DE19912798C1 - Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben - Google Patents
Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von GewebeprobenInfo
- Publication number
- DE19912798C1 DE19912798C1 DE19912798A DE19912798A DE19912798C1 DE 19912798 C1 DE19912798 C1 DE 19912798C1 DE 19912798 A DE19912798 A DE 19912798A DE 19912798 A DE19912798 A DE 19912798A DE 19912798 C1 DE19912798 C1 DE 19912798C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cutting
- tissue
- tissue sample
- cell culture
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Virology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Bei einem Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen für naturwissenschaftliche Reihenuntersuchungen wird eine in bezug auf Kontaminanten, Normalzellen und Tumorzellen heterogene Gewebeprobe in einem sequentiell-parallelen Schneidvorgang örtlich aufgelöst. Die ortsaufgelösten Probensegmente werden weiter geteilt, wobei die Gewebefragmente und -flüssigkeiten der Gewebesegmente separat in einem bestimmten Zellkulturmedium unter vorgegebenen Kulturbedingungen zum Wachstum gebracht werden. Es werden ein Zellkulturmedium sowie eine Vorrichtung zum Teilen der Gewebeprobe in Scheibensegmente angegeben. Mit dem Verfahren wird in Verbindung mit der Schneidvorrichtung und dem Kulturmedium bei allen Tumorarten eine schnelle Kultivierung von aus Humangewebe gewonnenen Krebszellen mit einer Angehrate von 100% erreicht.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von
Krebszellen aus Humangewebe für naturwissenschaftliche,
vorzugsweise molekularbiologische und zellbiologische
Reihenuntersuchungen sowie ein Zellkulturmedium zur
Durchführung des Verfahrens und eine Vorrichtung zur
Aufarbeitung der Gewebeproben.
Für molekularbiologische Untersuchungen, vor allem mit
prädiktiver Intention, ist die Kultur von primären, aus
Feinnadel- und Stanzbiopsien gewonnenem Zellmaterial von
zentraler Bedeutung. Bei den bekannten Methoden ist
jedoch die "Angehrate" der aus Humangewebe isolierten
Zellen sehr gering. Bei manchen Tumorarten ist eine
Zellkultivierung bisher nicht gelungen. Diese Problematik
ist zum einen dadurch begründet, daß die das Tumorgewebe
umgebenden Normalzellen und/oder die das Tumorgewebe
infiltrierenden Bindegewebszellen als erste wachsen und
so die Tumorzellen, die für die Untersuchungen gewonnen
werden sollen, überwachsen und am Wachstum hindern. Eine
erfolgreiche Kultivierung von Krebszellen wird darüber
hinaus durch vielfältige Kontaminationen, insbesondere
mit Bakterien oder Pilzen, verhindert.
Die bisher für die Kultivierung von Tumorzellen
verwendeten Zellkulturmedien, wie RPMI 1640, Basal Medium
Eagle, ISCOVE's, Medium 199, Leibovitz L-15. u. a., sind
nicht in der Lage, das Wachstum der Krebszellen in
ausreichendem Maße zu fördern bzw. das der Normalzellen
und bakteriellen Kontaminanten zu verhindern. Der bisher
übliche unkontrollierte Einsatz von Antibiotika wirkt
zwar den negativen Einflüssen der Kontaminanten entgegen,
behindert aber gleichzeitig das Wachstum der Tumorzellen.
Bei den bekannten Verfahren zur Kultivierung von
Krebszellen erfolgt die Aufbereitung der aus Feinnadel-
oder Stanzbiopsien gewonnenen Gewebeproben durch eine
mechanisch-enzymatische Gewebe-Disaggregation, bei der
der heterogene, aus verschiedenen Schichten bestehende,
die Gewebeprobe bildende Stanzzylinder durch eine
Feinzerkleinerung als Ganzes in eine breiige Masse
zerteilt und mit Hilfe von Enzymen in einzelne Zellen
umgewandelt werden soll. Durch diese Feinzerkleinerung
wird aber die heterogene Struktur der entnommenen
Gewebeprobe zerstört und es erfolgt eine intensive
Vermischung der Tumorzellen mit den Normalzellen und
Kontaminanten. Zum einen wird die Vitalität der
Tumorzellen durch die Feinzerkleinerung beeinträchtigt.
Andererseits ist durch die Zerstörung der Heterogenität
der Gewebeprobe der Probematerialbrei mit Normalzellen
und Kontaminanten durchsetzt, so daß das Wachstum der
Tumorzellen aus den oben genannten Gründen vermindert
oder sogar vollständig verhindert wird. Bei dieser Art
der mechanisch-enzymatischen Gewebe-Desaggregation des
Gesamtmaterials sind Aussagen über die Struktur des
Tumors nicht möglich.
Bei den bisher bekannten Verfahren zur Vermehrung und
Reinigung des aus einer Gewebeprobe gewonnenen
Tumormaterials wird die Zellvermehrung durch
Transplantation des Tumormaterials auf eine Nacktmaus
vorgenommen (Xeno-Transplantat). Bei diesem Verfahren
können zwar Angehraten des transplantierten Tumorgewebes
von 50% und gelegentlich auch mehr erreicht werden,
jedoch vergehen - je nach Tumorart und Eigenschaften -
mehrere Wochen oder gar Monate, ehe sich eine Zellver
mehrung in vivo einstellt. Aufgrund des erheblichen
Aufwands und der Zeitdauer haben Routinetests mit
patientenindividuellen Primärzellen für eine
Verlaufskontrolle und prädiktive Zwecke bisher nicht
Eingang in die klinische Anwendung gefunden. Aufgrund der
langwierigen und oftmals vergeblichen Versuche zur
Kultivierung des vom Patienten entnommenen Gewebe
materials liegen die Testergebnisse viel zu spät vor, um
in einem Routineverfahren aus den Versuchsergebnisse eine
rechtzeitige Änderung des Therapieregimes vornehmen zu
können. Neben dem hohen Zeitaufwand ist auch die
erforderliche Durchführung von Tierversuchen und der hohe
Kostenaufwand nachteilig.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein von
Tierversuchen unabhängiges Verfahren zur Kultivierung von
Krebszellen aus Humangewebeproben anzugeben, das in einem
vergleichsweise kurzen Zeitraum von wenigen Tagen eine
sichere Vermehrung von Tumorzellen aus einer Gewebeprobe
gewährleistet und reproduzierbare Aussagen über die
Struktur und die Malignität des Tumors sowie Wachstums-
und Strukturänderungen oder therapeutische Effekte
zuläßt. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der
Bereitstellung einer auf dem Verfahren beruhenden
Vorrichtung zur reproduzierbaren Aufbereitung von
Gewebeproben sowie einem geeigneten Zellkulturmedium zur
Vermehrung von Krebszellen in vitro.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit einem Verfahren zur
Kultivierung von Krebszellen gemäß den Merkmalen des
Patentanspruchs I gelöst.
