DE19923892A1 - Diagnostisches Verfahren zur Erkennung einer Pankreasfunktionsstörung - Google Patents
Diagnostisches Verfahren zur Erkennung einer PankreasfunktionsstörungInfo
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Erkennung einer Pankreasfunktionsstörung beschrieben. Das Ziel wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Teilen aller Isoenzyme der Pankreas-Elastase und synthetischer Aminosäuresequenzen als Antigene für die Gewinnung spezifischer Antikörper und deren Verwendung in immunchemischen Testverfahren erreicht.
Description
Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Verfahren zur
Erkennung einer Pankreasfunktionsstörung Anwendungsgebiete
sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Funktionsstörungen der Bauchspeicheldrüse können das Ergebnis
unterschiedlicher Erkrankungen sein, deren Diagnose unter
anderem durch die Bestimmung funktioneller Kriterien
untermauert werden sollte. Die häufigsten Erkrankungen des
Pankreas sind die chronisch rezidivierende und die akute
Pankreatitis.
Die chronische Pankreatitis ist eine schleichende progrediente
Erkrankung, bei der das funktionstüchtige Pankreasgewebe im
Rahmen eines sklerotisierenden Prozesses allmählich
degeneriert. Sie ist charakterisiert durch ihr klinisches
Beschwerdebild (abdominelle Schmerzen, Steatorrhoe,
Gewichtsverlust), typische morphologische Veränderungen der
Drüse (Verkalkungen, dilatierter, unregelmäßig begrenzter
Ductus pancreaticus) sowie einen progredienten exokrinen und
endokrinen Funktionsverlust (Maldigestion, Diabetes mellitus).
Die chronische Pankreatitis hat eine Inzidenz von 6 bis 8
Neuerkrankungen pro 100 000 Einwohnern pro Jahr in Westeuropa.
Die Diagnose der chronischen Pankreatitis wird wegen steigenden
Alkoholkonsums immer häufiger gestellt.
Zur Untermauerung klinischer und morphologischer Befunde können
verschiedene funktionelle Kriterien bestimmt werden. Die
sensitivste Analysenmethode stellt der Sekretin-Caerulin- bzw.
Sekretin-Cholezystokinin-Test dar, der jedoch den Patienten
stark belastet und einen hohen Zeitaufwand erfordert. Als
indirekte Testmethoden werden Lundh-, NBT-PABA- und
Pancreoauryl-Test angewendet. Auch die Bestimmung von Trypsin
im Serum oder Chymotrypsin im Stuhl haben eine gewisse
praktische Bedeutung. Alle diese indirekten Testmethoden haben
den Nachteil einer ungenügenden Spezifität.
Die Bestimmung der Elastase 1 ist von allen verfügbaren
indirekten Funktionstesten der Test mit der höchsten
Sensitivität und Spezifität (Löser, C., Therapie & Erfolg 1997;
1: 411-413). Er hat sich in den letzten Jahren für die tägliche
Praxis als Standard für die exokrinen
Pankreasfunktionsdiagnostik durchgesetzt. Grundlage für diesen
Test sind polyklonale Antikörpern gegen Elastase 1 (Elastase 1-
RIA, Abbott) bzw. mono- und/oder polyklonalen Anti-Elastase-1-
Antikörpern, die durch Immunisierung mit einem Antigen, das die
Aminosäuresequenz Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly Asp-Ile-Arg oder
immunologisch wirksame Teilpeptide davon enthält, gewonnen
werden (EP 0 547 059 B1).
Pankreas-Elastase ist ein proteolytisches Verdauungsenzym. Im
Vergleich zu den gebräuchlichen Parametern der
Pankreasdiagnostik (z. B. Chymotrypsinaktivität im Stuhl) hat
die quantitative Elastase-Bestimmung entscheidende Vorteile.
