DE19901761A1 - Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen - Google Patents
Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-HybridisierungsereignissenInfo
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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-
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer, sowie ein
Verfahren zur elektrochemischen Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäure-
Oligomer-Hybridisierungsereignissen.
Zur Sequenzanalyse von DNA und RNA, z. B. in der Krankheitsdiagnose, bei
toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung,
sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor, werden im allgemeinen gel-elektro
phoretische Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion
verwendet.
Beim wichtigsten gel-elektrophoretischen Verfahren mit optischer Detektion, dem
Sanger-Verfahren wird eine DNA enthaltende Lösung in vier Ansätze aufgeteilt. Zur
Unterscheidung der vier Ansätze ist der Primer (komplementäre Startsequenz zur
Replikation) jedes Ansatzes mit je einem bei verschiedener Wellenlänge
emittierenden Fluoreszenzfarbstoff kovalent modifiziert. Ausgehend vom Primer wird
jeder Ansatz durch DNA-Polymerase I enzymatisch repliziert. Neben den dazu
nötigen Desoxyribonucleosid-Triphosphaten der Basen A (Adenin), T (Thymin), C
(Cytosin), und G (Guanin) enthält jedes Reaktionsgemisch noch genügend 2',3'-
Didesoxyanalogon eines dieser Nukleosidtriphosphate als Stopbase (je eine der 4
möglichen Stopbasen pro Ansatz), um die Replikation an allen möglichen
Bindungsstellen zu stoppen. Nach Vereinigung der vier Ansätze entstehen
replizierte DNA-Fragmente aller Längen mit stopbasenspezifischer Fluoreszenz, die
gel-elektrophoretisch der Länge nach sortiert und durch Fluoreszenz-Spektroskopie
charakterisiert werden können.
Ein anderes optisches Detektionsverfahren basiert auf der Anlagerung von
Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Ethidiumbromid an Oligonukleotide. Im Vergleich
zur freien Lösung des Farbstoffs ändert sich die Fluoreszenz solcher Farbstoffe bei
Assoziation mit doppelsträngiger DNA oder RNA drastisch und kann deshalb zum
Nachweis hybridisierter DNA oder RNA verwendet werden.
Bei der radioaktiven Markierung wird 32P in das Phosphatgerüst der Oligonukleotide
eingebaut, wobei 32P gewöhnlich am 5'-Hydroxylende durch Polynukleotid-Kinase
addiert wird. Die markierte DNA wird anschließend an jeweils einem der vier
Nukleotidtypen bevorzugt gespalten und zwar unter definierten Bedingungen, so
daß pro Kette durchschnittlich eine Spaltung erfolgt. Damit liegen im
Reaktionsgemisch für einen bestimmten Basentyp Ketten vor, die sich von der 32P-
Markierung bis zur Position dieser Base erstrecken (bei mehrfachem Auftreten der
Base erhält man entsprechend Ketten unterschiedlicher Länge). Die vier
Fragmentgemische werden anschließend auf vier Bahnen gel-elektrophoretisch
aufgetrennt und es wird vom Gel ein Autoradiogramm angefertigt, an dem die
Sequenz unmittelbar abgelesen werden kann.
Vor einigen Jahren wurde ein weiteres, auf optischer (oder autoradiographischer)
Detektion beruhendes Verfahren zur DNA-Sequenzierung entwickelt, nämlich die
Sequenzierung durch Oligomer-Hybridisierung (vgl. z. B. Drmanac et al., Genomics
4, (1989), S. 114-128 oder Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), S. 303-307). Bei
diesem Verfahren wird ein vollständiger Satz kurzer Oligonukleotide bzw.
Nukleinsäure-Oligomere (Probe-Oligonukleotide), z. B. alle 65.536 möglichen
Kombinationen der Basen A, T, C und G eines Oligonukleotid-Oktamers auf ein
Trägermaterial gebunden. Die Anbindung geschieht in einem geordneten Raster aus
65.536 Test-Sites, wobei jeweils eine größere Menge einer Oligonukleotid-
Kombination ein Test-Site definieren und die Position jeder einzelnen Test-Site
(Oligonukleotid-Kombination) bekannt ist. Auf solch einer Hybridisierungsmatrix,
dem Oligomer-Chip, wird ein DNA-Fragment, dessen Sequenz man ermitteln will
(das Target), mit Fluoreszenzfarbstoff (oder 32P) markiert und unter Bedingungen,
die nur eine spezifische Doppelstrangbildung erlauben, hybridisiert. Dadurch bindet
das Target DNA-Fragment nur an die Nukleinsäure-Oligomere (im Beispiel an die
Oktamere), deren komplementäre Sequenz exakt einem Teil (einem Oktamer) seiner
eigenen Sequenz entspricht. Durch optische (oder autoradiographische) Detektion
der Bindungsposition des hybridisierten DNA-Fragments werden damit alle im
Fragment vorhandenen Nukleinsäure-Oligomersequenzen (Oktamersequenzen)
bestimmt. Aufgrund der Überlappung benachbarter Nukleinsäure-
Oligomersequenzen kann durch geeignete mathematische Algorithmen die
fortlaufende Sequenz des DNA-Fragments bestimmt werden. Die Vorteile dieses
Verfahrens liegen unter anderem in der Miniaturisierung der Sequenzierung und
damit in der enormen Datenmenge, die gleichzeitig in einem Arbeitsgang erfaßt wird.
Daneben kann auf Primer und auf das gel-elektrophoretische Auftrennen der DNA-
Fragmente verzichtet werden. Beispielhaft ist dieses Prinzip in Fig. 1 für ein 13
Basen langes DNA-Fragment gezeigt.
Die Verwendung radioaktiver Markierungen bei der DNA-/RNA-Sequenzierung ist
mit mehreren Nachteilen verbunden, wie z. B. aufwendige, gesetzlich
vorgeschriebene Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven
Materialien, die Strahlenbelastung, das begrenzte räumliche Auflösungsvermögen
(maximal 1 mm2) und eine Sensitivität, die nur dann hoch ist, wenn die Strahlung der
radioaktiven Fragmente entsprechend lange (Stunden bis Tage) auf einen
Röntgenfilm einwirkt. Es kann zwar die räumliche Auflösung durch zusätzliche Hard- und
Software erhöht und die Detektionszeit durch die Verwendung von β-Scannern
verkürzt werden, beides ist jedoch mit erheblichen zusätzlichen Kosten verbunden.
Die Fluoreszenzfarbstoffe, die üblicherweise zur Markierung der DNA verwendet
werden, sind zum Teil (z. B. Ethidiumbromid) mutagen und erfordern, ebenso wie die
Anwendung der Autoradiographie, entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. In fast
allen Fällen erfordert die Verwendung optischer Detektion den Gebrauch von einem
oder mehreren Lasersystemen und somit geschultes Personal und entsprechende
Sicherheitsvorkehrungen. Die eigentliche Detektion der Fluoreszenz erfordert
zusätzliche Hardware, wie z. B. optische Bauelemente zur Verstärkung und, bei
verschiedenen Anregungs- und Abfragewellenlängen wie im Sanger-Verfahren, ein
Kontrollsystem. Abhängig von den benötigten Anregungswellenlängen und der
gewünschten Detektionsleistung können somit erhebliche Investitionskosten
entstehen. Bei der Sequenzierung durch Hybridisierung auf dem Oligomer-Chip ist
die Detektion noch (kosten)aufwendiger, da, neben dem Anregungssystem, zur 2-dimen
sionalen Detektion der Fluoreszenzspots hochauflösende CCD-Kameras
(Charge Coupled Device Kameras) benötigt werden.
Obwohl es also quantitative und extrem sensitive Methoden zur DNA-/RNA-
Sequenzierung gibt, sind diese Methoden zeitaufwendig, bedingen aufwendige
Probenpräparation und teure Ausstattung und sind im allgemeinen nicht als
transportable Systeme verfügbar.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung und ein
Verfahren zur Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden zu schaffen, welche
die Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer
gemäß unabhängigem Patentanspruch 1, durch das Verfahren zur Herstellung eines
modifizierten Nukleinsäure-Oligomers gemäß unabhängigem Anspruch 16, durch die
modifizierte leitfähige Oberfläche gemäß unabhängigem Patentanspruch 22, das
Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche gemäß
unabhängigem Patentanspruch 35 und ein Verfahren zur elektrochemischen
Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen gemäß
unabhängigen Patentanspruch 38 gelöst.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und
Begriffe benutzt:
DNA: Desoxyribonukleinsäure
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH2
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat Einheit durch die -NH-(CH2
)2
-N(COCH2
-Base)-CH2
CO-Einheit
hybridisiert PNA mit DNA).
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
U: Uracil
Base: A, G, T, C oder U
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Phosphorothioat- oder Phosphorodithioat-Rückgrat).
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA, PNA oder RNA Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid.
Primer: Start-Komplementär-Fragment eines Oligonukleotids, wobei die Basenlänge des Primers nur ca. 4-8 Basen beträgt. Dient als Ansatzpunkt für die enzymatische Replikation des Oligonukleotids.
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, daß die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss: single strand (Einzelstrang)
ds: double strand (Doppelstrang)
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
U: Uracil
Base: A, G, T, C oder U
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Phosphorothioat- oder Phosphorodithioat-Rückgrat).
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA, PNA oder RNA Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid.
Primer: Start-Komplementär-Fragment eines Oligonukleotids, wobei die Basenlänge des Primers nur ca. 4-8 Basen beträgt. Dient als Ansatzpunkt für die enzymatische Replikation des Oligonukleotids.
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, daß die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ss: single strand (Einzelstrang)
ds: double strand (Doppelstrang)
Elektron-Donor: Molekül (oder Molekülteil), das unmittelbar oder nach
Einwirkung bestimmter äußerer Umstände ein Elektron an
einen Elektron-Akzeptor transferieren kann. Besagte
äußere Umstände können z. B. Lichtabsorption durch den
Elektron-Donor oder -Akzeptor sein oder Übertragung eines
Elektrons auf den Elektron-Donor bzw. Abgabe eines
Elektrons durch den Elektron-Akzeptor. Die Fähigkeit als
Elektron-Donor oder -Akzeptor zu wirken ist relativ, d. h. ein
Molekül (oder Molekülteil), das unmittelbar oder nach
Einwirkung bestimmter äußerer Umstände gegenüber
einem anderen Molekül (oder Molekülteil) als Elektron-
Donor wirkt, kann gegenüber besagtem anderen Molekül
(oder Molekülteil) unter anderen experimentellen
Bedingungen oder gegenüber einem dritten Molekül
(Molekülteil) unter gleichen oder anderen experimentellen
Bedingungen auch als Elektron-Akzeptor wirken.
Elektron-Akzeptor: Molekül (oder Molekülteil), das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände ein Elektron von einem Elektron-Donor aufnehmen kann. Besagte äußere Umstände können z. B. Lichtabsorption durch den Elektron- Akzeptor oder -Donor sein oder Abgabe eines Elektrons durch den Elektron-Akzeptor bzw. Übertragung eines Elektrons auf den Elektron-Donor. Die Fähigkeit als Elektron-Akzeptor oder -Donor zu wirken ist relativ, d. h. ein Molekül (oder Molekülteil), das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände gegenüber einem anderen Molekül (oder Molekülteil) als Elektron- Akzeptor wirkt, kann gegenüber besagtem anderen Molekül (oder Molekülteil) unter anderen experimentellen Bedingungen oder gegenüber einem dritten Molekül (Molekülteil) unter gleichen oder anderen experimentellen Bedingungen auch als Elektron-Donor wirken.
Elektron-Donor- Molekül(teil): entspricht einem Elektron-Donor.
Elekron-Akzeptor- Molekül(teil): entspricht einem Elektron-Akzeptor.
photoinduzierbar: photoinduzierbar bedeutet, daß eine gewisse Eigenschaft erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird. So entfaltet z. B. eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, unter bestimmten äußeren Umständen an einen geeigneten Elektron- Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge. Ein weiteres Beispiel ist die photoinduzierbar reaktive Gruppe, d. h. eine Gruppe, die erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge reaktiv wird.
redoxaktiv: redoxaktiv bezeichnet die Eigenschaft einer redoxaktiven Einheit oder Substanz unter bestimmten äußeren Umständen an einen geeigneten Elektron-Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen.
photoinduzierbar redoxaktive Einheit: Oberbegriff für eine Einheit, die ein oder mehrere Elektron-Donor-Moleküle oder -Molekülteile und ein oder mehrere Elektron-Akzeptor-Moleküle oder -Molekülteile enthält, wobei dieses (diese) Elektron-Donor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) und dieses (diese) Elektron- Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) in ein oder mehrere Makromoleküle eingebettet sein können. Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit kann z. B. jedes beliebige photoinduzierbar redoxaktive Protein/Enzym, jeder beliebige photoinduzierbar redoxaktive, kovalent verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elekton-Donor-/ Elektron-Akzeptor-Komplex oder jeder beliebige photoinduzierbar redoxaktive Charge-Transfer-Komplex sein. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor an einen der Elektron-Akzeptoren ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A⁻ aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Dieser Vorgang innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird als photoinduzierte Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, an einen geeigneten externen Elektron-Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten, externen Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen, erst im ladungsgetrennten Zustand, da die externen Donoren (bzw. Akzeptoren) nur auf den oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Elektronen übertragen (bzw. aufnehmen), z. B. in Gegenwart eines externen Oxidationsmittels, das A⁻, jedoch nicht A, oxidieren kann (bzw. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺, jedoch nicht D, reduziert kann). Auch kann eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an eine Elektrode abgeben (bzw. von dieser aufnehmen), wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A⁻, jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert) wird.
photoinduzierbar redoxaktives Protein/Enzym: besteht in der Regel aus Apoprotein und Cofaktoren. Die photoinduzierte Ladungstrennung innerhalb des photoaktivierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms wird durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge ausgelöst. So sind zum Beispiel im photosynthetischen Reaktionszentrum (reaction center, RC) als Cofaktoren ein primärer Elektron-Donor P und mehrere verschiedene Elektron-Akzeptoren A, darunter auch Quinon-Cofaktor(en) Q, in eine Proteinmatrix eingebettet und bilden so eine "polymolekulare" Einheit. Bei Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge gibt der primäre Donor ein Elektron an einen der Elektron- Akzeptoren ab und es bildet sich, zumindest temporär, aus den anfänglich neutralen Cofaktoren ein ladungsgetrennter RC-Zustand P⁺A⁻, insbesondere auch der Zustand P⁺+Q⁻.
photoinduzierbar redoxaktiver, kovalent verknüpfter, (wenigstens bimolekularer) Elektron- Donor-/Elektron- Akzeptor-Komplex: kovalent verknüpfte Verbindung aus einem oder mehreren Elektron-Donor Molekülen D1, D2, D3 etc. und mindestens einem oder mehreren geeigneten Elektron- Akzeptor Molekülen A1, A2, A3 etc., wobei der Fachmann anhand der Struktur des Elektron-Donor/- Akzeptor-Komplexes den Aufbau aus den ursprünglichen Molekülen zu erkennen vermag. Die auch als Einzelmoleküle vorkommenden Bestandteile D1, D2, D3 etc. und A1, A2, A3 etc. sind im Elektron-Donor/ Elektron-Akzeptor-Komplex direkt oder indirekt (z. B. über einen Spacer, nicht aber über ein Nukleinsäure- Oligomer) miteinander verbunden. Der photoinduzierbar redox-aktive, kovalent verknüpfte, (wenigstens bimolekulare) Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor- Komplex entspricht in seiner erfindungsrelevanten Funktionsweise einem photoinduzierbar redoxaktiven Protein/Enzym, d. h. auch hier kommt es durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge zur photoinduzierten Ladungstrennung und es wird, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A⁻ gebildet (wobei D für ein beliebiges D1, D2, D3 etc. und A für ein beliebiges A1, A2, A3 etc. steht).
photoinduzierbar redoxaktiver Charge- Transfer-Komplex: elektrisch geladener oder ungeladener Komplex [M(L1)(L2)(L3)etc.] aus Übergangsmetall M und Liganden L1, L2, L3 etc., bei dem Lichtanregung zu einem intramolekularen Ladungstrennungsprozeß führt. Der photoinduzierbar redoxaktive Charge-Transfer- Komplex entspricht in seiner erfindungsrelevanten Funktionsweise einem photoaktivierbaren redoxaktiven Protein/Enzym, d. h. auch hier kommt es durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge zur photoinduzierten Ladungstrennung. Dabei wird ein Elektron von einem Liganden L zum Metall M transferiert und der ladungsgetrennte Zustand M⁻L⁺ gebildet oder es wird ein Elektron vom Metall M zu einem Ligand L transferiert und der ladungsgetrennte Zustand M⁺L⁻ entsteht.
