KR20020013507A - 인체 조직으로부터의 암 세포 배양 방법 및 조직 시료분리 장치 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
본 발명은 종양 세포, 정상 세포 및, 오염물과 관련하여 불균질한 조직 시료를 순차적인 평행 절단에 의해 국소적으로 분리하는, 과학적인 일련의 분석을 위한 암세포 배양 방법에 관한 것이다. 국소적으로 분리된 시료 분절(segment)은 더욱 분리되며, 여기서 조직 절편(fragment) 및 위의 조직 분절 중의 체액은 소정의 세포 배양 배지 중에 개별적으로 위치되며 소정의 배양 조건 하에서 증식된다. 또한, 본 발명은 세포 배양 배지 및 조직 시료를 디스크상 분절로 절단하는 장치에 관한 것이다. 위의 절단 장치 및 배양 배지와 조합되는 이 발명적인 방법은 인체 조직으로부터 얻어지는 암 세포를 모든 유형의 종양에 있어 100%의 증식률로 신속하게 배양할 수 있게 해 준다.
도면부호 목록
1 : 수집팬
1a1 내지 1a10 : 부속 체임버
1b1 내지 1b5 : 부속 체임버
1c1 내지 1c3 : 부속 체임버
1d : 부속 체임버
1e1 내지 1e10 : 부속 체임버
2 : 절단판
3 : 절단 블레이드 프레임
4 : 절단홈
4a : 4 중의 홀
5 : 지지 표면
6 : 조직 시료
6a : 시료 분절
7 : 안내 레일
8 : 오목부
10 : 절단칼/와이어
11 : 격벽
12 : 격벽
13 : 체액 수집팬
13a 내지 13e : 체임버
14 : 안내 레일
15 : 분리용판
16 : 오목부
17 : 홀
18 : 회전식 플런저
19 : 플런저칼날
20 : 플런저 베이스판
Description
미세 바늘 또는 펀치 생검(punch biopsy)에 의해 얻어지는 1차 세포물의 배양은 특히 예측 의도를 갖고 수행되는 경우의 분자생물학적 스크린닝에 있어서는 지극히 중요하다. 그러나, 인체 조직으로부터 분리된 세포의 "성공적인 증식" 속도는 공지의 방법으로는 매우 느리다. 그리고, 몇몇 유형의 종양에 대해서는, 세포 배양은 완전히 실패하고 있다. 이 문제에 대한 한가지 이유는, 종양 조직을 에워싸고 있는 정상 세포들 및/또는 종양 조직으로 침윤되어 있는 결합 조직 세포들이 1차적으로 증식하며 따라서 실험을 위해 분리하고자 하는 종양 세포를 능가하여 증식해서 종양 세포의 증식을 억제한다는 것이다. 이 외에, 암 세포의 성공적인 증식은 다양한 오염물, 특히 세균이나 진균에 의해 억제된다.
RPMI 1640, 이글 기초배지, ISCOVE's, 배지 199, Leibovitz L-15 등과 같은종양 세포 배양용으로 사용되고 있는 배지는 정상 세포 및 세균 오염체의 증식은 억제하면서 암 세포의 증식은 적절히 향상시키지는 못한다. 항생제의 통상적인 비제어식 적용은 이러한 불리한 영향에 대항하게 되나 또한 종양 세포의 증식을 제한하게 된다.
암 세포 배양을 위한 공지의 방법에 따르면, 미세 바늘 또는 펀치 생검 으로 얻어지는 조직 시료는 펀칭 실린더 내의 불균질성의(heterogeneous) 다층으로 된 내용물을 펄프질의 매스로 미세하게 마쇄하고 효소를 사용하여 개개의 세포로 변환시키는 기계적 및 효소적 조직 분리법을 이용하여 준비된다. 그러나, 이러한 미세 마쇄는 취해진 조직 시료의 불균질한 구조를 파괴하며, 종양 세포는 정상 세포 및 오염물과 극도로 상호 혼합된다. 한편, 미세 마쇄는 종양 세포의 생존 가능성을 손상시킨다. 다른 한편으로, 조직 시료의 불균질성의 파괴는 정상 세포 및 오염물과 펄프질 시료물을 혼합시키며, 종양 세포의 증식은 감소되고 심지어 상기한 바와 같은 이유로 정지된다. 전체 물질에 대한 이러한 유형의 기계적 및 효소적 분리는 종양의 구성에 대한 어떠한 정보도 제공하지 못한다.