Der Grundgedanke der Erfindung besteht dabei darin, daß
die Gewebeprobe in einem sequentiell-parallelen
Schneidvorgang in eine Mehrzahl separater Gewebesegmente
aufgeteilt wird und somit die auf der Grundlage von
Kontaminanten, Normalzellen und Tumorzellen heterogene
Gewebeprobe bzw. deren Heterogenität örtlich aufgelöst
wird. Die Gewebesegmente werden dann jeweils separat
weiter zerkleinert und die so gebildeten kleinen,
separierten Gewebefragmente und -flüssigkeiten sowie die
bei der sequentiell-parallelen Teilung der Gewebeprobe
entstandene, ebenfalls jeweils separat gewonnene
Gewebeflüssigkeit werden in einem spezifischen
Zellkulturmedium und unter ausgewählten Kulturbedingungen
kultiviert. Durch die örtliche Auflösung der Gewebeprobe
werden die Einflüsse von in dieser vorhandenen
Normalzellen, die bei üblicher - mechanischer oder
enzymatischer - Aufbereitung der Gewebeprobe ein
Überwachsen der Tumorzellen bewirken, ausgeschaltet oder
zurückgedrängt. Gleichermaßen wird das Ausmaß von
Kontaminationen, wie Pilze oder Bakterien, wesentlich
reduziert bzw. erforderliche Antibiotika, die die
Vermehrung von Tumorzellen bekanntermaßen stören, können
sparsam und gezielt eingesetzt werden, ohne sich auf die
Krebszellenkultivierung negativ auszuwirken.
Das vorgeschlagene Verfahren wird in weiterer Ausbildung
der Erfindung durch ein für sehr geringe Gewebemengen
geeignetes Zellkulturmedium in der im Anspruch 8
wiedergegebenen Zusammensetzung sowie durch die im
Anspruch 5 hinsichtlich der Sauerstoff- und
Kohlendioxidatmosphäre, der Luftfeuchte und der
Temperatur sowie der Verwendung einer Biomatrix
dargelegten Kultivierungsbedingungen vorteilhaft ergänzt.
Insgesamt werden somit Bedingungen geschaffen, unter
denen das Wachstum der Krebszellen gefördert und das der
Normalzellen und Kontaminanten wesentlich eingeschränkt
oder sogar vollständig ausgeschaltet wird.
Weitere vorteilhafte Verfahrensmerkmale ergeben sich aus
den Unteransprüchen. So wurde beispielsweise gefunden,
daß die Tumorzellen in Anwesenheit von Erythrozyten, die
unmittelbar von der Entnahmestelle der Gewebeprobe am
Patienten stammen, besonders schnell wachsen und eine
höhere "Angehrate" besitzen als Zellen, die nur im reinem
Zellkulturmedium zum Wachstum gebracht werden. Darüber
hinaus hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die
Gewebeprobe mindestens 2 Stunden, aber nicht länger als
24 Stunden, bei etwa 4°C bis 12°C in einem
Zellkulturmedium aufbewahrt wird, um bereits jetzt an
das Zellkulturmedium, in dem später die Vermehrung der
Krebszellen erfolgen soll, angepaßt zu werden. Unter den
aufgeführten Verfahrensbedingungen ist eine Adhäsion der
Tumorzellen aus den aufbereiteten Gewebefragmenten an
einer Biomatrix in der Zellkulturflasche bereits nach 1
bis 12 Stunden zu verzeichnen, sofern eine dem
Gewebeentnahmeart identische Kulturtemperatur eingestellt
wird.
Mit der vorliegenden und weiter unten in einem
Ausführungsbeipiel detailliert beschriebenen Erfindung
wird somit ein Verfahren zur Vermehrung von Tumorzellen
in vitro angegeben, mit dem in einem vergleichsweise
kurzen Zeitraum bei allen Tumorarten eine Kultivierung
von aus Humangewebe gewonnenen Zellen mit einer
"Angehrate" von 100% gelingt. Gegenüber der auf der
Nacktmaus (Xeno-Transplantat) erzielten Zellvermehrung,
bei der Angehraten von etwa 50% erzielt werden, werden
nicht nur Tierversuche vermieden und Kosten gespart,
sondern es ist auch eine drastische Verkürzung der für
die Vermehrung des Zellmaterials benötigten Zeit zu
verzeichnen, die gegenüber einem Zeitraum von mehreren
Wochen oder gar Monaten beim Tumorwachstum in vivo bei
dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren in der
Regel bei lediglich 1-10 Tagen liegt.
Dadurch ist es erstmals möglich, Routineuntersuchungen
für die Verlaufskontrolle von Krebserkrankungen und für
prädiktive Zwecke (Sensibilitätstest mit Strahlen,
Chemotherapie, Hyperthermie) oder zur Früherkennung von
Resistenzen zur Identifikation neuer Antikrebswirkstoffe,
als Ergänzung für zytologische oder histopathologische
Gewebebefunde und in der Grundlagenforschung auf einfache
und reproduzierbare Weise schnell und kostengünstig
durchzuführen.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung ist zur
erfindungsgemäß ortsaufgelösten Aufbereitung der
Gewebeprobe als entscheidende Voraussetzung für die
erfolgreiche Zellvermehrung eine Vorrichtung gemäß den
Merkmalen des Anspruchs 9 vorgesehen. Diese Vorrichtung
besteht zum einen aus einem Schneidapparat zum
sequentiell-parallelen Teilen der Gewebeprobe und zum
anderen aus einem Zerkleinerungsgerät zur weiteren
Aufarbeitung der mit dem Schneidapparat hergestellten
Gewebesegmente. Bei den in diesen Vorrichtungen
durchgeführten Schneidvorgängen werden die jeweiligen
Gewebestücke und -flüssigkeiten, die von verschiedenen
Stellen der heterogenen Gewebeprobe stammen, voneinander
getrennt in der Vorrichtung gehalten und können somit
selektiv für die Zellvermehrung eingesetzt werden.
Der Schneidapparat umfaßt im wesentlichen eine in Kammern
eingeteilte Auffangschale mit einer auf dieser beweglich
angebrachten Schneidplatte sowie einen
Schneidmesserrahmen. In der Schneidplatte in vorgegebenen
Abständen ausgebildete Schneidrinnen, die im
Schneidbereich zur Auffangschale hin offen sind, liegen
jeweils oberhalb einer Kammer. Im Schneidmesserrahmen
sind Schneidmesser oder Schneiddrähte in einem Abstand
angebracht, der mit dem zwischen den Schneidrinnen
übereinstimmt. Durch das Schneiden der auf der
Schneidplatte liegenden Gewebeprobe jeweils im Bereich
einer Schneidrinne wird ein sauberes Abtrennen der
Gewebesegmente erreicht, und gleichzeitig gelangen
Reststücke und Gewebeflüssigkeit in die unterhalb der
Schneidrinne liegende Kammer.
Zur weiteren Aufbereitung der Gewebesegmente ist ein
Zerkleinerungsgerät vorgesehen, das aus einer in Kammern
geteilten Flüssigkeits-Auffangschale, einer auf dieser
lösbar angebrachten Aufbereitungsplatte mit Vertiefungen
zur Aufnahme der Gewebesegmente und einzelnen oder in
einer Halteplatte drehbar und längsbeweglich angeordneten
Drehstempeln mit an deren Stirnseite befestigten Messern
besteht. Mit diesem Gerät werden die zur Zellvermehrung
letztlich eingesetzten kleinen Gewebefragmente erzeugt.