RC: Reaktionszentrum. Beispiel eines photoinduzierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms. Bei dem Protein/Enzym handelt es sich um einen sogenannten Pigment/Protein- Komplex der aus Apoprotein mit mehreren Proteinuntereinheiten und mehreren Cofaktoren (im Beispiel RC sogenannte Pigmente) handelt. In solchen Pigment/Protein-Komplexen spielen sich die ersten Schritte der lichtgetriebenen Ladungstrennung der bakteriellen oder pflanzlichen Photosynthese ab. Das RC der Photosynthese betreibenden Bakterien des Stammes Rhodobacter sphaeroides z. B. besteht aus drei Protein- Untereinheiten und acht Cofaktoren (Pigmenten). Die Cofaktoren sind ein Bakteriochlorophyll-Dimer P, zwei Bakteriochlorophyll-Monomere BA
Elektron-Akzeptor: Molekül (oder Molekülteil), das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände ein Elektron von einem Elektron-Donor aufnehmen kann. Besagte äußere Umstände können z. B. Lichtabsorption durch den Elektron- Akzeptor oder -Donor sein oder Abgabe eines Elektrons durch den Elektron-Akzeptor bzw. Übertragung eines Elektrons auf den Elektron-Donor. Die Fähigkeit als Elektron-Akzeptor oder -Donor zu wirken ist relativ, d. h. ein Molekül (oder Molekülteil), das unmittelbar oder nach Einwirkung bestimmter äußerer Umstände gegenüber einem anderen Molekül (oder Molekülteil) als Elektron- Akzeptor wirkt, kann gegenüber besagtem anderen Molekül (oder Molekülteil) unter anderen experimentellen Bedingungen oder gegenüber einem dritten Molekül (Molekülteil) unter gleichen oder anderen experimentellen Bedingungen auch als Elektron-Donor wirken.
Elektron-Donor- Molekül(teil): entspricht einem Elektron-Donor.
Elekron-Akzeptor- Molekül(teil): entspricht einem Elektron-Akzeptor.
photoinduzierbar: photoinduzierbar bedeutet, daß eine gewisse Eigenschaft erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge entfaltet wird. So entfaltet z. B. eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, unter bestimmten äußeren Umständen an einen geeigneten Elektron- Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge. Ein weiteres Beispiel ist die photoinduzierbar reaktive Gruppe, d. h. eine Gruppe, die erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge reaktiv wird.
redoxaktiv: redoxaktiv bezeichnet die Eigenschaft einer redoxaktiven Einheit oder Substanz unter bestimmten äußeren Umständen an einen geeigneten Elektron-Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen.
photoinduzierbar redoxaktive Einheit: Oberbegriff für eine Einheit, die ein oder mehrere Elektron-Donor-Moleküle oder -Molekülteile und ein oder mehrere Elektron-Akzeptor-Moleküle oder -Molekülteile enthält, wobei dieses (diese) Elektron-Donor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) und dieses (diese) Elektron- Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) in ein oder mehrere Makromoleküle eingebettet sein können. Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit kann z. B. jedes beliebige photoinduzierbar redoxaktive Protein/Enzym, jeder beliebige photoinduzierbar redoxaktive, kovalent verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elekton-Donor-/ Elektron-Akzeptor-Komplex oder jeder beliebige photoinduzierbar redoxaktive Charge-Transfer-Komplex sein. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor an einen der Elektron-Akzeptoren ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A⁻ aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Dieser Vorgang innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird als photoinduzierte Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen entfaltet die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität, also ihre Eigenschaft, an einen geeigneten externen Elektron-Akzeptor Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten, externen Elektron-Donor Elektronen aufzunehmen, erst im ladungsgetrennten Zustand, da die externen Donoren (bzw. Akzeptoren) nur auf den oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit Elektronen übertragen (bzw. aufnehmen), z. B. in Gegenwart eines externen Oxidationsmittels, das A⁻, jedoch nicht A, oxidieren kann (bzw. in Gegenwart eines Reduktionsmittels, das D⁺, jedoch nicht D, reduziert kann). Auch kann eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit erst nach der photoinduzierten Ladungstrennung ein Elektron an eine Elektrode abgeben (bzw. von dieser aufnehmen), wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A⁻, jedoch nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert) wird.
photoinduzierbar redoxaktives Protein/Enzym: besteht in der Regel aus Apoprotein und Cofaktoren. Die photoinduzierte Ladungstrennung innerhalb des photoaktivierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms wird durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge ausgelöst. So sind zum Beispiel im photosynthetischen Reaktionszentrum (reaction center, RC) als Cofaktoren ein primärer Elektron-Donor P und mehrere verschiedene Elektron-Akzeptoren A, darunter auch Quinon-Cofaktor(en) Q, in eine Proteinmatrix eingebettet und bilden so eine "polymolekulare" Einheit. Bei Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge gibt der primäre Donor ein Elektron an einen der Elektron- Akzeptoren ab und es bildet sich, zumindest temporär, aus den anfänglich neutralen Cofaktoren ein ladungsgetrennter RC-Zustand P⁺A⁻, insbesondere auch der Zustand P⁺+Q⁻.
photoinduzierbar redoxaktiver, kovalent verknüpfter, (wenigstens bimolekularer) Elektron- Donor-/Elektron- Akzeptor-Komplex: kovalent verknüpfte Verbindung aus einem oder mehreren Elektron-Donor Molekülen D1, D2, D3 etc. und mindestens einem oder mehreren geeigneten Elektron- Akzeptor Molekülen A1, A2, A3 etc., wobei der Fachmann anhand der Struktur des Elektron-Donor/- Akzeptor-Komplexes den Aufbau aus den ursprünglichen Molekülen zu erkennen vermag. Die auch als Einzelmoleküle vorkommenden Bestandteile D1, D2, D3 etc. und A1, A2, A3 etc. sind im Elektron-Donor/ Elektron-Akzeptor-Komplex direkt oder indirekt (z. B. über einen Spacer, nicht aber über ein Nukleinsäure- Oligomer) miteinander verbunden. Der photoinduzierbar redox-aktive, kovalent verknüpfte, (wenigstens bimolekulare) Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor- Komplex entspricht in seiner erfindungsrelevanten Funktionsweise einem photoinduzierbar redoxaktiven Protein/Enzym, d. h. auch hier kommt es durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge zur photoinduzierten Ladungstrennung und es wird, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter Zustand D⁺A⁻ gebildet (wobei D für ein beliebiges D1, D2, D3 etc. und A für ein beliebiges A1, A2, A3 etc. steht).
photoinduzierbar redoxaktiver Charge- Transfer-Komplex: elektrisch geladener oder ungeladener Komplex [M(L1)(L2)(L3)etc.] aus Übergangsmetall M und Liganden L1, L2, L3 etc., bei dem Lichtanregung zu einem intramolekularen Ladungstrennungsprozeß führt. Der photoinduzierbar redoxaktive Charge-Transfer- Komplex entspricht in seiner erfindungsrelevanten Funktionsweise einem photoaktivierbaren redoxaktiven Protein/Enzym, d. h. auch hier kommt es durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge zur photoinduzierten Ladungstrennung. Dabei wird ein Elektron von einem Liganden L zum Metall M transferiert und der ladungsgetrennte Zustand M⁻L⁺ gebildet oder es wird ein Elektron vom Metall M zu einem Ligand L transferiert und der ladungsgetrennte Zustand M⁺L⁻ entsteht.
RC: Reaktionszentrum. Beispiel eines photoinduzierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms. Bei dem Protein/Enzym handelt es sich um einen sogenannten Pigment/Protein- Komplex der aus Apoprotein mit mehreren Proteinuntereinheiten und mehreren Cofaktoren (im Beispiel RC sogenannte Pigmente) handelt. In solchen Pigment/Protein-Komplexen spielen sich die ersten Schritte der lichtgetriebenen Ladungstrennung der bakteriellen oder pflanzlichen Photosynthese ab. Das RC der Photosynthese betreibenden Bakterien des Stammes Rhodobacter sphaeroides z. B. besteht aus drei Protein- Untereinheiten und acht Cofaktoren (Pigmenten). Die Cofaktoren sind ein Bakteriochlorophyll-Dimer P, zwei Bakteriochlorophyll-Monomere BA
und BB
, zwei
Bakteriopheophytin-Monomere HA
und HB
und zwei
Ubichinon-50 (UQ) Moleküle QA
und QB
, die in den
jeweiligen Protein-Bindungstaschen (also der P-, BA
- etc.
Bindungstasche) lokalisiert sind (vgl. Struktur 1).
QA
QA
-Protein-
Bindungstasche: Proteinbindungstasche bzw. Proteinumgebung in der
sich der Chinon-Cofaktor QA
befindet. In RC von z. B.
Rhodobacter sphaeroides ist der Chinon-Cofaktor QA
ein
Ubichinon-50 (vgl. Struktur 1).
QA
QA
-Bindungstasche: QA
-Protein-Bindungstasche
freie, redoxaktive Substanz: eine nicht an ein Nukleinsäure-Oligomer gebundene, aber mit dem Nukleinsäure-Oligomer in Kontakt stehende, redoxaktive Substanz, wobei diese Substanz z. B. ein ungeladenes Molekül, eine beliebiges Salz oder ein redoxaktives Protein oder Enzym (Oxydoreductase) sein kann. Die freie redoxaktive Substanz ist dadurch gekennzeichnet, daß sie den oxidierten Donor (bzw. den reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktive Einheit re-reduzieren (bzw. re-oxidieren) kann.
freie, redoxaktive Substanz: eine nicht an ein Nukleinsäure-Oligomer gebundene, aber mit dem Nukleinsäure-Oligomer in Kontakt stehende, redoxaktive Substanz, wobei diese Substanz z. B. ein ungeladenes Molekül, eine beliebiges Salz oder ein redoxaktives Protein oder Enzym (Oxydoreductase) sein kann. Die freie redoxaktive Substanz ist dadurch gekennzeichnet, daß sie den oxidierten Donor (bzw. den reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktive Einheit re-reduzieren (bzw. re-oxidieren) kann.
ZnBChl: Zn-Bakteriochlorophyll (Formel 11 mit M = Zn)
Q: allgemein für Chinon (engl. Quinone), im Beispiel 3 und den sich darauf beziehenden Textpassagen ein modifiziertes Anthrachinon oder Pyrrollochinolinochinon (PQQ).
UQ: Ubichinon-50, RC-Cofaktor und temporärer Elektron- Akzeptor z. B. im RC der Photosynthese betreibenden Bakterien aus z. B. Rhodobacter sphaeroides oder Rhodopseudomonas viridis.
(cyt c2
Q: allgemein für Chinon (engl. Quinone), im Beispiel 3 und den sich darauf beziehenden Textpassagen ein modifiziertes Anthrachinon oder Pyrrollochinolinochinon (PQQ).
UQ: Ubichinon-50, RC-Cofaktor und temporärer Elektron- Akzeptor z. B. im RC der Photosynthese betreibenden Bakterien aus z. B. Rhodobacter sphaeroides oder Rhodopseudomonas viridis.
(cyt c2
)2+
: reduzierte Form des Cytochrom c2
, ein frei bewegliches
Häm-Protein, das in der bakteriellen Photosynthese in
Rhodobacter sphaeroides den oxidierten primären Donor
P⁺ zu P reduziert; Beispiel einer redoxaktiven Substanz.
PQQ: Pyrrolo-Chinolino-Chinon, 4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H-pyr rolo-[2,3-f]-chinolin-2,7,9-tricarboxylsäure)
EDTA: Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
sulfo-NHS: N-Hydroxysulfosuccinimid
EDC: (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES: N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
bipy: bispyridyl-Ligand
py: pyridyl-Ligand
im: imidazol-Ligand
Alkyl: Der Begriff "Alkyl" bezeichnet eine gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, die geradkettig oder verzweigt ist (z. B. Ethyl, 2,5-Dimethylhexyl oder Isopropyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. -CH2
PQQ: Pyrrolo-Chinolino-Chinon, 4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H-pyr rolo-[2,3-f]-chinolin-2,7,9-tricarboxylsäure)
EDTA: Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
sulfo-NHS: N-Hydroxysulfosuccinimid
EDC: (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES: N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
bipy: bispyridyl-Ligand
py: pyridyl-Ligand
im: imidazol-Ligand
Alkyl: Der Begriff "Alkyl" bezeichnet eine gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe, die geradkettig oder verzweigt ist (z. B. Ethyl, 2,5-Dimethylhexyl oder Isopropyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. -CH2
CH2
-, -CH2
C(CH3
)2
CH2
CH2
C(CH3
)2
CH2
- oder
-CH2
CH2
CH2
- etc.). Bevorzugte Alkylgruppen als
Substituenten oder Seitenketten R sind solche der
Kettenlänge 1-30 (längste durchgehende Kette von
kovalent aneinander gebundenen Atomen). Bevorzugte
Alkylgruppen als Linker oder Spacer sind solche der
Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14,
wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende
Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen,
also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem
Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer
Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül,
darstellt.
Alkenyl: Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind.
Alkinyl: Alkyl- oder Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C∼C- Dreifachbindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkyl: Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C-C Einfachbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkenyl: Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C∼S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkinyl: Alkinylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C=-C Dreifachbindung durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Linker: molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer: Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Alkenyl: Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind.
Alkinyl: Alkyl- oder Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C∼C- Dreifachbindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkyl: Alkylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C-C Einfachbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkenyl: Alkenylgruppen, bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C∼S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkinyl: Alkinylgruppen, bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C=-C Dreifachbindung durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Linker: molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer: Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
Mica: Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner
Schichten.