시료 조직으로부터 얻어지는 종양 물질을 증폭시키고 정제하는 공지의 방법에 따르면, 세포들은 누드 마우스(외래 이식)에 종양 물질을 이식하는 것에 의해서 증폭될 수 있다. 이 방법은 50%의 성공적인 증식 속도로 귀결되거나 또는 이식된 종양 조직에 대해 더 높은 증식 속도를 나타내게 되나, 종양의 유형 및 특성에 따라서는 체내 세포 증식이 시작되기에 앞서 수 주 또는 심지어 몇 달이 소요된다. 증식에 막대한 노력이 수반되며 장시간이 소요된다는 것은 환자에 특이적인 1차 세포를 이용한 통상적인 시험이 병세의 진전 체크 및 예측적인 목적의 표준 임상학적 프랙티스가 되지 못하게 한다. 환자로부터 취해진 조직의 배양이 지리하고 실패할 수 있음에 따라, 시험 결과가 나온다 하더라도 그것은 통상적인 시험 절차에 기초한 치료 요법을 적기에 변경하기에는 너무 때 늦은 것이 된다. 시험에 장시간이 소요된다는 것 이외의 단점은 동물 실험 및 이에 많은 비용이 소요된다는 것이다.
본 발명은 과학적인, 가장 바람직하게는 분자생물학적 및 세포생물학적 매스 스크린닝을 위한 인체 조직으로부터의 암 세포 배양 방법 뿐만 아니라, 이 방법을 수행하기 위한 세포 배양 배지와, 조직 시료 분리 장치에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 실험실 동물에 의존적이지 않은 인체 조직 시료로부터의 암 세포 배양 방법을 제공하는 것이며, 본 발명의 방법에 따르면, 상대적으로 짧은 수 일의 기간 내에 조직 시료로부터의 종양 세포 증식을 확실히 보장하며, 종양의 구성 및 악성도에 관해서, 그리고 그 증식, 구성 또는 치료 효과에 있어서의 변화에 관해 재현 가능한 언급을 용이하게 한다. 본 발명의 다른 목적은 암 세포의 시험관 내 증식을 위한 적당한 배지와 조직 시료의 재현 가능한 이러한 준비 방법에 기초한 장치를 제공하기 위한 것이다.
상기한 목적은 청구항 제1항에 명기한 특성을 갖는 암 세포의 배양 방법에 의해 본 발명에 따라 해소된다.
본 발명의 일반적인 개념은 조직 시료를 순차적이고 평행한 절단 과정을 통하여 다수의 개별적인 조직 분절(segment)로 잘라 나누고, 그에 의해 조직 시료의 불균질한 특성, 즉 오염물, 정상 세포 및, 종양 세포의 조성별로 국소적으로 분리하는 것이다. 이어서 각각의 조직 분절은 개별적으로 마쇄되며, 이러한 방식으로 형성되는 분리된 작은 조직 절편(fragment) 및 체액 뿐만 아니라, 조직 시료의 순차적이고 평행한 절단 중에 별도로 얻어지는 조직액은 선정된 배양 조건하에 특수한 배지 중에서 배양된다. 조직 시료의 이러한 국소적 분리는 그 중에 포함된 정상 세포에 의한 영향을 제거 또는 감소시키며, 조직 시료에 대한 종래의 기계적 및 효소적 준비로 종양 세포가 과도 증식(overgrow)될 수 있다. 진균 또는 세균과 같은 오염물의 양은 상당히 감소되며, 종양 세포 증식을 저해하는 것으로 알려진 항생제는 암 세포 배양에 대한 부정적인 영향을 나타내는 일 없이 보다 절약적이고 제휴적인 방식으로 사용될 수 있다.
상기한 제안 방법은, 제8항에 기재된 바와 같이 구성된 극소량의 조직에 적합한 배지에 의해서, 그리고 제5항에 특정된 바와 같은 산소 및 탄소 분위기, 습도 및 온도와 같은 배양 조건에 의해 보완하는 것이 본 발명의 더욱 완전한 완성을 위해 유리하다. 따라서, 이러한 완전한 세트의 조건은 암 세포의 증식을 향상시키며 정상 세포 및 오염물의 증식을 상당히 감소시키거나 또는 심지어 제거하게 된다.