Die gleichfalls verwendbare, bei dem Schneidvorgang
entstehende Gewebeflüssigkeit gelangt über in den
Vertiefungen ausgebildete Löcher in die jeweils
darunterliegende Kammer in der Flüssigkeits-Auffangschale
und wird ebenfalls zur Zellvermehrung verwendet.
Weitere Merkmale und vorteilhafte Weiterbildungen der
erfindungsgemäßen Vorrichtung ergeben sich aus den
übrigen Unteransprüchen.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung wird nachfolgend
beschrieben, wobei hinsichtlich der Zellvermehrung in
vitro auf die beigefügte Tabelle, in der die
Zusammensetzung des verwendeten Zellkulturmediums
wiedergegeben ist, und hinsichtlich der Aufarbeitung der
Gewebeproben auf die beigefügte Zeichnung Bezug genommen
wird. In der Zeichnung zeigen:
Fig. 1
eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht einer
Schneidvorrichtung zur erfindungsgemäßen sequentiell
parallelen Aufbereitung einer Gewebeprobe;
Fig. 2
eine auseinandergezogene perspektivische Darstellung
einer Vorrichtung zur weiteren Aufbereitung der in der
Vorrichtung nach Fig. 1 hergestellten Gewebesegmente für
die Zellvermehrung in vitro;
Fig. 3
eine Schnittansicht einer Auffangschale längs der Linie
B-B in Fig. 1;
Fig. 4
einen senkrechten Schnitt durch eine Schneidplatte im
Bereich einer Schneidrinne längs der Linie A-A in Fig.
1; und
Fig. 5
eine Querschnittsansicht der Vorrichtung nach Fig. 2 in
zusammengebautem Zustand.
Die vom Patienten in Form einer Feinnadel- bzw. Stanz-
Biopsie entnommene Gewebeprobe liegt als
Gewebestanzzylinder vor, kann aber auch ein nach anderen
Verfahren gewonnenes kleines Gewebefragment oder ein
Gewebestück unterschiedlicher Form und Größe sein. Die
Gewebeprobe mit den an dieser haftenden, von der
Entnahmestelle der Probe am Patienten stammenden
Erythrozyten wird für den Transport zum Untersuchungsort
in einem Zellkulturmedium bei Temperaturen zwischen 2°C
und 12°C aufbewahrt, und zwar für einen Zeitraum von
mindestens 2 Stunden, maximal jedoch 24 Stunden. In
diesem Zeitraum werden mechanische Belastungen des
Gewebestücks vermieden. Das Gewebestück kann sich dabei
bereits an das auch zur Zellvermehrung später benutzte
Zellkulturmedium mit gleicher Zusammensetzung anpassen,
wobei die oben angegebenen Temperaturen besonders günstig
sind.
Die Aufarbeitung der Gewebeprobe für die Zellkultivierung
erfolgt mit den in der Zeichnung dargestellten
Vorrichtungen.
Die Vorrichtung zum sequentiell-parallelen Teilen der
Gewebeprobe in Abschnitte von bestimmter, vorgegebener
Länge und zum Separieren dieser Abschnitte bzw. von
Bestandteilen derselben umfaßt eine Auffangschale 1, eine
auf der Auffangschale 1 gehaltene Schneidplatte 2 und
einen Schneidmesserrahmen 3. Die Schneidplatte 2 ist in
fünf Abschnitte gleicher Breite eingeteilt. In jedem
Abschnitt befinden sich jeweils in unterschiedlichem
Abstand angeordnete Schneidrinnen 4, die in ihrem
mittleren Bereich zur Auffangsschale 1 hin offen sind.
Die Schneidrinnen 4 sind in den fünf Abschnitten jeweils
im Abstand von 1 mm, 2 mm, 3 mm, 5 mm und 1 mm
angeordnet. In Längsrichtung der Schneidplatte ist in
deren mittlerem Bereich eine aufgerauhte Auflagefläche 5
ausgebildet, um die darauf liegende Gewebeprobe 6 bei
einem Schneidvorgang zu fixieren. In diesem Bereich sind
die Schneidrinnen 4 nach unten offen. Die Schneidplatte 2
ist in zwei an den Längsseiten der Auffangschale 1
angebrachten Führungsschienen 7 verschiebbar gehalten.
Die Schneidrinnen 4 in der Schneidplatte 2 setzen sich in
Einschnitten 8 in den Führungsschienen fort.
Die Auffangschale 1 ist entsprechend den in der
Schneidplatte 2 vorgesehenen Rinnenabschnitten durch
Trennwände 12 in fünf Kammern 1a-1e geteilt, wobei den
Schneidrinnen durch weitere Zwischenwände in den
betreffenden Kammern 1a, 1b, 1c und 1e jeweils
Unterkammern 1a1 bis 1a9, 1b1 bis 1b4, 1c1 bis 1c3 und
1e1 bis 1e9 zugeordnet sind. Die Unterkammern sind zur
exakten örtlichen Zuordnung der einzelnen
Gewebeprobesegmente 6a oder Gewebeprobenreste bzw.
Gewebeflüssigkeit entsprechend unterschiedlich markiert.
Der Schneidmesserrahmen 3 besteht aus einem Deckel oder
Halterahmen mit an dessen Deckplatte befestigten
Schneidmessern 10. Anstelle der Schneidmesser 10 können
zwischen den Rahmenseiten auch Schneiddrähte gespannt
sein. Die Schneidmesser 10 sind im gleichen Abstand wie
die Schneidrinnen 4 in der Schneidplatte angeordnet. Der
Schneidmesserrahmen 3 ist so dimensioniert bzw. die
Schneidmesser 10 sind so angeordnet, daß die
Schneidelemente über bzw. in den Schneidrinnen 4 und
Einschnitten 8 hin- und herbewegt werden können. Der
Schneidmesserrahmen 3 kann an einer Längsseite der
Auffangschale 1 gelenkig befestigt sein, und zwar so, daß
er in der auf der Schneidplatte 2 befindlichen Lage
dennoch quer zur Gewebeprobe bewegt werden kann, um die
Probe an den Schnittstellen sauber zu durchtrennen.
In Abhängigkeit von der Länge der Gewebeprobe und dem
gewünschten Schnittabstand wird die Gewebeprobe 6 auf die
aufgerauhte Auflage 5 der Schneidplatte 2 gelegt. Durch
Hin- und Herbewegen des auf die Gewebeprobe gelegten
(geklappten) Schneidmesserrahmens 3 wird das Präparat im
Bereich der Schneidrinnen 4 durchtrennt. Beim Schneiden
entstehende Flüssigkeit fließt über die im Bereich der
Auflagefläche 5 der Schneidplatte 2 in den Schneidrinnen
4 vorgesehenen Öffnungen 4a in die jeweils darunter
liegende Unterkammer. Die aufgefangene Flüssigkeit kann
ebenso für die Zellvermehrung genutzt werden wie die
abgetrennten Probensegmente, die entweder auf der
Schneidplatte 2 liegenbleiben oder durch die Öffnung 4a
in der Schneidrinne 4 in die darunterliegende Unterkammer
fallen.
