DE19903693A1

DE19903693A1 - Protease zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors VII

Info

Publication number: DE19903693A1
Application number: DE19903693A
Authority: DE
Inventors: Juergen Roemisch; Annette Feusner; Hans-Arnold Stoehr
Original assignee: Centeon Pharma GmbH
Current assignee: CSL Behring GmbH Deutschland
Priority date: 1998-04-24
Filing date: 1999-02-01
Publication date: 1999-10-28
Also published as: US20080175878A1; US6528299B1; JP2009131273A; JP4422781B2; AU748221B2; JP4361986B2; DE69930778T2; ES2262264T3; US7879803B2; KR20060107736A; US6911334B2; KR100776921B1; US20050202002A1; KR19990083444A; AU2393599A; JP2000023696A; DK0952215T3; DE69930778D1; EP0952215B1; EP0952215A2

Abstract

Es wird eine Protease zur Aktivierung des Blutgerinnungsfaktor VII beschrieben, die DOLLAR A a) durch Anwesenheit von Aprotinin gehemmt wird, DOLLAR A b) durch Calcium-ionen und/oder Heparin oder heparinverwandte Substanzen in ihrer Aktivität gesteigert wird und DOLLAR A c) in der SDS-PAGE bei anschließender Färbung im nicht-reduzierten Zustand eine oder mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von 50-75 kDa und im reduzieten Zustand eine Bande bei 40-55 kDa und eine oder mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von 10-35 kDa aufweist. DOLLAR A Es wird auch das Proenzym dieser Protease charakterisiert. DOLLAR A Außerdem wird ein Verfahren zur Gewinnung dieser Protease und ihre Verwendung in der Blutungsprophylaxe oder Blutungsstillung beschrieben. Es werden weiterhin ein stabilisiertes Faktor V- und ein stabilisiertes Faktor VIII-Präparat beschrieben, die von den durch proteolytischen Abbau entstehenden, inaktiven Faktor VIII-Fragmenten durch die Inhibition der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease frei sind. Darüber hinaus wird ein Testsystem zum qualitativen und quantitativen Nachweis einer Protease, die den Blutgerinnungsfaktor VII aktiviert, beschrieben, bei dem die Protease bestimmt wird durch ihre DOLLAR A a) die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va inaktivierende Wirkung oder DOLLAR A b) die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Gerinnungstests oder DOLLAR A c) Plasminogen-Aktivatoren aktivierende Wirkung. DOLLAR A Schließlich werden pharmazeutische Zubereitungen beschrieben, die zur ...

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine Protease zur Aktivierung des Blutgerinnungs faktors VII, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung, zu ihrem Nachweis und zu ihrer In aktivierung sowie Arzneizubereitungen, die diese Protease enthalten.

Das Blutgerinnungssystem umfaßt zwei unterschiedliche, kaskadenförmige Aktivie rungswege von im Plasma anwesenden Gerinnungsfaktoren. Je nach auslösen dem Mechanismus dient bevorzugt der endogene oder der exogene Weg zur In itiation der Gerinnung.

Bei einer Gewebeverletzung wird als Starter des exogenen Gerinnungsweges das Thromboplastin (Tissue Factor, TF mit Phospolipiden) von den betroffenen Zellen exponiert. Das membranständige Thromboplastin kann sowohl Gerinnungsfaktor VII (FVII) als auch zirkulierenden, aktivierten FVII (FVIIa) binden. Dieser TF-FVIIa-Komplex führt in Gegenwart von Calcium-ionen und Lipiden zur Bindung des FX, der durch limitierte Proteolyse in seine aktivierte Form (FXa) überführt wird. FXa wiederum führt durch Aktivierung von Prothrombin zu Thrombin zur Bildung von Fibrin und damit letztendlich zum Wundverschluß.

Die weitere Aktivierung des an das Thromboplastin gebundenen FVII vollzieht sich anfangs vor allem autokatalytisch, wird aber nach der Initiation der Gerinnungskas kade vor allem durch FXa und Thrombin unterstützt, was zu einer deutlichen Ver stärkung der Reaktionskaskade führt.

In bestimmten klinischen Situationen ist die Applikation von FVIIa oder FVIIa-ent haltenden Konzentraten indiziert. Bei Patienten, die bspw. unter Hämophilie A lei den und als Folge der Verabreichung von FVIII Antikörper gegen FVIII entwickelt haben, wird die sogenannte "FVIII bypassing activity" (FEIBA) des FVIIa genutzt. Dabei ist nach den bisherigen Befunden FVIIa gut verträglich und führt zu keiner Thromboseneigung, eignet sich aber dazu, die Gerinnung in einem begrenzten aber ausreichenden Umfang zu gewährleisten. Rekombinanter FVIIa wird bereits therapeutisch und prophylaktisch verwendet. Aus Blutplasma gewonnener FVII kann ebenfalls aktiviert und danach verwendet werden. Zu dieser Aktivierung kön nen Proteasen wie Thrombin verwendet werden, die aber als solche die Gerinnung selbst stark aktivieren und zu einer Thrombosegefährdung führen können. Deshalb ist eine anschließende Entfernung oder Inaktivierung von Thrombin erforderlich und führt zu Ausbeuteverlusten. Die Anwendung von FXa oder FIIa (Thrombin) ist wegen der damit verbundenen Thrombosegefährdung häufig kontraindiziert und nur in Notfällen, z. B. bei extremen Blutverlusten und nicht stillbaren Blutungen an gezeigt.

FVIIa wird in sehr geringen Konzentrationen im Plasma gesunder Menschen ge funden. Über die Bildung und Herkunft des im Blut zirkulierenden FVIIa ist bisher nur sehr wenig bekannt. Spuren von exprimiertem oder bei einer Zellzerstörung freigesetztem Thromboplastin könnten dabei eine Rolle spielen. Obwohl bekannt ist, daß z. B. Faktor XIIa unter bestimmten Bedingungen zu einer FVII-Aktivierung führen kann, ist die physiologische Relevanz dieser Reaktion noch nicht geklärt.

Überraschenderweise wurde nun bei der Fraktionierung von Humanplasma und von bestimmten Prothrombinkomplex-Konzentraten eine FVII aktivierende Pro tease gefunden, die sich von allen bisher bekannten Proteasen unterscheidet. Un tersuchungen dieser Protease zeigten, daß sie eine besonders hohe amidolytische Aktivität gegenüber dem Peptid-Substrat S2288 (HD-isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-pNA) der Firma Chromogenix AB, Schweden) aufweist. Ein besonderes Merkmal dieser Protease ist, daß die amidolytische Aktivität durch Aprotinin gut gehemmt wird. Auch andere Inhibitoren, wie der Antithrombin III/Heparin-Komplex eignen sich zur Inhibition. Dagegen wird ihre Aktivität durch Heparin und mit dem Heparin verwandte Substanzen wie Heparansulfat oder Dextransulfat und Calcium-ionen erhöht. Es wurde schließlich gefunden, daß diese Protease in Abhängigkeit von der Zeit und ihrer Konzentration in der Lage ist, den FVII in den FVIIa umzuwandeln. Auch diese Reaktion wird durch Aprotinin inhibiert.

Ein Gegenstand der Erfindung ist deshalb eine Protease zur Aktivierung des Blut gerinnungsfaktors VII, die

a) durch die Anwesenheit von Aprotinin gehemmt wird,
b) durch Calcium-ionen und/oder Heparin oder Heparin-verwandte Sub stanzen in ihrer Aktivität gesteigert wird und
c) in der SDS-PAGE bei anschließender Färbung im nicht-reduzierten Zustand eine oder mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von 50-75 kDa und im reduzierten Zustand eine Bande bei 40 bis 55 kDa und eine oder mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von 10 bis 35 kDa aufweist.

Im folgenden Text wird die aktivierte Form der Protease als "Protease" bezeichnet, während die nicht-aktivierte Form "Proenzym" genannt wird.

Weitere Untersuchungen mit dieser Protease zeigten, daß sie nach Anreicherung oder Isolierung einen raschen Aktivitätsverlust erleidet, der in einer Lösung enthal tend 20 mM Tris, 0,15 M NaCl bei einem pH-Wert von 7,5 beobachtet wurde. Der Zusatz von Albumin in einer Konzentration von 0,1% konnte nicht verhindern, daß nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Aktivität der Protease um 50% vermin dert war. Dagegen konnte eine sehr gute Stabilisierung der Protease in einer mit 50 mM Na-Citrat auf einen pH-Wert von 6,5 gepufferten Lösung beobachtet wer den. Werden der Proteaselösung keine besonderen Stabilisatoren zugesetzt, dann werden keine bzw. nur geringe Wirkungsverluste beobachtet, wenn sie auf einen pH-Wert zwischen 4 und 7,2, bevorzugt auf einen pH-Wert zwischen 5,0 und 7,0 eingestellt ist. Es ist jedoch zweckmäßig Stabilisatoren der Lösung zuzusetzen, wobei neben Citrat vor allem Glutamat, Aminosäuren wie Arginin, Glycin oder Ly sin, Calcium-ionen und Zucker wie Glukose, Arabinose oder Mannose in Mengen von 1-200 mM/l, bevorzugt in Mengen von 5-100 mM/l in Betracht kommen. Eine gute Stabilisierung wurde auch durch den Zusatz von Glykolen wie Ethylenglykol oder von Glycerin erreicht, wobei Mengen von 5-80 Gew.-%, vorzugsweise von 10-60 Gew.-% angewendet werden. Der pH-Wert der stabilisierten Lösung soll dann zwischen den pH-Werten 4-9 liegen.

