PT1112496E - Processo de diagnóstico para reconhecimento de um distúrbio da função pancreática - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO DE DIAGNÓSTICO PARA RECONHECIMENTO DE UM DISTÚRBIO DA FUNÇÃO PANCREÃTICA O re ae rico refere-se a um lirnento de um distúrbio cação são a medicina e a processo de diagnóstico da função pancreática. As indústria farmacêutica. para areas

Os dif o resultado de ser sustentado, funcionais. As as recorrências distúrbios funcionais do pâncreas podem ser erences afecções cujo diagnóstico deveria .7 -. .pela determinação de critérios frequentes do pâncreas são .ncreatite aguda. A pancreatite crónica é uma doença progressiva degenerativa em que o tecido pancreãtico funcional se degenera gradualmente, no âmbito de um processo esclerosante. A pancreatite crónica é caracterizada pelo seu quadro clínico de queixas (dores abdominais, seborreía, perda de peso), alterações morfológicas ilpicas glandulares (calcificação, canal pancreãtico dilatado e com delimitação irregular), bem como uma perda progressiva das funções exócrinas e endócrinas (dificuldades digestivas, Diaaeces mellitus). A pancreatite crónica tem um nível de 6 a 8 incidências por 100 000 habitantes por ano na Europa Ocidental. O diagnóstico de pancreatite crónica está a aumentar cada vez mais, devido ao crescente consumo de álcool. ) .ta suportar os diagnósticos clínicos e morfológicos, podem ser determinados diferentes critérios funcionais. 0 teste ae secretina-caeroline ou secretina-colecistocinina representa c método de análise mais sensível, que, contudo, sobrecarrega enormemente os pacientes e requer um enorme dispêndio, em termos de tempo. Como métodos de teste indirectos, são utilizados, c teste de Lundh, ο ΝΒΤ-ΡΛΒΛ e o Paiicreolauryl - test . Também c= determinação de Tripsina no soro ou de Químotripsina nas A. : tem. mm determinado significado prático. Todos estes métodos ·, 1 :ss:c indírectos apresentam a desvantagem de uma especi£ícidade iusaf iciente. A determinação da Elastase 1 é, de todos os testes funcionais indirectos disponíveis, o teste com a mais elevada sensibilidade e especificidade (Lôse, C. , Therapie & Erfolg 1957 ; 1:411-4x3; .

Eie tem sido utilizado como Standard, nos últimos anos, na ra o diagnóstico funcional pancreático exócrmo. . ;,·. ·.- teste são os anticorpos policlonais contra a .ase 1-RIA, Abbott) ou anticorpos Antí-Elastase mono x/ ou pciiclonais, obtidos através da imunização com um ant ígeno contendo a sequência de aminoãcidos Thr-Met-Val-Ala -

Gly-Gly Asp-Ile-Arg ou péptidos parciais, eficazes do ponto de vista imunológico, da mesma (EP 0 547 059 Bl) . A elastase pancreática é uma enzima digestiva proteolítíca. Em i..,ração com os parâmetros usuais do diagnóstico do pâncreas a.· . , a actividade de quimotripsina nas fezesi a determinação de elastase quantitativa tem vantagens decisivas. A enzima é formada exclusivamente no pâncreas e apresenta uma estabilidade extraordinária durante a passagem pelo intestino, isto é, a concentração de elastase reflecte o desempenho das secreções do pâncreas. . i·.. ua sua predominância relativamente a outros parâmetros ts, com o elastase 1-ELISA convencional, em demasiados ião se comprova a elastase pancreãtica, embora ela exista infrações consideráveis. A Fuj imoto e colaboradores (Fuj imoto, K., Clinicai Biochemístry 1983; 16 (1) : 26-27) divulgaram um processo no qual se exterminava o teor das elastases 1 e 2 no soro de pacientes com e, ^ η o r e a t r te . O objectivo do presente invento visa, por conseguinte, o desenvolvimento de um processo mais sensível para rec de uma afecção na função pancreãtica, tendo coi identificação de elastase pancreãtica.