Mit der beschriebenen Vorrichtung gemäß den Fig. 1, 3
und 4 können in den vorgegebenen Abmessungen präzise und
gleichmäßige sowie glatte Schnitte ohne Beschädigung des
Probenmaterials reproduzierbar ausgeführt werden. Die
Zellvermehrung erfolgt somit aus einer entsprechend der
Heterogenität des dem Patienten entnommenen Gewebestücks
durch die Segmentierung örtlich aufgelösten Gewebeprobe.
Dadurch wird der störende Einfluß von Normalzellen und
Kontaminanten auf das Wachstum der Tumorzellen
zurückgedrängt bzw. ausgeschaltet (Selektion). Außerdem
kann auch die beim Schneiden der Gewebeprobe
ortsaufgelöst entstehende Gewebeflüssigkeit, die wichtige
Stammzellen enthält, für die Zellvermehrung genutzt
werden. Im Ergebnis der sich an die unten beschriebene
weitere Aufbereitung der Gewebeprobe anschließenden
Zellvermehrung in vitro können Aussagen über die Struktur
der heterogen ausgebildeten Gewebeprobe, über die
Anordnung des Tumorkerns oder die Malignität getroffen
werden. Schließlich ist die Herstellung der
Probensegmente mit der jeweiligen Ortsauflösung auch
reproduzierbar, so daß verläßliche Aussagen über den
Verlauf der Erkrankung oder die Wirkung therapeutischer
Maßnahmen getroffen werden können.
In einer Ausführungsvariante der oben beschriebenen
Schneidvorrichtung kann das Durchtrennen der Gewebeprobe
auch mit einem separaten Messerstempel (nicht
dargestellt) erfolgen, an dem die Schneidmesser oder
Schneiddrähte in einem Abstand angebracht sind, der mit
dem zwischen den Schneidrinnen 4 übereinstimmt.
In den Fig. 2 und 5 ist eine Vorichtung zur weiteren
Aufbereitung der ortsaufgelöst zur Verfügung gestellten
Probensegmente 6a oder von Reststücken wiedergegeben. Bei
dieser Vorrichtung ist eine Flüssigkeits-Auffangschale 13
durch senkrechte Trennwände 11 in mehrere Kammern 13a bis
13e aufgeteilt. In zwei am oberen Rand der Flüssigkeits-
Auffangschale 13 gegenüberliegend angebrachten
Führungsschienen 14 ist eine Aufbereitungsplatte 15 mit
in dieser im Abstand eingeformten Vertiefungen 16
gehalten. Die Vertiefungen 16 weisen am Boden kleine
Löcher 17 auf. In der in die Führungsschienen 14
vollständig eingeschobenen Lage der Aufbereitungsplatte
15 liegen die Vertiefungen 16 jeweils über einer Kammer
13a bis 13e. Die zuvor abgetrennten Probensegmente 6a der
Gewebeprobe 6 werden in die Vertiefungen 16 gelegt und
mit an einem Drehstempel 18 befestigten Drehstempelmesser
19 weiter zerkleinert. Vorzugsweise sind 2 oder mehrere
Drehstempelmesser 19 an der Stirnseite des Drehstempels
angeordnet. Das Zerkleinern der Probensegmente 6a erfolgt
bei leichtem Druck und gegebenenfalls gleichzeitigem Hin-
und Herdrehen des Drehstempels 18.
Wie Fig. 2 zeigt, können auch mehrere Drehstempel 18 in
einer Halteplatte 20 drehbeweglich und heb- und senkbar
gehalten sein. Der Abstand zwischen den Drehstempeln 18
entspricht dem der Vertiefungen 16 in der
Aufbereitungsplatte 15.
Nach der weiteren Teilung der Probensegmente 6a stehen
deren Teilstücke (Gewebefragmente) und die bei diesem
Trennvorgang entstehende Gewebeflüssigkeit, die über die
Löcher 17 in den Vertiefungen 16 in die Kammern 13a bis
13e gelangt, für die Zellvermehrung zur Verfügung.
Die in den Fig. 1 bis 5 dargestellten Vorrichtungen
zum ortsaufgelösten, sequentiell-parallelen Schneiden und
weiteren Aufbereiten der Gewebeprobe bestehen aus einem
bis 121°C beständigen, zur Behandlung im Autoklav
geeigneten Material, vorzugsweise Teflon, Metall oder
Plastik. Für die Schneidmesser wird vorzugsweise Glas
verwendet.
Die einzelnen Teilstücke und die jeweilige
Gewebeflüssigkeit der ortsaufgelöst hergestellten
Probensegmente 6a werden nun separat in einzelne, mit dem
gleichen Zellkulturmedium, in dem sich bereits die dem
Patienten entnommene Gewebeprobe 6 befand, gefüllte
Zellkulturflaschen eingebracht. Das verbleibende
Zellkulturmedium, in dem die Gewebeprobe nach der
Probenahme aufbewahrt wurde, wird ebenfalls in eine
Zellkulturflasche gefüllt. Die Zellkulturflaschen sind
jeweils mit einer Biomatrix, hier Collagen oder Polylysin
beschichtet. Die Zusammensetzung des hier für die
Zellvermehrung in vitro eingesetzten Zellkulturmediums
ist in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben:
Ca(NO3)2 | 50 mg/L |
CaCl2.2H2O | 132 mg/L |
Kcl | 400 mg/L |
MgSO4.7H2O | 150 mg/L |
NaCl | 400 mg/L |
NaHCO3 | 2100 mg/L |
Na2HPO4 | 400 mg/L |
L-Arginin.4HCl | 110 mg/L |
L-Asparagin (freie Base) | 38 mg/L |
L-Asparaginsäure | 23 mg/L |
L-Cystin | 31 mg/L |
L-Glutaminsäure | 25 mg/L |
L-Glutamin | 296 mg/L |
Glycin | 13 mg/L |
L-Histidin (freie Base) | 12 mg/L |
L-Hydroxyprolin | 10 mg/L |
L-Isoleucin | 38 mg/L |
L-Leucin | 38 mg/L |
L-Lysin.HCl | 35 mg/L |
L-Methionin | 12 mg/L |
L-Phenylalanin | 16 mg/L |
L-Prolin | 22 mg/L |
L-Serin | 26 mg/L |
L-Threonin | 22 mg/L |
L-Tryptophan | 5 mg/L |
L-Tyrosin | 19 mg/L |
L-Valin | 22 mg/L |
L-Alanin | 10 mg/L |
Biotin | 0,6 mg/L |
D-Ca-Pantothenat | 0,7 mg/L |
Cholinchlorid | 3,5 mg/L |
Folsäure | 1,0 mg/L |
i-Inositol | 35,9 mg/L |
Nicotinamid | 1,0 mg/L |
Pyridoxal.HCl | 1,0 mg/L |
Riboflavin | 20 µg/L |
Thiamin.HCl | 1,0 mg/L |
Para-Aminobenzoesäuure | 500 µg/L |
Vitamin B12 | 5 µg/L |
Niacin | 25 µg/L |
Ascorbinsäure | 50 µg/L |
Folinsäure | 6 µg/L |
Liponsäure | 21 µg/L |
Vitamin A (Acetat) | 100 µg/L |
Pyridoxin.HCl | 25 µg/L |
Niacinamid | 25 µg/L |
α-Tocopherolphosphat | 10 µg/L |
D-Glucose | 1750 mg/L |
Phenolrot | 7 mg/L |
Glutathion (reduziert) | 0,5 mg/L |
Na-Pyrovat | 1 mM |
Epidermaler Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor, EGF-rekombinant | 250 ng/L |
Fötales Rinderserum (FBS) | 12,5% |
Insulin vom Rind (Lyophilisat) | 8 mg/L (26 U/mg) |
Antibiotika nach Stand der Technik.
