des katG Kodons 315 erfaßt und mittels eines geschachtelten PCR Protokolls
sensitiv direkt aus Sputum nachgewiesen werden.
22 Sputen unterschiedlicher Patienten wurden in üblicher Weise verflüssigt, dekontaminiert
und zentrifugiert (DIN 58943, Teil 3) und die enthaltene DNA nach Standardmethoden
[Hellyer et al. (1995) J. Infect. Dis. 173: 934-941; Katzwinkel-Wladarsch et al. (1996) Trop.
Med. Int. Health 1: 373-378; Stauffer et al. (1998) J. Clin. Microbiol. 36: 614-617; Vitale et
al. (1998) J. Clin. Microbiol. 36: 1050-1055] isoliert.
Um den späteren Mutationsnachweis zu erleichtern, wurden die inneren Primer so gewählt,
daß sie asymmetrisch zum Codon 315 hybridisieren. Diese Forderung wird durch die Primer
MYC-32 5'-TGG AGC AGA TGG GCT TGG-3' (Sequenz Nr. 3) und MYC-33 5'-CAG
TGG CCA GCA TCG TCG-3' (Sequenz Nr. 4) erfüllt, die 0,05 kb vor, beziehungsweise
0,18 kb hinter dem Codon 315 enden. Weiterer Vorteil dieser Primer ist, daß sie zusätzlich
zur AciI-Erkennungssequenz, die mit Kodon 315 überlappt, noch zwei weitere AciI-
Erkennungssequenzen umschließen, die später als Kontrolle für den Erfolg der AciI-
Restriktion dienen (Abb. 1). Zur Erhöhung der Sensitivität wird vor dieser PCR eine weitere
PCR-Amplifizierung durchgeführt, deren Primer distal zu den zuvor beschriebenen inneren
Primern liegen. Hierfür geeignete Primer sind MYC-30 5'-CGA ACC CGA GGC TGC TCC-
3' (Sequenz Nr. 1) und MYC-31 5'-CAC CCG CAG CGA GAG GTC-3' (Sequenz Nr. 2).
Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 2 zusammengestellt
Mit dem Primer-Paar MYC-30/MYC-31 und der zuvor isolierten DNA als Matrize wurden
in einem geeigneten Puffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl] in Gegenwart von
1,5 mM MgCl2, 2% Dimethylsulfoxid, jeweils 0,25 mM der vier Deoxynukleotide, je 1 µM der
beiden Primer und 2,5 u Taq DNA-Polymerase 45 Zyklen mit Denaturierungen bei 92°C für
jweils 60 Sekunden, Primer-Hybridisierung bei 57°C für jeweils 60 Sekunden und Primer-
Extension bei 72°C für jeweils 60 Sekunden durchgeführt. Die zweite, geschachtelte Reaktion
wurde unter Einsatz von 4% des Reaktionsgemisches der ersten PCR-Reaktion als DNA-
Matrize bei ansonsten gleichen Reaktionsbedingungen wie zuvor durchgeführt. Die Bildung
von Nebenprodukten konnte durch eine Abwandlung einer bereits beschriebenen, sogenannten
"Hot-Start"-Technik [D'Aquila et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 3749] vermindert werden,
indem der Puffer, die Desoxynukleotide und die Taq-Polymerase erst nach einer initialen
Inkubation der übrigen Komponenten bei 96°C für 2 Minuten bei einer Temperatur von 85°C
zugegeben werden [Dobner et al. (1997) Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1: 365-369].
Aus 16 von 19 Sputen, in denen kulturell Mycobacterium tuberculosis nachgewiesen wurde,
wurden PCR-Amplifikate erhalten. Das 0,27 kb große Reaktionsprodukt wurde nach
elektrophoretischer Aufreinigung im Agarosegel nach AciI-Restriktion analysiert. Dazu
wurden 4 µl des PCR-Reaktionsgemisches und 4 µl Wasser oder, alternativ, in 8 µl Wasser
eluiertes, zuvor durch Gelelektrophorese gereinigtes Reaktionsprodukt zusammen mit 1 µl
eines 10-fach konzentrierten, für AciI geeigneten Reaktionspuffers und 1 µl einer 5 u
enthaltenden AciI-Lösung 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden in
einem 3%-igen, 0,2 µg/ml Ethidiumbromid-enthaltenden Agarosegel, für das ein sogenanntes
"Minigel"-Format mit einer Länge von ca. 8 cm ausreicht, elektrophoretisch aufgetrennt und
unter UV-Licht sichtbar gemacht (Abb. 2).
Das Fehlen einer Produktbande in Höhe des ursprünglichen Amplifikationsproduktes bei 0,27 kb
zeigte bei allen PCR-Produkten eine erfolgreiche Restriktion an. Ein Produkt bei 0,12 kb
(Nr. 6, 8, 12-14, 16-18, 20-22) zeigte eine intakte, für die Wildtyp-Sequenz charakteristische
und mit Codon 315 überlappende AciI-Erkennungssequenz an. Das Fehlen dieser Bande bei
den Proben Nr. 1, 3, 7, 10 und 19 zeigte eine Mutation innerhalb der AciI-Erkennungs
sequenz an. Tatsächlich erwiesen sich die Mycobakterien jeder dieser 5 Sputumproben nach
der Kultivierung als Isoniazid-resistent.
Dem Fachmann ist bekannt, daß ähnliche Ergebnisse mit Primern, die gegenüber den hier
beschriebenen in ihrer Sequenz geringfügig verändert oder in ihrer Position verschoben
wurden, möglicherweise auch erzielt werden könnten.
Claims (7)
1. Verfahren zur kulturunabhängigen Vorhersage von Resistenzen gegen das
Antituberkulotikum Isoniazid bei Mykobakterien aus klinischem Material aufgrund von
Mutationen im Kodon 315 des Resistenzgens katG, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil
dieses Gens durch eine geschachtelte Polymerasekettenreaktion ("nested PCR") mit den
Startermolekülen ("Primern") MYC-30 (CGA ACC CGA GGC TGC TCC) und MYC-31
(CAC CCG CAG CGA GAG GTC) als äußere Primer sowie MYC-32 (TGG AGC AGA
TGG GCT TGG) und MYC-33 (CAG TGG CCA GCA TCG TCG) als innere Primer
amplifiziert wird und die enthaltenen Mutationen dadurch einem Nachweis mit
Restriktionsendonukleasen zugänglich werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das klinische Material Sputum
ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das zum Nachweis der
resistenzanzeigenden Mutationen verwendete Restriktionsenzym AciI ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Restriktions
endonukleasen mit gleicher oder ähnlicher Erkennungssequenz wie AciI verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikations- und
Restriktionsprodukte nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarosegel durch
Ethidiumbromid-Fluoreszenz sichtbar gemacht werden.
6. Reagenziensatz zur kulturunabhängigen Vorhersage von Isoniazid-Resistenzen bei
Mykobakterien, mit:
Start-Oligonukleotiden ("Primern") für die PCR-Amplifikationen oder geeigneten Restriktionsenzymen oder beidem.
Start-Oligonukleotiden ("Primern") für die PCR-Amplifikationen oder geeigneten Restriktionsenzymen oder beidem.
7. Reagenziensatz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß weitere Komponenten zur
DNA-Isolierung aus klinischen Materialien, zur PCR, zur Endonukleasen-Restriktion, zum
Produktnachweis oder zu mehreren oder allen dieser Arbeitsschritte vorhanden sind.
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1999
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DE19943913A1 (de) | 2001-05-10 |
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