상기한 방법의 다른 유리한 특징은 종속항들에 개시(開示)되어 있다. 예컨대, 종양 세포는 조직 시료가 환자로부터 수집된 곳으로부터 직접 유래하는 적혈구의 존재 하에 특히 빠르게 증식하며, 따라서 순수한 배지 중에서 증식하는 세포 보다 더 높은 "성공적인 증식" 속도를 나타내는 것으로 판명되었다. 더욱이, 암 세포가 후에 증식하게 될 배양 배지에 적응하도록, 4℃∼12℃의 온도 범위에서 배지 중에 최소 2시간, 그러나 24시간 이하 동안 조직 시료를 보관하는 것이 유용한 것으로 입증되었다. 상기한 방법 조건 하에, 준비된 조직 절편으로부터의 종양 세포는 배양 온도가 조직 채취 부위의 온도와 유사하게 설정된다면 1 내지 12 시간 경과만큼이나 신속하게 배양병의 바이오매트릭스에 달라 붙는다.
이하의 일구체예를 통하여 더욱 상세히 기재한 본 발명의 방법을 이용하면, 종양 세포는 상대적으로 단시간 내에 체 외에서(in vitro) 증식될 수 있으며, 인체 조직으로부터 얻어지는 세포의 배양은 100%의 "성공적인 증식"율을 나타낸다. 약 50%의 성공적인 증식율을 나타내는 누드 마우스(외래 이식)에서 달성되는 세포 증식과 비교하여, 본 발명의 방법은 동물 실험을 회피할 수 있어서 비용을 절감할 수 있을 뿐만 아니라, 생체 내 종양 증식에 수 주일 또는 심지어 몇 달 걸리던 기간을 전형적으로 1 내지 10일 정도로 단축시키므로 세포물 증식에 소요되는 시간을 극적으로 단축시킨다.
따라서, 암성 질환의 진전 조사, 그리고 예단적인 목적(방사능 감수성 시험 또는 화학요법이나 고열치료법에 대한 감수성 시험) 또는 새로운 항암제를 분리하기 위한 내성의 조기 검출, 세포학적 또는 조직병리학적 발견의 보완, 그리고 단순하고 재현가능한 방식으로의 기초 조사 등에 대한 신속하고도 비용 효율적인 정례적인 검사가 가능하게 된다.
본 발명의 또 다른 특징에 따르면, 제9항에 특정한 바와 같은 본 발명의 조직 시료 분리 장치가 성공적인 세포 증식을 위한 결정적인 사전 전제조건으로서 제공된다. 이 장치는 조직 시료의 순차적인 평행 절단을 위한 절단 유니트와 상기한 절단 구성 요소에 의해 생성되는 조직 분절을 더욱 분리하기 위한 마쇄 유니트로 이루어진다. 이들 유니트 내에서 수행되는 절단 방법은 상기한 장치 내에서 분리되는 불균질한 조직 시료의 다양한 부분들로부터 유래하는 체액 및 각각의 조직편을 그대로 유지하며, 그리하여 이들이 세포 증식을 위해 선택적으로 사용될 수 있게 한다.
상기한 절단 유니트는 그 상단에 가요적(可撓的)으로 장착되는 절단판을 갖는 체임버들로 나뉘어지는 수집팬과 절단 블레이드 프레임으로 구성된다. 한정된 공간을 두고 절단판에 설치되는 절단홈은 수집팬을 향하여 개방되어 있으며, 각각은 체임버의 상단에 위치한다. 절단 블레이드 프레임은 상기한 절단홈들 사이에 상응하는 간격을 두고서 설치되는 절단칼 또는 와이어를 포함한다. 절단판 상에 놓여있는 조직 시료가 절단홈 영역 내에서 절단될 때, 잔류 조각 및 체액가 절단홈 하방의 체임버 내에 수집되면서 조직 분절은 원활하게 분리된다.
마쇄 유니트는 조직 분절을 더욱 분리하기 위하여 제공되며, 체임버들로 나뉘어져 있는 체액 수집팬, 상기한 팬의 상단에 착탈 가능하게 장착되며 조직 분절을 유지하기 위한 공동부를 갖는 분리용판과, 종방향으로의 이동 및 회전 가능하게 베이스판에 장착되거나 개별적으로 장착되며, 그 앞쪽에 칼들을 포함하는 회전식 플런저로 이루어진다. 이 유니트는 세포 배양을 위해 최종적으로 사용되는 작은 조직 절편을 생성하도록 사용된다. 절단에 의해 생겨나는 조직 체액도 세포 배양에 사용될 수 있다; 체액는 공동부 내의 홀을 통하여 각각의 공동부 아래에 위치하는 체액 수집팬의 체임버 내로 흐르게 된다.
본 발명에 따른 장치의 다른 특징 및 유리한 개량점은 나머지 종속항들에 개시(開示)되어 있다.
본 발명의 일구체예를 하기하며; 특히 사용 배지의 조성을 나타내는 시험관내(in vitro) 세포 증식에 관한 표와 조직 시료의 분리에 관한 첨부 도면을 참조하기 바란다.