Die mit einer Biomatrix beschichteten Zellkulturflaschen
mit dem erfindungsgemäßen Zellkulturmedium und den in
diesem befindlichen, nach dem zuvor beschriebenen
Aufbereitungsverfahren hergestellten kleinen
Gewebefragmenten bzw. der Gewebeflüssigkeit werden
anschließend in einen Brutschrank eingebracht und dort
bei einer Temperatur zwischen 30°C und 36,5°C, einer
Sauerstoffatmosphäre von 0,01 bis 3%, einer
Kohlendioxidatmosphäre von 0,1 bis 5% und einer
Luftfeuchte von 100% aufbewahrt. Die genaue Temperatur
richtet sich nach der Temperatur, die bei der Entnahme
der Gewebeprobe gemessen wurde.
Bereits nach 1 bis 12 Stunden erfolgt eine Adhäsion der
Tumorzellen an das Biomatrixsubstrat in der
Zellkulturflasche. Etwa 24 Stunden nach der
Erstetablierung der Kultur wird nach erfolgter
Zelladhäsion das in den Zellkulturflaschen befindliche
Medium gegen ein frisches Zellkulturmedium, das die
gleiche Zusammensetzung wie das erste aufweist,
ausgetauscht. Weitere Medienwechsel werden - je nach
Präsenz von Kontaminanten - in der ersten Woche
durchgeführt. Nachdem die Tumorzellen nach einer
Ruhephase etabliert sind und sich vermehren, werden sie
in einem von Antibiotika freien Medium gehalten.
Daraufhin wird die Massenvermehrung initiiert.
Durch die oben beschriebene frühzeitige Teilung der
Gewebeprobe nach 2 bis 24 Stunden in separate
Gewebesegmente bzw. noch kleinere Gewebefragmente ist die
Wahrscheinlichkeit einer Kontamination und einer
Massenvermehrung von Kontaminanten in den Kulturflaschen
gering. Dennoch vereinzelt aufgefundene Kulturflaschen
mit hoher Kontaminationsbelastung werden verworfen. Bei
einer durch technische Fehler bedingten starken
Vermehrung von Normalzellen, die zu einem Überwachsen der
Tumorzellen führen, kann auch eine Magnetseparation
durchgeführt werden, woraufhin unter den oben angegebenen
Kulturbedingungen ein selektives Wachstum der malignen
Zellen gewährleistet ist.
1
Auffangschale
1
a1 bis
1
a10Unterkammern
1
b1 bis
1
b5Unterkammern
1
c1 bis
1
c3Unterkammern
1
d
1
e1 bis
1
e10Unterkammern
2
Schneidplatte
3
Schneidmesserrahmen
4
Schneidrinnen
4
aÖffnung in
4
5
Auflagefläche
6
Gewebeprobe
6
aProbensegment
7
Führungsschiene
8
Einschnitte
10
Schneidmesser/Schneiddrähte
11
Trennwand
12
Trennwand
13
Flüssigkeitsauffangschale
13
a bis
13
eKammern
14
Führungsschienen
15
Aufbereitungsplatte
16
Vertiefungen
17
Löcher
18
Drehstempel
19
Drehstempelmesser
20
Drehstempel-Halteplatte
Claims (16)
1. Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus
Humangewebe für molekularbiologische
Reihenuntersuchungen, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Gewebeprobe (6) auf der Grundlage ihrer
heterogenen Struktur in bezug auf Tumorzellen,
Normalzellen und Kontaminanten durch eine
sequentiell-parallele Teilung in Scheibensegmente
örtlich aufgelöst wird und die einzelnen
Gewebeprobensegmente separiert und weiter in
Gewebefragmente geteilt werden und die gewonnenen
kleinen, separierten Gewebefragmente und
Gewebeflüssigkeiten der ortsaufgelösten
Gewebeprobensegmente (6a) in einem bestimmten
Zellkulturmedium unter vorgegebenen Kulturbedingungen
selektiv zum Wachstum gebracht werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Gewebeprobe aus Feinnadel-, Aspirations- und
intraoperativem Biopsien oder einer Resektatprobe
gewonnen wird und zusammen mit den an der Gewebeprobe
haftenden Erythrozyten aus dem Bereich der
Entnahmestelle der Probe an dem betreffenden
Patienten vorübergehend in ein Zellkulturmedium
eingebracht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Zellkulturmedium zur zwischenzeitlichen
Aufbewahrung der frischen Gewebeprobe mit dem
Vermehrung der Tumorzellen vorgesehenen
Zellkulturmedium identisch ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe (6) zur Anpassung
an das Zellkulturmedium in diesem mindestens 2
Stunden, jedoch nicht länger als 24 Stunden bei einer
Temperatur zwischen 4°C und 12°C verbleibt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die aus den ortsaufgelösten
Gewebeprobensegmenten (6a) erzeugten Gewebefragmente
und -flüssigkeiten separat in mit einer Biomatrix
beschichteten und mit dem Zellkulturmedium gefüllten
Zellkulturflaschen unter einer Sauerstoffatmosphäre
von 0,01 bis 3% und einer Kohlendioxidatmosphäre von
0,1-5% sowie bei einer Luftfeuchte von 100% und
Temperaturen zwischen 30°C und 36,5°C kultiviert
werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß eine bestimmte Zeit nach der Erstetablierung der
Kultur und erfolgter Zelladhäsion das
Zellkulturmedium in der Kulturflasche gegen ein
neues, jedoch mit gleicher Zusammensetzung
ausgetauscht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß das Zellkulturmedium in Abhängigkeit von der