Das Enzym wird ausschließlich im Pankreas gebildet und weist
eine außergewöhnliche Stabilität während der Darmpassage auf,
d. h., die Konzentration der Elastase spiegelt die
Sekretionsleistung des Pankreas wieder.
Trotz Überlegenheit gegenüber anderen exokrinen Parametern wird
mit dem herkömmlichen Elastase 1-ELISA in zu vielen Fällen
Pankreas-Elastase nicht nachgewiesen, obwohl sie in
beträchtlichen Konzentrationen vorhanden ist.
Ziel der Erfindung ist daher die Entwicklung eines sensitiveren
Verfahrens zur Erkennung einer Pankreasfunktionsstörung auf der
Grundlage des Nachweises pankreatischer Elastase.
Durch systematische Untersuchung von Stuhlproben, die mit dem
herkömmlichen ELISA nicht auf Elastase 1 reagierten, konnten
nach elektrophoretischer Trennung Proben hergestellt werden,
die Elastase enthielten. Die weitere Charakterisierung ergab,
daß es sich bei diese Proteinen um verschiedene Isoenzyme
handelt, die offensichtlich mit den kommerziellen
Testantikörpern nicht erkannt werden. Es gibt offensichtlich
für dieses Enzym einen ausgeprägten genetischen Polymorphismus,
der sich in der Fachliteratur auch in der Beschreibung von
Pankreas-Elastase 1, 2 und 3 widerspiegelt. Durch eigene
Untersuchungen konnte auch nachgewiesen werden, daß zumindest 2
Isoenzyme gleichzeitig vorkommen können. Es konnte auch gezeigt
werden, daß sich diese Elastasen in ihrer
Konzentrationsabhängigkeit zur Pankreasschädigung genauso
verhalten, wie die Elastase 1.
Im Gegensatz zu den bekannten Lösungen, die sich auf den
spezifischen Nachweis der Pankreas-Elastase 1 beschränken,
wurde überraschenderweise gefunden, daß durch den Nachweis
möglichst jedoch alle Pankreas-Elastase-Isoformen, bekannt sind
derzeit die Pankreas-Elastasen 1, 2 und 3, die Aussagefähigkeit
im Bezug auf die Pankraesfunktion entscheidend verbessert
werden kann. Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur
Herstellung von anti-Elastase-Antikörpern auf übliche Weise,
das jedoch dadurch gekennzeichnet ist, daß die verwendeten
spezifischen Antigene einzeln oder in Kombination alle
bekannten Elastase-Isoenzyme oder Teilstücke von diesen oder
kreuzreagierende synthetische Sequenzen repräsentieren.
Teilstücke werden vorzugsweise durch Peptidsynthese gewonnen,
wobei die Aminosäuresequenz vorher mittels strukturanalytischer
Methoden aus der Gesamtsequenz abgeleitet oder nach
Proteinsequenzierung ermittelt wird. Wenngleich die Peptide
bereits allein eine Antikörperinduktion auslösen, hat es sich
erfindungsgemäß als zweckmäßig erwiesen, diese Peptide an
übliche Carriersubstanzen wie Hämocyanin zu binden. Mit den
erfindungsgemäßen Peptiden ist es möglich, monoklonale wie
polyklonale Antikörper zu erzeugen.
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen polyklonalen
Antipeptidantikörper werden Versuchstiere wie Kaninchen,
Meerschweinchen, Ziegen, Hühner oder Fische in bekannter Weise
mit den Peptiden immunisiert. Für die Herstellung monoklonaler
Antikörper werden die Peptide in bekannter Weise für die
Induktion spezifischer B-Zellen verwendet, die nach
Fusionierung mit Myelomzellen Hybridomzellen generieren, die
nach bekannten Klonierungsverfahren in Zellinien kultiviert
werden, die spezifische monoklonale Antikörper sezernieren. Die
erfindungsgemäßen mono- oder polyklonalen Antikörper-reagieren
nur mit dem verwendeten spezifischen Epitopen bzw. mit allen
bekannten Elastase-Isoenzymen.