Através de pesquisas sistemáticas efectuadas em amostras de fezes que não reagiram à elastase 1 com o reste ELISA o.....rcvoau: loxiai , foi possível obter amostras que contêm elastase, tctiance separação electroforética. Da posterior caracieriz;, . resulta que, no caso destas proteínas, se trata de dife rsoenzimas que não são reconhecidos de forma evidente c testes comerciais de anticorpos. Para esta enzima exist forma evidente, um polimorfismo genético pronunciado de manifesta, que na literatura especializada se reflecte tam ue.soriçâo das elastases pancreãticas 1, 2 e 3. Me L..o.squi sas próprias, tornou-se também possível comprova... ρ,.,οιη: ocorrer pelo menos 2 isoenzimas em simultâneo. Foi possível provar que estas elastases, na sua dependência de concentrações para afecções pancreãticas, se podem comportar precisamente da mesma forma que a elastase 1.

Em oposição às soluções conhecidas que se restringem ao acto aprovar a elastase pancreát ica 1, descobriu-se '.n.i , u o.r-tridente que através do comprovativo ao maior de isoforrnes de elastase pancreãtica, presentemente são conhecidas as elastases pancreãticas 1, 2 e 3, se pode melhorar de forma categórica a capacidade de afirmação relativamente à função pancreãtica. 0 invento corresponde, assim a um processo para a produção de anticorpos anti-elastase da 1 ^ td haiituai, caracteri zado, contudo, pelo facto de os . f icos utilizados representarem, individualmente ,n.; ,.m todos os isoenzimas de elastase ou partes deles ou sequências sintéticas de reacção cruzada.

As partes mencionadas obtêm-se, de preferência, através a síntese dos péptidos, sendo que a sequência de aminoãcidos é derivada primeiro através de métodos analíticos estruturais da sequência total ou é determinada pela sequência de proteínas. Se cem que os péptidos já desencadeiam sozinhos uma indução de .: :.....: ..: . .v"· o invento foi considerado apropriado i.gar ibstâncias portadoras convencionais como é o caso da hemocíanína. Com os péptidos de acordo com o invento, torna-se possível gerar anticorpos tanto monoclonais como policlonais.

Para a produção de anticorpos anti-péptidos policlonais procede- se a imunização, com os péptidos, de cobaias como, por exemple, coelhos, porquinhos-da-índia, cabras, galinhas ou peixes, de Corrias j a conhecidas. Para a produção de anticorpos monoclonaí s, cs p'=pt:uos são utilizados de formas conhecidas para a indução d-o- c s 3 específicas que, depois da fusão com células eme-o , geram células hibridomas que são cultivadas segundo processos de clonagem conhecidos em linhas celulares, e que isolam anticorpos monoclonais específicos. Os anticorpos raonoclonais e policlonais segundo o invento só reagem com os epi topes específicos utilizados ou com todos os isoenzimas de eiastase conhecidos.

Pude comprovar-se que os anticorpos perante os péptidos A-V-K-E-3-P-E-Q-V-I-P-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R, R-S-G-C-N-G- D-S-G-G-P-L-N, G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q, G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I, H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V, W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A, V-3-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T, G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q, S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N, K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D, G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R- W, G-A-.L-P-D-D-L~K-Q~G-R-L·, S-L-Q-Y - E - K-S - G - S - F - Y, F-G-C-N-T- iv R · K - P -1' - V - F - T , reagem de forma altamente específica com os Arõicrmes aa eiastase pancreãtica e não ocorre nenhuma reaoção não específica com outras matérias fecais.