Präsenz von Kontaminanten, insbesondere Bakterien oder Pilze,
bei gleichbleibendem oder verringertem Anteil an
Antibiotika ausgetauscht wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß das Zellkulturmedium aus
anorganischen Salzen, nämlich
Ca(NO3)2 210-100 mg/L
CaCl2.2H2O 80-150 mg/L
Kcl 200-1000 mg/L
MgSO4.7H2O 200-700 mg/L
NaCl 3000-10000 mg/L
NaHCO3 1500-4000 mg/L
Na2HPO4 100-1000 mg/L;
Aminosäuren, nämlich
L-Arginin.4HCL 10-500 mg/L
L-Asparagin (freie Base) 10-500 mg/L
L-Asparaginsäure 10-500 mg/L
L-Cystin 10-500 mg/L
L-Glutaminsäure 10-500 mg/L
L-Glutamin 10-500 mg/L
Glycin 10-500 mg/L
L-Histidin (freie Base) 10-500 mg/L
L-Hydroxyprolin 10-500 mg/L
L-Isoleucin 10-500 mg/L
L-Leucin 10-500 mg/L
L-Lysin.HCL 10-500 mg/L
L-Methionin 10-500 mg/L
L-Phenylalanin 10-500 mg/L
L-Prolin 10-500 mg/L
L-Serin 10-500 mg/L
L-Threonin 10-500 mg/L
L-Tryptophan 10-400 mg/L
L-Tyrosin 10-500 mg/L
L-Valin 10-500 mg/L
L-Alanin 10-300 mg/L
Vitaminen, nämlich
Biotin 0,01-10 mg/L
D-Ca-Pantothenat 0,01-10 mg/L
Cholinchlorid 0,1-50 mg/L
Folsäure 0,01-10 mg/L
i-Inositol 0,1-100 mg/L
Nicotinamid 0,01-10 mg/L
Pyridoxal.HCL 0,01-10 mg/L
Riboflavin 0,1-100 µg/L
Thiamin.HCL 0,1-50 mg/L
Para-Aminobenzoesäure 1-1000 µg/L
Vitamin B12 1-1000 µg/L
Niacin 1-100 µg/L
Ascorbinsäure 1-5000 µg/L
Folinsäure 1-100 µg/L
Liponsäure 1-100 µg/L
Vitamin A (Acetat) 10-1000 µg/L
Pyridoxin.HCl 1-100 µg/L
Niacinamid 1-100 µg/L
α-Tocopherolphosphat 0-1000 µg/L
sowie
D-Glucose 100-5000 mg/L
Phenolrot 0,1-1000 mg/L
Glutathion (reduziert) 0,01-10 mg/L
Na-Pyruvat 0,1-50 nM
Epidermaler Wachstumsfaktor (Epidermal Growth Factor, EGF) -rekombinant 1-3000 ng/L
Fötales Rinderserum (FBS) Insulin vom Rind (Lyophilisat) 0,1-50 mg/L
und Antibiotika zusammengesetzt ist.
9. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach
Anspruch 1, zur ortsaufgelösten Aufbereitung der
Gewebeprobe, gekennzeichnet durch einen
Schneidapparat zum sequentiell-parallelen Zerteilen
der Gewebeprobe (6) in einzelne, voneinander
getrennte Gewebesegmente (6a) und der entsprechenden
Schnittstelle zugehöriger Gewebeflüssigkeit,
bestehend aus einer in Kammern mit Unterkammern (1a1
bis 1a10, 1b1 bis 1b5, 1c1 bis 1c3, 1d und 1e1 bis
1e10) aufgeteilten Auffangschale (1), einer auf
dieser lösbar gehaltenen Schneidplatte (2) mit zur
Auffangschale (1) hin teilweise offenen Schneidrinnen
(4) sowie einem Schneidmesserrahmen (3) für
Schneidmesser (10), wobei die Anordnung der
Schneidmesser (10) im Schneidmesserrahmen (3) mit der
der Schneidrinnen (4) in der Schneidplatte (2)
übereinstimmt und jeder Schneidrinne (4) eine sich
unter dieser befindenden einzelnen Unterkammer
zugeordnet ist; sowie ein Zerkleinerungsgerät zur
weiteren Aufbereitung der ortsaufgelösten
Gewebeprobensegmente (6a), die eine in Kammern (13a
bis 13e) aufgeteilte Flüssigkeits-Auffangschale (13),
eine auf dieser lösbar angebrachte
Aufbereitungsplatte (15) mit Vertiefungen (16) sowie
Drehstempel (18) mit Drehstempelmessern (19) umfaßt,
wobei die Vertiefungen (16) Löcher (17) aufweisen und
sich jeweils oberhalb einer Kammer (13a bis 13e)
befinden und die Drehstempel (18) den Vertiefungen
(16) zugeordnet sind.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Schneidplatte (2) eine senkrecht zu den
Schneidrinnen (4) verlaufende und mittig angeordnete
aufgerauhte Auflagefläche (5) zur stabilen Lagerung
der Gewebeprobe (6) aufweist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9 und 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die Schneidrinnen (4) im Bereich
der Auflagefläche (5) zu der darunterliegenden
Unterkammer hin offen sind, so daß beim Schneiden
gebildete Gewebeflüssigkeit oder Gewebestücke
getrennt in der jeweiligen Unterkammer aufgefangen
werden.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß die Breite der
Schneidrinnen (4) größer als die Stärke der
Schneidmesser (10) ist.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß die Schneidmesser (10) an
einer Deckplatte des Schneidmesserrahmens (3)
befestigt sind.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß die Schneidmesser (10)
in dem Schneidmesserrahmen (3) verspannte
Schneiddrähte bilden.
15. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Schneidplatte (2) und die Aufbereitungsplatte
(15) jeweils in Führungsschienen (7 bzw. 14) an der
Auffangsschale (1) bzw. der Flüssigkeits-
Auffangschale (13) gehalten sind, wobei in den
Führungsschienen (7) für die Schneidplatte (2) mit
den Schneidrinnen (4) fluchtende Einschnitte (8)
ausgebildet sind.
16. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Drehstempel (18) in Bohrungen einer
Drehstempel-Halteplatte (20) in senkrechter Richtung
bewegbar sowie drehbar angeordnet sind.