Es konnte nachgewiesen werden, daß Antikörper gegen die Peptide
A-V-K-E-G-P-E-Q-V- I-P-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R, R-S-G-
C-N-G-D-S-G-G-P-L-N, G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q, G-T-E-A-G-R-N-
S-W-P-S-Q-I, H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V, W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A,
V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T, G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q, S-S-S-R-
T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N, K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D, G-P-L-N-C-Q-A-
S-D-G-R-W, G-A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L, S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y, F-G-
C-N-T-R-R-K-P-T-V-F-T, hochspezifisch mit den Isoformen der
Pankreas-Elastase reagieren und keine unspezifische Reaktion
mit anderen Stuhlbestandteilen eingehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Elastase-Antikörper für den Nachweis und die
Quantifizierung aller bekannter Elastase-Isoenzyme in
Körperflüssigkeiten und Stuhl. Die Erfindung betrifft daher
auch Nachweissysteme, vorzugsweise ein immunchemisches
Nachweissystem zur Feststellung der Funktionalität des Pankreas
als Hilfsmittel zur Erkennung von Funktionsstörungen dieses
Organs. Dazu können die spezifischen Antikörper an jeden
geeigneten Träger adsorptiv oder chemisch mit bekannten
Kopplungsverfahren gebunden werden. Als Träger eignen sich
Membranen oder Partikel. Mit einem erfindungsgemäßen Sandwich-
ELISA unter Verwendung von kreuzreaktiven oder einer
Kombination unterschiedlicher Epitopantikörper lassen sich
schnell und spezifisch Pankreas-Elastase in Stuhl und Serum
bzw. Plasma nachweisen und quantifizieren.
Er dient zur Diagnose bzw. dem Ausschluß einer
Pankreasbeteiligung bei Abdominalbeschwerden und exokriner
Pankreasinsuffiziens.
Es gibt auch Fälle, in denen bereits die Erfassung von Elastase
1 genügt, um eine sichere Diagnose von Pankreasstörungen
stellen zu können. In diesen Fällen wird das erfindungsgemäße
Verfahren folgendermaßen geführt:
Die DNA-Sequenz für humane Elastase 1 (JP 1987000276-A/6) wurde in die Aminosäuresequenz übertragen. Unter Verwendung üblicher Proteinstrukturprogramme konnten mehrere Aminosäuresequenzen identifiziert werden, die eine potentielle Epitopstruktur aufweisen. Es konnte nachgewiesen werden, daß Antikörper gegen die Peptide A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-X-L-Q-Q- A-R, R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N und G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q hochspezifisch Elastase 1 binden und keine unspezifische Reaktion mit anderen Stuhlbestandteilen eingehen.
Die DNA-Sequenz für humane Elastase 1 (JP 1987000276-A/6) wurde in die Aminosäuresequenz übertragen. Unter Verwendung üblicher Proteinstrukturprogramme konnten mehrere Aminosäuresequenzen identifiziert werden, die eine potentielle Epitopstruktur aufweisen. Es konnte nachgewiesen werden, daß Antikörper gegen die Peptide A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-X-L-Q-Q- A-R, R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N und G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q hochspezifisch Elastase 1 binden und keine unspezifische Reaktion mit anderen Stuhlbestandteilen eingehen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von anti-
Elastase-Antikörpern auf übliche Weise, das jedoch dadurch
gekennzeichnet ist, daß die verwendeten spezifischen Antigene
zuvor mittels strukturanalytischer Methoden aus der
Aminosäuresequenz abgeleitet und chemisch synthetisiert wurden.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Teile dieser synthetischen
Peptide für die Herstellung von Antikörpern zu verwenden.
Wenngleich die Peptide allein eine Antikörperinduktion
auslösen, hat es sich erfindungsgemäß als zweckmäßig erwiesen,
diese Peptide an übliche Carriersubstanzen wie Hämocyanin zu
binden. Mit den erfindungsgemäßen Peptiden ist es möglich,
sowohl monoklonale wie polyklonale Antikörper zu erzeugen.
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen polyklonalen
Antipeptidantikörper werden Versuchstiere wie Kaninchen,
Meerschweinchen, Ziegen, Hühner oder Fische in bekannter Weise
mit den Peptiden immunisiert. Für die Herstellung monoklonaler
Antikörper werden die Peptide in bekannter Weise für die
Induktion spezifischer B-Zellen verwendet, die nach
Fusionierung mit Myelomzellen Hybridomzellen generieren, die
nach bekannten Klonierungsverfahren in Zellinien kultiviert
werden, die spezifische monoklonale Antikörper sezernieren. Die
erfindungsgemäßen mono- oder polyklonalen Antikörper reagieren
nur mit dem verwendeten spezifischen Epitop bzw. der reifen
Elastase 1.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der
erfindungsgemäßen Elastase 1-epitopspezifischen Antikörper für
den Nachweis und die Quantifizierung von Elastase 1 in
Körperflüssigkeiten und Stuhl. Die Erfindung betrifft daher
auch ein immunchemisches Nachweissystem zur Feststellung der
Funktionalität des Pankreas als Hilfsmittel zur Erkennung von
Funktionsstörungen dieses Organs. Dazu können die spezifischen
Antikörper an jeden geeigneten Träger adsorptiv oder chemisch
mit bekannten Kopplungsverfahren gebunden werden. Als Träger
eignen sich Membranen oder Partikel. Mit einem
erfindungsgemäßen Sandwich-ELISA unter Verwendung von je zwei
unterschiedlichen Epitopantikörpern läßt sich schnell und
spezifisch Elastase 1 in Stuhl und Serum bzw. Plasma nachweisen
und quantifizieren.
Mittels Festphasensynthese nach Merrifield werden die Peptide
mit den Aminosäuresequenzen NH2-A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N-COOH,
NH2-Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R-COOH, NH2-R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-
P-L-N-COOH und NH2-G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q-COOH
synthetisiert. Die Peptide werden mit bekannten Verfahren an
Napfschneckenhämocyanin (KLH) gekoppelt (1 mg Peptid/mg KLH).
Je 300 µg dieses Konjugates werden unter Zusatz von Freundschen
Adjuvants für die Immunisierung von Kaninchen bzw. Huhn
verwendet. Nach 3maliger Vakzination werden die Tiere
entblutet. Nach Gewinnung des Serums wird die Spezifität der
Antiseren in einem ELISA getestet. Dazu wird freies Peptid an
die Oberfläche der Kavitäten von Mikrotiterplatten adsorbiert.
Nach Inkubation der Kavitäten mit den Antiseren werden diese
gründlich gewaschen. Unter Verwendung von Antikaninchen- bzw.
Antihuhn-POD-Konjugat und TMB als Substrat werden in üblicher
Weise die Antigen-Antikörperreaktion detektiert. Jedes
Antiserum reagiert nur mit dem homologen Peptid.
Die Elastase 1 - Spezifität kann im Westernblot nachgewiesen
werden. Dazu werden grob- bzw. hochgereinigte Elastase 1 aus
Stuhl mittels Polyacrylamidgel-Elektropherese entsprechend
ihrer relativen Molmasse von begleitenden Verunreinigungen
getrennt. Die Proteinzonen aus dem Gel werden mit Hilfe einer
"Semidry-blotting"-Apparatur auf Nitrozellulose übertragen.
Nach Absättigung der freien Bindungsstellen der Membran mit
resuspendierter Trockenmagermilch werden die Membranen mit den
1 : 500 verdünnten anti-Peptid-Antiseren inkubiert. Nach
intensiven Waschen der Membranen zur Entfernung aller
unspezifisch gebundenen Antikörper werden die Membranen mit
Phosphatase - markierten anti-Kaninchen-Antikörpern inkubiert.