Um outro objecto do invento é a utilização de anticorpos de eiastase segundo o invento, para a identificação e a quantificação de todos os isoenzimas de eiastase conhecidos nos lindos corporais e nas fezes. 0 invento refere-se, por rseguiiite, também a sistemas de identificação, uernr ialinente a um sistema de identificação ímunoquímicc para determinação da funcionalidade do pâncreas como meio auxiliar para reconhecimento de afecções funcionais deste órgão. Nesse intuito, os anticorpos específicos podem ser ligados a cada um dos portadores adequados de forma adsorvida ou química com processos de acoplamento conhecidos. Como portadores são u-uequadas as membranas ou partículas. Com um ''ELISA Sandwich'', .-r:mac o invento, utilizando reactivos cruzados ou uma , niiiçao de diferentes anticorpos epitopes, pode identificar-se e quantificar - se rapidamente e de forma específica a eiastase pancreãtica nas fezes e no soro ou no plasma. 4

Tem a função de diagnóstico ou de exclusão de uma ligação do pâncreas a queixas abdominais e à insuficiência pancreácica exócrina.

Existem também casos em que a mera identificação de eiastase 1 ·- ente para que se possa efectuar um diagnóstico : :. .......s pancreãt iças . destes casos, de acordo com processo segundo o invento, procede -se do seguinte modo: A sequência de DNA para a Eiastase 1 humana (JP 1987000276-A/6} foi transferida para a sequência de aminoácidos. Mediante a utilização de programas de estrutura proteica comuns cornou-se ztstivc* identificar outras sequências de aminoácidos que apresentam uma potencial estrutura epitope. Foi, assim, possível comprovar que os anticorpos contra os péptidos A-V-K-E-G-P-E-Q-v- I -P- I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R, R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-L-t! e G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q ligam a Eiastase 1 de forma aicameiite específica e não ocorre nenhuma reacção não específica com outras matérias fecais. z: x,vento corresponde a um processo para a produção de anticorpos anti-elastase de forma já habitual, caracterizado, contudo, pelo facto de os antígenos específicos utilizados terem sido derivados primeiramente mediante métodos analíticos estruturais da sequência de aminoácidos e de terem sido sintetizados de forma química. De acordo com o invento, também é possível utilizar partes destes péptidos sintéticos para a urcauçãc de anticorpos. Se bem que os péptidos já desencadeiam s.ó por si uma indução de anticorpos, segundo o invento foi considerado apropriado ligar estes péptidos a substâncias portadoras convencionais como é o caso da hemocinina. Corn os péptidos de acordo com o invento, torna-se possível gerar tanto, anticorpos monoclonais como policionaís.

Para a xr.d^ção de anticorpos anti-péptidos policionaís procede -s.·: à çáo, com os péptidos, de cobaías como, por exemplo, oue_hos, porquinhos-da-índia, cabras, galinhas ou peixes, ae formas já conhecidas. Para a produção de anticorpos monoclonais, 5 pé ρ c í ao s são utilizados de formas conhecidas para a indução de células B específicas que, depois da fusão com células mieiornas, geram células hibrídomas que são cultivadas segundo processos de clonagem conhecidos em linhas celulares, e que isolam anticorpos monoclonais específicos. Os anticorpos monoclonaís e policlonais segundo o invento só reagem com os epítcpes específicos utilizados ou com a Elastase 1 amadurecida. dm ouirc obiecio do invento ê a utilização dos anticorpos específicos de epitope da Elastase 1 segundo o invento, para a identificação e a quantificação da Elastase 1 em fluídos corporais e nas fezes. 0 invento refere-se, por conseguinte, também a um sistema de identificação irnunoquímico para determinação da funcionalidade do pâncreas como meio auxiliar paio reconhecimento de afecções funcionais desce órgão. Nesse uuttc, os anticorpos específicos podem ser ligados a cada um ol-.s portadores adequados de forma adsorvida ou química com processos de acoplamento conhecidos. Como portadores são adequadas as membranas ou partículas. Com um ''ELISA Sandwich'' segundo o invento, utilizando dois anticorpos de epitope diferentes, pode identificar-se e quantíficar-se rapidamente e de forma especifica a Elastase 1 nas fezes e no soro ou no u .l a sma . • · · i .. v :.i. — cução 1 - Produção de anticorpos anti -pep-tídos :__-j. _ j^reccionados contra sectores definidos da Elastase _ η.- ju recida .

Mediante a síntese de fase fixa, segundo Merrifield, os pépcidos são sintetizados com as sequências de aminoácidos NH2-A-V-K-E-G-P E-Q- I-N-COOH, NH2-Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R-C00H, NH 2 - i-·. P - C - ·. ...........-G-P-L-N - COOH e NH2 - G- P- L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q-

PoPP . : s sâo acoplados com processos já conhecidos à uemocianina de lapa (KJH) (1 mg péptidos/mg KLH) . 300gg deste conjugado são utilizados, com a adição do adjuvante de Freund, para a imunização de coelhos ou galinhas. Depois de três vacinações, os animais ficam sangrados. Depois da obtenção do soro, é testada a especificidade dos antisoros num ELISA. Para tal, o péptido livre é adsorvído na superfície dos poços de pPecas de microtíter. Após a incubação dos poços com os 6

Mediante a anc isoros, estes ficam lavadas por completo .si^-açao ae conjugados POD antí-coelho ou anti-galinha e TML· o.....;mu substrato, é detectada a reacção de anticorpos de antígenos aa tonta habituai. Cada antisoro reage somente com o péptído homólogo.

Exemplo de execução 2 - Comprov at 1VO d cl especificidade dos anticorpos segundo o invento .·'·. ospeor r i cidade da Elascase 1 pode ser comprovada no Western u,ou. Para cal, a Elastase 1, de fezes, lavada grosseira ou meticulosamente é separada por electroforese em gel de poiracriiamida, de acordo com a sua massa molar, das impurezas que a acompanham. As zonas proteicas do gel são transferidas com a ajuda de um aparelho de ''semidry-blotting'' para nitrocelulose Após a saturação dos pontos de ligação livres, da membrana com leite magro em põ resuspendído, as membranas são incubadas com ot ii.xrems de antí -péptído diluído numa relação de 1 : 500.

Após .,a is intensivas das membranas para retirar todos os antícorpos xigados não específicos, as membranas são incubadas com anticorpos anti-coelho marcados com fosfatase.

Os anticorpos secundários ligados específicos que permanecem após a lavagem das membranas, tornam-se visíveis após a adição t.ibstrato. Assim, mostra-se que nas amostras utilizadas foi . sovada exclusivamente a Elastase.

Exemplo de execução 3 - Determinação da Elastase 1 em fezes

mediante a. utilização dos anticorpos segundo o invento num ELISA A Elastase 1 em amostras de soro ou em amostras fecais é determinada num ensaio de imunoabsorção enzimãtíca de fases íd.xas que se baseia na técnica sandwich. Um anticorpo r ,rco i^naao contra a epitope da Elastase 1 é dissob e...ex.,çae tampão de bicarbonato/ carbonato, pH 9,6 e é c poços de uma placa microtíter. Após a incubação a 4" C durante ;..t horas, os anticorpos não ligados são removidos durante a lavagem com PBS . Os pontos de ligação ainda livres, do material portador, são bloqueados por um tampão PBS contendo amino-etanol e Tween 20. 0 bloqueio ocorre à temperatura ambiente durante 90 / minutos. Depois da lavagem, as amostras de fezes e de soro diluídas em PBS são colocadas com uma pipeta nos poços. A rmjtação de 60 minutos à temperatura ambiente termina com a ..avagem. Uma segunda elascase 1 de anticorpos policlonars cspecííicos, conjugada com biotína, é adicionada à elastase ligada ao primeiro anticorpo.