도면의 간단한 설명은 다음과 같다:
도 1은 조직 시료를 본 발명에 따른 순착적 평행 절단 분리하기 위한 절단 유니트에 대한 분해 사시도이다.
도 2는 도 1에 나타낸 유니트에서 생성되는 시험관 내 세포 배양을 위한 조직 분절을 더욱 분리하기 위한 유니트의 분해 사시도이다.
도 3은 도 1의 B-B선을 따라 절단한 수집팬의 단면도이다.
도 4는 도 1의 A-A선을 따라 절단하여 절단판을 통해 절단홈을 노출시킨 종단면도이다.
도 5는 도 2에 나타낸 장치를 완전히 조립한 상태에서의 단면도이다.
미세 니들 또는 펀치 검경으로 환자로부터 얻어지는 조직 시료는 펀치 실린더의 형태로 얻어질 수 있으나, 다른 절차를 이용하여 얻어지는 상이한 형상 및 크기의 작은 조직 절편 또는 조직 조각일 수도 있다. 환자에 있어서의 시료 수집 부위로부터 적혈구를 포함하는 조직 시료를 검사 위치에 제공하기에 앞서 2℃ 내지 12℃ 범위의 온도에서 최소 2 시간 내지 최대 24 시간 동안 배양 배지 중에 저장하였다. 이 기간 중에는 조직 조각에 대해 기계적 응력이 가해지지 않도록 하였다. 조직 시료는 나중에 배양에 사용되는 배양 배지에 적응시킬 수 있으며, 상기한 온도가 가장 유리하다.
조직 시료는 도면에 나타낸 유니트를 사용하여 세포 배양을 위해 분리된다.
조직 시료를 특정한 길이의 분절로 순차적인 평행한 절단을 하고 이 분절들을 상호간에 또는 그 구성 성분들로부터 분리하기 위한 장치는, 수집팬(1), 상기한 수집팬(1)에 장착되는 절단판(2) 및, 절단 블레이드 프레임(3)으로 구성된다. 절단판(2)은 동일한 크기의 5개의 섹션으로 나뉘어진다. 각 섹션은 상이한 간격으로 절단홈(4)을 포함하며, 모든 절단홈의 중앙부는 수집팬(1)을 향하여 개방되어 있다. 5개의 섹션 내의 절단홈(4) 사이의 간격은 1mm, 2mm, 3mm, 5mm 및 1mm이다. 절단판의 중앙 섹션은 그 세로 길이 방향을 따라 절단 과정 중에 조직 시료(6)를 그 위에 놓고 고정시키기 위한 거치른 지지 영역(5)을 포함한다. 이것은 절단홈(4)이 그 바닥 쪽으로 개방되어 있는 영역이다. 절단판(2)은 수집팬(1)의 측벽에 부착되어 있는 2개의 안내 레일(7)을 따라 이동될 수 있다. 절단판(2) 중의 절단홈(4)은 안내 레일의 요홈(8)까지 연장된다.
수집팬(1)은 격벽(11)에 의해서 절단판(2)에 형성되어 있는 홈섹션에 상응하는 5개의 체임버(1a-1e)로 나뉘어져 있으며, 체임버(1a,1b,1c,1e) 내에는 더 많은 격벽에 의해서 부속 체임버(1a1-1a9,1b1-1b4,1c1-1c3,1e1-1e9)들이 절단홈을 할당하도록 되어 있다. 이들 부속 체임버들은 각각의 조직 시료 분절(6a) 또는 조직 시료 잔류물이나 체액의 정확한 분배 할당되도록 정해진다.
절단 블레이드 프레임(3)은 상단 패널에 장착되는 절단 블레이드(10)를 갖는 두껑 또는 홀딩 프레임으로 이루어진다. 절단 와이어는 프레임의 일측으로부터 타측으로 신장될 수 있으며, 선택적으로는 와이어 대신에 절단 블레이드(10)가 연장되어 있을 수 있다. 절단 블레이드(10)는 절단판의 절단홈(4)과 동일한 간격을 두고서 위치되어 있다. 절단 구성 요소들이 절단홈(4) 및 요홈(8) 내에서 또는 이를 경유하여 전후로 움직일 수 있도록 절단 블레이드 프레임(3)이 배열되며, 또는 절단 블레이드들이 배열된다. 절단 블레이드 프레임(3)은, 조직 시료가 절단판(2) 상에 위치될 때 시료 분절에 대해 원활한 절단날을 제공하도록 조직 시료에 대해 횡단 방향으로 여전히 이동할 수 있게 하는 바와 같은 방식으로 수집팬의 측벽에 경첩식으로 장착될 수도 있다.
조직 시료(6)는 조직 시료의 길이 및 요구되는 절단 간격에 따라 절단판(2)의 거치른 지지 표면(5) 상에 위치된다. 절단 블레이드 프레임(3)을 조직 시료 상에 놓은(접은) 후에 전후로 움직이는 것에 의해서 절단홈(4)에서 절단되어 분리가 이루어진다. 절단 과정 중에 생겨나는 체액는 절단홈(4) 내에 설치된 홀(4a)을 경유하여 절단판(2)의 지지 표면(5)으로부터 그 하방에 놓여 있는 부속 체임버 내로 흐르게 된다. 수집된 체액는 절단판(2) 상에 잔류하는 것이든 또는 절단홈(4) 중의 홀(4a)을 통하여 그 하방에 위치하는 부속 체임버 내로 적하된 것이거나 간에 시료 분절로서 뿐만 아니라 세포 배양에 사용될 수 있다.
도 1 내지 도 3에 나타낸 바와 같이 기재한 장치는 시료 물질에 손상을 주는 일 없이 특정한 치수로 정밀하고 균일하며 평활하고 재현가능한 절단을 할 수가 있다. 따라서, 환자로부터 취해진 조직 시료와 매치되는 불균질성을 갖는 국소적으로 분절된 조직 시료로부터 세포 배양을 할 수가 있다. 이것은 종양 세포의 증식(선별)에 대한 정상 세포 및 오염물의 방해를 감소시키거나 또는 제거한다. 그 외에, 조직 시료의 절단에 의해 생기는 국소적으로 분리된 체액는 중요한 간상세포(stemcell)를 포함하며 세포 배양에 사용될 수 있다. 하기한 바와 같은 조직 시료의 더 이상의 분리를 속행한 시험관 내 세포 증식 결과로서, 불균질한 조직 시료의 구성, 종양 코어의 배열, 또는 악성 여부 등에 대한 판단을 가능케 한다. 최종적으로, 시료의 국소적 분리 유형은 재현될 수 있으며, 질병의 진전 또는 치료학적 수단의 효과에 대한 신뢰성있는 판단의 제공을 가능케 한다.
상기한 절단 유니트의 일구체예에 있어서, 조직 시료는 절단홈(4)의 간격과 매치되는 간격으로 칼날 또는 절단 와이어가 장착된 별도의 절단 다이(미도시)를 이용하여 절단될 수도 있다.
도 2 및 도 5는 국소적으로 분리된 시료 분절(6a) 또는 잔류 조각들에 대한 더 이상의 분리를 위한 장치를 나타낸다. 이 유니트는 수직 격벽(11)을 이용하여 다수의 체임버(13a-13e)로 나뉘어진 체액 수집팬(13)을 포함한다. 성형되어 있는 이격된 오목부(16)를 갖는 분리용판(15)은 체액 수집팬(13)의 상단 가장자리에 장착되는 2개의 안내 레일(14)에 의해 유지되어 있다. 이들 오목부(16)는 그 바닥에 작은 홀(17)을 포함하고 있다. 분리용판(15)이 안내 레일(14) 내에서 완전히 활주 되면, 각각의 상기한 오목부(16)는 체임버(13a-13e) 상에 위치된다. 조직 시료(6)의 분리된 시료 분절(6a)은 오목부(16) 내에 놓여지며 회전식 플런저(18)에 부착된 플런저 칼날(19)을 이용하여 더욱 마쇄된다. 회전식 플런저의 앞 쪽에는 둘 또는 그 이상의 플런저 칼날(19)이 장착되어 있는 것이 바람직하다. 시료 분절(6a)은 약간의 압력을 가하여 회전식 플런저(18)를 앞뒤로 회전시키는 것에 의하여 마쇄한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 다수의 회전식 플런저(18)가 베이스판(20)상에서 회전, 승하강될 수 있게 장착될 수 있다. 회전식 플런저(18) 사이의 간격은 분리용판(15)의 오목부(16) 사이의 간격과 매치된다.
시료 분절(6a)이 더욱 절단된 후에는, 그 부분들(조직 분절) 및 절단에 의해 생성되어 오목부(16) 내의 홀(17)을 통해 체임버(13a-13e) 내로 흘러 모여진 조직액은 세포 배양에 유용하다.
조직 시료를 국소적으로 분리하고, 순차적인 평행한 절단을 하며, 이를 더욱 분리하기 위한, 도 1 내지 도 5에 도시한 바와 같은 장치는 고압 멸균에 적합하게 121℃까지에서 내열성인 소재로 만들어지며, 바람직하게는, 테플론, 금속, 또는 플라스틱이다. 절단 블레이드는 유리로 만드는 것이 바람직하다.
국소적으로 분리된 시료 분절(6a)의 각각의 절편 및 각각의 조직액은, 환자로 부터 취해진 시료 조직(6)이 저장되는 동일한 배지를 포함하는 세포 배양병 내에 각각 채워진다. 시료 채취 후 조직 시료가 저장되는 남아있는 배지도 배양병 내에 채워진다. 각각의 세포 배양병은 바이오매트릭스로 코팅되며, 본 예에 있어서는 콜라겐 및 폴리라이신으로 만들어진다. 시험관 내 세포 배양을 위해 사용되는 배지의 조성을 하기의 표에 열거한다:
무기염류
Ca(NO3)250 mg/L
CaCl2ㆍ2H2O 132 mg/L
KCl 400 mg/L
MgSO4ㆍ7H2O 150 mg/L
NaCl 6400 mg/L
NaHCO32100 mg/L
Na2HPO4400 mg/L
아미노산류
L-아르기닌ㆍ4HCl 110 mg/L
L-아스파라긴(유리염) 38 mg/L
L-아스팔트산 23 mg/L
L-시스틴 31 mg/L
L-글루타민산 25 mg/L
L-글루타민 296 mg/L
글리신 13 mg/L
L-히스티딘(유리염) 12 mg/L
L-하이드록시프롤린 10 mg/L
L-이소류신 38 mg/L
L-류신 38 mg/L
L-라이신ㆍHCl 35 mg/L
L-메티오닌 12 mg/L
L-페닐알라닌 16 mg/L
L-프롤린 22 mg/L
L-세린 26 mg/L
L-트레오닌 22 mg/L
L-트립토판 5 mg/L
L-타이로신 19 mg/L
L-발린 22 mg/L
L-알라닌 10 mg/L
비타민류
바이오틴 0.6 mg/L
D-Ca-팥토테네이트 0.7 mg/L
콜린 클로라이드 3.5 mg/L
폴린산 1.0 mg/L
i-이노시톨 35.9 mg/L
니아신 아미드 1.0 mg/L
피리독신ㆍHCl 1.0 mg/L
리보플라빈 20 ㎍/L
티아민ㆍHCl 1.0 mg/L
파라미노벤조산 500 ㎍/L
비타민 V125 ㎍/L
니아신 25 ㎍/L
아스콜빈산 50 ㎍/L
폴리닌산 6 ㎍/L
리포닌산 21 ㎍/L
비타민 A(초산염) 100 ㎍/L
피리독신ㆍHCl 25 ㎍/L
니아신아미드 25 ㎍/L
α-토코페롤 포스페이트 10 ㎍/L
기타 성분들
D-글루코오스 1750 mg/L
페놀 레드 7 mg/L
글루타치온(환원) 0.5 mg/L
소디움 피루베이트 1 mM
상피 증식 인자(EGF)
(상피 증식 인자, EGF-재결합) 250 ng/L
송치 혈청(FBS) 12.5%
송아지 인슐린(동결건조품) 8mg/L(26 U/mg)
당해 기술 분야의 항생 물질들.
본 발명의 배지 및 작은 조직 절편 또는 상기한 바와 같이 제조된 조직액을 포함하는 바이오매트릭스 섭스트레이트(biomatrix substrate)를 갖는 세포 배양병을 30℃-36.5℃의 온도 범위, 0.01%-3% 산소 분위기, 0.1%-5% 이산화탄소 분위기 및, 100% 습도로 유지되는 배양기에 넣고 보관한다. 정확한 온도는 조직 시료가 취해졌을 때에 측정된 온도에 의존적이다.
종양 세포들은 1 내지 12 시간 정도 경과하면 조기에 세포 배양병 내의 바이오매트릭스 섭스트레이트에 부착된다. 병 속의 배지는 세포 부착이 시작되고 배양이 초기 확립된 후 약 24 시간 째에 동일한 조성의 신선한 배지로 교체된다. 오염물이 존재하는가 아닌가에 따라, 첫 번째 주 내로 다른 배지로의 변경이 행해져야만 할 것이다. 종양 세포들이 한동안의 휴지기 후에 증식을 시작하여 배양이 확립되면, 항생제가 존재하지 않는 배지 중에 유지된다. 이어서, 다량 증식(mass proliferation)이 개시된다.
배양병 내의 오염 및 오염물의 다량 증식 가능성은 매우 낮으며, 그 이유는 조직 시료를 분리된 조직 분절 또는 심지어 더욱 작은 조직 절편으로 조기에 절단하여 상기한 바와 같이 2 내지 24 시간 후 배양이 확립되기 때문이다. 높은 수준의 오염물이 포함되어 있는 것으로 판명된 소수의 배양병들은 폐기된다. 취급 실수의결과로서, 정상세포가 강하게 증식하여 종양 세포 보다 더욱 증식하게 되는 경우에는, 자성 분리(magnetic separation)를 수행할 수도 있다; 이와 같은 특수한 상황하에서는, 악성 세포의 선별적인 증식이 보장되어져야만 한다.
Claims (16)
- 조직 시료(6)를 종양 세포, 정상 세포 및, 오염물의 불균질한 구성에 근거하여 순차적인 평행 절단(sequential and parallel splitting)에 의해 디스크상 분절(disk segment)로 국소적으로 분리시키며, 상기한 분리된 조직 시료 분절을 조직 절편(fragment)으로 더욱 절단하고, 상기한 작게 분리된 절편 및 상기한 국소적으로 분리된 조직 시료 분절(6a)로부터의 체액를 미리 설정된 배양 조건 및 특정한 배지 중에서 선별적으로 배양하는 것을 포함하는분자생물학적 매스 스크린닝(mass screening)을 위한 인체 조직으로부터의 암 세포의 배양 방법.
- 제1항에 있어서, 상기한 조직 시료가 미세 니들, 흡인 및 외과수술적 생검, 또는 절제 시료로부터 얻어지며 각각의 환자의 시료 채취 부위로부터 유래하는 점착된 적혈구와 함께 배지 중에 잠정적으로 위치시키는 암 세포의 배양 방법.
- 제2항에 있어서, 취해진 신선한 시료의 잠정적 보관을 위한 배양 배지와 종양 세포의 배양에 사용되는 배지가 동일한 암 세포의 배양 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 조직 시료(6)가 배지에의 적응을 위해 4∼12℃의 온도 범위에서 최소 2시간 이상, 그러나 24 시간 이내의 시간 동안 배양 배지중에 유지시키는 암 세포의 배양 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기한 조직 절편 및 상기한 국소적으로 분리된 조직 시료 분절(6a)로부터의 체액을 30℃∼36.5℃의 온도 범위, 0.01%∼3% 산소 분위기, 0.1%∼5% 이산화탄소 분위기 및, 100% 습도 하에, 바이오매트릭스 섭스트레이트가 코팅되어 있으며 상기한 배지가 들어 있는 세포 배양병 중에서 개별적으로 배양되는 암 세포의 배양 방법.
- 제5항에 있어서, 상기한 배양병 중의 배지가, 세포 부착 완료 및 세포 배양의 초기 확립(initial establishment) 후 일정 시점에서 동일 조성의 신선한 배지로 교체되는 암 세포의 배양 방법.
- 제6항에 있어서, 상기한 배지가 세균이나 진균과 같은 오염물이 존재하는 경우 항생제를 포함하는 동일한 양 또는 감소된 양의 배지로 교체되는 암 세포의 배양 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기한 배양 배지가 하기의 특정한 무기염류, 아미노산류, 비타민류 및 첨가제를 포함하는 암 세포의 배양 방법:무기염류로서는Ca(NO3)210-100 mg/LCaCl2ㆍ2H2O 80-150 mg/LKCl 200-1000 mg/LMgSO4ㆍ7H2O 200-700 mg/LNaCl 3000-10000 mg/LNaHCO31500-4000 mg/LNa2HPO4100-1000 mg/L아미노산류로서는L-아르기닌ㆍ4HCl 10-500 mg/LL-아스파라긴(유리염) 10-500 mg/LL-아스팔트산 10-500 mg/LL-시스틴 10-500 mg/LL-글루타민산 10-500 mg/LL-글루타민 10-500 mg/L글리신 10-500 mg/LL-히스티딘(유리염) 10-500 mg/LL-하이드록시프롤린 10-500 mg/LL-이소류신 10-500 mg/LL-류신 10-500 mg/LL-라이신ㆍHCl 10-500 mg/LL-메티오닌 10-500 mg/LL-페닐알라닌 10-500 mg/LL-프롤린 10-500 mg/LL-세린 10-500 mg/LL-트레오닌 10-500 mg/LL-트립토판 10-400 mg/LL-타이로신 10-500 mg/LL-발린 10-500 mg/LL-알라닌 10-300 mg/L비타민류로서는바이오틴 0.01-10 mg/LD-Ca-팥토테네이트 0.01-10 mg/L콜린 클로라이드 0.1-50 mg/L폴린산 0.01-10 mg/Li-이노시톨 0.1-100 mg/L니아신 아미드 0.01-10 mg/L피리독신ㆍHCl 0.01-10 mg/L리보플라빈 0.01-100 ㎍/L티아민ㆍHCl 0.1-50 mg/L파라미노벤조산 1-1000 ㎍/L비타민 V121-1000 ㎍/L니아신 1-100 ㎍/L아스콜빈산 1-5000 ㎍/L폴리닌산 1-100 ㎍/L리포닌산 1-100 ㎍/L비타민 A(초산염) 10-1000 ㎍/L피리독신ㆍHCl 1-100 ㎍/L니아신아미드 1-100 ㎍/Lα-토코페롤 포스페이트 0-1000 ㎍/L및D-글루코오스 100-5000 mg/L페놀 레드 0.1-1000 mg/L글루타치온(환원) 0.1-10 mg/L소디움 피루베이트 0.1-50 mM상피 증식 인자(EGF)(상피 증식 인자, EGF-재결합) 1-3000 ng/L송치 혈청(FBS) 12.5%송아지 인슐린(동결건조품) 0.1-50 mg/L그리고 항생제.
- 조직 시료(6)를 각각의 절단날에 의해 개개의 조직 분절(segment) 및 조직액으로 순착적인 평행 절단을 하기 위한 절단(splitting) 장치 및 국소적으로 세절된 조직 시료 분절(segment)(6a)을 더욱 분리하기 위한 마쇄(grinding) 유니트를 포함하며,상기한 절단 장치는 체임버 및 부속 체임버(1a1 내지 1a10, 1b1 내지 1b5, 1c1 내지 1c3, 1d, 1e1 내지 1e10)로 나뉘어지는 수집팬(1), 상기한 수집팬(1) 위에 착탈 가능하게 장착되며 상기한 수집팬(1)을 향하여 부분적으로 개방되어 있는 절단홈(4)들을 갖는 절단판(2) 및, 상기한 절단판(2)의 절단홈(4)들의 배열과 매치되는 절단칼 배열을 갖는 절단칼들이 장착된 절단 블레이드 프레임(3)으로 이루어지며, 상기한 각각의 절단홈(4)은 그 아래에 위치하는 단일 부속 체임버에 할당되고;상기한 마쇄 유니트는 체임버(13a 내지 13e)로 나뉘어지는 체액 수집팬(13), 그 상면에 오목부(16)를 가지며 착탈 가능하게 장착되는 분리용판(15) 및, 플런저칼(18)들을 갖는 회전식 플런저(18)로 구성되며, 상기한 오목부(16)는 홀(17)들을 포함하고 상기한 회전식 플런저(18)와 결합되는 한편 체임버(13a 내지 13e) 위에 위치되는 것을 특징으로 하는,조직 시료를 국소적으로 세분한 분리물을 생성하기 위한 제1항에 따른 방법 수행용 장치.
- 제9항에 있어서, 상기한 절단판(2)이 상기한 절단홈(4)들에 대해 세로 방향으로 가로지르는 중앙부에 거치른 지지 표면(5)을 포함하며 상기한 조직 시료(6)를 안정한 위치로 유지하는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기한 지지 표면(5) 아래에서 연장되는 절단홈(4)들이, 절단에 의해 생겨나는 조직액 또는 조직 조각(piece)들을 각각의 부속 체임버 내에 별개로 수집하도록, 그 아래에 위치하는 부속 체임버들을 향하여 개방되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기한 절단홈(4)의 너비가 절단칼(10)의 두께 보다 더 큰 것을 특징으로 하는 장치.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기한 절단칼(10)이 절단 블레이드 프레임(3)의 커버판에 장칙되는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기한 절단칼(10)이 절단 블레이드 프레임(3)의 내측에서 연신되는 절단 와이어로서 설계되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제9항에 있어서, 상기한 절단판(2) 및 분리용판(15)이 각각, 상기한 수집팬(1) 또는 체액 수집팬(13) 상의 가이드 레일(각각, 7 또는 14) 내에 유지되며, 절단판(2)의 안내 레일(7)은 상기한 절단홈(4)들과 매치되게 정렬되어 있는 오목부(8)를 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
- 제9항에 있어서, 상기한 회전식 플런저(18)가 플런저 베이스판(20)의 홀 내에 상하 승강 운동 및 회전 운동 가능하게 장착되는 것을 특징으로 하는 장치.
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