Die spezifisch gebundenen sekundären Antikörper, die nach
Waschen auf der Membran verblieben, werden nach Zugabe des
Substrates sichtbar gemacht. Dabei zeigt sich, daß in den
verwendeten Proben ausschließlich Elastase nachgewiesen wurde.
Die Elatase 1 in Serumproben oder in Stuhlproben wird in einem
Festphasen-Enzymimmunoassay, der auf der Sandwichtechnik
basiert, bestimmt. Ein polyklonaler Antikörper, der gegen
Epitope der Elastase 1 gerichtet ist, wird in einem
Karbonat/Bikarbonat-Puffergemisch, pH 9,6 gelöst und in die
Wells einer Mikrotiterplatte gegeben. Nach der Inkubation bei 4°C
über 12 h werden die nicht gebundenen Antikörper durch
Waschen mit PBS entfernt. Die noch freien Bindungsstellen des
Trägermaterials werden durch einen PBS-Puffer, der Ethanol-amin
und Tween 20 enthält, geblockt. Das Blocken findet bei
Raumtemperatur über 90 min statt. Nach dem Waschen werden die
in PBS verdünnten Serum- bzw. Stuhlproben in die Wells
pipettiert. Die 60-minütige Inkubation bei Raumtemperatur wird
durch Waschen beendet. Ein zweiter Elastase 1 spezifischer
polyklonaler Antikörper, der mit Biotin konjugiert ist, wird zu
der an den ersten Antikörper gebundenen Elastase gegeben.
Nach einer Inkubation von 30 Minuten und dem Waschprozeß wird
der biotinmarkierte Antikörper mit Peroxidase-konjugiertem
Streptavidin nachgewiesen. Durch den letzten Waschschritt
erfolgt die Beseitigung des nicht gebunden Streptavidins.
Anschließend wird TMB als Substrat für die Peroxidase
da zugegeben und nach einer definierten Zeit wird die
Farbreaktion durch Zugabe von HCl abgestoppt. Gemessen wird die
Änderung der optischen Dichte. Die Intensität der Farbreaktion
ist proportional der Elastase 1-Konzentration der Probe.
Mittels Festphasensynthese nach Merrifield werden die Peptide
mit den Aminosäuresequenzen A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N, Y-T-N-G-
P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R, R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N, G-P-L-N-C-P-T-
E-D-G-G-W-Q, G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I, H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-
Y-V, W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A, V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T, G-G-E-E-
A-R-P-N-S-W-P-W-Q, S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N, K-D-W-N-S-N-Q-
I-S-K-G-N-D, G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R-W, G-A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L,
S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y, F-G-C-N-T-R-R-K-P-T-V-F-T synthetisiert.
Die Peptide werden mit bekannten Verfahren an
Napfschneckenhämocyanin (KLH) gekoppelt (1 mg Peptid/mg KLH).
Je 300 µl dieses Konjugates werden unter Zusatz von Freundschen
Adjuvants für die Immunisierung von Kaninchen oder Huhn
verwendet. Nach dreimaliger Vakzination werden die Tiere
entblutet. Nach Gewinnung der Antikörper (Reinigung über
Protein A-Säule bzw. fraktionierte Fällung) wird ihre
Spezifität in einem ELISA getestet. Dazu wird freies Peptid an
die Oberfläche der Kavitäten von Mikrotiterplatten adsorbiert.
Nach Inkubation der Kavitäten mit den homologen bzw.
heterologen Antikörpern werden diese gründlich gewaschen. Unter
Verwendung von Anti-Kaninchen- bzw. Anti-Huhn-POD-Konjugaten
und TMB als Substrat werden in üblicher Weise die Antigen-
Antikörper-Reaktionen detektiert. Jeder Antikörper reagiert nur
mit dem homologen Peptid.
Die Spezifität der Antikörper für verschiedene Isoformen der
Pankreas-Elastase kann im Western-Blot nachgewiesen werden.
Dazu werden grob- und hochgereinigte Elastaseproben aus Stuhl
und Pankreassaft mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese
entsprechend ihrer relativen Molmasse von begleitenden
Verunreinigungen getrennt. Die Proteinzonen aus dem Gel werden
mit Hilfe einer "semi-dry"-Blottingapparatur auf Nitrozellulose
übertragen. Nach Absättigung der freien Bindungsstellen der
Membran mit resuspendierter Trockenmagermilch werden die
Membranen mit den jeweiligen vorverdünnten anti-Peptid-
Antikörper alleine oder in unterschiedlicher Kombination
inkubiert. Nach intensivem Waschen der Membranen zur Entfernung
aller unspezifisch gebundener Antikörper werden die Membranen
mit alkalischer Phosphatase-markierten anti-Kaninchen-
Antikörpern in einer vorher ermittelten Konzentration
inkubiert. Die spezifischen sekundären Antikörper, die nach dem
Waschen auf der Membran verbleiben, werden nach Zugabe von
Substrat sichtbar gemacht. Dabei zeigte sich, das in allen
Proben mit einzelnen Antikörpern oder Antikörpergemischen
Elastase detektiert werden kann, jedoch nicht jeder Antikörper
alle Isoformen detektiert.
Die Elastase in Serum, Plasma oder Stuhl wird mit einem
Festphasen-ELISA, der auf der Sandwichtechnik basiert,
bestimmt. Dazu werden einzelne oder ein entsprechendes Gemisch
mehrerer der erfindungsgemäßen Antikörper in einem
Karbonat/Bikarbonat-Puffergemisch, pH 9,6 gelöst und in die
Wells einer Mikrotiterplatte gegeben. Nach Inkubation bei 4°C
werden die nicht gebundenen Antikörper durch Waschen mit PBS
entfernt. Die noch freien Bindungsstellen des Trägermaterials
werden durch einen Ethanolamin/Tween 20-PBS-Puffer geblockt.
Das Blocken findet bei Raumtemperatur über 90 Minuten statt.
Nach dem Waschen werden die in PBS verdünnten Serum- bzw.
Stuhlproben in die Wells pipettiert. Die 60minütiger Inkubation
bei Raumtemperatur wird durch Waschen beendet. Als
Detektionsantikörper werden einzelne oder ein entsprechendes
Gemisch aus mehreren erfindungsgemäßen Antikörpern verwendet,
die mit Biotin konjugiert wurden. Nach einer Inkubation von 30
Minuten und dem Waschprozeß wird der Biotin-markierte
Antikörper mit Peroxidase-konjugiertem Streptavidin
nachgewiesen. Durch den letzten Waschschritt erfolgt die
Beseitigung des nicht gebundenen Streptavidins. Anschließend
wird mit TMB als Substrat die Peroxidasekonzentration bestimmt.
Nach Zugabe von HCl zur Beendigung der Enzymreaktion wird die
Änderung der optischen Dichte gemessen. Die Intensität der
Farbreaktion ist proportional der Elastase-Konzentration in der
Probe.
Claims (19)
1. Diagnostisches Verfahren zur Erkennung einer
Pankreasfunktionsstörung, dadurch gekennzeichnet, daß in
Serum, Se- oder Exkreten eines Patienten der Gesamtgehalt
aller pankreatischen Elastasen (Isoenzyme) bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Bestimmung vorzugsweise mittels immunchemischer Systeme unter
Nutzung mono- oder polyklonaler Antikörper, die alle
Elastase-Isoenzyme einzeln spezifisch oder kreuzreaktiv
erkennen, mit Ausnahme der Aminosäuresequenz Thr-Met-Val-Ala-
Gly-Gly-Asp-Ile-Arg, erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die eingesetzten Antikörper mittels Antigenen gewonnen
werden, die die kompletten Elastasen 1, 2 und 3 oder
Untereinheiten davon darstellen mit Ausnahme der
Aminosäuresequenz Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg oder
einer immunologisch wirksamen Teilsequenz davon.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als
Antigene synthetische Peptide verwendet werden, die nach
Immunisierung von Tieren Antikörper induzieren, die
kreuzreaktiv mehrere Elastasen erkennen, mit Ausnahme der
Aminosäuresequenz Thr-Met-Val-Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4 dadurch gekennzeichnet, daß
vorzugsweise folgende synthetische Peptide verwendet werden
NH2-A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N-COOH
NH2-Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R-COOH
NH2-R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N-COOH
NH2-G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q-COOH
NH2-G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I-COOH
NH2-H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-y-V-COOH
NH2-W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A-COOH
NH2-V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T-COOH
NH2-G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q-COOH
NH2-S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N-COOH
NH2-K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D-COOH
NH2 -G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R-W-COOH
NH2-G-A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L-COOH
NH2-S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y-COOH
NH2 -F-G-C-N-T-R-R-K-P-T-V-F-T-COOH
NH2-A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N-COOH
NH2-Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R-COOH
NH2-R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N-COOH
NH2-G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q-COOH
NH2-G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I-COOH
NH2-H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-y-V-COOH
NH2-W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A-COOH
NH2-V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T-COOH
NH2-G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q-COOH
NH2-S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N-COOH
NH2-K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D-COOH
NH2 -G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R-W-COOH
NH2-G-A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L-COOH
NH2-S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y-COOH
NH2 -F-G-C-N-T-R-R-K-P-T-V-F-T-COOH
6. Verfahren nach Ansprüchen 1-5 dadurch gekennzeichnet,
daß Antikörper einzeln oder in einer Kombination in
immunchemischen Nachweissystemen verwendet werden.
7. Immunologische Testkits zur Diagnose und Verlaufskontrolle
von Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse unter Verwendung von
Stuhl oder Körperflüssigkeiten, enthaltend Antikörper gemäß
den Ansprüchen 2-6.
8. Verfahren zur Gewinnung von mono- und/oder polyklonalen
Antikörpern, die spezifisch mit humaner Elastase 1 in Stuhl
oder Körperflüssigkeiten reagieren und durch übliche
Immunisierungsverfahren dadurch gekennzeichnet, daß man die
Peptide
A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R,
R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N und G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q oder immunogene Teilpeptide davon als Antigen zur Immunisierung von Vertebraten, insbesondere von Kleinsäugern und Vögeln, verwendet.
A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R,
R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N und G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q oder immunogene Teilpeptide davon als Antigen zur Immunisierung von Vertebraten, insbesondere von Kleinsäugern und Vögeln, verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
man die freien Peptide vor der Immunisierung an geeignete
Trägersubstanzen, vorzugsweise Hämocyanin oder Albumin
koppelt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet,
daß polyklonale Antikörper unter Einsatz von Hühnern als
Versuchstieren produziert werden.
11. Polyklonale Antikörper, sofern sie nach Anspruch 8 bis
10 hergestellt wurden.
12. Monoklonale Antikörper, sofern sie nach Anspruch 8 und 9
hergestellt wurden.
13. Peptid A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N
14. Peptid Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R
15. Peptid R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-N
16. Peptid G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q
17. Reinigungs- und Detektionssysteme für humane Elastase 1,
dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen der
erfindungsgemäßen Antikörper enthalten.
18. Immunologische Testkits nach Anspruch 17 zur Diagnose
und Verlaufskontrolle von Erkrankungen der
Bauchspeicheldrüse und der Mucoviscidose unter Verwendung
von Stuhl oder Körperflüssigkeiten.
19. Immunologische Testkits nach Anspruch 16 und 17, dadurch
gekennzeichnet, daß 2 unterschiedliche Antikörper verwendet
werden (Sandwich-ELISA).
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- 1999-09-03 PT PT99968715T patent/PT1112496E/pt unknown
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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