Depois de uma incubação de 30 minutos e do processo de lavagem, os anticorpos marcados com biotína são identificados mediante streptavídina conjugada de peroxidase. Através da última etapa a·.:: wagcíii, ocorre a eliminação da streptavídina não ligada. Em seguida, o TMB é adicionado como substrato para a peroxidase e, -;pós um período de tempo definido, a reacção de coloração é interrompida através da adição de HC1 . A modificação da densidade óptica é, então, medida. A intensidade da reacção de coloração ê proporcional â concentração de Elastase 1 da amostra b__'---c Jtào -t - Produção de anticorpos anti-péptidos .. _____^.idos contra secções definidas de rsoformes

Mediante a síntese de fase fixa segundo Merrífieid, os péptidos são sintetizados com as sequências de aminoácidos A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R, R-S-G-C-N-G-D-S-G- G-P-L-N, G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q, G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I, H"N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V, W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A, V-S-S-R-G-C-N-V-3-R-K-P-T, G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q, S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-1 U, K-D W-E-S-N-Q-I-S-K-G-N-D, G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R-W, G-A-L P · D - b - i. - K - Q - G - R - L , S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y, F-G-C-N-T-R-R-K-P- T - V - F - T .

Os péptidos são acoplados com processos jã conhecidos â hemocíanina de lapa (KJH) (1 mg péptidos/mg KLH) . 300μg deste conjugado são utilizados, com a adição do adjuvante de Preund, paru a imunização de coelhos ou galinhas. Depois de três tutmpDv, os animais ficam sangrados. Depois da obtenção de _iuticorpcs (limpeza através da coluna proteína A ou precipitação íraccíonada), é testada a sua especificidade num ELISA. Para i péptido livre é adsorvído na superfície das cavidades placas rnicrotiter. Após a incubação das cavidades com cs 8 anticoxpos homólogos ou heterólogos, estes ficam lavaaas por completo. Mediante a utilização de conjugados POD anti-coelho ou anti-galinha e TMB como substrato, é detectada a reacção de anticorpos de antígenos da forma habitual. Cada anticorpo reage . : com o péptido homólogo. rçtegp 10___________ue execução d - comprovativo da sspscit iciQade dos ρpicorpos segundo o invento A especificidade dos anticorpos para diferentes ísofcrmes aa eiastase pancreática pode ser comprovada no Western blot. Para tal, as amostras de eiastase de fezes e de suco pancreático ,,maaas grosseira ou meticulosamente são separadas por ·.: ..eot roP-r^se em gel de poliacrí lamida, de acordo com a sua massa m< das impurezas que a acompanham. As zonas proteicas ao gel saa transferidas com a ajuda de um aparelho de biotting ' 'semi-dry' ' para nitrocelulose.

Após a saturação dos pontos de ligação livres da membrana com leite magro em pó resuspendido, as membranas são incubadas com o ; ; "c:cc de anti-péptido sozinho ou com ele incubado em . o.;ie s combinações. Após lavagens intensivas das membranas ραία retirar coaos os anticorpos ligados não específicos, membranas são incubadas com anticorpos anti-coelho marcados fosfatase alcalina numa concentração previamente determinada. r anticorpos secundários ligados específicos que permanecem após a lavagem das membranas tornam-se visíveis após a adição do substrato. Assim, mostrou-se que é possível detectar eiastase em iodas as amostras com anticorpos individuais ou misturas de iiorpos, porém, nem todos os anticorpos detectarn coaos os .si c cr me s .

Bxernplo de execução 6 - Determinação da eiastase pancreát ica em fezes e em soro mediante a utilização dos anticorpos segundo 0 invento. A Eiastase no soro, plasma ou fezes é determinada com um cases lixas que se baseia na técnica saiidwich. Para cal, são 1 oiclviJcs amicorpos segundo o invento, indivií o. . numa mistura correspondente de vários, em uma solução tanq 9 o... oarooricit o/carbonato, pH 9,6 e são colocados nos poços da una piaca microtíter. Após a incubação a 4 ° C, os anticorpos não ligados são removidos durante a lavagem com PBS. Os pontos de ligação ainda livres, do material portador, são bloqueados por um tampão PBS 2 0 de amino- etanol ,/Tween. O bloqueio ocorre ã temperatura ambiente durante 90 minutos. Depois da lavagem, as amostras de fezes ou de soro diluídas em PBS são colocadas com w.i p_p-c-ta nos poços. A incubação de 50 minutos à temperatura mtjsiente termina com a lavagem. Como anticorpos de detecçãu sãe utilizados anticorpos segundo o invento, individualmente ou numa mistura correspondente de vários, que foram conjugados com Biotína. Depois de uma incubação de 30 minutos e do processo de lavagem, os anticorpos marcados com biotina são identificados mediante streptavidina conjugada de peroxídase. Através da última etapa de lavagem, ocorre a eliminação da streptavidina ião iigada. Em seguida, com TMB, a concentração de peroxídase é determinada como substrato. Após a adição de HC1 para encerrar a reacçáo enzimãtíca, é medida a modificação da densidade õptica. A intensidade da reacção de coloração é proporcional à concentração de Elastase na amostra.

Lisboa, 4 de Dezembro de 2006

Pela Requerente 0 Agente Oficial

f X" ........... ' p 10

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES - . Π. _ e s s de diagnóstico para reconhecimento de cana afecção da : ..a. „ a c gancreácica, caracterí zado por, no soro, secreções ca excreções de um paciente, se determinar o volume totai das --.asceses pancreáticas 1, 2 e 3 {isoenzima; neles contidas.
2. 2. Processo segundo a reivindicação 1, caracterizado por a determinação ocorrer mediante sistemas imunoquímicos e a „t i i izaçác de anticorpos mono c lona is e policlonais, que . :·; .;.:ncai. a eiastase pancreát ica 1, 2 e 3 ; r sonenzirna; , com -xc-pção ao fragmento de eiastase com a sequência de aminoáciucs Th r - Me c-Val -Ala-Gly-Gly-Asp-Ile -Arg, indí vi dualmente de forma específica ou em reacção cruzada.
3. 3. Processo segundo a reivindicação 2, caracterizado por os anticorpos utilizados serem obtidos mediante antígenos que :. "Xxseuai as elastases pancreáticas completas 1, 2 e 3 .soenzima) ou subunidades das mesmas, sendo que a sequência de miiincáciaos Thr-Met-Val -Ala-Gly-Gly-Asp-Ile-Arg não é utilizada como fragmento de eiastase, nem uma sequência parcial imunelogicamente eficaz da mesma.
4. 4. Processo segundo a reivindicação 3, caracterizado por, como antígenos, serem utilizados preferencialmente os péptidos unétj. tos que se seguem, os quais, após a imunização de ..;uxu, induzem anticorpos que reconhecem várias elastases, e que não se referem à sequência de amínoácidos Thr-Met- Vai-Âla - Giy-Gly-Asp-Ile~Arg: NK2-A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P-I-N-COOH NH2-Y-T-N-G-P-L-P-B-K-L-Q-Q-A-R-COOH ΗΠ2 - P - m - 3-C-N-G-D-S-G-G-W-Q- COOK .3.: m- imPumug-E-D-G-G-W-Q- COOH X h 2.....0 - T - E - A - G - R - N - S ~ W - P ~ S - Q - I - COOH WH2-H-N-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V-COOH WH2-W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A-COOH WH2-V-S-S-R-G-C-N-V-S-R-K-P-T-COOH 2hi2 - G-G-E-E-A--R-P-N-S-W-P-W-Q- COOH 22 i 2 - S- S- 3-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H-N - COOH MH 2 -K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D-COCH i22. ^ G-F-l-K-C-Q-A-S-D-G-R-W-COOK 2--_ 2-2,---2 - D - D - L - K - Q - G - R - L - COOH ..u_ r. _ - - t - 2' - 2. - 2 - u - S - Y - 2 - CCGH 22-2 - 2 - 2- 2-2 -T-R-R - K-P-T-V-F-T- COOH 03 anuicorpos serem utilizados individualmente ou em mua combinação em sistemas de identificação imunoquímicos. u - 1 - pune uporais o para a oboenção de anticorpos mcnoclonais e, ou que recaem de forma específica com elascases s humanas 1, 2 e 3 (isoenzimas) nas fezes ou fluídos e de serem induzidos mediante processos de imunização caracterizado por os péptidos A-V-K-E-G-P-E-Q-V-I-P- 1 ~rh Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R, R-S-G-C-N-G-D-S-G-G-P-^-M, G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q, G-T-E-A-G-R-N-S-W-P-S-Q-I, H-N-L- 2 - o -ue-o-o-T-E-Q-Y-V, W-G-K-T-K-T-N-G-Q-L-A, V-S-S-R-G-C-n-V-S-e. 2 2-2, G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q, S-S-S-R-T-Y-R-V-G-L-G-R-H- 2, ii - D - V-J - K - S - N - Q - I - S- K- G- N- D, G-P-L-N-C-Q-A-S-D-G-R-W; G- A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L, S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y, F-G-C-N-T-R-R- 12 -P-T-V-F-T ou péptidos parciais imunógenos, serem utilizados como antígenos para imunização de vertebrados, em especial de mamíferos pequenos e pássaros. 2Y Processo segunde a reivindicação 6, caracterizado por, se _-p_ c;_em us péptidos livres antes da imunização a substâncias p wi t. adoras adequadas, preferencialmente hemocíanína ou albumina . o. Processo segundo as reivindicações 6 e 7, caracterizado por de. os anticorpos policlonais serem produzidos mediante u utilização de galinhas como cobaias. Anticorpos policlonais, desde V' reivindicações de 6 a Q que tenham .ao produz 1, tu . .....^-.~_corpcs mcnocionais, desde que tenham sido produzidos s-.-a_.ozdo zz reivindicações de 6 e 7. is. Sistemas de limpeza e de detecção para os isoenzinzu ei astases pancreáticas 1, 2 e 3 humanas, caracterizados por .:· .uizeren pelo menos um dos anticorpos segundo o invento, de i no: o:m as reivindicações 5 e 10 . 1 _ . Ki cs de t zestes imunológicos, caracterizado por conter um cu vários antic orpos segunde as reivindicações 9 6 10 pai a aiaqnostico e controlo do desenvolvimento de doeu tas pancreáticas, mediante a .zação de fezes ou 1 1 ti _-dos corporais. . i. ... L ti UO testes imunológicos segundo a reivíndic ::açãc 01 , caracterizados por poderem ser utilizados 2 anticorpos distintos sandwich ELISA; . Ia . Sistemas de limpeza e detecção para anticorpos que cenharn sedo produzidos segundo uma das reivindicações S - 8, caracterizados por conterem um ou vários dos péptidos A-V-K-E-G- 1- E-Q-V-i-F-I-N, Y-T-N-G-P-L-P-D-K-L-Q-Q-A-R, R-S-G-C-N-G-D- G-G-P-L-N, G-P-L-N-C-P-T-E-D-G-G-W-Q, G - T - E - A - G - E - N - S - W - F - 3 -R-i-J-L-S-Q-N-D-G-T-E-Q-Y-V, W - G - K - T - K - T - N - G - Q - L - A, 7-3-3- R-G-C-N-V-S-R-K-P-T, G-G-E-E-A-R-P-N-S-W-P-W-Q, S-S-S-R-T-Y-R- Y-G-L-G-R-H-N, K-D-W-N-S-N-Q-I-S-K-G-N-D, G-P-L-N-C-Q-A-5-D- G-R-W, G-A-L-P-D-D-L-K-Q-G-R-L, S-L-Q-Y-E-K-S-G-S-F-Y.. F-G-C-K-T-R-R-K-P-T-V-F-T ou péptidos parciais imunógenos. o^ soi , — oe Dezembro de 2 0 06. Pela R _ -ente 0 Agente Giio_a_