Au-S-(CH2
Au-S-(CH2
)2
-ss-oligo-
Spacer-UQ(RC): Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer
aus derivatisiertem 12Bp Einzelstrang DNA-Oligonukleotid
(Sequenz: TAGTCGGAAGCA). Hierbei ist die endständige
Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3'-Ende mit (HO-(CH2
)2
-S)2
zum P-O-(CH2
)2
-S-S-(CH2
)2
-OH verestert, wobei
die S-S Bindung homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R
Bindung bewirkt. Die endstandige Base Thymin am 5'-Ende
des Oligonukleotids ist am C-5 Kohlenstoff mit
-CH=CH-CO-NH-CH2
-CH2
-NH2
modifiziert und dieser Rest
wiederum ist über seine freie Aminogruppe durch
Amidbildung mit der Carbonsäuregruppe des modifizierten
Ubichinon-50 verbunden und anschließend mit dem
restlichen RC rekonstituiert.
Au-S(CH2
Au-S(CH2
)2
-ds-oligo-
Spacer-UQ(RC): Au-S-(CH2
)2
-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) hybridisiert mit dem
zu ss-oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA)
komplementären Oligonukleotid.
Au-S-(CH2
Au-S-(CH2
)2
-ss-oligo-
Spacer-Q-ZnBChl: identisch zu Au-S-(CH2
)2
-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) mit der
Ausnahme, daß, statt des über UQ angebundenen RCs, Q-ZnBChl
als photoinduzierbar redoxaktive Einheit
angebunden ist.
Au-S-(CH2
Au-S-(CH2
)2
-ds-oligo-
Spacer-Q-ZnBChl: Au-S-(CH2
)2
-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl hybridisiert mit dem
ss-oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA)
komplementären Oligonukleotid.
E: Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
EOx
EOx
: Potential beim Strom-Maximum der Oxidation einer
reversiblen Elektrooxidation oder -reduktion.
i: Stromdichte (Strom pro cm2
i: Stromdichte (Strom pro cm2
Elektrodenoberfläche)
Cyclovoltametrie: Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungs kurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie: Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Cyclovoltametrie: Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential, bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential, bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungs kurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie: Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Oligomer, das durch chemische
Bindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit modifiziert ist, wobei die
photoinduzierbar redoxaktive Einheit nach Abgabe oder Aufnahme eines Elektrons
an einen externen Elektron-Donor oder Elektron-Akzeptor, z. B. eine Elektrode,
durch eine freie redoxaktive Substanz re-reduziert bzw. re-oxidiert, also in seinen
ursprünglichen Zustand zurückversetzt werden kann.
Als Nukleinsäure-Oligomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine
Verbindung aus wenigstens zwei kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus
wenigstens zwei kovalent verbundenen Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder
Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder
PNA-Fragment, verwendet. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der
Begriff Nukleinsäure auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen
Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA,
cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Rückgrat-
Strukturen, wie z. B. ein Phosphorothioat-, ein Phosphorodithioat- oder ein
Phosphoramid-Rückgrat. Alternativ zu dem Begriff "Nukleinsäure-Oligomer" werden
die Begriffe "(Probe-) Oligonukleotid", "Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet.
Unter einer "photoinduzierbar redoxaktiven Einheit" wird im Rahmen der
vorliegenden Erfindung jede Einheit verstanden, die einen oder mehrere Elektron-
Donor-Moleküle oder -Molekülteile und einen oder mehrere Elektron-Akzeptor-
-Moleküle oder -Molekülteile enthält. Die Elektron-Donor-Molekül(e) oder
Molekülteil(e) und Elektron-Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) dieser
photoinduzierbar redoxaktiven Einheit können untereinander durch eine oder
mehrere kovalente oder ionische Bindungen, durch Wasserstoff-Brücken-
Bindungen, van-der-Waals-Brücken, durch π-π-Wechselwirkung oder durch
Koordination mittels Elektronenpaar-Donation und -Akzeptation miteinander
verbunden sein. Außerdem können die Elektron-Donor-Molekül(e) oder
-Molekülteil(e) und Elektron-Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) in ein oder
mehrere Makromolekül(e) eingebunden sein, wobei diese Einbindung durch
Einkapseln in molekulare Kavitäten der Makromolekül(e), durch Wasserstoff-
Brücken-Bindungen, van-der-Waals-Brücken oder π-π-Wechselwirkung zwischen
dem(n) Makromolekül(en) und dem(n) Elektron-Donor-Molekül(en) oder -Mole
külteil(en) und/oder dem(n) Elektron-Akzeptor-Molekül(en) oder -Molekülteil(en)
erfolgt. In diesem Fall bilden also die Makromolekül(e) und die Elektron-Donor-
Molekül(e) oder -Molekülteil(e) und die Elektron-Akzeptor-Molekül(e) oder
-Molekülteil(e) die photoinduzierbar redoxaktive Einheit. Die photoinduzierbar
redoxaktive Einheit kann also z. B. ein photoinduzierbar redoxaktives Protein oder
Enzym, ein photoinduzierbar redoxaktiver, kovalent verknüpfter (wenigstens
bimolekularer) Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex oder ein photoinduzierbar
redoxaktiver Charge-Transfer-Komplex sein. Die angesprochenen Donor- und
Akzeptor-Moleküle (oder -Molekülteile) bilden erfindungsgemäß eine redoxaktive
Einheit, d. h. sie sind direkt oder über weitere Molekülteile aneinander gebunden.
Einzige erfindungsgemäße Einschränkung der die Bestandteile der photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit verbindenden Moleküle oder Molekülteile ist der Ausschluß von
Nukleinsäure-Oligomeren. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die
photoinduzierbar redoxaktive Einheit als eine komplette Einheit an das Probe-
Oligonukleotid gebunden, wobei natürlich mehrere chemische Bindungen zwischen
Oligonukleotid und der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit ausgebildet werden
können. Durch den Ausschluß von Nukleinsäure-Oligomeren als die die Bestandteile
der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit verbindenden Moleküle oder Molekülteile
soll verdeutlicht werden, daß nicht einzelne Teile der photoinduzierbar redoxaktiven
Einheit an verschiedenen Stellen des Probe-Oligonukleotids angebunden sind. Das
Probe-Oligonukleotid stellt also explizit nicht die Verbindung zwischen den Elektron-
Donor-Molekül(en) oder -Molekülteil(en) und den Elektron-Akzeptor-Molekül(en)
oder -Molekülteil(en) der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit dar.
"Photoinduzierbar" heißt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die
Redoxaktivität der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, also deren Eigenschaft
unter bestimmten äußeren Umständen an einen geeigneten Elektron-Akzeptor
Elektronen abzugeben oder von einem geeigneten, externen Elektron-Donor
Elektronen aufzunehmen, erst durch Einstrahlen von Licht bestimmter oder
beliebiger Wellenlänge entfaltet wird. Durch Einstrahlung von Licht bestimmter oder
beliebiger Wellenlänge gibt der Elektron-Donor an einen der Elektron-Akzeptoren
ein Elektron ab und es bildet sich, zumindest temporär, ein ladungsgetrennter
Zustand D⁺A⁻ aus oxidiertem Donor und reduziertem Akzeptor. Dieser Vorgang
innerhalb der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit wird als photoinduzierte
Ladungstrennung bezeichnet. Bei entsprechend gewählten äußeren Umständen
entfaltet die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ihre Redoxaktivität erst im
ladungsgetrennten Zustand, da die externen Donoren (bzw. Akzeptoren) nur auf den
oxidierten Donor (bzw. vom reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktiven
Einheit Elektronen übertragen (bzw. aufnehmen), z. B. in Gegenwart eines externen
Oxidationsmittels, das A⁻, jedoch nicht A, oxidieren kann (bzw. in Gegenwart eines
Reduktionsmittels, das D⁺, jedoch nicht D, reduziert kann). Entsprechend kann eine
photoinduzierbar redoxaktive Einheit auch erst nach der photoinduzierten
Ladungstrennung ein Elektron an eine Elektrode abgeben (bzw. von dieser
aufnehmen), wenn die Elektrode auf ein Potential gesetzt wird, bei dem A⁻, jedoch
nicht A, oxidiert (bzw. D⁺, jedoch nicht D, reduziert) wird.
Mit dem Begriff "freie redoxaktive Substanz" wird im Rahmen der vorliegenden
Erfindung eine nicht an ein Nukleinsäure-Oligomer gebundene, aber mit dem
Nukleinsäure-Oligomer in Kontakt stehende, redoxaktive Substanz bezeichnet,
wobei diese Substanz z. B. ein ungeladenes Molekül, eine beliebiges Salz oder ein
redoxaktives Protein oder Enzym (Oxydoreductase) sein kann. Die freie redoxaktive
Substanz ist dadurch gekennzeichnet, daß sie den oxidierten Donor (bzw. den
reduzierten Akzeptor) der photoinduzierbar redoxaktive Einheit re-reduzieren (bzw.
reoxidieren) kann. Des weiteren ist die freie redoxaktive Substanz dadurch
gekennzeichnet, daß sie bei einem Potential ϕ oxidierbar und reduzierbar ist, wobei
ϕ der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧-2,0 V genügt. Das Potential bezieht sich hierbei auf das
freie redoxaktive Molekül in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen gegen
Normalwasserstoffelektrode. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der
Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧-1.7 V bevorzugt, wobei der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧-1,2 V
besonders bevorzugt ist und der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧-0,7 V, in dem die redoxaktiven
Substanzen der Anwendungsbeispiele oxidiert (bzw. reduziert) werden, ganz besonders
bevorzugt ist.
Das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer ist direkt oder indirekt (über einen Spacer)
an eine leitfähige Oberfläche gebunden. Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche"
wird jede elektrisch leitfähige Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere
metallische Oberflächen, Oberflächen aus Metallegierungen oder dotierte oder nicht
dotierte Halbleiteroberflächen, wobei sämtliche Halbleiter als Reinsubstanzen oder
als Gemische Verwendung finden können. Die leitfähige Oberfläche kann im
Rahmen der vorliegenden Erfindung alleine oder auf einem beliebigen
Trägermaterial, wie z. B. Glas, aufgebracht vorliegen. Im Rahmen der vorliegenden
Erfindung wird der Begriff "Elektrode" alternativ zu "leitfähige Oberfläche" gebraucht.
Unter dem Begriff "modifizierte leitfähige Oberfläche" wird eine leitfähige Oberfläche
verstanden, die durch Anbindung eines mit einer photoinduzierbar redoxaktiven
Einheit modifizierten Nukleinsäure-Oligomers modifiziert ist.
Gemäß eines weiteren Aspekts betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das
die elektrochemische Detektion molekularer Strukturen, insbesondere die
elektrochemische Detektion von DNA-/RNA-/PNA-Fragmenten in einer
Probenlösung durch sequenzspezifische Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierung
ermöglicht. Die Detektion der Hybridisierungsereignisse durch elektrische Signale ist
eine einfache und kostengünstige Methode und ermöglicht in einer
batteriebetriebenen Variante den Einsatz vor Ort.
Außerdem stellt betrifft die vorliegende Erfindung ein photoadressierbares
Ausleseverfahren zur Detektion molekularer Strukturen zur Verfügung, unter
anderem zur Detektion von Hybridisierungsereignissen auf einem Oligomer-Chip
durch z. B. elektrische Signale. Erfindungsgemäß wird unter photoadressierbarem
(Oligomer-Chip-) Ausleseverfahren ein Verfahren verstanden, bei dem die Detektion
molekularer Strukturen auf ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-
Gruppe innerhalb des Gesamtsystems (des kompletten Oligomer-Chips) begrenzt
wird, indem Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge zur Induktion der
Redoxaktivität der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit räumlich auf diese Test-
Site (-Gruppe) fokussiert (begrenzt) wird.
Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Bindung einer
photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer. Als Beispiele
einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit seien genannt:
- (i) das photosynthetische bakterielle Reaktionszentrum (RC), wie z. B. das RC von Rhodobacter sphaeroides mit der schematischen Struktur 1, das RC anderer photosynthetischer Bakterien, wie z. B. das Reaktionszentrum von Rhodopseudomonas viridis oder von Rhodobacter capsulatus, oder ein Reaktionszentrum der Photosynthese betreibenden Pflanzen, wie z. B. das Photosystem 1 oder das Photosystem 2, als Beispiele für ein photoinduzierbar redoxaktives Protein/Enzym.
- (ii) Cyclophane, also verbrückte Porphyrin-Chinon-Systeme, der allgemeinen Struktur 2 als Beispiel für einen photoinduzierbar redoxaktiven, kovalent verknüpften, wenigstens bimolekularen Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplex. Die beiden Spacer-verbrückten, kovalenten Verbindungen zwischen dem Elektron- Akzeptor (1,4-Benzochinon in der Struktur 2) und dem Elektron-Donor (Porphyrin in der Struktur 2) können an beliebigen Stellen des Elektron-Donors und/oder Elektron- Akzeptors angebracht sein. Neben den in der Struktur 2 gezeigten Elektron- Akzeptoren können auch Flavine der allgemeinen Formel 1, Nicotinsäureamide der allgemeinen Formel 2 oder andere Chinone, z. B. solche der allgemeinen Formeln 3-8 oder organische bzw. anorganische Elektron-Akzeptoren und außerdem neben den (Metallo-)Porphyrinen der allgemeinen Formel 9 andere Elektron-Donoren, wie z. B. (Metallo-)Chlorophylle der allgemeinen Formel 10 oder (Metallo-) Bakteriochlorophylle der allgemeinen Formel 11 oder andere organische bzw. anorganische Elektron-Donoren verwendet werden. Daneben können auch einfach kovalent (Spacer-)verbrückte Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplexe wie z. B. kovalente Verbindungen einer Substanz gemäß Formel 9 und einer der Substanzen gemäß einer der Formeln 1-8, kovalente Verbindungen einer Substanz gemäß Formel 10 und einer der Substanzen gemäß einer der Formeln 1-8 oder kovalente Verbindungen einer Substanz gemäß Formel 11 und einer der Substanzen gemäß einer der Formeln 1-8 als photoinduzierbar redoxaktive, kovalent verknüpfte, wenigstens bimolekulare Elektron-Donor/Elektron-Akzeptor-Komplexe verwendet werden.
- (iii) Übergangsmetall-Komplexe wie z. B. [Ru(bipy)2(py)(im)]2+ der allgemeinen Struktur 3, beliebige andere [Ru(II)(L1)(L2)(L3)(L4)(L5)(L6)]-Komplexe, Cr(III)-, Fe(II)-, Os(II)-, oder Co(II)-Komplexe als Beispiele für einen photoinduzierbar redoxaktiven Charge-Transfer-Komplex.
Struktur 1: Reaktionszentrum bestehend aus den Cofaktoren P (primärer Donor, ein
Bakteriochlorophyll Dimer), BA und BB (Bakteriochlorophyll Monomere), HA und HB
(Bakteriopheophytine), QA und QB (Ubichinon-50) und den Proteinuntereinheiten L,
M, und H (nicht gezeigt), die die Cofaktoren einhüllen.
M = z. B. 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc.; R1 bis R8, Spacer = z. B.
beliebiger Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder
Heteroalkinyl-Substituent.