Priority Applications (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19912798A DE19912798C1 (de) | 1999-03-10 | 1999-03-10 | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben |
AT00920340T ATE312168T1 (de) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
US09/914,662 US7393685B1 (en) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Method for cultivating cancer cells from human tissue and device for preparing tissue samples |
JP2000603351A JP2002537829A (ja) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | ヒト組織からとれる癌細胞の培養方法および組織サンプルの製造装置 |
EP00920340A EP1165753B1 (de) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
HU0302796A HUP0302796A3 (en) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Method for cultivating cancer cells from human tissue and device for preparing tissue samples |
KR10-2001-7011262A KR100496778B1 (ko) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | 인체 조직으로부터의 암 세포 배양 방법 및 조직 시료분리 장치 |
AU40986/00A AU4098600A (en) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Method for cultivating cancer cells from human tissue and device for preparing tissue samples |
PCT/DE2000/000528 WO2000053728A2 (de) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
CNB008047375A CN1249223C (zh) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | 培养来自人体组织的癌细胞的方法和制备组织样品的装置 |
DE50011820T DE50011820D1 (de) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19912798A DE19912798C1 (de) | 1999-03-10 | 1999-03-10 | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19912798C1 true DE19912798C1 (de) | 2000-02-17 |
Family
ID=7901907
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19912798A Expired - Fee Related DE19912798C1 (de) | 1999-03-10 | 1999-03-10 | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben |
DE50011820T Expired - Lifetime DE50011820D1 (de) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE50011820T Expired - Lifetime DE50011820D1 (de) | 1999-03-10 | 2000-02-18 | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7393685B1 (de) |
EP (1) | EP1165753B1 (de) |
JP (1) | JP2002537829A (de) |
KR (1) | KR100496778B1 (de) |
CN (1) | CN1249223C (de) |
AT (1) | ATE312168T1 (de) |
AU (1) | AU4098600A (de) |
DE (2) | DE19912798C1 (de) |
HU (1) | HUP0302796A3 (de) |
WO (1) | WO2000053728A2 (de) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000053728A2 (de) * | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Magforce Applications Gmbh | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
DE10136722A1 (de) * | 2001-07-27 | 2003-02-13 | Evotec Ag | Verfahren zur Verhinderung der Adhäsion von Partikeln |
WO2006105777A1 (de) * | 2005-04-07 | 2006-10-12 | Medizinische Hochschule Hannover | Verfahren zum erhalt von primärkulturtumorzellen aus tumorgewebe, insbesondere mammakarzinom, primärkulturtumorzellen und deren verwendung |
DE102005042262B3 (de) * | 2005-09-05 | 2006-12-21 | Hirt Zerspanungstechnik Gmbh | Vorrichtung zur Bearbeitung schneidfähiger Proben |
EP1931987A1 (de) * | 2005-08-24 | 2008-06-18 | Hepahope Inc. | Neue verbesserte verfahren zum testen und screening von wirkstoffen unter verwendung von menschlichem gewebe |
DE102009022349A1 (de) * | 2009-05-15 | 2010-12-02 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Automatisches Trennen von Gewebeschichten |
EP2266544A2 (de) | 2005-08-19 | 2010-12-29 | MagForce Nanotechnologies AG | Verfahren zur Einschleusung von therapeutischen Substanzen in Zellen |
EP2269664A2 (de) | 2007-01-21 | 2011-01-05 | Hemoteq AG | Medizinprodukt zur Behandlung von Verschlüssen von Körperdurchgängen und zur Prävention drohender Wiederverschlüsse |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2002950713A0 (en) | 2002-08-09 | 2002-09-12 | Vital Health Sciences Pty Ltd | Carrier |
ES2557475T3 (es) | 2005-06-17 | 2016-01-26 | Vital Health Sciences Pty Ltd. | Un portador que comprende uno o más derivados di- y/o monofosfato de agentes de transferencia de electrones |
US9192697B2 (en) | 2007-07-03 | 2015-11-24 | Hemoteq Ag | Balloon catheter for treating stenosis of body passages and for preventing threatening restenosis |
ES2550634T3 (es) | 2009-07-10 | 2015-11-11 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Uso de nanocristales para un balón de suministro de fármaco |
WO2011008393A2 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Nucleation of drug delivery balloons to provide improved crystal size and density |
WO2011081712A1 (en) * | 2009-12-31 | 2011-07-07 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Cryo activated drug delivery and cutting balloons |
AU2011213557B2 (en) | 2010-02-05 | 2015-05-07 | Phosphagenics Limited | Carrier comprising non-neutralised tocopheryl phosphate |
MX2012011355A (es) | 2010-03-30 | 2012-11-30 | Phosphagenics Ltd | Parche de suministro transdermico. |
US8889211B2 (en) | 2010-09-02 | 2014-11-18 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Coating process for drug delivery balloons using heat-induced rewrap memory |
US9561243B2 (en) | 2011-03-15 | 2017-02-07 | Phosphagenics Limited | Composition comprising non-neutralised tocol phosphate and a vitamin A compound |
US8669360B2 (en) | 2011-08-05 | 2014-03-11 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Methods of converting amorphous drug substance into crystalline form |
WO2013028208A1 (en) | 2011-08-25 | 2013-02-28 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Medical device with crystalline drug coating |
KR101284708B1 (ko) | 2011-10-26 | 2013-07-16 | 주식회사 마이크로이즈 | 생체 조직 절단 장치 |
WO2017009800A1 (en) * | 2015-07-16 | 2017-01-19 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Device for high- throughput sample slicing and characterization |
CA3007587C (en) | 2015-12-09 | 2023-12-05 | Phosphagenics Limited | Pharmaceutical formulation |
EP3524957B1 (de) * | 2016-10-07 | 2022-08-24 | Umihira Co., Ltd. | Gewebeteilungsvorrichtung |
WO2018112512A1 (en) | 2016-12-21 | 2018-06-28 | Phosphagenics Limited | Process |
CN106556526B (zh) * | 2017-01-04 | 2024-02-23 | 志诺维思(北京)基因科技有限公司 | 肿瘤组织三维空间取样器及其取样方法 |
JP6877714B2 (ja) * | 2017-07-25 | 2021-05-26 | 公立大学法人福島県立医科大学 | 組織細切器及び組織細切方法 |
CN110335278B (zh) * | 2019-05-16 | 2023-02-28 | 陕西师范大学 | 一种量化肿瘤微环境的胶质方向特征的方法 |
CN111103280A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-05-05 | 河北博海生物工程开发有限公司 | 一种检测抗胰岛素自身抗体的试纸条及其制备方法 |
EP4132716A4 (de) * | 2020-04-06 | 2024-07-17 | Univ Miami | Vorrichtung und verfahren zur gewebeverarbeitung |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991017240A1 (en) * | 1990-05-07 | 1991-11-14 | Baxter Diagnostics Inc. | Method and apparatus for conducting the cytotoxicity assays on tumor cells |
DE4334281A1 (de) * | 1993-10-08 | 1995-04-13 | Dornhan Maschf Gmbh | Druck- und Förderschnecke für Fleischwölfe |
JPH07218398A (ja) * | 1994-01-31 | 1995-08-18 | Seitai Kagaku Kenkyusho:Kk | 生物組織試料作成方法および器具 |
JPH09501324A (ja) | 1994-03-11 | 1997-02-10 | バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド | 細胞保持用の溝を備えた貫流バイオリアクター |
AU730222B2 (en) * | 1995-12-21 | 2001-03-01 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Improved immortalized human skin cell lines and novel serum-free medium useful for the production thereof |
US6033674A (en) | 1995-12-28 | 2000-03-07 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of treating cancer with a tumor cell line having modified cytokine expression |