Die erfindungsgemäße Protease sowie das Proenzym können nach gentechnologi schen Verfahren, vor allem aber durch Fraktionierung von Blutplasma oder von Prothrombinkomplex (PPSB)-Konzentraten gewonnen werden. Dabei wird das Ausgangsmaterial zunächst einer Anionenaustauscher-Chromatographie unter worfen, an die sich eine Affinitätschromatographie des Eluates anschließt. Für die Affinitätschromatographie eignet sich besonders ein auf einer Matrix immobilisier tes Heparin oder eine mit dem Heparin verwandte Substanz wie Heparansulfat oder Dextransulfat. Mit einem derartigen chromatographischen Verfahren kann die erfindungsgemäße Protease und/oder das Proenzym selektiv gebunden und an schließend nach bekannten Verfahren wieder eluiert werden. Zur Kopplung des Liganden an die Matrix empfiehlt sich der Einsatz eines "Spacers". Für die Gewin nung der erfindungsgemäßen Protease hat sich eine Heparin-Lysin-Matrix als be sonders geeignet gezeigt.

Die nach diesem Verfahren isolierte Protease zeigt in der SDS-PAGE und an schließender Färbung im nicht reduzierten Zustand eine bis mehrere eng beieinan der liegende Banden im Molekulargewichtsbereich von 55-75 kDa. Nach Reduk tion beobachtete man eine bis mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von 15-35 kDa und eine Bande bei 40-55 kDa. Eine weitere Bande zwischen 60 und 65 kDa, die nach "Scannen" und quantitativer Auswertung zwischen 5-10% des Gesamtproteins ausmachte, zeigte, dass auch das nicht-aktivierte Proenzym vor handen war. Dieses Ergebnis wurde durch entsprechende Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern gegen diese Protease unterstützt. Deshalb wird gefol gert, dass auch das Proenzym dieser Protease durch das erfindungsgemäße Ver fahren präpariert, pasteurisiert und verwendet werden kann. Ein Gegenstand der Erfindung ist deshalb das Proenzym der Protease zur Aktivierung des Blutgerin nungsfaktors VII. Der Anteil des Proenzyms ist durch die Bande zwischen 60 und 65 kDa gekennzeichnet. Entsprechend der Aminosäuresequenz, die die Aktivie rungsregion des Proenzymes ausmacht, kommen als physiologische Aktivatoren des Proenzymes gemäß ihren Substratspezifitäten zum Beispiel Thrombin oder FXIIa in Frage.

Einige der beschriebenen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Protease, näm lich ihre Isolierbarkeit aus Plasma oder aus davon abgeleiteten Prothrombinkom plex(PPSB)-Konzentraten, die Hemmung ihrer amidolytischen Aktivität durch Apro tinin und das beschriebene Migrationsverhalten sowohl im reduzierten als auch im nicht-reduzierten Zustand unter SDS-PAGE erinnern an eine von Hunfeld et al. (Ann. Hematol. 1997; 74: A87, 113; Ann. Hematol 1998; 76: A101, P294) isolierte Protease aus einem nicht näher definierten PPSB-Konzentrat. Die Präparation ge lang dort im wesentlichen mittels einer Aprotinin-Matrix. Aufgrund der amidolyti schen Spaltung von bestimmten Peptidsubstraten wurde die Aktivität als eine Thrombin-ähnliche bezeichnet. Ein Einfluß auf globale Gerinnungsparameter, wie Prothrombinzeit, Quick oder Plättchenaggregation wurde bei Hunfeldt et al. nicht gefunden.

Die N-terminale Sequenzierung der von Hunfeld et al. beschriebenen Protease zeigt Übereinstimmungen mit einem Protein, dessen cDNA von Choi-Miura et al. (J. Biochem. 119: 1157-1165 (1996)) beschrieben wurde. Das korrespondierende Protein zeigt in der Primärstruktur eine Homologie zu einem als "Hepatocyte Growth Factor Activating Enzyme (HGFA)" bezeichneten Enzym.

Bei der N-terminalen Sequenzierung zweier unter reduzierenden Bedingungen aus der SDS-PAGE isolierten Banden wurden folgende Übereinstimmungen festge stellt:

Übereinstimmungen zeigen sich auch in anderen Testergebnissen wie der Sub stratspezifität und der Inhibierbarkeit der Aktivität. Trotzdem kann derzeit von einer Identität dieser Proteine noch nicht mit Sicherheit ausgegangen werden. Jedenfalls ist für die früher untersuchten vorstehend genannten Proteine die Eigenschaft einer FVII-Aktivierung bzw. Aktivierung anderer Faktoren (s. u.) nicht beschrieben wor den.

Aufgrund der beschriebenen Eigenschaften kann die erfindungsgemäße Protease diagnostisch und therapeutisch angewendet werden.

1. Testsysteme mit der erfindungsgemäßen Protease

Die erfindungsgemäße Protease kann in Testreagenzien diagnostische Verwen dung finden. So läßt sich das Vorliegen des Faktors VII qualitativ und quantitativ im Gerinnungstest durch Zusatz der erfindungsgemäßen Protease feststellen.

Umgekehrt läßt sich das zur Messung der FVII-Aktivierung entwickelte Testsystem auch zur Detektion und Quantifizierung der Protease anwenden. Dazu wird eine die Protease enthaltende Lösung mit einer FVII-haltigen Lösung gemischt und nach einer entsprechenden Inkubationszeit die entstandene Menge an FVIIa quan tifiziert. Dies kann zum Beispiel mittels des Staclot® FVIIa-rTF Testes (Stago/Boehringer Mannheim) durchgeführt werden. Nach einer bevorzugten Ver fahrensweise wird dieser Test nicht durch die angebotene FVII-Konzentration limi tiert. Ist die Proteasemenge in Form des Gesamtproteinanteiles bekannt, der

- in einer reinen Proteasepräparation mittels Kjel-dahl-Verfahren oder mittels eines anderen dem Fachmann geläufigen Proteinassays oder
- mit Hilfe eines Antigentests, zum Beispiel basierend auf spezifischen Antikörpern und einem entsprechenden immunchemischen Bestim mungsverfahren wie ELISA ermittelt werden kann, läßt sich entspre chend die spezifische Aktivität der Proteasepräparation messen.

Überraschenderweise wurde nun bei der weiteren Charakterisierung der Protease eine Eigenschaft gefunden, die eine zusätzliche Bestimmungsmethode ermöglicht. Bei der Inkubation der Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa und V/Va mit der genann ten Protease und anschließender Quantifizierung wurde deutlich, daß die genann ten Gerinnungsfaktoren in einer von der Proteasekonzentration und Inkubations dauer abhängigen Weise inaktiviert werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein neues Testsystem zum qua litativen und quantitativen Nachweis der Protease, die den Blutgerinnungsfaktor VII aktiviert, bei dem die Protease durch ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va inaktivierende Wirkung bestimmbar ist. Dieses Testsystem beruht darauf, daß eine die Protease enthaltende Lösung mit dem Faktor VIII/VIIIa oder dem Faktor V/Va inkubiert wird und dann die verbleibende Faktor VIII/VIIIa- oder die verblei bende Faktor V/Va-Menge mittels eines üblichen Aktivitätstests gemessen und daraus durch Vergleich mit einer Standardkurve die Proteasemenge quantitativ bestimmt wird. Dabei wird die Inkubation der Proteaseaktivität nach vorgegebenen Zeitabschnitten durch die limitierte Zugabe von Aprotinin inhibiert, welches den Vorteil hat, dass es in diesen Konzentrationen die anschließenden Messungen des Testsystems nicht beeinflußt. Danach werden dann die restlichen Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren mittels eines dem Fachmann geläufigen Tests gemessen. Be sonders bewährt hat sich hierfür ein Testsystem, bei dem der sog. Coamatic® Faktor VIII Test (Chromogenix AB) eingesetzt wird, der im wesentlichen die Fakto ren IXa und X enthält, wobei in Gegenwart eines Thrombininhibitors die entstan dene Menge an FXa mittels einer Umsetzung eines chromogenen Substrates quantifiziert wird. Diese ist wiederum der FVIII- oder FVIIIa-Menge proportional.

Durch die Bestimmung der FVIII-Restaktivität kann dann auf die vorhandene Pro teasekonzentration zurückgeschlossen werden.

Die Degradation des FVIII/FVIIIa oder des FV/FVa durch die proteolytische Einwir kung ist mittels der SDS-PAGE deutlich nachvollziehbar. Abhängig von der Inkuba tionsdauer der Protease z. B. auf ein FVIII-Konzentrat verschwinden FVIII-typische Banden, während andere neu auftauchen oder schwach vorhandene zunehmen. Dementsprechend läßt sich die Proteaseaktivität auch mit Hilfe der Quantifizierung der abnehmenden oder zunehmenden Banden korrelieren und somit quantitativ z. B. mittels eines Proteasestandards erfassen. Die Änderungen der Bandeninten sitäten auf dem SDS-PAGE Elektropherogramm oder nach anderen elektrophoreti schen Verfahren läßt sich beispielsweise mit einem dem Fachmann vertrauten "Scanner" samt entsprechendem Programm quantifizieren. Darüber hinaus können Antikörper gegen die genannten Gerinnungsfaktoren zum Western Blotting ver wendet und in der beschriebenen Weise zur Evaluierung benutzt werden. Beson ders eignen sich Antikörper, die spezifisch die abnehmenden oder vor allem die entstehenden Banden erfassen. Dabei können diese auch zur Etablierung von an deren immunchemischen Tests, wie ELISA, Verwendung finden.

Die für den FVIII/FVIIIa beschriebene proteolytische Inaktivierung wird ebenfalls bei Inkubation der Protease mit dem Faktor V/Va beobachtet, der eine gewisse Struk turhomologie zu FVIII aufweist. In geeigneten Aktivitäts-Testsystemen sowie in der SDS-PAGE/Western Blotting läßt sich die Degradation verfolgen.

Trotz der FV- und FVIII-Inaktivierungen wurde nun gefunden, daß die Zugabe der Protease zu Blut, zu an Plättchen reichem Plasma oder Plasma die Gerinnungs zeiten verkürzte, also der prokoagulatorische Effekt in verschiedenen sog. "globa len Gerinnungstests" überwog. Unter diesen Testsystemen versteht man zum Bei spiel die nicht-aktivierte partielle Thrombo-plastinzeit (NAPTT), die Prothrombinzeit (PT) und die Rekalzifizierungszeit. Da die Verkürzung dieser Zeiten, gemessen zum Beispiel in sog. Koagulometern, mittels Thrombelastographie oder aber in chromogenen Tests, mit der Konzentration einer gerinnungsfördernden Substanz korreliert, kann umgekehrt anhand einer Eichkurve von der Gerinnungszeit auf die Konzentration der Substanz in einer Probe geschlossen werden. Entsprechend läßt sich die Konzentration des "FVII-Aktivators" mit Hilfe von ausgewählten Gerin nungs-Globaltests bestimmen.

Überraschend war ebenfalls der Befund, daß der "FVII-Aktivator" auch eine effek tive Aktivierung der Einketten-Urokinase (scuPA, single chain urokinase plasmino gen activator) und des Einketten-tPA (sctPA, single chain tissue plasminogen acti vator) bewirken kann, also als Plasminogenaktivator-Aktivator (PAA) agieren kann. Die Aktivität der aktivierten PAs kann beispielsweise mittels chromogener Sub strate gemessen werden. Diese Eigenschaft kann daher dementsprechend eben falls zur Detektion und auch zur Quantifizierung des "FVII-Aktivators" verwendet werden. Die Aktivierung der Plasminogen-Aktivatoren kann in Anwesenheit von Plasminogen in einer gekoppelten Reaktion auch durch die Plasminbildung selbst oder durch die von Plasmin bewirkte Auflösung eines Fibringerinnsels bestimmt werden.

Zusammengefaßt läßt sich also feststellen, daß man die Protease detektieren und auch quantifizieren kann, indem man sie mit einer FVIII- oder FVIIIa-haltigen Lö sung inkubiert und danach die restliche FVIII/VIIIa-Menge mittels eines geeigneten Aktivitätstestes bestimmt. In gleicher Weise kann FV oder FVa mit der Protease inkubiert und danach die restliche FV/FVa-Menge quantifiziert werden. Die unbe kannte Proteasekonzentration kann durch Vergleich mit einer mitgeführten Stan dardkurve steigender Proteasemengen quantitativ bestimmt werden. Verschiedene globale Gerinnungstests sind ebenfalls zur Quantifizierung geeignet, indem mit Hilfe der Verkürzung der Gerinnungszeit an einer Eichkurve die Proteasenkonzen tration abgelesen wird. Auch die PAA-Aktivität der Protease kann zu Bestim mungszwecken genutzt werden.

Ein weiteres Merkmal dieser Tests ist es, daß sich die FV- und die FVIII-Inaktivie rung und die PAA-Aktivität besonders gut in Gegenwart genügend hoher Kalzium konzentrationen entfaltet, bevorzugt <0,001 mM, besonders bevorzugt <0,005 mM, z. B. in Form von CaC1₂. Im Gegensatz zum direkten chromogenen Assay, in dem, wie vorstehend beschrieben, sowohl Heparin und heparin-ähnliche Substanzen als auch Kalzium die Proteaseaktivität steigern, wird die FV/FVIII-Inaktivierung durch Heparin nicht oder nur unbedeutend gefördert. Dagegen wird die PAA-Aktivität in Gegenwart beider Agenzien, also durch Kalzium und/oder Heparin oder heparin ähnliche Substanzen, stimuliert.

Die durch die Protease vermittelten Reaktionen lassen sich durch Inkubation der Protease mit Inhibitoren, besonders Antithrombin III in Gegenwart von Heparin oder heparin-ähnlichen Substanzen (bevorzugt in Gegenwart von Heparin), C1-Esterase-Inhibitor, alpha2-Antiplasmin, Inter-alpha-Trypsin-Inhibitor oder bekann ten synthetischen, niedermolekularen Protease-Inhibitoren wie das FOIPAN® sehr effektiv verringern oder verhindern. Deshalb kann man diese Substanzen zum Stoppen der Reaktion verwenden, um z. B. Inkubationszeiten exakt zu definieren bzw. die Spezifität des Testes noch zu erhöhen. Auch die Verringerung freier Kal ziumionen im Ansatz durch zum Beispiel Chelatbildner ist hierfür verwendbar.

2. Stabilisierte Faktor-V- und Faktor VIII-Präparate

Aus den vorstehend beschriebenen Beobachtungen über die proteolytischen Wir kungen der erfindungsgemäßen Protease auf die Gerinnungsfaktoren V und VIII ergab sich nun die weitere Aufgabe, die Protease zu inhibieren oder in ihrer Aktivi tät zu reduzieren, um Ausbeuteverluste und das Entstehen von eventuell stören den Proteinfragmenten zu vermeiden. Dies gilt umso mehr, als die Herstellung von FV und FVIII meistens aus aus Plasma gewonnenem Kryoprätipitat und in Ge genwart von Kalziumionen erfolgt, weil diese zur Aufrechterhaltung von Protein-Konformationen benötigt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein stabilisiertes FV- oder ein stabilisiertes FVIII-Präparat, das von den durch proteolytischen Abbau entstehen den Faktor V- oder Faktor VIII-Fragmenten frei ist, weil die den Blutgerinnungsfak tor VII aktivierende Protease inhibiert ist. Da genauere Untersuchungen gezeigt haben, daß die Faktor V- und die Faktor VIII-Inaktivierung durch die genannte Protease besonders effektiv in Gegenwart von Kalziumionenkonzentrationen über 0,5 mM geschieht, kann eine wirksame Stabilisierung des Faktor V oder des VIII-Präparates erreicht werden, wenn zur Inhibition der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease die Konzentrationen an Kalziumionen im Faktor V- oder im Faktor VIII-Präparat auf weniger als 1,0 mM, vorzugsweise auf weniger als 0,5 mM eingestellt werden. Bei diesen Konzentrationen sind die den Faktor V und den Faktor VIII inaktivierenden Eigenschaften der Protease deutlich reduziert, jedoch reicht die Menge der Kalziumionen noch aus, um das FV- und das FVIII Molekül in ihren Konformationen zu stabilisieren. Die vorstehend genannten Mengen an Kal ziumionen sollten nicht nur im Endprodukt, sondern schon im Kryopräzipitat und in den sich anschließenden Reinigungsschritten nicht überschritten werden.

Entsprechend der oben beschriebenen Affinität der Protease bzw. des Proenzymes zu Heparin und heparin-ähnlichen Substanzen, kann die Protease/das Proenzym durch Inkubation mit immobilisiertem Heparin aus der FVIII- bzw. FV-haltigen Lö sung entfernt werden.

Zur Verhinderung der proteolytischen Degradation des FV oder des FVIII können jedoch auch natürliche oder synthetische Protease-Inhibitoren, ggf. zusätzlich zu einer Verminderung der Menge an Kalziumionen, eingesetzt werden. Als Inhibito ren können Proteine wie das Aprotinin, das alpha2-Antiplasmin, der C1-Esterase-In hibitor oder der Inter-Trypsin-Inhibitor eingesetzt werden. Auch niedermolekulare Substanzen, die dem Fachmann als synthetische Serinprotease-Inhibitoren be kannt sind, können hier Verwendung finden. Inhibitoren, deren hemmendes Po tential durch Heparin oder Heparinoide erhöht wird, wie das Antithrombin III, kön nen ebenfalls zugesetzt werden. Denn es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß Heparin allein zwar die amidolytische Aktivität der Protease gegenüber kleinen chromogenen Substanzen zu steigern vermag, nicht jedoch die FV/FVIII-Inaktivie rung unterstützt.

3. Die erfindungsgemäße Protease enthaltende Arzneimittel

Die neue Protease bzw. deren Proenzym können aber auch therapeutisch ange wendet werden.

Sie können als Blutgerinnungsmittel entweder allein oder zusammen mit die Pro teaseaktivität erhöhenden Substanzen wie Heparin oder dem Heparin verwandten Substanzen wie Heparansulfat und/oder Calcium-ionen eingesetzt werden, wobei diesem Mittel zusätzlich auch noch der Faktor VII in seiner inaktiven Form zuge setzt sein kann. Die Anwendung eines derartigen Mittels kann z. B. unter Ausnut zung seiner FVIII bypassing activity (FEIBA) angezeigt sein, wenn Unverträglich keiten gegenüber dem FVIII und/oder FIX und/oder FXI und/oder den Proteinen der Kontaktphase, wie FXII, z. B. wegen des Vorliegens von Antikörpern, bestehen oder andersartigen Mangelsituationen vorliegen. Die Aktivierung des FVII kann da bei entweder in vitro, im Plasma, in angereicherten Fraktionen oder durch Einwir kung auf gereinigten FVII erfolgen. Auch die Anwendung ex vivo zur allgemeinen Blutungsprophylaxe oder zur Stillung von Blutungen kann mit dem erfindungsge mäßen Blutgerinnungsmittel durchgeführt werden.

Andererseits kann die festgestellte Inhibierung der erfindungsgemäßen Protease durch Aprotinin oder die obengenannten Inhibitoren zur Entwicklung eines einen Proteasehemmer enthaltenden Mittels benutzt werden, welches die Gerinnungsfä higkeit des Blutes vermindert. Darüberhinaus lassen sich mittels der erfindungsge mäßen Protease auch physiologische oder nicht-physiologische Faktoren wie syn thetische Peptide ermitteln, die wegen ihrer proteasehemmenden Wirkung die Blutgerinnung beeinträchtigen. Dazu können als strukturelle Grundlage die Pep tidsequenzen der besonders effektiv umgesetzten chromogenen Substrate dienen, wie die des S 2288 (im Detail, siehe oben). Der Zusatz von geeigneten Inhibitoren zu Gerinnungspräparaten oder bei deren Präparation kann erforderlich werden, wenn diese frei von proteolytischen Aktivitäten sein sollen.

Überraschenderweise wurde nun bei der weiteren Charakterisierung der Protease eine Eigenschaft gefunden, die eine zusätzliche Nutzung der Protease, des sog. "Faktor VII-Aktivators", ermöglicht. Bei der Inkubation von Einketten-Plasminogen aktivatoren wie der Prourokinase (Einketten-Urokinase, scuPA, single chain uroki nase plasminogen activator) oder des sctPA (single chain tissue plasminogen acti vator) bewirkt der "Faktor VII-Aktivator" eine Aktivierung dieser Plasminogenakti vatoren (PA). Dabei findet eine limitierte Proteolyse der Einketten-PAs zur zweiket tigen Protease statt, die im besonderen zur Aktivierung des Plasminogens geeignet sind. Das resultierende Plasmin ist der Effektor der Fibrinolyse, also des physiolo gischen Systems, das für die Auflösung von Thromben zuständig ist. PAs, wie Prourokinase oder tPA sind körpereigene Proteine, die bei Bedarf freigesetzt und bekanntermassen durch Plasmin oder durch Kallikrein (scuPA) aktiviert werden. Die Aktivierung der scuPA im gesunden Zustand ist bisher noch nicht vollständig geklärt.

Therapeutisch werden die Plasminogenaktivatoren als isolierte oder rekombinant hergestellte Proteine in pharmazeutischen Zubereitungen bei thromboembolischen Erkrankungen oder Komplikationen eingesetzt, wie bei der Beinvenenthrombose, dem Herzinfarkt oder Schlaganfällen.

Entsprechend der jetzt aufgefundenen Eigenschaft des "Faktor VII-Aktivators" kann dieser zur endogenen oder exogenen Aktivierung von Plasminogenaktivatoren wie der Prourokinase oder des sctPAs verwendet werden. Diese Aktivität kann auch durch Anwendung der genannten Protease zur Prophylaxe oder Therapie von thromboembolischen Erkrankungen Anwendung finden, und zwar auch in Kombi nation mit Einketten- oder Zweiketten-Plasminogenaktivatoren oder Antikoagulan zien. Diese Anwendungsmöglichkeit steht nicht im Widerspruch zu der Tatsache, dass die Protease auch prokoagulatorisch wirken kann. Die Frage, welche der bei den Reaktionen überwiegt, regelt sich wahrscheinlich durch die Verfügbarkeit der physiologischen Substrate. Nach dem derzeitigen Stand des Wissens wird der Faktor VII im Plasma moderat aktiviert und hält ständig eine bestimmte Konzentra tion an FVIIa aufrecht, um plötzlichen Gefässverletzungen sofort entgegenwirken zu können. Dagegen findet man beim Tissue-Plasminogenaktivator und beim Uro kinase-Plasminogenaktivator nur Nanogramm-Mengen in einem ml Blutplasma. Erst bei Fibrinablagerung oder Thromben erhöht sich die Konzentration an Plasmi nogenaktivatoren durch Sekretion oder Synthese, die nach Aktivierung lokal, be sonders thrombusgebunden, ihre thrombolytische Aktivität durch Plasminogenakti vierung entfalten. In Anwesenheit von Einketten-PAs, besonders lokal begrenzt, könnte deren Aktivierung die FVII-Aktivierung überwiegen, wodurch eine Anpas sung an die physiologische Situation möglich ist. Entsprechend könnte diese Pro tease auch die Hämostase regulieren, wodurch eine Substitution mit der Protease und/oder des Proenzymes bei angeborenen und erworbenen Mangelzuständen angezeigt ist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb eine pharmazeutische Zuberei tung, die eine zur Auflösung von fibrinhaltigen Thromben ausreichende Menge der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease und/oder deren Proenzym form enthält. Diese Zubereitung kann ausserdem Einketten-Plasminogenaktivato ren (PA) und/oder Anti-koagulanzien enthalten.

Da sich gezeigt hat, dass die Plasminogenaktivatoren verstärkende Wirkung des "FVII-Aktivators" besonders durch Kalzium und/oder Heparin und heparinähnliche Substanzen wie Dextransulfat gefördert wird, können zur erfindungsgemässen Auflösung von fibrinhaltigen Thromben besonders vorteilhaft pharmazeutische Zu bereitungen eingesetzt werden, die zusätzlich lösliche Kalziumsalze und/oder He parin oder heparinähnliche Substanzen enthalten. Dabei kann die Protease/das Proenzym allein oder in Kombination mit Einketten- oder Zweiketten-Plasmino genaktivatoren ohne oder mit Substanzen eingesetzt werden, die besondere Affi nitäten zu der Protease aufweisen und damit deren Aktivität als Trägersubstanz zur Verlängerung der Plasmahalbwertszeit oder als Vermittler zu Oberflächen erhöhen.

Aufgrund seiner besonderen fibrinolytischen Wirkung können pharmazeutische Zu bereitungen, die die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease enthalten, zur Behandlung von Erkrankungen eingesetzt werden, die durch fibrinhaltige Thromben verursacht werden. Auch bei Wundheilungsprozessen spielen fibrinolyti sche Prozesse eine Rolle. Dabei kann die genannte Protease und/oder das Proen zym intravenös oder lokal, subkutan, intradermal, intramuskulär oder bei Verlet zungen und Wunden auch topisch oder gebunden an eine geeignete Trägermatrix erfolgen. Dabei kann nicht nur die aus Körperflüssigkeiten wie Blut oder Plasma gewonnene Protease/Proenzym, sondern auch rekombinant oder transgen herge stellte Protease/Proenzym eingesetzt werden. Auch als Bestandteil eines sog. Fi brinklebers kommt die Protease/Proenzym in Frage, der dann eine die Pro tease/Proenzym hemmende Substanz, wie Aprotinin, nicht enthalten sollte. Dabei können die gerinnungsverkürzenden Eigenschaften der Protease genutzt werden.

4. Verfahren zur Pasteurisierung der FVII aktivierenden Protease

Als ein aus Humanplasma isoliertes Protein kann die erfindungsgemäße Protease und/oder ihr Proenzym nur dann als pharmazeutische Zubereitung eingesetzt wer den, wenn sie vorher einem Verfahren zur Virusinaktivierung unterworfen worden ist. Besonders das Pasteurisierungsverfahren ist als das wichtigte Verfahren zur Virusinaktivierung anerkannt. Eine Erhitzung von bis zu 10 Stunden bei etwa 60°C setzt jedoch eine ausreichende Stabilität des zu behandelnden Proteins voraus. Die optimalen Stabilisatoren müssen für jedes Protein gesondert ermittelt und de ren Konzentrationen optimiert werden.

Für die erfindungsgemäße Protease und/oder ihr Proenzym sind bereits vorste hend Bedingungen genannt worden, die das Protein in Lösung stabilisieren, ohne dass eine Pasteurisierung vorgenommen wird. Besonders ein leicht saurer pH-Be reich hat sich diesbezüglich als vorteilhaft herausgestellt. Bei einer Pasteurisierung unter diesen Bedingungen verliert die erfindungsgemäße Protease und/oder ihr Proenzym jedoch in der Regel mehr als 50% ihrer ursprünglichen Aktivität.

Es wurde nun gefunden, dass eine Pasteurisierung einer die erfindungsgemäße Protease und/oder ihr Proenzym enthaltenden pharmazeutischen Zubereitung op timale Stabilisierungserfolge gewährleistet, wenn die Zubereitung

a) in einem pH-Bereich von 3,5 bis 8,0, vorzugsweise in einem pH-Be reich von 4,0 bis 6,8;
b) unter Zusatz einer oder mehrerer Aminosäuren in einer Menge von mehr als 0,01 mol/l, vorzugsweise mehr als 0,05 mol/l; und/oder
c) unter Zusatz eines Zuckers oder einer Kombination verschiedener Zucker mit einer Gesamtkonzentration von mehr als 0,05 g/ml, vor zugsweise mehr als 0,2 g/ml; und/oder
d) unter Zusatz ein oder mehrerer Substanzen, die Kalziumionen zu komplexieren vermögen, wie Zitrat, Oxalat, Ethylendiamintetraessig säure usw. hergestellt wird.

Auch Zusätze wie Albumin, Haemaccel®, Heparin und Heparinoide, Glyzerin, Gly kol und Polyethylenglykol können separat oder in Mischung Verwendung finden. Nach Beendigung der Pasteurisierung können die als Stabilisatoren zugesetzten Zucker, Aminosäuren und anderen Zusatzstoffe mit dem Fachmann vertrauten Verfahren vermindert oder aus der Zubereitung ganz entfernt werden. Die Ergebnisse der Pasteurisierungsverfahren sind in den Beispielen 12 und 13 enthalten.

Beispiel 1

Zur Demonstration der Aktivierung von FVII durch die präparierte Protease wurde das Staclot® FVIIa-rTF-Testsystem (Stago/Boehringer Mannheim) verwendet. Die ses Detektionssystem beruht auf der besonderen Eigenschaft des (rekombinanten) löslichen Tissue Factors (rTF), der ausschließlich den präformierten aktivierten FVII (FVIIa) zur Initiation des exogenen Gerinnungsweges verwenden kann. Damit wird, anders als beim vollständigen Tissue Factor, eine genaue Bestimmung des aktu ellen FVIIa Gehaltes möglich.

Für die Aktivierungsexperimente wurde isolierter FVII (Enzyme Research Labs) verwendet. Dieser enthält selbst Spuren FVIIa, da er aus Humanplasma isoliert wird. Die Konzentration wurde durch Verdünnung mit Puffer auf 0,05 lU/ml FVII eingestellt. FVII wurde mit den Testsubstanzen für 10 min bei Raumtemperatur in kubiert und anschließend auf den aktuellen FVIIa-Gehalt getestet. Die FVIIa-Ge halte wurden anhand der parallel erstellten Referenzkurve quantifiziert.

In Vorversuchen, die hier nicht beschrieben werden, wurde ermittelt, daß das Aprotinin in der verwendeten Konzentration die Aktivität der präparierten Protease vollständig inhibierte, jedoch weder FVIIa direkt noch das FVIIa-rTF Testsystem signifikant beeinflußte.

Die nachfolgenden Ergebnisse beziehen sich jeweils auf Dreifachbestimmungen.

Entsprechend wurden folgende experimentelle Ansätze durchgeführt:

1. FVII Resultat: 10 mlU/ml FVIIa

Nicht aktivierter FVII diente als Kontrollansatz. Dieser enthält bereits Spuren von FVIIa (siehe oben) in der Größenordnung 10 mlU FVIIa/ml.

2. FVII + Aprotinin

In diesem Ansatz wurde FVII in Anwesenheit von Aprotinin inkubiert und in den FVIIa-rTF Assay eingesetzt, um zu zeigen, daß weder FVIIa selbst inhibiert noch der Test durch das verwendete Aprotinin beeinflußt wurde. Dies wurde bestätigt (im Vergleich zu Ansatz 1).

3. Protease + FVII (Inkubation), danach Zugabe von Aprotinin Resultat: 18 mlU/ml FVIIa

Der Protease wurde hier Zeit gegeben, um FVIIa zu aktivieren. Erst nach der 10 minütigen Inkubation wurde Aprotinin zugegeben, um die Protease zu inhibieren. Entstandener FVIIa wurde im FVIIa-rTF Assay quantifiziert. Abzüglich des FVIIa Basiswertes (Ansatz 1) sind unter den gewählten Bedingungen also 8 mlU/ml FVIIa durch die Proteaseeinwirkung entstanden.

4. Protease + Aprotinin, danach Zugabe von FVII Resultat: 11 mlU/ml FVIIa

In diesem Ansatz wurde die Protease vor Kontakt mit FVII mit Aprotinin inhibiert. Weder die anschließende Inkubation mit FVII noch die folgende FVIIa Quantifizie rung zeigte einen signifikanten Anstieg des FVIIa-Gehaltes (11 versus 10 mlU/ml in Ansatz 1 ist aufgrund des Assay-Schwankungsbreite als nicht signifikant zu wer ten).

5. Protease Resultat: 0 mlU/ml FVIIa

Durch diesen Ansatz wurde demonstriert, daß die Protease in der gewählten Kon zentration selbst keinen Einfluß auf das FVIIa-rTF Testsystem zeigte.

Zusammenfassend ergibt sich hieraus, daß

- die beschriebene Protease FVII aktiviert;
- die Aktivierung von FVII durch die Protease "direkt" erfolgt, also unabhängig von der Anwesenheit des rTF;
- die Aktivierung von FVII durch Aprotinin hemmbar ist, Aprotinin selbst das Testsystem in der gewählten Konzentration nicht signifikant beeinflußt.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt, daß die Aktivierung von FVII in einer von der Konzen tration der Protease und der Inkubationszeit der Protease mit FVII abhängigen Re aktion erfolgt.

Testsysteme und Reagenzien wurden entsprechend den in Beispiel 1 beschriebe nen Bedingungen gewählt. In einer ersten Versuchsreihe wurde der vorgelegte FVII mit verschiedenen Verdünnungen (1 : 5, 1 : 10,1 : 20) der Protease enthaltenden Lösungen vorinkubiert (5 min RT), danach mit Aprotinin versetzt (zur Inhibition der Protease) und anschließend im FVIIa-rTF Assay auf den Gehalt an FVIIa geprüft.

Als Kontrollansätze dienten wiederum die Parallelansätze, bei denen die Protease vor Kontakt mit FVII durch Aprotinin inhibiert worden war.

Die Ergebnisse sind als Aktivierungsfaktor angegeben, d. h. entsprechen dem x-fachen dessen, was in dem o.g. Kontrollansatz selbst gemessen wurde:

Der Aktivierungsfaktor 1,0 der Kontrollansätze entspricht der zusätzlich einge schlossenen Kontrolle, bei der lediglich der Testpuffer mit dem verwendeten FVII unter identischen Inkubationsbedingungen behandelt und getestet wurde. Das heißt, es fand keine signifikante Aktivierung in den Kontrollansätzen statt.

Hieraus ergibt sich, daß die Aktivierung von FVII durch die Protease in einer von der Konzentration der Protease abhängigen Weise erfolgt.

In ähnlicher Weise wurde gezeigt, daß sich die Aktivierung von FVII durch die Protease bei konstant gehaltenen Konzentrationen der Reaktionspartner in einer von der Inkubationsdauer abhängigen Weise vollzieht.

Bei Inkubation gleicher Volumina einer 0,2 lU/ml FVII enthaltenden Lösung mit ei ner 1 : 10 verdünnten Proteaselösung ergaben sich nach entsprechenden Inkuba tionszeiten und anschließender Zugabe von Aprotinin (um die Aktivierung zu stop pen) folgende FVIIa-Gehalte:

Inkubationsdauer
Aktivierungsfaktor
0 min	1,0
2,5 min	1,3
5,0 min	2,0
10,0 min	2,8
40,0 min	<3,8

Hieraus ergibt sich, daß sich die Aktivierung von FVII durch die Protease in einer von der Zeit abhängigen Weise vollzieht.

Beispiel 3

Anhand dieses Beispiels soll demonstriert werden, daß die Aktivierung von FVII durch die Protease in Anwesenheit von Calcium-ionen und Heparin erhöht wird.

25 µl der Protease enthaltenden Lösung wurde mit 50 µl

- Puffer (Kontrolle)
- 15 mM CaCl₂
- 50 USP-E Heparin/ml
- Pathromtin (Lipidgemisch, Abfüllung nach Angaben des Herstellers gelöst)

gemischt, für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, mit 150 µl einer Tris/NaCl-Puf ferlösung (pH 8,2) und 25 µl des chromogenen Substrates S2288 (3 mM) versetzt und die zeitabhängige Änderung der Extinktion bei 405 nm (bei 37°C) gemessen. Angegeben sind Aktivierungsfaktoren bezogen auf die Puffer-Kontrolle (x-fach).

Ansätze
Aktivierungsfaktor
(x-fach Puffer-Kontrolle)
Puffer-Kontrolle	1,0
+ CaCl₂	3,6
+ Heparin	2,6
+ Lipid	0,9
+ CaCl₂ + Heparin	4,3
+ CaCl₂ + Lipid	3,3
+ Heparin + Lipid	2,7
+ CaCl₂ + Heparin + Lipid	3,7

Unter den Bedingungen dieses Beispiels sind deutliche Aktivitätssteigerungen der Protease in Anwesenheit von Calcium-ionen und/oder Heparin zu vermerken.

Beispiel 4

Jeweils 25 µl einer Lösung, die 10, 1 oder 0,1 µg/ml der Protease enthielt, wurden mit 25 µl FVIII (2 lU/ml) gemischt und anschließend mit 25 µl CaCl₂ (25 mM) und 25 µl Pathromtin® (Dade Behring GmbH) versetzt. Nach einer Inkubation bei 37°C für 0, 3, 10 und 20 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 400 µl Aprotinin (500 KIE/n-d) gestoppt. Als eine Kontrolle diente ein Ansatz, bei dem Aprotinin vorgelegt wurde.

Jede Probe wurde in Tris-Puffer/BSA verdünnt. Je 50 µl dieser Lösung wurden mit 50 µl des Faktorenreagenzes (im Wesentlichen bestehend aus FIXa, FX und einem Thrombininhibitor, entsprechend modifiziert nach dem Coamatic® FVIII Test, Chromogenix AB) gemischt und für 10 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 50 µl Substrat (z. B. S 2765, N-a-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA) wurde die Reaktion nach einer bestimmten Inkubationsdauer durch Zugabe von 50 µl Essigsäure (50%) ge stoppt und die OD405mm gemessen. Eine FVIII-Standardkurve diente der Ermitt lung der Probenkonzentration.

Ergebnis

In einem ersten Ansatz wurde die Inkubationszeit von Protease mit FVIII (2 lU/ml) konstant gehalten (10 min), jedoch die Proteasekonzentration variiert (0,1,1 und 10 µg/ml). Die Reaktion wurde gestoppt und die restliche Konzentration an aktivem FVIII bestimmt. Mit steigender Proteasekonzentration wurde entsprechend mehr FVIII inaktiviert (Abb. 1).

Mit Hilfe einer entsprechenden Standardkurve läßt sich der Proteasegehalt einer Probe quantifizieren.

In einem zweiten Ansatz wurde die Proteasekonzentration konstant gehalten (10 µg/ml), jedoch die Inkubationszeit mit FVIII (2 lU/ml) variiert. Mit zunehmender Inkubationsdauer zeigte sich eine deutliche Reduktion der verbleibenden Konzen tration an aktivem FVIII (Abb. 2).

Beispiel 5

Der Einfluß des "FVII-Aktivators" auf die Faktor V Aktivität wurde untersucht:
25 µl protease-haltige Lösung (0-100 µg/ml) wurde mit 50 µl FV (5 lU/ml) und 25 µl 25 mM CaCl₂ inkubiert (0-20 min) und danach mit 400 µl Puffer enthaltend 100 KIE/ml Aprotinin versetzt.

Je 100 µl eines jeden Inkubationsansatzes wurden dann mit 100 ?l FV-Mangel plasma für 1 min bei 37°C inkubiert, mit 200 µl Thromborel S® gemischt und die Gerinnungszeiten im Koagulometer nach Schnitger und Gross bestimmt. Die Restaktivitäten des FV wurden ermittelt.

Ergebnis

Dieses Beispiel zeigt, daß der FV durch die Protease mit der Zeit inaktiviert wurde.

Beispiel 6

Der Einfluß des "FVII-Aktivators" auf die Gerinnungszeiten in sog. Globaltests wurde mit Hilfe von Koagulometern nach Schnitger und Gross untersucht. Alle auf geführten Differenzwerte entsprechen den um diesen Betrag verkürzten Gerin nungszeiten.

NAPTT (Nicht-aktivierte partielle Thromboplastinzeit)

Die protease-haltige Lösung wurde mit Puffer auf 100 µg/ml, 30, 10 und 3 µg/ml verdünnt. Jeweils 100 µl dieser Lösung wurden mit 100 µl Citrat-Plasma (Standard Human Plasmapool oder Einzelspender) und 100 µl Pathromtin® für 2 min bei 37°C inkubiert und anschließend mit 100 µl 25 mM CaCl₂ versetzt und danach die Gerinnungszeiten ermittelt. Die Differenzen zwischen diesen Meßwerten und den entsprechenden Gerinnungszeiten, die mit Pufferlösung anstelle der Protease er mittelt wurden, wurden bestimmt.

Plasma-Rekalzifierungszeit

Die protease-haltige Lösung wurde mit Puffer auf 100 µg/ml, 30, 10 und 3 µg/ml verdünnt. Jeweils 100 µl dieser Lösung wurden mit 100 µl Citrat-Plasma (Standard Human Plasmapool oder Einzelspender) für 1 min bei 37°C inkubiert und anschlie ßend mit 100 µl 25 mM CaCl₂ versetzt und danach die Gerinnungszeiten ermittelt. Die Differenzen zwischen diesen Meßwerten und den entsprechenden Gerin nungszeiten, die mit Pufferlösung anstelle der Protease ermittelt wurden, wurden bestimmt.

PT (Prothrombinzeit)

Die protease-haltige Lösung wurde mit Puffer auf 100 µg/ml. 30, 10 und 3 µg/ml verdünnt. Jeweils 100 µl dieser Lösung wurden mit 100 µl Citrat-Plasma (Standard Human Plasmapool oder Einzelspender) für 1 min bei 37°C inkubiert und anschlie ßend mit 200 µl Thromborel S® (Dade Behring GmbH) versetzt und danach die Gerinnungszeiten ermittelt.

Die Differenzen zwischen diesen Meßwerten und den entsprechenden Gerin nungszeiten, die mit Pufferlösung anstelle der Protease ermittelt wurden, wurden bestimmt.

Die Gerinnungszeiten der genannten Globaltests wurden in einer von der Konzen tration der Protease abhängigen Weise verkürzt. Entsprechend liess sich nach "Ei chung" eines verwendeten Plasmas mit einer bekannten Menge des "FVII-Aktiva tors" unter Ablesung von einer Standardkurve die Proteasekonzentration einer Probe ermitteln.

Beispiel 7

Die Plasminogenaktivatoren aktivierenden Eigenschaften des "FVII-Aktivators" wurden an der Einketten-Urokinase (scuPA) und des Einketten-tPA (sctPA) unter sucht.

Ansatz:
0,1 ml PAA-Lösung (20 µg/ml scuPA oder 100 µg/ml sctPA)
+0,1 ml Test-Puffer oder
100 U Heparin/ml in Test-Puffer oder
20 mM CaCl₂ im Test-Puffer
+ 0,5 ml Test-Puffer
+ 0,1 ml Protease/Probe (steigende Konzentrationen:

2-10 µg/ml scuPA oder
50-200 µg/ml sctPA)
Inkubation bei 37°C
+ 0,1 ml 100 KIE Aprotinin/ml in Test-Puffer
Inkubation für 2 min bei 37°C
ü 0,1 ml Substrat S-2444 (3 mM).

Als Kontrolle wurde anstelle des Plasminogenaktivators (PA) vor der ersten Inku bation Aprotinin vorgelegt und jeweils mitgeführt. Dafür wurde anstelle des Aproti nin erst später PA zugegeben.

Die ΔOD_405mm wurde photometrisch bestimmt. Die ermittelten Kontroll-Werte wurden von den Proben/Proteasewerten abgezogen und sb die durch die PAA Aktivität verursachte PA-Aktivität) in mlU/min) bestimmt.

Ergebnis

scuPA-Aktivierung (20 µg/ml scuPA 2-10 µg/ml "FVII-Aktivator")

A. Stimulanz: ohne

B. Stimulanz: Heparin

B. Stimulanz: CaCl₂

Die Tabellen veranschaulichen, daß scuPA in einer von der Konzentration des "FVII-Aktivators" und der Inkubationsdauer abhängigen Weise aktiviert wurde. Da bei wirkten sowohl Heparin als auch Kalzium stimulierend auf die durch die Pro tease verursachte Aktivierung des PA.

sctPA-Aktivierung (100 µg/ml sctPA, 50-200 µg/ml "FVII-Aktivator")

Da die Umsatzrate des aktivierten tPA gegenüber dem tPA-Proenzym lediglich um den Faktor 3-4 zunimmt, (die der uPA jedoch um das 1.000-1.500-fache), mussten höhere Konzentrationen beider Reaktionspartner (siehe oben) gewählt werden, um ein auswertbares Messignal zu erhalten.

B. Abhängigkeit von der Konzentration des "FVII-Aktivators" (Inkubationszeit: 20 min 37°C), Stimulanz: Heparin (100 lU/ml)

C. Stimulanzien (Inkubationsdauer: 20 min bei 37°C)

Die Tabellen demonstrieren, daß auch sctPA in einer von der Konzentration der Protease und der Inkubationszeit abhängigen Weise aktiviert wurde. Sowohl Hepa rin als auch Kalziumionen hatten eine stimulierende Wirkung auf den "FVII-Akti vator" hinsichtlich seiner PA-Aktivierung.

Beispiel 8

Zwei FVIII enthaltende Lösungen, die eine im wesentlichen frei von von Willebrand Faktor und die andere vWF-haltig, wurden mit der obengenannten Protease in Ge genwart von Kalzium inkubiert. Nach bestimmten Zeiten wurden die restlichen FVIII-Aktivitäten mittels eines chromogenen Testes bestimmt und in Relation zu den Kontrollansätzen ohne Protease gesetzt.

Dazu wurden 25 µl einer 0.1 lU/ml FVIII enthaltenden Lösung mit dem gleichen Volumen der Proteaselösung (10 µg/ml) versetzt und mit 25 µl CaCl₂ (25 mM) ge mischt. Nach Inkubationsdauern von 0, 5, 10 und 20 min bei 37°C wurden die An sätze mit je 400 µl einer 200 KIE/ml Aprotinin enthaltenden Lösung versetzt, um die proteolytische Aktivität der Protease zu stoppen. Vorversuche hatten gezeigt, daß diese Aprotininkonzentration keinen wesentlichen störenden Einfluß auf den nachfolgend beschriebenen FVIII-Aktivitätstest hatte (Ansätze 1+3). In Ansatz 2 wurde die Protease vor Kontakt mit FVIII mit Aprotinin inkubiert und danach verfah ren wie oben beschrieben.

Je 50 µl der gestoppten Probe (bzw. nach weiterer Verdünnung) wurden danach mit dem sog. Faktorenreagenz, im wesentlichen bestehend aus FIXa, FX und ei nem Thrombininhibitor versetzt und für 10 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 50 µl eines chromogenen Substrates, das durch aktivierten FX gespalten wird, wurde die Reaktion nach 5 minütiger Inkubation durch Zugabe von 50 µl Essig säure (50%) gestoppt und die delta OD_405nm quantifiziert. Die FVIII Aktivität (mlU) wurde anhand einer Standardkurve, die mit Hilfe einer mitgeführten Verdünnungs reihe des FVIII-Konzentrates erstellt wurde, ermittelt.

Die FVIII-Aktivitäten sind in Prozent der nicht mit Protease versetzten Kontrollen dargestellt.

Ergebnis

FVIII-Aktivität (%)

In Gegenwart von CaCl₂ (hier 6,25 mM) wurde FVIII durch die Protease in einer von der Inkubationsdauer abhängigen Weise inaktiviert. Der vWF schützte den FVIII nicht vor Inaktivierung durch die Protease. Die Inhibition der Protease mit Aprotinin vor Kontakt mit FVIII verhinderte dessen Inaktivierung.

Beispiel 9

Diese Versuchsreihe wurde durchgeführt wie in Beispiel 1/Ansatz 1 beschrieben, jedoch wurden hier die Kalziumkonzentrationen in den Mischungen aus Protease und FVIII variiert. Dazu wurde aus der Kalzium-Stammlösung CaCl₂ zugegeben bis zu den in der Abb. 3 dargestellten Endkonzentrationen.

Ergebnis

Wird die Kalziumkonzentration im Ansatz unter 1 mM gesenkt, werden unter diesen Bedingungen ca. 50% des FVIII verschont. Unter 0,5 mM Kalzium sind es bereits mehr als 60% (Abb. 1).

Beispiel 10

Der Einfluss des "FVII-Aktivators" auf die Gerinnungszeiten in sog. Globaltests wurde mit Hilfe der Thrombelastographie untersucht.

Mit einem TEG-Meter (Fa. Hellige) nach Hilgard wurde die Änderung der Scherela stizität bzw. die Festigkeit des entsprechenden Blutgerinnsels fortlaufend regi striert. Bei den sog. r-, bzw. k-Werten handelt es sich um die Zeiten vom Beginn der Blutabnahme bzw. dem Start der Gerinnungsreaktion, bei Citrat-Blutplasma um den Zeitpunkt der Rekalzifizierung bis zur Verbreiterung der TEG-Kurve um 1 mm bzw., die Zeit vom Endpunkt des r-Wertes bis zur Verbreiterung der Kurve auf 20 mm (Gerinnselbildungszeit).

Dazu wurden 150 µl Blut oder Plasma vom 5 Spendern jeweils in den Messküvet ten bei 37°C für 2 min inkubiert und danach 50 µl Probe (Protease) zugemischt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 µl 25 mM CaCl₂ gestartet. Die Endkon zentration des "FVII-Aktivators" im Ansatz betrug 30 µg/ml. Die Verkürzung der r-Zeit wurde in Relation zum Ansatz gemessen, der anstelle der Probe Puffer ent hielt.

Ergebnis

Dieses Beispiel verdeutlicht, dass die Zugabe der Protease in fast allen Fällen eine deutliche Verkürzung der Gerinnungszeit zur Folge hatte. Die fibrinolytischen Ei genschaften des "FVII-aktivators" traten hier in den Hintergrund. Ein Grund dafür ist, dass in "Normalpersonen" die Plasminogenaktivator-Konzentrationen im Plasma im Nanogramm-Bereich liegen und in dem in-vitro Gerinnungstest nicht zum Tragen kommen.

Beispiel 11

Die FVIII "Bypassing Acitivity" der Protease wurde durch folgenden Versuchsan satz demonstriert: Als Messtechnik diente die Thrombelastographie. Ausgewertet wurde die r-Zeit (siehe Beispiel 10). Eine Vollblutprobe wurde mit einem monoklo nalen Antikörper, dessen FVIII-Aktivität inhibierende Eigenschaften bekannt waren, inkubiert, um die Anwesenheit eines natürlich vorkommenden FVIII-Inhibitors (Anti körper gegen FVIII) zu simulieren. Diese Probe wurde verglichen mit der Vollblut proben-Kontrolle (Puffer anstelle von mAb). Die FEIB-Aktivität der Protease wurde durch Zusatz der Protease (Endkonzentration 17 µg/ml) zu der durch den mAb in hibierten Vollblutprobe getestet. Einer weiteren Probe wurde Protease zugegeben und deren alleiniger Einfluss auf die r-Zeit ermittelt.

Ergebnis

r-Zeit
Vollblut-Kontrolle	8,0
Vollblut + mAb	11,0
Vollblut + mAb + Protease	8,0
Vollblut + Protease	3,5

Die Verlängerung der r-Zeit, die durch den anti-FVIII-mAb verursacht wurde, wurde durch die Anwesenheit der Protease wieder normalisiert, was die FEIB-Aktivität der Protease veranschaulichte. Die Protease allein bewirkte eine Verkürzung der Gerin nungszeit, wie schon oben gezeigt.

Die Ergebnisse sind in den Beispielen 12 und 13 enthalten.

Beispiel 12

Einer Lösung, die 50 µg/ml der FVII-aktivierenden Protease enthielt, wurden fol gende Substanzen auf die entsprechenden Endkonzentrationen zugesetzt:
25 mM Na-Citrat
25 mM HEPES
100 mM Arginin
0,75 g/ml Saccharose.

Die Lösung wurde portioniert und die Aliquots wurden jeweils auf unterschiedliche pH-Werte von 5,0 bis 8,6 eingestellt und anschließend für 10 Stunden bei 60°C erhitzt.

Die Aktivitäten der erhitzten Proteaselösungen wurden in einem chromogenen Test bestimmt, wobei die zeitabhängige Amidolyse des chromogenen Substrates S2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pHA×2 HCL, Chromogenix AB, Schweden) registriert wurde. Diese Aktivität wurde als Prozent der parallel gemessenen, nicht erhitzten Aliquots ausgedrückt:

Resultat

Ansatz
Aktivität (%)
Ausgangsmaterial	100
pH 5,0	76
pH 5,5	65
pH 6,1	81
pH 6,5	50
pH 7,1	43
pH 7,5	46
pH 8,1	46
pH 8,6	32

Diese Versuchsreihe verdeutlicht, dass die Stabilisierung besonders im saurem pH-Bereich die Inaktivierung der Protease deutlich reduziert hat. Der leichte "Einbruch" bei pH 5,5 läßt sich dadurch erklären, dass der isoelektrische Punkt der Protease in diesem Bereich liegt. Na-Citrat verhindert, dass ein Aktivitätsverlust <50% im bevorzugten pH-Bereich eintritt.

Beispiel 13

Der Ansatz bei pH 6,1 (Beispiel 1) zeigte die beste Stabilisierung der Protease. Entsprechend wurden bei pH 6,0 verschiedene Zusätze getestet und entsprechend Beispiel 1 ausgewertet:
Folgende Endkonzentrationen wurden bei einer Konzentration der Protease von 50 µg/ml eingestellt:
50 mM Na-Citrat/50 mM NaCl, pH 6,0
0,75 g/ml Saccharose
100 mM Glycin
100 mM Arginin

Resultat

Ansatz
Aktivität (%)
Ausgangsmaterial	100
Na-Citrat/NaC1	54
Na-Citrat/NAC1/Saccharose	85
Na-Citrat/NaC1/Saccharose/Glycin	92
Na-Citrat/NaC1/Saccharose/Arginin	97

Eine deutliche Stabilisierung der Protease durch Zusatz von Saccharose und je weils einer Aminosäure wurde gezeigt.

Claims

1. Protease zur Aktivierung des Blutgerinnungsfaktors VII, dadurch gekenn zeichnet, daß sie

a) durch die Anwesenheit von Aprotinin gehemmt wird,
b) durch Calcium-ionen und/oder Heparin oder Heparin-verwandte Sub stanzen in ihrer Aktivität gesteigert wird und
c) in der SDS-PAGE bei anschließender Färbung im nicht-reduzierten Zustand eine oder mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von 50-75 kDa und im reduzierten Zustand eine Bande bei 40-55 kDa und eine oder mehrere Banden im Molekulargewichtsbereich von 10-35 kDa aufweist.

2. Protease nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die in der SDS-PAGE im reduzierten Zustand im Molekulargewichtsbereich 60-65 kDa und von 40-55 kDa gewonnene Bande eine Aminosäuresequenz von LLESLDP und die im Molekulargewichtsbereich von 10-35 kDa gewonnene Bande eine Aminosäure sequenz von IYGGFKSTAGK aufweist.

3. Protease nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Fraktionierung von Blutplasma oder von Prothrombinkomplex(PPSB)-Kon zentraten gewonnen wird.

4. Proenzym der Protease nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß sie in der SDS-PAGE im reduzierten Zustand eine Bande im Mole kulargewichtsbereich zwischen 60 und 65 kDa aufweist und die Aminosäurese quenzen LLESLDP und IYGGFKSTAGK enthält.

5. Verfahren zur Gewinnung der Protease gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, da durch gekennzeichnet, daß sie aus Blutplasma oder Prothrombinkomplex (PPSB)-Konzentraten nach vorangegangener Anionenaustauscher-Chromatogra phie mittels einer Affinitätschromatographie unter Verwendung von Heparin oder einer dem Heparin verwandten Substanz oder Dextransulfat gewonnen wird.

6. Reagenz zum immunologischen Nachweis der Protease der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper gegen die Protease enthält.

7. Reagenz zum Nachweis von Faktor VII, dadurch gekennzeichnet, daß es die Protease der Ansprüche 1 bis 3, ggf. zusammen mit Protease-Aktivatoren ent hält.

8. Testsystem zum qualitativen und quantitativem Nachweis einer Protease nach Anspruch 1 oder ihres Proenzyms nach Anspruch 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Protease gemessen wird durch

a) ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa oder V/Va inaktivierende Wirkung oder
b) ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Ge rinnungstests oder
c) ihre Plasminogen-Aktivatoren aktivierende Wirkung
d) ihre den FVII aktivierende Wirkung.

9. Testsystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die die Blut gerinnungszeiten verkürzende Wirkung bestimmt wird mittels der

a) nicht-aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (NAPTT) oder der
b) Prothrombinzeit (PT) oder der
c) Plasma-Rekalzifizierungszeit oder der
d) aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT).

10. Testsystem nach Ansprüchen 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die die Plasminogen-Aktivatoren aktivierende und/oder verstärkende Wirkung gemes sen wird durch die Aktivierung der

a) Einketten-Urokinase (scuPA, single chain urokinase plasminogen activator) oder der
b) Einketten-tPA (sctPA, single chain tissue plasminogen acti vator).

11. Testsystem nach Ansprüchen 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es Kalziumionen in einer Menge von mehr als 0,001 mM, vorzugsweise in einer Menge von mehr als 0,005 mM, enthält.

12. Testsystem nach den Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die die Plasminogen-Aktivatoren verstärkende Wirkung

a) mit einem chromogenen Test oder
b) in einer gekoppelten Reaktion in Anwesenheit von Plasminogen ge messen wird, wobei die Plasminbildung selbst oder die durch Plasmin bewirkte Auflösung eines Fibringerinnsels bestimmt wird.

13. Stabilisiertes Faktor V- und stabilisiertes Faktor VIII-Präparat, dadurch ge kennzeichnet, daß sie von den durch proteolytischen Abbau entstehenden, inakti ven Faktor VII und Faktor V-Fragmenten durch die Inhibition der den Blutgerin nungsfaktor VII aktivierenden Protease frei sind.

14. Stabilisiertes Präparat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Inhibition der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease die Konzen tration an Kalziumionen im Faktor VIII oder im Faktor V-Präparat weniger als 1.0 mM, vorzugsweise weniger als 0,5 mM beträgt.

15. Stabilisiertes Präparat nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die FVIII- bzw. FV-haltige Lösung mit immobilisiertem Heparin, immobilisierten he parin-ähnlichen Substanzen oder immobilisiertem Dextransulfat in Kontakt ge bracht und dadurch eine ganz oder teilweise von Protease/Proenzym befreite Lö sung gewonnen worden ist.

16. Stabilisiertes Präparat nach den Ansprüchen 14 und 15, dadurch gekenn zeichnet, daß es gegen den proteolytischen Abbau durch die den Blutgerin nungsfaktor VII aktivierende Protease durch den Zusatz eines natürlichen oder synthetischen Protease-Inhibitors geschützt ist.

17. Stabilisierte Lösung der Protease oder des Proenzyms nach den Ansprü chen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Zugabe eines Puffers auf einen pH-Wert auf 4,0 bis 9,0 eingestellt ist und/oder Ethylenglykol oder Glyzerin in einer Menge von 5-80 Gew.-% enthält.

18. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine zur Auflösung von fibrinhaltigen Thromben ausreichende Menge der den Blutgerin nungsfaktor VII aktivierenden Protease und/oder ihr Proenzym enthält.

19. Pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeich net, dass sie ausser der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease und/oder ihrem Proenzym Einketten- oder Zweiketten-Plasminogenaktivatoren (PA) und/oder Antikoagulantien enthält.

20. Pharmazeutische Zubereitung nach den Ansprüchen 18 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich lösliche Kalziumsalze und/oder Heparin oder heparin-ähnliche Substanzen enthält.

21. Pharmazeutische Zubereitung zur Verminderung der Gerinnungsfähigkeit des Blutes, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Inhibierung der Protease und/oder ihres Proenzyms gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 einen Proteasehemmer wie Aprotinin enthält.

22. Verfahren zur Herstellung einer die Proenzym gemäß den Ansprüchen 1-4 enthaltenden pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung

a) in einem pH-Bereich von 3,5 bis 8,0
b) unter Zusatz einer oder mehrerer Aminosäuren in einer Menge von

<0,01 mol/l und/oder

c) unter Zusatz eines Zuckers oder einer Kombination mehrerer Zucker in einer Gesamtmenge von < 0,05 g/ml und/oder
d) unter Zusatz einer oder mehrerer Substanzen, die Calcium-ionen zu komplexieren vermögen

unter Pasteurisierungs-Bedingungen hergestellt wird.

23. Pharmazeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach dem Verfahren gemäß Anspruch 22 erhältlich ist.

24. Verwendung der aus Blutplasma, Prothrombin-Komplex(PPSB)Konzentra ten hergestellten oder rekombinant oder transgen exprimierten Protease oder ihres Proenzyms gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 zur Förderung der Wundheilung und der Blutstillung, als Zusatz eines auf Fibrinbasis zum raschen Wundverschluß ge eigneten Fibrinklebers, zur Substitution bei angeborenen oder erworbenen Man gelzuständen an dieser Protease oder ihrem Proenzym, beim Vorliegen von Anti körpern gegen den Blutgerinnungsfaktor VIII oder zur in vitro-Aktivierung von Fak tor VII.