R1 bis R8 = beliebiger Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder
Heteroalkinyl-Substituent.
M = 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc.; R1 bis R8 = beliebiger Alkyl-,
Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituent.
Daneben zeichnet sich die photoinduzierbar redoxaktive Einheit erfindungsgemäß
dadurch aus, daß besagte Einheit an einen anderen, ebenfalls kovalent an das
Nukleinsäure-Oligomer angebundenen Elektron-Akzeptor photoinduziert Elektronen
abgibt bzw. von einen anderen ebenfalls kovalent an das Oligonukleotid
angebundenen Elektron-Donor photoinduziert Elektronen aufnimmt, wobei dieser
andere Elektron-Donor oder Elektron-Akzeptor insbesondere eine elektrisch
leitfähige Oberfläche (Elektrode) ist und die photoinduzierbar redoxaktive Einheit
durch Anlegen einer äußeren Spannung an dieser Elektrode im elektrochemisch
zugänglichen Potentialbereich der Elektrode elektrooxidiert/-reduziert werden kann.
Die redoxaktive Substanz zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, daß sie die
photoinduzierbar redoxaktive Einheit, nach deren Elektron-Abgabe an einen
anderen, von der redoxaktiven Substanz verschiedenen, kovalent an das
Oligonukleotid angebundenen Elektron-Akzeptor re-reduzieren kann (nach deren
Elektron-Aufnahme von einem anderen, von der redoxaktiven Substanz
verschiedenen, kovalent an das Oligonukleotid angebundenen Elektron-Donor re
oxidieren kann). Die redoxaktive Substanz stellt also die photoinduzierbar
redoxaktive Einheit in ihrem ursprünglichen, vor der photoinduzierten Abgabe bzw.
Aufnahme eines Elektrons an den anderen, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-
Oligomer angebundenen Elektron-Akzeptors bzw. Elektron-Donors vorhandenen
Zustand, wieder her. Erfindungsgemäß kann dazu jede redoxaktive Substanz
verwendet werden, solange sie bei einem Potential ϕ, das der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧-2,0 V
genügt, oxidierbar und reduzierbar ist und das Potential geeignet ist, besagte
photoinduzierbar redoxaktive Einheit nach deren Elektron-Abgabe an einen
anderen, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenen Elektron-
Akzeptor zu re-reduzieren (bzw. nach deren Aufnahme eines Elektrons von einen
anderen, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenen Elektron-
Donor zu re-oxidieren). Das Potential bezieht sich hierbei auf die freie,
unmodifizierte, redoxaktive Substanz in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen
gegen Normalwasserstoffelektrode. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der
Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧-1,7 V bevorzugt, wobei der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧-1,2 V
besonders bevorzugt ist und der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧-0,7 V, in dem die
redoxaktiven Substanzen der Anwendungsbeispiels oxidiert (und rereduziert)
werden, ganz besonders bevorzugt ist. Geeignet sind, neben den üblichen
organischen und anorganischen redoxaktiven Molekülen wie z. B.
Hexacyanoferraten, Ferrocenen, Cobaltocenen und Chinonen vor allem die
Ascorbinsäure (oder das Na⁺ Salz davon), [Ru(NH3)6]2+, oder Cytochrom c2 (cyt
c2)2+, ein frei bewegliches eisenhaltiges Protein, das den oxidierten primären Donor
P⁺ in RC von Rhodobacter sphaeroides zu P reduziert und dabei selbst zu (cyt c2)3+
oxidiert wird.
Erfindungsgemäß wird eine photoinduzierbar redoxaktive Einheit an ein
Nukleinsäure-Oligomer kovalent durch die Reaktion des Nukleinsäure-Oligomers mit
der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit oder Teilen davon (siehe auch Abschnitt
"Wege zur Ausführung der Erfindung") gebunden. Diese Bindung kann auf vier
verschiedene Arten durchgeführt werden:
- a) Als reaktive Gruppe zur Bindungsbildung am Nukleinsäure-Oligomer wird eine freie Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe des Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere eine Gruppe an einem der beiden Enden des Oligonukleotid-Rückgrats, verwendet. Die freien, endständigen Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. Amidbildung mit (primären oder sekundären) Aminogruppen bzw. mit Säuregruppen, Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. mit Säuregruppen, Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkoholen bzw. mit Säuregruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung ein. Die zur kovalenten Anbindung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit nötige Kopplungsgruppe (Säure-, Amin-, Alkohol-, Thioalkohol- oder Aldehydfunktion) ist entweder natürlicherweise an der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit vorhanden oder wird durch chemische Modifikation der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit erhalten. Die Anbindung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Teilen der Einheit mit anschließender Vervollständigung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit erfolgen (siehe unten).
- b) Das Nukleinsäure-Oligomer ist über einen kovalent angebundenen Molekülteil (Spacer) beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge (längste durchgehende Kette von aneinander gebundenen Atomen), insbesondere der Kettenlänge 1 bis 14, am Oligonukleotid-Rückgrat bzw. an einer Base mit einer reaktiven Gruppe modifiziert. Die Modifikation erfolgt bevorzugt an einem der Enden des Oligonukleotid-Rückgrats bzw. an einer terminalen Base. Als Spacer kann z. B. ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinylsubstituent verwendet werden. Mögliche einfache Reaktionen zur Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen photoinduzierbar redoxaktiver Einheit und des so modifizierten Nukleinsäure- Oligomers sind wie unter a) beschrieben, die Amidbildung aus Säure- und Amino- Gruppe, die Esterbildung aus Säure- und Alkohol-Gruppe, die Thioesterbildung aus Säure- und Thio-Alkohol-Gruppe oder die Kondensation von Aldehyd und Amin mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung. Die Anbindung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Teilen der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit mit anschließender Vervollständigung der Einheit erfolgen (siehe unten).
- c) Bei der Synthese des Nukleinsäure-Oligomers wird eine terminale Base durch die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ersetzt. Diese Anbindung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Teilen der Einheit mit anschließender Vervollständigung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit erfolgen (siehe unten).
- d) Bei der Verwendung eines kovalent verknüpften (wenigstens bimolekularen) Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes als photoinduzierbar redoxaktiver Einheit wird der Elektron-Akzeptor (oder -Donor) in einer ersten kovalenten Modifikation, wie unter b) oder c) in diesem Abschnitt beschrieben, an eine oder statt einer terminalen Base an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden und anschließend in einer zweiten kovalenten Modifikation der Elektron-Donor (oder -Akzeptor), wie unter a) in diesem Abschnitt beschrieben, am selben Ende des Nukleinsäure-Oligomer- Rückgrats an eine reaktive Gruppe des Rückgrats gebunden. Bei Verwendung eines kovalent verknüpften, tri- oder höhermolekularen Elekton-Donor-/Elektron-Akzeptor- Komplexes kann, statt des Elektron-Akzeptors (oder -Donors), auch ein beliebiger Teil des Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes in der ersten kovalenten Modifikation verwendet und in der zweiten kovalenten Modifikation komplettiert werden.
Erfindungsgemäß kann die Bindung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an
das Nukleinsäure-Oligomer ganz oder in Teilen vor oder nach der Bindung des
Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche erfolgen. So kann im Falle
eines photoinduzierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms aus Apoprotein und
Cofaktor(en) statt der kompletten photoinduzierbar redoxaktiven Einheit auch nur
das Apoprotein oder ein Cofaktor angebunden sein und die photoinduzierbar
redoxaktive Einheit wird durch anschließende Rekonstitution mit den noch fehlenden
Teilen komplettiert. Bei der Verwendung eines kovalent verknüpften (wenigstens
bimolekularen) Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes als photoinduzierbar
redoxaktiver Einheit wird der Elektron-Akzeptor (oder -Donor) in einer ersten
kovalenten Modifikation, wie unter b) oder c) in diesem Abschnitt beschrieben, an
oder statt einer terminalen Base an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden und
anschließend in einer zweiten kovalenten Modifikation der Elektron-Donor (oder -Akzeptor),
wie unter a) in diesem Abschnitt beschrieben, am selben Ende des
Nukleinsäure-Oligomer-Rückgrats an eine reaktive Gruppe des Rückgrats
gebunden. Bei Verwendung eines kovalent verknüpften, tri- oder höhermolekularen
Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplexes kann, statt des Elektron-Akzeptors
(oder -Donors), auch ein beliebiger Teil des Elekton-Donor-/Elektron-Akzeptor-
Komplexes in der ersten kovalenten Modifikation verwendet und in der zweiten
kovalenten Modifikation komplettiert werden. Diese Modifikationen können vor oder
nach der Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche erfolgen.
Bei mehreren verschiedenen Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen (Test-Sites) auf
einer gemeinsamen Oberfläche ist es vorteilhaft, die (kovalente) Anbindung der
photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an die Nukleinsäure-Oligomere durch
geeignete Wahl der reaktiven Gruppe an den freien Nukleinsäure-Oligomerenden
der verschiedenen Test-Sites für die gesamte Oberfläche zu vereinheitlichen, wenn
die photoinduzierbar redoxaktive Einheit nach Immobilisierung des Nukleinsäure-
Oligomers an der Oberfläche angebunden werden soll.
Bei Verwendung von photoinduzierbar redoxaktiven Proteinen/Enzymen als
photoinduzierbar redoxaktiver Einheit kann die kovalente Anbindung des
Nukleinsäure-Oligomers an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch
Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe des Proteins erfolgen oder - in dem
Falle, daß das photoinduzierbar redoxaktive Protein/Enzym aus Apoprotein und
Cofaktor(en) besteht - an eine beliebige, natürlicherweise vorhandene oder durch
Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe eines (beliebigen) Cofaktors. Im Rahmen
der vorliegenden Erfindung ist die kovalente Anbindung an eine beliebige,
natürlicherweise vorhandene oder durch Modifikation angebrachte, reaktive Gruppe
eines (beliebigen) Cofaktors des Proteins bevorzugt. Ohne an mechanistische
Details gebunden sein zu wollen, ist bei mehreren Cofaktoren derjenige besonders
bevorzugt, der Elektronen an einen anderen, externen, ebenfalls kovalent an das
Nukleinsäure-Oligomer angebundenen Elektron-Akzeptor abgeben oder von einem
anderen, externen, ebenfalls kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer angebundenen
Elektron-Donor aufnehmen kann (siehe auch Abschnitt "Verfahren zur
amperometrischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden").
Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird erfindungsgemäß jeder Träger mit
einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere
Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink,
Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan.
Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen
beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als
Reinsubstanzen oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend
gemeinte Beispiele seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn,
Cu(I)- und Ag(I)-Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind
ebenfalls sämtliche binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und
beliebiger Struktur aus den Elementen der Gruppen 14 und 16, den Elementen der
Gruppen 13 und 15, sowie den Elementen der Gruppen 15 und 16. Daneben können
ternäre Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur aus den
Elementen der Gruppen 11, 13 und 16 oder den Elementen der Gruppen 12, 13 und
16 verwendet werden. Die Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der
Elemente beziehen sich auf die IUPAC-Empfehlung von 1985.
Erfindungsgemäß wird ein Nukleinsäure-Oligomer direkt oder über einen
Linker/Spacer mit den Oberflächenatomen oder -molekülen einer leitfähigen
Oberfläche der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf drei
verschiedene Arten durchgeführt werden:
- a) Die Oberfläche wird so modifiziert, daß eine reaktive Molekül-Gruppe zugänglich
ist. Dies kann durch direkte Derivatisierung der Oberflächenmoleküle, z. B. durch
naßchemische oder elektrochemische Oxidation/Reduktion geschehen. So kann z. B.
die Oberfläche von Graphitelektroden durch Oxidation naßchemisch mit Aldehyd- oder
Carbonsäure-Gruppen versehen werden. Elektrochemisch besteht z. B. die
Möglichkeit durch Reduktion in Gegenwart von Aryl-Diazoniumsalzen das
entsprechende (funktionalisierte, also mit einer reaktiven Gruppe versehene) Aryl-
Radikal oder durch Oxidation in Gegenwart von R'CO2H das (funktionalisierte) R'-
Radikal auf der Graphit-Elektrodenoberfläche anzukoppeln. Ein Beispiel der direkten
Modifikation von Halbleiteroberflächen ist die Derivatisierung von
Siliziumoberflächen zu reaktiven Silanolen, d. h. Silizium-Träger mit Si-OR'' Gruppen
an der Oberfläche, wobei R'' ebenso wie R' einen beliebigen, funktionalisierten,
organischen Rest darstellt (z. B. Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-,
Heteroalkenyl- oder Heteroalkinylsubstituent). Alternativ kann die gesamte
Oberfläche durch die kovalente Anbindung einer reaktiven Gruppe eines
bifunktionalen Linkers modifiziert werden, so daß auf der Oberfläche eine
monomolekulare Schicht beliebiger Moleküle entsteht, die, bevorzugt endständig,
eine reaktive Gruppe enthalten. Unter dem Begriff "bifunktionaler Linker" wird jedes
Molekül beliebiger Kettenlänge, insbesondere der Kettenlängen 2-14, mit zwei
gleichen (homo-bifunktional) oder zwei verschiedenen (hetero-bifunktional) reaktiven
Molekül-Gruppen verstanden.
Sollen mehrere verschiedene Test-Sites auf der Oberfläche durch Ausnutzen der Methodik der Photolithographie gebildet werden, so ist mindestens eine der reaktiven Gruppen des homo- oder hetereo-bifunktionalen Linkers eine photoinduzierbar reaktive Gruppe, d. h. eine erst durch Lichteinstrahlung bestimmter oder beliebiger Wellenlänge reaktiv werdende Gruppe. Dieser Linker wird so aufgebracht, daß die/eine photoaktivierbare reaktive Gruppe nach der kovalenten Anbindung des Linkers auf der Oberfläche zur Verfügung steht. An die so modifizierte Oberfläche werden die Nukleinsäure-Oligomere kovalent angebunden, wobei diese selbst über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 0-14, mit einer reaktiven Gruppe modifiziert sind, bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers. Bei der reaktiven Gruppe des Oligonukleotids handelt es sich um Gruppen, die direkt (oder indirekt) mit der modifizierten Oberfläche unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagieren. Daneben kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres anderen Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 0-14, angebunden ist. Desweiteren kann die photoinduzierbar redoxaktive Einheit (komplett oder Bestandteile davon), alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem anderen Ende des Nukleinsäure-Oligomers angebunden sein. - b) Das Nukleinsäure-Oligomer, das auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht werden soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 0-14, mit einer reaktiven Gruppe modifiziert, wobei sich die reaktive Gruppe bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers befindet. Bei den reaktiven Gruppen handelt es sich um Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte Nukleinsäure- Oligomere der allgemeinen Formel HS-Spacer-oligo bzw. R-S-S-Spacer-oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter Ausbildung einer Gold-Schwefelbindung reagieren oder (ii) Amine, die sich durch Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern. Daneben kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres anderen Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 0-14, angebunden ist. Des weiteren kann die photoinduzierbar redoxaktive Einheit (komplett oder Bestandteile davon), alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an diesem anderen Ende des Oligonukleotids angebunden sein.
- c) Als reaktive Gruppe am Probe-Nukleinsäure-Oligomer werden die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen des Oligonukleotid-Phosphatgerüstes, insbesondere endständige Gruppen, verwendet.
Die Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte
Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. Amidbildung mit
(primären oder sekundären) Amino- bzw. Säuregruppen, Esterbildung mit (primären,
sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. Säuregruppen, Thioesterbildung mit
(primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkoholen bzw. Säuregruppen oder die
Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender Reduktion der
entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung ein. Die nötige Kopplungs-
Gruppe zur kovalenten Anbindung an die Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-,
Carbonsäure- oder Amin-Gruppe ist in diesem Fall ein Teil der
Oberflächenderivatisierung mit einer (monomolekularen) Schicht beliebiger
Moleküllänge, wie unter a) in diesem Abschnitt beschrieben, oder die
Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe kann direkt
mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren, wie unter b) in diesem Abschnitt
beschrieben. Daneben kann an die Oligonukleotide in der Nähe ihres anderen
Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe
wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger
Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 0-14,
angebunden ist. Desweiteren kann die photoinduzierbar redoxaktive Einheit
(komplett oder Bestandteile davon), alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe,
an diesem anderen Ende des Nukleinsäure-Oligomers angebunden sein.
Die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche kann vor oder
nach der Anbindung der photoinduzierbar redoxaktive Einheit an das Nukleinsäure-
Oligomer erfolgen. Im Falle eines photoinduzierbar redoxaktiven Proteins/Enzyms
aus Apoprotein und Cofaktor(en) kann statt der kompletten photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit auch nur das Apoprotein oder Cofaktor angebunden sein und
die photoinduzierbar redoxaktive Einheit wird durch anschließende Rekonstitution
mit den noch fehlenden Teilen komplettiert. Bei der Verwendung eines kovalent
verknüpften (wenigstens bimolekularen) Elekton-Donor-/Elektron-Akzeptor-
Komplexes als photoinduzierbar redoxaktive Einheit kann der Elektron-Akzeptor (bzw.
-Donor), wie unter b) oder c) im Abschnitt "Bindung einer photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben, an eine oder statt
einer terminalen Base an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden sein und der
Elektron-Donor (bzw. -Akzeptor) durch anschließende kovalente Anbindung oder,
wie unter a) im Abschnitt "Bindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an
ein Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben, durch anschließende Anbindung an eine
terminale reaktive Gruppe des Nukleinsäure-Oligomer-Rückgrats am selben Ende
gebunden werden (siehe auch den Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung").
Alternativ kann die Bindung des Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige
Oberfläche vor oder nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen
Spacers zur Bindung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit erfolgen. Die
Bindung des bereits modifizierten Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige
Oberfläche, d. h. die Bindung an die Oberfläche nach der Anbindung der
photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer bzw. nach der
Anbindung von Teilen der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit oder nach
Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der
photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, erfolgt ebenfalls wie unter a) bis c) in diesem
Abschnitt beschrieben.
Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Anbindung der Einzelstrang-
Nukleinsäure-Oligomere an die Oberfläche darauf geachtet werden, daß zwischen
den einzelnen Nukleinsäure-Oligomeren ein genügend großer Abstand verbleibt, um
zum einen den für eine Hybridisierung mit dem Target-Nukleinsäure-Oligomer
nötigen Freiraum und zum anderen den für die Anbindung der photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit nötigen Freiraum zur Verfügung zu stellen. Dazu bieten sich
insbesondere drei verschiedene Vorgehensweisen (und Kombinationen daraus) an:
- 1. Herstellung einer modifizierten Oberfläche durch Anbindung eines hybridisierten Nukleinsäure-Oligomers, also eine Oberflächen-Derivatisierung mit hybridisiertem Probe-Nukleinsäure-Oligomer statt mit Einzelstrang-Probe-Oligonukleotid. Der zur Hybridisierung verwendete Nukleinsäure-Oligomer-Strang ist unmodifiziert (die Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a)-c) in diesem Abschnitt beschrieben). Anschließend wird der hybridisierte Nukleinsäure-Oligomer- Doppelstrang thermisch dehybridisiert, wodurch eine mit Einzelstrang-Nukleinsäure- Oligomer modifizierte Oberfläche mit größerem Abstand zwischen den Probe- Nukleinsäure-Oligomeren hergestellt wird.
- 2. Herstellung einer modifizierten Oberfläche durch Anbindung eines Einzelstrang- oder Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomers, wobei während der Oberflächen- Derivatisierung mit Einzelstrang-Probe-Nukleinsäure-Oligomer ein geeigneter monofunktionaler Linker zugesetzt wird, der neben dem Einzelstrang- oder Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer ebenfalls an die Oberfläche gebunden wird (die Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a)-c) in diesem Abschnitt beschrieben). Erfindungsgemäß hat der monofunktionale Linker eine Kettenlänge, die der Kettenlänge des Spacers zwischen der Oberfläche und dem Nukleinsäure- Oligomer identisch ist oder um maximal vier Kettenatome abweicht. Bei der Verwendung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer gemeinsam mit geeignetem monofunktionalen Linker zur Oberflächen-Derivatisierung wird der Nukleinsäure- Oligomer-Doppelstrang nach der gemeinsamen Anbindung des Doppelstrang- Nukleinsäure-Oligomers und des Linkers an die Oberfläche thermisch dehybridisiert.
- 3. Herstellung einer modifizierten Oberfläche durch Anbindung eines Einzelstrang- oder Doppelstrang-Oligonukleotids, an das die photoinduzierbar redoxaktive Einheit bereits angebunden ist, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit einen Durchmesser von größer als 30 A aufweist. Bei der Verwendung von Doppelstrang- Oligonukleotid wird der Oligonukleotid-Doppelstrang nach der Anbindung des Doppelstrang-Oligonukleotids an die Oberfläche thermisch dehybridisiert.
Im Bezug auf die einzelnen Schritte zur "Bindung einer photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-Oligomer" als auch zur "Bindung eines
Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche" sei darauf verwiesen, daß im Abschnitt
"Wege zur Ausführung der Erfindung" die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten
der einzelnen Schritte, die zum selben Endergebnis führen, an einem Beispiel
demonstriert sind (Fig. 2).
Vorteilhafterweise werden gemäß dem Verfahren zur elektrochemischen Detektion
von Nukleinsäure-Oligomer-Hybriden mehrere Probe-Nukleinsäure-Oligomere
unterschiedlicher Sequenz, idealerweise alle möglichen Kombinationen des
Nukleinsäure-Oligomers, auf einem Oligomer (DNA)-Chip aufgebracht, um die
Sequenz eines beliebigen Target-Nukleinsäure-Oligomers oder einer
(fragmentierten) Target-DNA zu detektieren bzw. um Mutationen im Target
aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer
leitfähigen Oberfläche die Oberflächenatome oder -moleküle eines definierten
Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-/RNA-/PNA-Nukleinsäure-Oligomeren bekannter,
aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. Als Probe- Nukleinsäure-
Oligomere werden Nukleinsäure-Oligomere (z. B. DNA-, RNA- oder PNA-
Fragmente) der Basenlänge 3 bis 30, bevorzugt der Länge 5 bis 25, besonders
bevorzugt der Länge 6 bis 18 verwendet. Erfindungsgemäß wird oder ist an die
Probe-Nukleinsäure-Oligomere, wie nachfolgend beschrieben, eine
photoinduzierbar redoxaktive Einheit gebunden.
Die Modifikation der Probe-Nukleinsäure-Oligomere mit einer photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit kann komplett oder in Bestandteilen der photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit entweder vor oder nach der Bindung des Probe-Oligonukleotids
an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten
der einzelnen Schritte (Reaktionssequenzen), sind mit Hilfe der Fig. 2 am Beispiel
einer über ein Probe-Oligonukleotid an eine Elektrode gebundenen photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit im Abschnitt "Wege zur Ausführung der Erfindung"
demonstriert.
Unabhängig von der jeweiligen Reaktionssequenz entsteht ein Oberflächen-Hybrid
der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit, wobei "Einheit"
repräsentativ für die photoinduzierbar redoxaktive Einheit steht. Im Beispiel der
Fig. 2 ist die photoinduzierbar redoxaktive Einheit das Reaktionszentrum (RC) der
Photosynthese betreibenden Bakterien des Stammes Rhodobacter sphaeroides, ein
photoinduzierbar redoxaktives Protein bestehend aus Apoprotein und Cofaktoren. Im
Beispiel der Fig. 2, 3 und 4 ist das RC über seinen Cofaktor Ubichinon-50 (UQ) in
der sogenannten QA-Protein-Bindungstasche des RCs kovalent mit dem
Nukleinsäure-Oligomer verbunden. Das RC bildet mit dem Cofaktor Ubichinon-50 in
der QA-Bindungstasche einen 1 : 1 Komplex, wobei das Ubichinon-50 in der
beschriebenen Weise kovalent an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist. Im
Beispiel der Fig. 5 und 6 ist die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ein
photoinduzierbar redoxaktiver Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex, nämlich
ein kovalent verknüpfter Zn-Bakteriochlorophyll-Chinon-Komplex, der über das
Chinon, dem Elektron-Akzeptor-Molekül des Komplexes, kovalent über einen Spacer
mit dem Nukleinsäure-Oligomer verbunden ist. Die elektrochemische Kommunikation
zwischen der (leitfähigen) Oberfläche und der über ein Einzelstrang-Oligonukleotid
verbrückten photoinduzierbar redoxaktiven Einheit ("Einheit") in der allgemeinen
Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist schwach oder gar nicht vorhanden.
In einem nächsten Schritt werden die Test-Sites mit der zu untersuchenden
Nukleinsäure-Oligomer-Lösung (Target) in Kontakt gebracht. Dabei kommt es nur in
dem Fall zur Hybridisierung, wenn die Lösung Nukleinsäure-Oligomer-Stränge
enthält, die zu den an die leitfähige Oberfläche gebundenen Probe-Nukleinsäure-
Oligomeren komplementär, oder zumindest in weiten Bereichen komplementär sind.
Im Falle der Hybridisierung zwischen Probe und Target kommt es zu einer
verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Oberfläche und der photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit, da diese nunmehr über das aus einem Doppelstrang
bestehende Nukleinsäure-Oligomer verbrückt ist. Fig. 3 zeigt dies schematisch am
Beispiel der Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ(RC). In Fig. 4 ist die Sequenz der
Elektron-Transfer-Schritte in Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) im Detail gezeigt,
während Fig. 5 das Beispiel Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl schematisch
zeigt und Fig. 6 die Sequenz der Elektron-Transfer-Schritte in Elek-Spacer-ds-oligo-
Spacer-Q-ZnBChl im Detail darstellt.
Aufgrund der Hybridisierung von Probe-Nukleinsäure-Oligomer und dem dazu
komplementären Nukleinsäure-Oligomer-Strang (Target) verändert sich die
elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Oberfläche und der
photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Somit kann ein sequenzspezifisches
Hybridisierungsereignis durch elektrochemische Verfahren wie z. B.
Cyclovoltametrie, Amperometrie oder Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden.
Bei der Cyclovoltametrie wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode
zeitabhängig linear verändert. Ausgehend von einem Potential bei dem keine
Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet, wird das Potential solange verändert bis die
redoxaktive Substanz oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen
des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen
zunächst ansteigenden Strom, dann einen Maximalstrom (Peak) und schließlich einen
allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs
umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder
-reduktion aufgezeichnet.
Eine alternative elektrische Detektionsmethode, die Amperometrie, wird dadurch
ermöglicht, daß die photoinduzierbar redoxaktive Einheit durch Anlegen eines
geeigneten, konstant gehaltenen Elektrodenpotentials zwar elektrooxidiert
(elektroreduziert) wird, die Rereduktion (Reoxidation) der photoinduzierbar redoxaktiven
Einheit in den ursprünglichen Zustand aber nicht wie in der Cyclovoltametrie durch
Änderung des Elektrodenpotentials erfolgt, sondern durch ein der Targetlösung
zugesetztes geeignetes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), der "redoxaktiven
Substanz", wodurch der Stromkreis des Gesamtsystems geschlossen wird. Solange
solches Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) vorhanden ist bzw. solange das verbrauchte
Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) an der Gegenelektrode rereduziert (reoxidiert) wird,
fließt Strom, der amperometrisch detektiert werden kann und der proportional zur Zahl
der Hybridisierungsereignisse ist.
Dieses Prinzip der amperometrischen Detektion soll am Beispiel der Glucoseoxidase
näher erläutert werden. Die Glucoseoxidase ist ein aus Apoprotein und einem
Flavin-Adenin-Dinukleotid-Cofaktor bestehendes redoxaktives Enzym. Das mit
einem Ende kovalent an die Elektrode angebundene Probe-Oligonukleotid kann am
anderen, noch freien Ende mit der vollständigen enzymatischen Einheit der
Glucoseoxidase funktionalisiert werden, indem z. B. der Flavin-Adenin-Dinukleotid
(FAD)-Cofaktor des Enzyms kovalent an das Probe-Oligonukleotid angebunden wird
und anschließend mit dem Glucoseoxidase-Apoprotein (GOx) rekonstituiert wird.
Das entstandene Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-
Spacer-FAD(GOx) weist zwischen Elektrode und FAD keine oder nur geringe
Leitfähigkeit auf. Im Falle der Hybridisierung mit dem zu "ss-oligo" komplementären
Target-Oligonukleotid wird die Leitfähigkeit deutlich erhöht wird. Bei Zusatz des
Substrats Glucose zur Target-Oligonukleotid-Lösung wird das FAD der
Gukoseoxidase (FAD(GOx)) zu FADH2 der Glucoseoxidase (FADH2(GOx)) reduziert,
wobei Glucose zur Gluconsäure oxidiert wird. Liegt nun an der Elektrode ein
geeignetes äußeres Potential an, so daß über das hybridisierte Oligonukleotid
Elektronen von FADH2(GOx) an die Elektrode abgegeben werden und somit
FADH2(GOx) zu FAD(GOx) reoxidiert wird (aber weder Glucose noch Gluconsäure
bei diesem Potential elektrooxidiert oder -reduziert werden kann), fließt im System
Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-FAD(GOx) solange Strom wie FAD(GOx) durch freie
Glucose reduziert wird, d. h. bis die gesamte Glucose verbraucht ist bzw. für den
Fall, daß an der Gegenelektrode ein Potential anliegt, bei dem Gluconsäure zu
Glucose reduziert werden kann, solange wie Gluconsäure an der Gegenelektrode
reduziert wird. Dieser Strom kann amperometrisch detektiert werden und ist
proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse.
Handelt es sich bei der redoxaktiven Einheit um eine photoinduzierbar redoxaktive
Einheit, so wird die Redoxaktivität der Einheit erst durch Licht bestimmter oder
beliebiger Wellenlänge ausgelöst. Erfindungsgemäß wird diese Eigenschaft dadurch
ausgenutzt, daß die elektrochemische Detektion erst durch Einstrahlen von Licht auf
das Oberflächenhybrid der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-
Einheit (Oberflächenhybrid mit hybridisiertem Target) ausgelöst wird und maximal
solange aufrechterhalten wird wie die Lichteinstrahlung andauert. Insbesondere bei
der amperometrischen Detektion fließt somit bei Verwendung einer photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit, unter bestimmten äußeren Umständen, erst dann
(längeranhaltend) Strom, wenn Licht auf das Oberflächenhybrid eingestrahlt wird.
Solche äußere Umstände sind z. B. die Gegenwart eines geeigneten
Reduktionsmittels (bzw. Oxidationsmittels), um einen durch Photoinduktion
gebildeten, oxidierten Donor D⁺ (bzw. reduzierten Akzeptor A⁻) der photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit zu reduzieren (bzw. zu reduzieren) und das Anliegen eines
Potentials an der Elektrode, bei dem zwar ein durch Photoinduktion gebildeter
reduzierter Akzeptor A⁻ (bzw. oxidierter Donor D⁺) der photoinduzierbar redoxaktiven
Einheit, nicht jedoch der nicht reduzierte Akzeptor A (bzw. der nicht oxidierte Donor
D) oxidiert (bzw. reduziert) werden kann. Im Abschnitt "Wege zur Ausführung der
Erfindung" wird dies anhand verschiedener Beispiele von Elek-Spacer-ss-oligo-
Spacer-Einheit mit photoinduzierbar redoxaktiver Einheit näher erläutert. Somit kann
die Detektion bei Verwendung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit auf eine
bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe des Oligomer-Chips
räumlich beschränkt werden, indem das Licht auf dieses Test-Site oder auf diese
Test-Site-Gruppe begrenzt wird. Erfindungsgemäß können also verschiedene Test-
Sites (Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen) eines Oligomer-Chips auf eine
gemeinsame, durchgängige, elektrisch leitende Oberfläche aufgebracht werden. Ein
bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe kann einfach durch
Anlegen eines geeigneten äußeren Potentials an die (gesamte) Oberfläche bei
Lichteinstrahlung auf genau dieses Test-Site oder diese Test-Site Gruppe adressiert
und amperometrisch detektiert werden. Die verschiedenen Test-Sites müssen also
nicht auf einzelnen, elektrisch voneinander isolierten und zum Anlegen eines
Potentials und Auslesen des Stroms einzeln ansteuerbaren (Mikro-)Elektroden
aufgebracht werden. Darüberhinaus kann bei der Verwendung von
Oberflächenhybriden der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit
mit photoinduzierbar redoxaktiver Einheit und amperometrischer Detektion der
Ausleseprozeß zur Detektion der einzelnen sequenzspezifischen
Hybridisierungsereignisse auf dem Oligomer-Chip dadurch optimiert werden, daß
dies Test-Sites durch entsprechende Fokusierung des Lichts erst grobgerastert
ausgelesen werden und dann in den Rastern mit Hybridisierungsereignissen des
Auflösungsvermögen sukzessive erhöht wird, also z. B. bei einem Oktamer-Chip mit
65.536 Test-Sites zuerst in z. B. 64 Gruppen von je 1024 Test-Sites ausgelesen
wird, dann die Test-Site-Gruppen, die anhand der amperometrischen Messungen
Hybridisierungsereignisse aufweisen, z. B. in 32 Gruppen von je 32 Test-Sites
durchgetestet werden und anschließend in den erneut Hybridisierungsereignisse
aufweisenden Test-Site-Gruppen die Test-Sites einzeln ausgetestet werden. Die
einzelnen Hybridisierungsereignisse können dadurch mit geringem experimentellen
Aufwand schnell bestimmten Probe-Oligomeren zugeordnet werden.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen im
Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
Fig. 1 Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Sequenzierung durch
Hybridisierung auf einem Chip;
Fig. 2 Verschiedene Reaktionssequenzen zur Herstellung des
Oberflächenhybrids Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ(RC). Die
photoinduzierbar redoxaktive Einheit in diesem Oberflächenhybrid ist
das Reaktionszentrum (RC) der Photosynthese betreibenden Bakterien
Rhodobacter sphaeroides. Dieses photoinduzierbar redoxaktive Protein
besteht aus Apoprotein und Cofaktoren. Das RC ist über seinen
Cofaktor Ubichinon-50 (UQ) in der sogenannten QA-Protein-
Bindungstasche kovalent über einen Spacer mit dem Oligonukleotid
verbunden;
Fig. 3 Schematische Darstellung der photoinduzierten amperometrischen
Meßmethode am Beispiel des Oberflächen-Hybrids Elek-Spacer-ss-oligo-
Spacer-UQ(RC) aus Fig. 2 (hν: Einstrahlung von Licht, P:
primärer Donor des RC, UQ: Ubichinon-50 Elektron Akzeptor in der QA-
Protein-Bindungstasche des RC, Red/Ox: reduzierte bzw. oxidierte
Form der freien, der Targetlösung zugesetzten redoxaktiven Substanz,
z. B. cyt c2 2+, Natriumascorbat oder Fe(CN)6 2+, die die oxidierte Form P⁺
in den ursprünglich neutralen Zustand P rereduzieren können, EOx:
Potential der Elektrode, bei dem UQ⁻ durch Elektronabgabe an die
Elektrode zu UQ oxidiert wird, "hν an": Beginn der Lichteinstrahlung, "hν
aus": Ende der Lichteinstrahlung);
Fig. 4 Detaillierte schematische Darstellung des Oberflächenhybrids Au-S(CH2)2-ds-oligo-
Spacer-UQ(RC) der Fig. 3 mit Gold als
Oberflächenmaterial, Mercaptoethanol als Spacer zwischen Elektrode
und Oligonukleotid und die Darstellung der Sequenz der
photoinduzierten Elektron-Transfer-Schritte. Das Apoprotein des RCs
ist nur als Hülle (durchgezogene Linie) angedeutet (vgl. Struktur 1).
Das 12 Bp Probe-Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'-
TAGTCGGAAGCA-3' ist, als Ausschnitt, im hybridisierten Zustand
gezeigt;
Fig. 5 Schematische Darstellung der photoinduzierten amperometrischen
Meßmethode am Beispiel des Oberflächen-Hybrids Elek-Spacer-ss-oligo-
Spacer-Q-ZnBChl (hν: Einstrahlung von Licht, ZnBChl: das
Elektron-Donor-Molekül Zn-Bakteriochlorophyll, Q: das Elektron-
Akzeptor-Molekül Chinon, z. B. modifiziertes Anthrachinon oder PQQ,
Red/Ox: reduzierte bzw. oxidierte Form der freien, der Targetlösung
zugesetzten redoxaktiven Substanz, z. B. Fe(CN)6 2+, das die oxidierte
Form des Elektron-Donors ZnBChl⁺ in den ursprünglich neutralen
Zustand ZnBChl rereduzieren kann, EOx: Potential der Elektrode, bei
dem Q⁻ durch Elektronabgabe an die Elektrode zu Q oxidiert wird, "hν an":
Beginn der Lichteinstrahlung, "hν aus": Ende der Lichteinstrahlung);
Fig. 6 Detaillierte schematische Darstellung des Oberflächenhybrids Au-S(CH2)2-ds-oligo-
Spacer-Q-ZnBChl der Fig. 5 mit Gold als
Oberflächenmaterial, Mercaptoethanol als Spacer zwischen Elektrode
und Oligonukleotid und die Darstellung der Sequenz der
photoinduzierten Elektron-Transfer-Schritte. Das 12 Bp Probe-
Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3'
ist, als Ausschnitt, im hybridisierten Zustand gezeigt.
Eine Bildungseinheit einer exemplarischen Test-Site mit hybridisiertem Target, Au-S(CH2)2-ds-oligo-
Spacer-UQ(RC) der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-
Spacer-Einheit ist in Fig. 4 dargestellt. Unter Bildungseinheit wird im Rahmen der
vorliegenden Erfindung die kleinste sich wiederholende Einheit einer Test-Site
verstanden. In dem Beispiel der Fig. 4 ist die Oberfläche eine Gold-Elektrode. Die
Verbindung zwischen Gold-Elektrode und Probe-Oligonukleotid wurde mit dem
Linker (HO-(CH2)2-S)2 aufgebaut, der mit der endständigen Phosphatgruppe am 3'-Ende
zu P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert wurde und nach homolytischer Spaltung der S-S
Bindung an der Gold-Oberfläche je eine Au-S Bindung bewirkte, womit 2-Hydroxy
mercaptoethanol und Mercaptoethanol-verbrücktes Oligonukleotid auf der Oberfläche
koadsorbiert wurde. Die photoinduzierbar redoxaktive Einheit im Beispiel der Fig. 4
ist das Reaktionszentrum (RC) der Photosynthese betreibenden Bakterien
Rhodobacter sphaeroides, ein photoinduzierbar redoxaktives Protein bestehend aus
Apoprotein und Cofaktoren. Im Anwendungsbeispiel ist das RC über seinen Cofaktor
Ubichinon-50 (UQ) in der sogenannten QA-Bindungstasche des RCs kovalent mit
dem Oligonukleotid verbunden, wobei zuerst freies UQ mit einer reaktiven
Carbonsäuregruppe versehen wurde (siehe Beispiel 1), dann freies UQ über diese
Carbonsäure-Gruppe kovalent an das Probe-Oligonukleotid angebunden wurde
(Amidbildung unter Wasserabspaltung mit der terminalen Aminofunktion des an die
C-5-Position des 5'-Thymins angebundenen -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2 Linkers)
und schließlich das restliche RC (Apoprotein mit allen Cofaktoren außer UQ) an UQ
rekonstituiert wurde.
Wie weiter oben bereits erwähnt, kann die Modifikation der Probe-Oligonukleotide
mit der kompletten oder mit einem Bestandteil der photoinduzierbar redoxaktiven
Einheit entweder vor oder nach der Bindung des Probe-Oligonukleotids an die
leitfähige Oberfläche erfolgen. Die verschiedenen Kombinationsmöglichkeiten der
einzelnen Schritte, die prinzipiell zur selben Bildungseinheit einer Test-Site führen,
sollen im folgenden mit Hilfe der Fig. 2 am Beispiel des Oberflächenhybrids Au-S(CH2)2-ss-oligo-
Spacer-UQ(RC) bzw. in seiner allgemeineren Form als Elek-
Spacer-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) dargestellt werden.
Das Probe-Oligonukleotid ist in der Nähe der beiden Enden jeweils über einen
(beliebigen) Spacer mit (verschiedenen) reaktiven Gruppe versehen. In einer
Reaktionssequenz "1" kann das so modifizierte Probe-Oligonukleotid in Gegenwart
eines monofunktionalen Linkers (entsprechend den Punkten a)-c) und 2. im
Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche") gemeinsam
mit 22524 00070 552 001000280000000200012000285912241300040 0002019901761 00004 22405dem monofunktionalen Linker kovalent an die Elektrode angebunden werden,
wobei darauf geachtet wird, daß genügend monofunktionaler Linker geeigneter
Kettenlänge zugesetzt wird, um zwischen den einzelnen Probe-Oligonukleotiden
genügend Freiraum für eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid und für
die Anbindung der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit zur Verfügung zu stellen.
Danach wird an die freie, spacerverbrückte, reaktive Gruppe dem Probe-
Oligonukleotids UQ, das vorher mit einer passenden reaktiven Kopplungsgruppe
versehen wurde, angebunden. Die Anbindung erfolgt wie unter a) bzw. b) im
Abschnitt "Bindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an ein
Nukleinsäure-Oligomer" beschrieben. Im letzten Schritt dieser Reaktionssequenz "1"
wird dann das restliche RC (Apoprotein mit allen Cofaktoren außer UQ) an UQ
rekonstituiert. In einer Variante dazu (Reaktionssequenz "2") kann das (mit Spacer
und reaktiven Gruppen) modifizierte Probe-Oligonukleotid zuerst ohne freien,
monofunktionalen Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode gebunden werden,
wobei es zu einer flachen Anlagerung des Oligonukleotids kommt. Danach wird der
freie, monofunktionale Linker (Spacer) kovalent an die Elektrode gebunden. Eine
weitere Möglichkeit (Reaktionssequenz "3") besteht darin, das (mit Spacer und
reaktiven Gruppen) modifizierte Probe-Oligonukleotid zuerst mit UQ zu modifizieren,
dann in Gegenwart von freiem, monofunktionalen Linker (Spacer) kovalent an die
Elektrode anzubinden und anschließend mit dem restlichen RC zu rekonstituieren.
Schließlich kann in einer Reaktionssequenz "4" das (mit Spacer und reaktiven
Gruppen) modifizierte Probe-Oligonukleotid zuerst mit UQ modifiziert werden, um es
dann mit dem restlichen RC zu rekonstituieren und anschließend kovalent an die
Elektrode zu binden. Falls, wie im Fall des RCs, die photoinduzierbar redoxaktive
Einheit einen wesentlich größeren Durchmesser aufweist als das hybridisierte ds-
Oligonukleotid (größer als 30 Å), kann auf die kovalente Anbindung eines
geeigneten freien, monofunktionalen Linkers (Spacers) an die Elektrode verzichtet
werden, anderenfalls geschieht die Anbindung der Struktur -Spacer-ss-oligo-Spacer-
UQ(RC) an die Elektrode in Gegenwart eines geeigneten, freien monofunktionalen
Linkers.
Im Beispiel der Fig. 2 ist das RC über seinen Cofaktor Ubichinon-50 (UQ) in der
sogenannten QA-Protein-Bindungstasche des RCs kovalent mit dem Oligonukleotid
verbunden. Alternativ kann statt des UQ-Cofaktors in der QA-Bindungstasche auch
ein anderer Cofaktor des RCs oder das Apoprotein kovalent an das Probe-
Oligonukleotid angebunden werden, es können beliebige Kombinationen der
Reaktionssequenzen "1", "2", "3" oder "4" in Fig. 2 angewandt werden, solange sie
zum gleichen Endprodukt führen (vgl. Fig. 2) und es kann in beliebigen
Reaktionsschritten statt des Einzelstrang-Probe-Oligonukleotids das mit
komplementären, unmodifizierten (Target-)Oligonukleotid hybridisierte Probe-
Oligonukleotid verwendet werden. Das Probe-Oligonukleotid kann auch direkt, also
nicht über einen Spacer verbrückt, sowohl an die Elektrode als auch an die
photoinduzierbar redoxaktive Einheit angebunden werden, wie unter c) im Abschnitt
"Bindung eines Nukleinsäure-Oligomers an die leitfähige Oberfläche" bzw. a) im
Abschnitt "Bindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an ein Nukleinsäure-
Oligomer" beschrieben.
Die elektrische Kommunikation zwischen der leitfähigen Oberfläche und der über ein
Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten photoinduzierbar redoxaktiven Einheit in
der allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist schwach oder gar
nicht vorhanden. Durch Behandlung der Test-Site(s) mit einer zu untersuchenden
Oligonukleotid-Lösung, kommt es, im Falle der Hybridisierung zwischen Probe und
Target, zu einer verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Oberfläche und der über ein
Doppelstrang-Oligonukleotid verbrückten photoinduzierbar redoxaktiven Einheit. Für
die Bildungseinheit der exemplarische Test-Site Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-
UQ(RC) (mit 12-Bp Probe-Oligonukleotiden) ist dies schematisch in Fig. 3 anhand
amperometrischer Messungen gezeigt.
Durch Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge auf das RC wird der Cofaktor P, der
sogenannte primäre Donor, elektronisch angeregt und es kommt innerhalb der
Cofaktoren des RCs zur photoinduzierten Ladungstrennung, wobei ein Elektron vom
angeregten primären Donor P* auf das UQ in der QA-Bindungstasche übertragen
wird. Liegt an der Elektrode ein geeignetes Potential an, um vom reduzierten
Ubichinon (UQ⁻) ein Elektron auf die Elektrode zu übertragen, kommt es im Falle
des nicht mit Target-Oligonukleotid hybridisierten Probe-Oligonukleotids trotzdem zu
keinem Stromfluß, da die Leitfähigkeit des ss-Oligonukleotids in Au-S(CH2)2-ss-oligo-
Spacer-UQ(RC) sehr gering oder überhaupt nicht vorhanden ist. Im
hybridisierten Zustand (Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-UQ(RC)) jedoch ist die
Leitfähigkeit hoch, ein Elektron kann von UQ- zur Elektrode übertragen werden
(unter Bildung von UQ) und bei Anwesenheit einer geeigneten redoxaktiven
Substanz, die P⁺ zu P zu reduziert, wird der Stromkreis geschlossen und weitere
Lichtabsorption durch das RC startet den Zyklus erneut. Dies äußert sich
amperometrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen Elektrode und
photoinduzierbar redoxaktiver Einheit (Fig. 3). Damit ist es möglich, die
sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Probe-Oligonukleotiden
durch Amperometrie lichtinduziert zu detektieren. Die einzelnen Elektron Transfer
Schritte, die im Oberflächenhybrid Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) durch
Lichteinstrahlung und bei Anwesenheit einer geeigneten redoxaktiven Substanz zur
Reduktion von P⁺ zu P ausgelöst werden, sind in Fig. 4 dargestellt. Natürlich kann
das Oberflächenhybrid Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-UQ(RC) unter geeigneten
äußeren Umständen und bei geeigneter Anbindung (z. B. Anbindung des RCs an
das Probe-Oligonukleotid in der Nähe des primären Donors), auch umgekehrt
geschaltet werden, so daß nach Lichteinstrahlung P⁺ von der Elektrode reduziert
und Q⁻ von einem geeigneten Oxidationsmittel oxidiert wird.
Eine weitere Test-Site Au-S(CH2)2-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl der allgemeinen
Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Einheit ist in Fig. 5 dargestellt. Durch
Lichteinstrahlung geeigneter Wellenlänge auf ZnBChl wird ZnBChl elektronisch
angeregt und es kommt zur photoinduzierten Ladungstrennung, wobei ein Elektron
vom angeregten ZnBChl* auf das Chinon Q übertragen wird. Liegt an der Elektrode
ein geeignetes Potential an, um vom so reduzierten Chinon (Q⁻) ein Elektron auf die
Elektrode zu übertragen, kommt es im Falle des nicht mit Target-Oligonukleotid
hybridisierten Probe-Oligonukleotids trotzdem zu keinem Stromfluß, da die
Leitfähigkeit des ss-Oligonukleotids in Au-S(CH2)2-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl sehr
gering oder überhaupt nicht vorhanden ist. Im hybridisierten Zustand Au-S(CH2)2-ds-oligo-
Spacer-Q-ZnBChl jedoch ist die Leitfähigkeit hoch, ein Elektron kann von Q⁻
zur Elektrode übertragen werden (unter Bildung von Q) und bei Anwesenheit einer
geeigneten redoxaktiven Substanz, die ZnBChl⁺ zu ZnBChl reduziert, wird der
Stromkreis geschlossen und weitere Lichtabsorption durch ZnBChl startet den
Zyklus erneut. Dies äußert sich amperometrisch in einem deutlichen Stromfluß
zwischen Elektrode und photoinduzierbar redoxaktiver Einheit (Fig. 5). Damit ist es
möglich, die sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Probe-
Oligonukleotiden durch Amperometrie lichtinduziert zu detektieren. Natürlich kann
das Oberflächenhybrid Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-Q-ZnBChl unter geeigneten
äußeren Umständen und geeigneter Anbindung (z. B. Au-S(CH2)2-ds-oligo-Spacer-
ZnBChl-Q) auch umgekehrt geschaltet werden, so daß nach Lichteinstrahlung
ZnBChl⁺ von der Elektrode reduziert und Q⁻ von einem geeigneten Oxidationsmittel
oxidiert wird.
Da die Redoxaktivität der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit - auch bei
passendem Elektrodenpotential - erst durch Lichteinstrahlung geeigneter
Wellenlänge ausgelöst und maximal solange aufrechterhalten wird, wie die
Lichteinstrahlung andauert, kann dies erfindungsgemäß dadurch ausgenutzt
werden, daß ein bestimmtes Test-Site oder eine bestimmte Test-Site-Gruppe eines
Oligomer-Chips räumlich aufgelöst wird, indem das Licht auf dieses Test-Site oder
auf diese Test-Site-Gruppe begrenzt wird. Dies birgt den erfindungsgemäßen
Vorteil, daß die verschiedenen Test-Sites (Nukleinsäure-Oligomer-Kombinationen)
eines Oligomer-Chips auf eine gemeinsame, durchgängige, elektrisch leitende
Oberfläche aufgebracht werden können und ein bestimmtes Test-Site oder eine
bestimmte Test-Site-Gruppen einfach durch Anlegen eines geeigneten äußeren
Potentials an die (gesamte) Oberfläche bei Lichteinstrahlung nur auf genau dieses
Test-Site oder diese Test-Site Gruppe adressiert und amperometrisch detektiert
werden kann. Die verschiedenen Test-Sites müssen also nicht auf einzelnen,
elektrisch voneinander isolierten und zum Anlegen eines Potentials und Auslesen
des Stroms einzeln ansteuerbaren (Mikro-) Elektroden aufgebracht werden.
Daneben können fehlerhafte Basenpaarungen (Basenpaar Mismatches) durch eine
geänderte cyclovoltammetrische Charakteristik erkannt werden. Ein Mismatch
äußert sich in einem größeren Potentialabstand zwischen den Strommaxima der
Elektroreduktion und der Elektroreoxidation (Umkehrung der Elektroreduktion bei
umgekehrter Potentialvorschubrichtung) bzw. der Elektrooxidation und
Elektrorereduktion in einem cyclovoltammetrisch reversiblen Elektronen-Transfer
zwischen der elektrisch leitenden Oberfläche und der photoinduzierbar redoxaktiven
Einheit. Dieser Umstand wirkt sich vor allem in der amperometrischen Detektion
günstig aus, da dort der Strom bei einem Potential getestet werden kann, bei dem
zwar das perfekt hybridisierende Oligonukleotid-Target signifikant Strom liefert, nicht
aber das fehlerhaft gepaarte Oligonukleotid-Target.
Die 2-Methoxy-Gruppe des Ubichinon-50 (UQ-50) wird durch
Etherspaltung mit HBr, einer Standardmethode, zur 2-Hydroxygruppe modifiziert
(alternativ kann 2-OH-UQ-50 nach dem Verfahren von Moore, H. W. and Folkers, K.
Journal of the American Chemical Society, 1966, 88, 564-570 oder von Daves, G. et
al., Journal of the American Chemical Society, 1968, 90, 4487-4493 hergestellt
werden). Anschließend wird 2-OH-UQ-50 in einem Standardverfahren mit einer
äquimolaren Menge an Cl-CH2-CH2-CO2H zum 2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50 umgesetzt
und chromatographisch aufgereinigt. Alternativ können 5-OH-6-alkyl-1,4-
Benzochinon-Analoga des UQ-50 (Darstellung gemäß Catlin et al., Journal of the
American Chemical Society, 1968, 90, 3572-3574) in einem Standardverfahren mit
einer äquimolaren Menge an Cl-CH2-CH2-CO2H zu 5-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50-
Analoga modifiziert werden.
Die Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-Spacer-UQ(RC) gliedert
sich in 4 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der
Derivatisierung der Oberfläche mit dem Probe-Oligonukleotid in Gegenwart eines
geeigneten monofunktionalen Linkers (Inkubationsschritt), der kovalenten
Anbindung des modifizierten Ubichinon-50 (Redoxschritt) und der Rekonstitution des
restlichen RCs (Rekonstitutionsschritt).
Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide
bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde
in einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon-
Ionenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99.99%) in einer
Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wurde der Gold-Film mit 30%
H2O2,/70% H2SO4 von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation
organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der
Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der Oberfläche
mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte Oberfläche eine vorher
bereitete 1×10-4 molare Lösung des (modifizierten) Doppelstrang-Oligonukleotids
aufgetragen, so daß die komplette Gold-Oberfläche benetzt wird (Inkubationsschritt,
siehe auch unten).
Zur Inkubation wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid
der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3'
Endes mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist
die endständige Base Thymin des Oligonukleotids am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-
NH-CH2-CH2-NH2 modifiziert. Zu einer 2×10-4 molaren Lösung dieses Oligonukleotids
in HEPES-Puffer (0,1 molar in Wasser, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB,
siehe Abkürzungen) wurde ca. 10-4 bis 10-1 molar 2-Hydroxy-mercaptoethanol
gegeben (oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge) und
die Gold-Oberfläche eines Test-Sites komplett benetzt und 2-24 h inkubiert.
Während dieser Reaktionszeit wird der Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH
des Oligonukleotids homolytisch gespalten. Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen
der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1
Koadsorption des ss-Oligonukleotids und des abgespaltenen 2-Hydroxy-mer
captoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung gleichzeitig anwesende,
freie 2-Hydroxy-mercaptoethanol wird ebenfalls durch Ausbildung einer Au-S
Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt).
Die so mit einer Monolayer aus ss-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol
modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und
anschließend mit einer Lösung von 3×10-3 molarem Chinon 2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50,
10-2 molarem EDC und 10-2 molarem sulfo-NHS in HEPES-Puffer (0,1 molar (in
Wasser, pH = 7.5), benetzt. Nach einer Reaktionszeit von ca. 1-4 h bilden der
-CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2 Spacer und das 2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50 eine
kovalente Bindung aus (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und
der C-2-Säurefunktion des 2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50, Redoxschritt).
Anschließend wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser
gewaschen und mit einer Lösung von ca. 5×10-5 molarem Ubichinon-50-freien RCs in
10 mM Tris, pH = 8, mit 0.7 molarem Zusatz von TEATFB bei ca. 4°C für ca. 12 h
inkubiert, um das restliche RC an das Oligonukleotid-gebundene UQ-50 zu
rekonstituieren (Rekonstitutionsschritt).
Alternativ zur kovalenten Anbindung von 2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50 an das Probe-
Oligonukleotid kann, unter gleichen Bedingungen, auch ein 5-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50-
Analogon (Beispiel 1) oder ein anderes, mit einer reaktiven Carbonsäure
versehenes Chinon der Formel 1-8 verwendet werden, da auch an diese
Ubichinon-50-freies RC rekonstituiert werden kann.
Die Herstellung von Au-S(CH2)2-ss-oligo-Spacer-Q-ZnBChl gliedert sich in
5 Teilabschnitte, nämlich der Darstellung der leitfähigen Oberfläche, der
Derivatisierung der Oberfläche mit dem (mit Komplementärstrang hybridisierten)
Probe-Oligonukleotid in Gegenwart eines geeigneten monofunktionalen Linkers
(Inkubationsschritt), der kovalenten Anbindung des Elektron-Akzeptors
(Akzeptorschritt), der kovalenten Anbindung des Elektron-Donors (Donorschritt) und
der thermischen Dehybridisierung des Doppelstrang-Oligonukleotids
(Dehybridisierungsschritt).
Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide,
ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen), wurde wie in
Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.
Zur Inkubation wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp Einzelstrang-Oligonukleotid
der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an der Phosphatgruppe des 3'-Endes
mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH verestert ist. Am 5'-Ende ist
die endständige Base Thymin des Oligonukleotids am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2
modifiziert. Eine 2×10-4 molare Lösung dieses Oligonukleotids im
Hybridisierungspuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5 mit 0.7 molarem Zusatz von
TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde mit einer 2×10-4 molaren Lösung des
(unmodifizierten) komplementären Strangs im Hybridisierungspuffer bei
Raumtemperatur für ca. 2 h hybridisiert (Hybridisierungsschritt). Nach der
Hybridisierung wurde der nun 1×10-4 molaren Doppelstrang-Oligonukleotid-Lösung
ca. 10-4 bis 10-1 molar 2-Hydroxy-mercaptoethanol (oder ein anderer Thiol- oder
Disulfid-Linkers geeigneter Kettenlänge) zugesetzt, die Gold-Oberfläche eines Test-
Sites komplett benetzt und 2-24 h inkubiert. Während dieser Reaktionszeit wird der
Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten.
Dabei bildet der Spacer mit Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S Bindung
aus, wodurch es zu einer 1 : 1 Koadsorption des ds-Oligonukleotids und des
abgespaltenen 2-Hydroxy-mercaptoethanols kommt. Das in der Inkubationslösung
gleichzeitig anwesende, freie 2-Hydroxy-mercaptoethanol wird ebenfalls durch
Ausbildung einer Au-S Bindung koadsorbiert (Inkubationsschritt).
Die so mit einer Monolayer aus ds-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol
modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser gewaschen und
anschließend mit einer Lösung von 3×10-3 molarem Chinon PQQ, 10-2 molarem EDC
und 10-2 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer Reaktionszeit von
ca. 1-4 h bilden der -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2 Spacer und das PQQ eine
kovalente Bindung (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und der C-7-
Carbonsäurefunktion des PQQ, Akzeptorschritt).
Anschließend wurde die so modifizierte Goldelektrode mit bidestilliertem Wasser
gewaschen und mit einer wässerigen Lösung aus 3×10-3 molarem Donor ZnBChl
(freie Säure), 1,5×10-1 molarem EDC, 2,5×10-3 molarem Hydrazin-Monohydrat
(NH-NH2×H2O) und 1×10-1 molarem Imidazol benetzt. Nach einer Reaktionszeit von
ca. 16 h bei 23°C bindet die C-1-Carbonsäurefunktion des an das Oligonukleotid
gebundenen PQQ über Hydrazin an die freie Carbonsäure-Gruppe des ZnBChl
(Amidbildung zwischen den Aminogruppen des Hydrazins und der C-1-Carbonsäure-
Gruppe des PQQ bzw. der freien Carbonsäure-Gruppe des ZnBChl, Donorschritt).
Anschließend wurden die Doppelstränge bei Temperaturen von T < 40°C thermisch
dehybridisiert und erneut mit bidestilliertem Wasser abgespült
(Dehybridisierungsschritt). Das ZnBChl (freie Säure) wird aus Zn-BChl (Darstellung
gemäß Hartwich et al., Journal of the American Chemical Society, 1998, 120, 3684-3693)
durch Inkubation mit Trifluoressigsäure hergestellt.
Alternativ kann z. B. ZnBChl (freie Säure) über Esterbildung nach Standardverfahren
auch an die 3-OH-Gruppe des 5'-terminalen Zuckers des Probe-Oligonukleotids
gebunden werden oder der vorher kovalent verbundene Elektron-Donor/Elektron-
Akzeptor-Komplex wird, wie im Donorschritt beschrieben, über eine freie
Carbonsäure-Gruppe z. B. des Donors an das Probe-Oligonukleotid angebunden.
Statt PQQ kann unter den gleichen Reaktionsbedingungen auch Anthrachinon-2,6-
Disulfonsäure Dinatriumsalz im Akzeptorschritt verwendet werden. Bei Verwendung
von PNA-Oligonukleotid mit z. B. -NH-(CH2)2-N(COCH2-Base)-CH2CO- als
Oligonukleotid-Baustein besteht eine alternative Anbindungsmöglichkeit der ZnBChl-PQQ-
Einheit an das Nukleinsäure-Oligomer (PNA-Oligonukleotid) entsprechend d)
im Abschnitt "Bindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit an ein
Nukleinsäure-Oligomer". Dabei wird während der PNA-Oligonukleotid-Synthese
statt der N-terminale Base in der Standard-PNA-Synthese-Reaktion PQQ über
seinen Pyrrol-Stickstoff angebunden. Anschließend wird Zn-BChl, ähnlich wie im
Donorschritt beschrieben, durch Inkubation des mit PQQ modifizierten PNA-
Oligonukleotids mit 3×10-3 molarem ZnBChl (freie Säure), 1,5×10-1 molarem EDC
10-2 und 2×10-1 molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer an das Amino-Ende des Peptid-
Rückgrats gebunden (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Rückgrats und
der Carbonsäure-Gruppe des Zn-BChl (freie Säure)).
Claims (45)
1. Durch kovalente Anbindung einer photoinduzierbar redoxaktiven Einheit
modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer, dadurch gekennzeichnet, daß die
photoinduzierbar redoxaktive Einheit ein oder mehrere Elektron-Donor-
Moleküle oder -Molekülteile und ein oder mehrere Elektron-Akzeptor-Moleküle
oder -Molekülteile enthält.
2. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ein
photoinduzierbar redoxaktiver, kovalent verknüpfter, wenigstens bimolekularer
Elektron-Donor-/Elektron-Akzeptor-Komplex ist, wobei wenigstens zwei der
Elektron-Donor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) und/oder Elektron-Akzeptor-
Molekül(e) oder -Molekülteil(e) dieser photoinduzierbar redoxaktiven Einheit
direkt durch eine oder mehrere kovalente Bindungen miteinander verbunden
sind.
3. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 1, wobei wenigstens zwei
der Elektron-Donor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) und/oder Elektron-
Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) durch einen oder mehrere verzweigte
oder unverzweigte Molekülteile beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge
kovalent verbunden sind.
4. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 3, wobei die verzweigten
oder unverzweigten Molekülteile eine Kettenlänge von 1-20 Atomen,
insbesondere 1-14 Atomen, aufweisen.
5. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die photoinduzierbar redoxaktive
Einheit ein in ein oder mehrere Makromoleküle eingebetteter Elektron-Donor-/Elektron-
Akzeptor-Komplex ist.
6. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit das native oder
modifizierte Reaktionszentrum von Photosynthese betreibenden Organismen
ist, insbesondere das native oder modifizierte Reaktionszentrum von
Photosynthese betreibenden Bakterien.
7. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eines oder mehrere der Elektron-
Donor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) Farbstoffe sind, insbesondere Flavine,
(Metallo-)Porphyrine, (Metallo-)Chlorophylle oder (Metallo-)
Bakteriochlorophylle bzw. Derivate davon.
8. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eines oder mehrere der Elektron-
Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) Flavine, Nikotinsäureamide oder
Chinone sind, insbesondere Pyrrolo-Chinolin-Chinone (PQQ), 1,2-
Benzochinone, 1,4-Benzochinone, 1,2-Naphtochinone, 1,4-Naphtochinone
oder 9,10-Anthrachinone bzw. Derivate davon.
9. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die photoinduzierbar redoxaktive Einheit ein Charge-
Transfer-Komplex ist.
10. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 9, wobei der Charge-
Transfer-Komplex ein Übergangsmetall-Komplex ist, insbesondere ein Ru(II)-,
ein Cr(III)-, ein Fe(II)-, ein Os(II)- oder ein Co(II)-Komplex.
11. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das Nukleinsäure-Oligomer ein Desoxyribonukleinsäure-,
Ribonukleinsäure-, ein Peptidnukleinsäure-Oligomer oder ein Nukleinsäure-
Oligomer mit strukturell analogem Rückgrat ist.
12. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit kovalent alternativ
an eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen oder an einen
Zucker, insbesondere an eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, des Nukleinsäure-
Oligomer-Rückgrats gebunden ist.
13. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der Ansprüche 1-11, wobei
die photoinduzierbar redoxaktive Einheit alternativ kovalent an eine Thiol-,
Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe einer modifizierten Base des
Nukleinsäure-Oligomers angebunden ist.
14. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, daß die reaktive Thiol-, Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-
Gruppe der Base kovalent über einen verzweigten oder unverzweigten
Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge an die Base
gebunden ist, wobei die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen der
Thiol-, Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe und der Base ein
verzweigtes oder unverzweigtes Molekülteil mit einer Kettenlänge von 1-20
Atomen, insbesondere von 1-14 Atomen, ist.
15. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der Ansprüche 12-14, wobei
die photoinduzierbar redoxaktive Einheit an ein Ende des Nukleinsäure-
Oligomer-Rückgrats bzw. an eine endständige, modifizierte Base angebunden
ist.
16. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers, wobei
eine ein oder mehrere Elektron-Donor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) und ein
oder mehrere Elektron-Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) enthaltende
photoinduzierbar redoxaktive Einheit kovalent an ein Nukleinsäure-Oligomer
angebunden wird.
17. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomer nach
Anspruch 16, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit durch kovalente
Anbindung eines oder mehrerer Elektron-Donor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e)
oder eines oder mehrerer Elektron-Akzeptor-Molekül(e) oder -Molekülteil(e) an
ein Nukleinsäure-Oligomer angebunden wird.
18. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomer nach
Anspruch 16 oder 17, wobei die photoinduzierbar redoxaktive Einheit durch
kovalente Anbindung eines oder mehrerer Makromoleküle bzw. durch
kovalente Anbindung eines oder mehrerer Proteine an ein Nukleinsäure-
Oligomer angebunden wird.
19. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers nach
einem der Ansprüche 16-18, wobei das Nukleinsäure-Oligomer alternativ
durch eine oder mehrere Amidbildungen mit Amin- oder mit Säure-Gruppen
der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit, durch eine oder mehrere
Esterbildungen mit Alkohol- oder mit Säure-Gruppen der photoinduzierbar
redoxaktiven Einheit, durch Thioesterbildung mit Thio-Alkohol- oder mit Säure-
Gruppen der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit bzw. durch Kondensation
einer oder mehrerer Amin-Gruppen des Nukleinsäure-Oligomers mit Aldehyd-
Gruppen der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit und anschließender
Reduktion der entstandenen Kohlenstoff-Stickstoff-Doppelbindung an die
photoinduzierbar redoxaktive Einheit gebunden wird.
20. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers nach
einem der Ansprüche 16-19, wobei an die photoinduzierbar redoxaktive
Einheit kovalent eine oder mehrere verzweigte oder unverzweigte Molekülteile
beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden ist und die
verzweigten oder unverzweigten Molekülteile alternativ eine reaktive Amin-,
Hydroxy-, Thiol-, Säure- oder Aldehyd-Gruppe zur kovalenten Anbindung an
ein Nukleinsäure-Oligomer besitzen.
21. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers nach
Anspruch 20, wobei die kürzeste. durchgehende Verbindung zwischen dem
Nukleinsäure-Oligomer und der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit ein
verzweigtes oder unverzweigtes Molekülteil mit einer Kettenlänge von 1-20
Atomen, insbesondere von 1-14 Atomen, ist.
22. Modifizierte leitfähige Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder
mehrere Arten von modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren gemäß den
Ansprüchen 1 bis 15 an eine leitfähige Oberfläche angebunden sind.
23. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 22, wobei die Oberfläche aus
einem Metall oder einer Metallegierung besteht, insbesondere einem Metall
ausgewählt aus der Gruppe Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber,
Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium, Mangan und
deren Mischungen.
24. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 22, wobei die Oberfläche aus
einem Halbleiter besteht, insbesondere einem Halbleiter ausgewählt aus der
Gruppe Kohlenstoff, Silizium, Germanium und α-Zinn.
25. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 22, wobei die Oberfläche aus
einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 14 und 16, einer binären
Verbindung der Elemente der Gruppen 13 und 15, einer binären Verbindung
der Elemente der Gruppen 15 und 16, oder einer binaren Verbindung der
Elemente der Gruppen 11 und 17 besteht, insbesondere aus einem Cu(I)-
Halogenid oder einem Ag(I)-Halogenid.
26. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 22, wobei die Oberfläche aus
einer ternären Verbindung der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16 oder einer
ternären Verbindung Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 besteht.
27. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach den Ansprüchen 22-26, wobei die
Anbindung der modifizierten Nukleinsäure-Oligomere an die leitfähige
Oberfläche kovalent oder durch Chemi- bzw. Physisorption erfolgt.
28. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach einem der Ansprüche 22-27, wobei
alternativ eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure-, Amin- oder eine Zucker-
Gruppe, insbesondere eine Zucker-Hydroxy-Gruppe, des Nukleinsäure-
Oligomer-Rückgrats kovalent oder durch Chemi- bzw. Physisorption an die
leitfähige Oberfläche angebunden ist.
29. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach einem der Ansprüche 22-27, dadurch
gekennzeichnet, daß alternativ eine Thiol-, Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-
Gruppe einer modifizierten Base des Nukleinsäure-Oligomers kovalent oder
durch Chemi- bzw. Physisorption an die leitfähige Oberfläche angebunden ist.
30. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach den Ansprüchen 28 oder 29, wobei das
modifizierte Nukleinsäure-Oligomer über eine Gruppe am Ende des
Nukleinsäure-Oligomer-Rückgrats bzw. über eine Gruppe einer endständigen,
modifizierten Base an die leitfähige Oberfläche gebunden ist.
31. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach den Ansprüchen 22-30, wobei an die
leitfähige Oberfläche verzweigte oder unverzweigte Molekülteile beliebiger
Zusammensetzung und Kettenlänge kovalent oder durch Chemi- bzw.
Physisorption angebunden sind und die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere
kovalent an diese Molekülteile angebunden sind.
32. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 31, wobei die kürzeste
durchgehende Verbindung zwischen der leitfähigen Oberfläche und dem
Nukleinsäure-Oligomer ein verzweigtes oder unverzweigtes Molekülteil mit
einer Kettenlänge von 1-20 Atomen, insbesondere von 1-12 Atomen, ist.
33. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach den Ansprüchen 31 und 32, wobei der
verzweigte oder unverzweigte Molekülteil alternativ an eine Phosphorsäure-,
Carbonsäure-, eine Amin- oder eine Zucker-Gruppe, insbesondere eine
Zucker-Hydroxy-Gruppe, des Nukleinsäure-Oligomer-Rückgrats oder eine
Thiol-, Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe einer modifizierten Base
des Nukleinsäure-Oligomers angebunden ist.
34. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 33, wobei der verzweigte
oder unverzweigte Molekülteil an eine Phosphorsäure-, Zucker-Hydroxy-,
Carbonsäure- oder Amin-Gruppe am Ende des Nukleinsäure-Oligomer-
Rückgrats bzw. eine Thiol-, Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe einer
endständigen, modifizierten Base gebunden ist.
35. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach den
Ansprüchen 22-34, wobei ein oder mehrere Arten von modifizierten
Nukleinsäure-Oligomeren gemäß den Ansprüchen 1-15 auf eine leitfähige
Oberfläche aufgebracht werden.
36. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach
Anspruch 35, wobei das Nukleinsäure-Oligomer oder das modifizierte
Nukleinsäure-Oligomer mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-
Oligomerstrang hybridisiert wird und in Form des Doppelstranghybrids auf die
leitfähige Oberfläche aufgebracht wird.
37. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach den
Ansprüchen 35 oder 36, wobei das Nukleinsäure-Oligomer oder das
modifizierte Nukleinsäure-Oligomer in Gegenwart von weiteren chemischen
Verbindungen, die ebenfalls an die leitfähige Oberfläche angebunden werden,
auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht wird.
38. Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Oligomer-
Hybridisierungsereignissen, dadurch gekennzeichnet, daß eine leitfähige
Oberfläche gemäß den Ansprüchen 22-34 mit Nukleinsäure-Oligomeren in
Kontakt gebracht wird.
39. Verfahren zur elektrochemischen Detektion nach Anspruch 38, dadurch
gekennzeichnet, daß die elektrochemische Detektion durch photoinduzierte
Ladungstrennung in der über ein Nukleinsäure-Oligomer an die leitfähige
Oberfläche angebundenen photoinduzierbar redoxaktive Einheit gestartet wird.
40. Verfahren zur elektrochemischen Detektion nach einem der Ansprüche 38
oder 39, wobei mehrere Arten von modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren
gemäß den Ansprüchen 1-15 auf eine gemeinsame, durchgängige, elektrisch
leitende Oberfläche aufgebracht werden.
41. Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Lichteinstrahlung zur photoinduzierten
Ladungstrennung in der über ein Nukleinsäure-Oligomer an die leitfähige
Oberfläche angebundenen photoinduzierbar redoxaktive Einheit auf einen
Bereich der leitfähigen Oberfläche mit einer oder mehreren modifizierten
Nukleinsäure-Oligomeren-Arten begrenzt wird.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 38-41, wobei die Detektion
cyclovoltametrisch, amperometrisch oder durch Leitfähigkeitsmessung erfolgt.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 38-42, wobei das nach Einstrahlen von
Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge gebildete oxidierte Elektron-
Donor-Molekül oder -Molekülteil oder das gebildete reduzierte Elektron-
Akzeptor-Molekül oder -Molekülteil der photoinduzierbar redoxaktiven Einheit
durch eine geeignete, freie, nicht an das Nukleinsäure-Oligomer gebundene,
aber mit dem Nukleinsäure-Oligomer in Kontakt stehende, redoxaktive
Substanz, re-reduziert bzw. re-oxidiert, also jeweils in seinen ursprünglichen
vor der Lichteinstrahlung vorhandenen Zustand, zurückversetzt werden kann.
44. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die freie, nicht an ein Nukleinsäure-
Oligomer gebundene, aber mit dem Nukleinsäure-Oligomer in Kontakt
stehende, redoxaktive Substanz bei einem Potential ϕ selektiv oxidierbar und
reduzierbar ist, wobei ϕ der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧-2,0 V, gemessen gegen
Normalwasserstoffelektrode, genügt.
45. Verfahren nach Anspruch 43 oder 44, wobei die freie, nicht an ein
Nukleinsäure-Oligomer gebundene, aber mit dem Nukleinsäure-Oligomer in
Kontakt stehende, redoxaktive Substanz ein freies Chinon, ein freier
Hexacyanoferrat(II)-Komplex, ein freies Natriumascorbat, ein freier
Ru(II)hexamin-Komplex oder ein freies redoxaktives Protein, insbesondere ein
freies Cytochrom, ist.
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