US5728541A (en) * | 1996-07-12 | 1998-03-17 | Precision Therapeutics, Inc. | Method for preparing cell cultures from biologial specimens for chemotherapeutic and other assays |
CA2330628A1 (en) * | 1998-05-01 | 1999-11-11 | Queen's University At Kingston | Method for diagnosing a vascular condition |
DE19912798C1 (de) * | 1999-03-10 | 2000-02-17 | Andreas Jordan | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben |
-
1999
- 1999-03-10 DE DE19912798A patent/DE19912798C1/de not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-18 CN CNB008047375A patent/CN1249223C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-18 WO PCT/DE2000/000528 patent/WO2000053728A2/de active IP Right Grant
- 2000-02-18 KR KR10-2001-7011262A patent/KR100496778B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-02-18 AU AU40986/00A patent/AU4098600A/en not_active Abandoned
- 2000-02-18 DE DE50011820T patent/DE50011820D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-02-18 HU HU0302796A patent/HUP0302796A3/hu unknown
- 2000-02-18 AT AT00920340T patent/ATE312168T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-02-18 US US09/914,662 patent/US7393685B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-02-18 JP JP2000603351A patent/JP2002537829A/ja active Pending
- 2000-02-18 EP EP00920340A patent/EP1165753B1/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
CA 120:320383 * |
Cited By (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000053728A3 (de) * | 1999-03-10 | 2001-04-19 | Andreas Jordan | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
WO2000053728A2 (de) * | 1999-03-10 | 2000-09-14 | Magforce Applications Gmbh | Verfahren zur kultivierung von krebszellen aus humangewebe und vorrichtung zur aufbereitung von gewebeproben |
US7393685B1 (en) | 1999-03-10 | 2008-07-01 | Magforce Applications Gmbh | Method for cultivating cancer cells from human tissue and device for preparing tissue samples |
DE10136722A1 (de) * | 2001-07-27 | 2003-02-13 | Evotec Ag | Verfahren zur Verhinderung der Adhäsion von Partikeln |
US7300793B2 (en) | 2001-07-27 | 2007-11-27 | Evotec Technologies Gmbh | Method for preventing the adhesion of particles |
WO2006105777A1 (de) * | 2005-04-07 | 2006-10-12 | Medizinische Hochschule Hannover | Verfahren zum erhalt von primärkulturtumorzellen aus tumorgewebe, insbesondere mammakarzinom, primärkulturtumorzellen und deren verwendung |
EP2266544A2 (de) | 2005-08-19 | 2010-12-29 | MagForce Nanotechnologies AG | Verfahren zur Einschleusung von therapeutischen Substanzen in Zellen |
DE102005039579B4 (de) | 2005-08-19 | 2022-06-30 | Magforce Ag | Verfahren zur Einschleusung von therapeutischen Substanzen in Zellen |
US9827312B2 (en) | 2005-08-19 | 2017-11-28 | Magforce Ag | Method for carrying therapeutic substances into cells |
EP1931987A1 (de) * | 2005-08-24 | 2008-06-18 | Hepahope Inc. | Neue verbesserte verfahren zum testen und screening von wirkstoffen unter verwendung von menschlichem gewebe |
EP1931987A4 (de) * | 2005-08-24 | 2009-03-18 | Hepahope Inc | Neue verbesserte verfahren zum testen und screening von wirkstoffen unter verwendung von menschlichem gewebe |
DE102005042262B3 (de) * | 2005-09-05 | 2006-12-21 | Hirt Zerspanungstechnik Gmbh | Vorrichtung zur Bearbeitung schneidfähiger Proben |
EP2269664A2 (de) | 2007-01-21 | 2011-01-05 | Hemoteq AG | Medizinprodukt zur Behandlung von Verschlüssen von Körperdurchgängen und zur Prävention drohender Wiederverschlüsse |
DE102009022349A1 (de) * | 2009-05-15 | 2010-12-02 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Automatisches Trennen von Gewebeschichten |
DE102009022349B4 (de) * | 2009-05-15 | 2011-02-03 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Automatisches Trennen von Gewebeschichten |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1249223C (zh) | 2006-04-05 |
WO2000053728A3 (de) | 2001-04-19 |
US7393685B1 (en) | 2008-07-01 |
KR100496778B1 (ko) | 2005-06-22 |
ATE312168T1 (de) | 2005-12-15 |
EP1165753B1 (de) | 2005-12-07 |
WO2000053728A2 (de) | 2000-09-14 |
KR20020013507A (ko) | 2002-02-20 |
AU4098600A (en) | 2000-09-28 |
HUP0302796A3 (en) | 2004-08-30 |
CN1351655A (zh) | 2002-05-29 |
HUP0302796A2 (hu) | 2003-11-28 |
EP1165753A2 (de) | 2002-01-02 |
JP2002537829A (ja) | 2002-11-12 |
DE50011820D1 (de) | 2006-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE19912798C1 (de) | Verfahren zur Kultivierung von Krebszellen aus Humangewebe und Vorrichtung zur Aufbereitung von Gewebeproben | |
EP3506733B1 (de) | Anzucht- und probennahme-verfahren | |
Wani et al. | Effect of different factors on the recovery rate of oocytes for in vitro maturation and in vitro fertilisation procedures in sheep | |
EP1247085B1 (de) | Verfahren zur herstellung von materialblöcken mit einer vielzahl von zu untersuchenden proben | |
EP1910517A2 (de) | Verfahren zur isolierung von stammzellen aus kryokonserviertem zahngewebe | |
DE102013112604A1 (de) | Einrichtung und Verfahren zum Schneiden von Bioproben und Zellbeobachtungs-Verfahren | |
Zhang et al. | Cell cycle synchronization of embryonic stem cells: effect of serum deprivation on the differentiation of embryonic bodies in vitro | |
DE69530440T2 (de) | Verfahren zur Induktionskultur von zytotoxischen T Lymphozyten mit tumorzelltötender Aktivität | |
CN108291200A (zh) | 基质细胞用于制备微毛囊的用途 | |
Schiavone | Microamputation of somatic embryos of the domestic carrot reveals apical control of axis elongation and root regeneration | |
EP3198005B1 (de) | Verfahren zur in-vitro-oozytenentwicklung | |
DE10208311B4 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Kultivierung von Gewebezellen | |
DE102008039812A1 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Kultivierung von adhärenten Zellen | |
Church et al. | Preparation of Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures Using the Membrane-Interface Method | |
EP1581613B1 (de) | Verfahren zur behandlung von zellkulturen | |
DE102014003432B3 (de) | Verfahren zum Testen neuroaktiver Substanzen | |
WO2008155072A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur bildung von aggregaten biologischer zellen | |
El-Sharawy et al. | Comparison of harvesting techniques and corpus luteum bearing on recovery and quality of sheep oocytes | |
Clua Obradó et al. | P-220 “Blame it on my youth”: when very young age appears to be associated with poorer embryo development in oocyte donors | |
CN101339104B (zh) | 用于对细胞进行损伤处理的机械损伤器 | |
WO2023247007A1 (de) | Vorrichtung und verfahren zur erzeugung von organoiden sowie zellkultur | |
DE10109290C2 (de) | Zellzüchtungsvorrichtung für die Züchtung und Analyse der Zellen | |
Buckley et al. | A simple method for culturing chick embryo liver and kidney parenchymal cells for microscopic studies | |
ROBERTSON et al. | BEAT H. GÄHWILER | |
Hulshof et al. | The effect of inhibitors on bovine oocyte maturation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8100 | Publication of patent without earlier publication of application | ||
D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: MAGFORCE APPLICATIONS GMBH, 14050 BERLIN, DE |
|
8381 | Inventor (new situation) |
Free format text: JORDAN, ANDREAS, DR.RER.NAT., 14167 BERLIN, DE |
|
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: MAGFORCE NANOTECHNOLOGIES AG, 14050 BERLIN, DE |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |