DE19821859A1

DE19821859A1 - Darstellung immunogener (Kapsel-)Polysaccharid-Konjugate durch orientierte Kupplung synthetischer T-Zell-Epitope zur Erzeugung von Vakzinen gegen N.meningitidis

Info

Publication number: DE19821859A1
Application number: DE1998121859
Authority: DE
Inventors: M Alexander Schmidt; Waltraud Walz-Schmidt
Original assignee: WALZ SCHMIDT WALTRAUD
Current assignee: WALZ SCHMIDT WALTRAUD
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1998-05-15
Publication date: 1999-12-09

Abstract

Als repetitive T-Zell unabhängige Antigene sind bakterielle Polysaccharide in isolierter Form nur wenig oder nicht immunogen und induzieren eine kurzlebige und schwache Immunantwort, Polysaccharid-Protein Konjugate haben dieses Problem bisher nur unvollständig gelöst. Das neue Verfahren soll eine spezifische, langanhaltende, "boosterfähige" Immunantwort mit sehr hohen Antikörper-Titern und sehr hohen Titern der Bakterizidie induzieren. DOLLAR A Synthetische Peptide, die in ihrer Sequenz T-Zell Epitopen des Zielorganismus entsprechen, werden in diesem Verfahren über einen heterobifunktionellen "crosslinker" entweder über den N- oder den C-terminus gerichtet mit Polysacchariden aus z. B. N. meningitidis konjugiert. DOLLAR A Das Verfahren ermöglicht die Darstellung von Polysaccharid-Konjugaten, die zur Induktion einer spezifischen bakteriziden Immunantwort als Impfstoffe (Vakzine) gegen bakterielle Erreger eingesetzt werden können.

Description

Anwendungsgebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, entsprechend des Anspruches 1 zur Darstellung immunogener (Kapsel-)Polysaccharid Konjugate, die in höheren Organismen eine spezifische Immunantwort gegen N. meningitidis zu induzieren vermögen und dadurch sowohl als Vakzine als auch zur Erzeugung monoklonaler Antikörper eingesetzt werden können.

Diese Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Darstellung immunogener Konjugate als Vakzine und zu Immunisierungszwecken unter Verwendung von Polysaccharid-Komponenten anderer bakterieller Species als N. meningitidis.

Diese Aufgabe wird durch die orientierte Konjugation isolierter (Kapsel-) Polysaccharide mit synthetischen Peptiden gelöst, die (universalen) T Zell Epitopen entsprechen.

Stand der Technik

Der Schutz vor Infektionskrankheiten durch vorbeugende Impfungen ist die erfolgreichste medizinische Entwicklung neuerer Zeit. Um eine schützende Immunantwort zu induzieren, wird mit abgeschwächten oder abgetöteten Erregern oder isolierten Antigenen geimpft. Viele Bakterien schützen sich durch die Bildung einer Kapsel aus Polysacchariden vor Abwehrreaktionen des Wirtes, da die Kapsel nicht nur die Phagocytose und die Complement-vermittelte Lyse der Bakterien blockiert, sondern auch häufig die Bildung einer humoralen Immunantwort verhindert oder zumindest erschwert. Kapselpolysaccharide (CPS) haben sich dadurch als essentielle Virulenzfaktoren erwiesen. Gelingt es allerdings, opsonisierende Antikörper zu erzeugen, so zeigen diese eine deutliche Schutzwirkung gegen die jeweiligen Infektionen (I. Goldschneider et al., J. Exp. Med. 129 : 1307-1326, 1969), sogar in "late-complement" defizienten Personen (J. Andreoni et al., J. Inf. Dis. 168 : 227-231, 1993). Versuche, andere Antigene als CPS für die Induktion einer Immunantwort einzusetzen, führten zur Bildung einer schützenden humoralen Antwort, die aber gleichwohl auf die Stämme beschränkt blieb, in denen das betreffende Antigen vorkam. Eine der Schwierigkeiten, CPS zur Entwicklung prophylaktischer oder therapeutischer Vakzine zu verwenden, besteht darin, daß die Kapselpolysaccharide in isolierter Form im Menschen nicht oder nur wenig immunogen sind, da es sich bei den aus repetitiven Einheiten aufgebauten Polymeren um T-Zell unabhängige Antigene handelt. Bei der Verabreichung isolierter Kapselpolysaccharide werden in der Regel nur eine niedrig-titrige IgM Antikörper Antwort und kein immunologisches Gedächtnis induziert. Für die Induktion einer lang anhaltenden, ausreichend starken und wieder stimulierbaren Immunantwort ist der Beitrag von T-Zellen zur Immunantwort und zur Bildung des immunologischen Gedächtnisses notwendig ("T-Zell Hilfe" durch Th-Zellen). Daher wurden zahlreiche Versuche unternommen, Kapselpolysaccharide (CPS) an Proteine (Carrierproteine) zu kuppeln (z. B. auch Tetanus Toxoid oder CRM197 A. Bartoloni et al., Vaccine, 13 : 463-470, 1995), die dann als sog. "Carrier" die für die Induktion einer ausreichenden Immunantwort notwendigen T-Zell Epitope zur Verfügung stellen sollten. Diese Konjugate sollen dann als Immunogene zur Induktion einer humoralen Immunantwort und zur Bildung spezifischer Antikörper eingesetzt werden, die durch ihre opsonisierende Wirkung vor dem betreffenden Erreger schützen sollen. Ein besonders erfolgreiches Entwicklungsbeispiel für diese allgemeine Strategie ist die seit mehr als zehn Jahren eingesetzte Hib-Vakzine gegen Haemophilus influenzae Erreger.

Neben Haemophilus influenzae sind Neisseria meningitidis die häufigsten Erreger der bakteriellen Meningitis und der bakteriellen Sepsis bei Kindern. Durch den seit etwa zehn Jahren sehr erfolgreichen Einsatz eines Kapselpolysaccharid-Protein Konjugats von H. influenzae als Impfstoff, spielt in Nordamerika H. influenzae als Erreger der Meningitis praktisch keine Rolle mehr. Dadurch werden die weitaus meisten bakteriellen Meningitiden in den westlichen Industrieländern durch N. meningitidis verursacht, wobei die Mehrzahl aller Infektionen von N. meningitidis Stämmen der Serogruppen A, B und C verursacht werden (Abb. 1, 2). Dabei zeigt die Serogruppe B ein deutliches Übergewicht (zwischen 50 und 80% aller Fälle). Etwa 10% der Infektionen enden tödlich (S. J. N. Devi et al., Infect. Immun. 65 : 1045-1052, 1997). Über eine vergleichbare erfolgreiche Impfstudie mit Kapselpolysaccharid-Konjugaten aus N. meningitidis im Menschen wurde bisher nicht berichtet. Auf der Basis der isolierten Kapselpolysaccharide der Serogruppen A, C, Y und W-135 wird ein tetravalenter Impfstoff seid längerer Zeit vor allem zur Eindämmung von Meningitis-Ausbrüchen eingesetzt. Zur generellen prophylaktischen Impfung ist dieser Impfstoff wenig geeignet, da die erzielte Immunantwort nicht sehr lange anhält (K.M. Zangwill et al., J. Inf. Dis. 169 : 847-852, 1994) und bei Kindern unter 2 Jahren (Hauptrisikogruppe) keine Immunantwort erzielt wird. Dies ist eine Folge der erwähnten, T-Zell unabhängigen und generell schlechten Immunantwort gegen bakterielle Kapselpolysaccharide. Im Gegensatz zu den oben angeführten N. meningitidis Antigenen zeigten sich die CPS aus N. meningitidis Gruppe B nicht immunogen, so daß gegen N. meningitidis Erreger der Gruppe B bisher kein Impfstoff zur Verfügung steht (M. R. Lifely et al., Vaccine, 5 : 11-26, 1987).

Gleiches gilt auch für den E. coli K1 Stamm, der ein mit N. meningitidis Gruppe B strukturidentisches Kapselpolysaccharid bildet. CPS K1 bildende E. coli Stämme treten als Verursacher von Harnwegsinfektionen und Sepsis, aber vor allem als häufigster Erreger der neonatalen bakteriellen Meningitis in Erscheinung.

Versuche zur Derivatisierung der N. meningitidis Gruppe B Struktur [poly-α(2- 8)N-Acetyl Neuraminsäure (NeuNAc); Abb. 3] durch N-propinonylierung führten nach unserer Kenntnis bisher nicht zu einer ausreichenden Immunantwort, da die N-Acetyl-Funktion für die Erkennung durch Antikörper offenbar von entscheidender Bedeutung ist (Fusco et al., J.Inf. Dis. 175 : 364-372 1997).

Seit einiger Zeit wird versucht, synthetische Peptide zur Bereitstellung der notwendigen T-Zell Determinanten zur Immunogenisierung bakterieller Polysaccharide einzusetzen, wobei allerdings die für die Darstellung von Proteinkonjugaten geläufigen Methoden der Konjugation, die in der Regel zu einer ungerichteten Kupplung führen, eingesetzt werden. Für Polysaccharide aus N. meningitidis wurde diese Möglichkeit bisher nicht untersucht.

Nachteile des Standes der Technik

Die bisher beschriebenen Verfahren zur Bereitstellung von T-Zell Epitopen durch Kupplung von Carrierproteinen zeigen verschiedene Nachteile dadurch, daß

- der Proteinanteil der Polysaccharid-Konjugate relativ hoch ist und eine - in der Regel auch individuell unterschiedliche - Immunantwort gegen das entsprechende Carrierprotein induziert wird;
- die Immunantwort gegen diese Carrierproteine nicht immer vorhersagbar ist und es dadurch auch zu Kreuzreaktionen, möglichen Autoimmun reaktionen oder allergischen Reaktionen kommen kann;
- in den als Carrierproteinen verwendeten Proteinen auch Suppressor- Epitope auftreten können;
- Carrierproteine in der Regel nicht gerichtet (orientiert) sondern es je nach Aminosäuresequenz und der Zahl der zur Konjugation häufig eingesetzten frei zugänglichen z. B. ε-Aminofunktionen zu einer unterschiedlichen Konjugation des Carrierproteins mit unterschiedlicher Immunantwort kommen kann;
- bei der Verwendung der häufig eingesetzten detoxifizierten Diphtheria oder Tetanus Toxine (DT bzw. TT) bzw. deren gentechnisch erzeugte Derivate (z. B. CRM's) mögliche Restaktivitäten eindeutig ausgeschlossen werden müssen;
- die Identität und Homogenität der aus biologischer Quelle gewonnenen Carrierproteine gesichert sein muß und Kontaminationen mit anderen Bestandteilen der biologischen Quelle (z. B. Proteine, Lipide, Lipopolysaccharide, DNA etc.) die im Zuge des Isolierungs- und Reinigungs verfahrens mitgeschleppt werden können, sicher ausgeschlossen werden müssen.

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, (Kapsel-)Polysaccharide (z. B. aus N. meningitidis und E. coli K1) durch die orientierte Konjugation von chemisch definierten, synthetisch hergestellten Aminosäuresequenzen (Peptiden), die in ihrer Sequenz T-Zell Epitopen entsprechen, entweder N-terminal oder C-terminal mit Hilfe eines heterobifunktionellen "Cross-linkers" so zu derivatisieren, daß immunogene Polysaccharide dargestellt werden, die eine spezifische humorale Immunantwort induzieren und als Impfstoffe eingesetzt werden können.

Lösung der Aufgabe

Diese Aufgabe wird durch das beschriebene Verfahren mit den unter Anspruch 1 genannten Merkmalen erfüllt. Diese Erfindung liefert im Anwendungsbeispiel mit synthetischen T-Zell Epitopen orientiert modifizierte Gruppe B Polysaccharide von N. meningitidis, die als Vakzine zur Erzeugung bakterizider Antikörper eingesetzt wurden.

Vorteile der Erfindung

Vorteile der beschriebenen Erfindung zur Immunogenisierung von (Kapsel-) Polysacchariden bestehen in der Verwendung synthetischer Peptide zur Bereitstellung der notwendigen T-Zell Epitope durch die orientierte, sequenzunabhängige Konjugation mit Hilfe eines heterobifunktionellen "cross linkers".

Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens zur Verwendung synthetischer Peptide gegenüber komplexen Proteinen liegen z. B.:

- in der Verringerung der erforderlichen Proteinbeladung,
- in der Verringerung einer Gefahr der Sensibilisierung gegen den Carrier selbst,
- im gezielten Einsatz von T-Zell Epitopen, die nur T_h-Zellen stimulieren. Die Immunantwort gegen hoch-molekulare Carrier (Suppressor-Epitope/ Kreuzreaktionen) ist demgegenüber nicht immer vorhersagbar,
- in der chemischen Reinheit der eingesetzten Peptide, die keine immuno genen Kontaminationen mitführen, wie sie bei einer Verwendung von Carrier-Proteinen aus natürlichen Quellen nie ganz auszuschließen sind,
- in der orientierten C- oder N-terminalen Kupplung mit Hilfe eines heterobifunktionalen Cross-linkers, durch welche die jeweiligen synthetischen T-Zell Epitope sequenzunabhängig, in ihrer jeweiligen Konformation an die Polysaccharidkette gekuppelt werden können,
- in der Vermeidung einer etwaigen eigenen biologische Wirkung des T-Zell Epitop Carriers,
- in der Anwendbarkeit des Verfahrens auf alle Kohlenhydratsequenzen, die mit Perjodat oxidierbar sind; auf der Seite der synthetischen T-Zell Epitope unterliegt die Auswahl kupplungsfähiger Peptide keiner Einschränkung.

B. Beispielbeschreibung der Patentanmeldung Darstellung immunogener (Kapsel-)Polysaccharid-Konjugate durch orientierte Kupplung synthetischer T-Zell Epitope zur Erzeugung von Vakzinen gegen N. meningitidis

Diese Erfindung liefert ein Verfahren zur Darstellung von modifizierten Polysacchariden, die aufgrund der orientierten Konjugation von synthetischen T- Zell Epitopen mit Hilfe eines heterobifunktionellen Crosslinkers immunogen werden bzw. ihre Immunogenität wesentlich erhöhen, so daß sie wie die im Beispiel beschriebene Anwendung für die Polysaccharide der Gruppe B von N. meningitidis zeigt, zur Erzeugung bakterizider Antikörper als Vakzine eingesetzt werden können.

Die Erfindung besteht aus einer Kombination von einzelnen folgerichtigen Teilschritten, die sich mehrerer, aus dem Stand der Technik bekannter chemischer und biochemischer Reaktionen, wie sie in Abb. 4 schematisch dargestellt und unter Abschnitt II beschrieben sind, bedienen. Dazu gehören z. B. Polysaccharidisolierung und -reinigung, Periodatoxidation, FPLC, Reaktion mit einem heterobifunktionellen Crosslinkermolekül, synthetische Peptide, T-Zell Epitope, Immunisierung, ELISA, Bestimmung der Bakterizidie.

Zur Demonstration des Potentials der Erfindung wurde das Gruppe B Polysaccharid von N. meningitidis gewählt, weil dieses Polysaccharid im Menschen nicht immunogen ist und gegen N. meningitidis Gruppe B bisher keine Vakzine entwickelt werden konnte. Als Anwendungsbeispiel beschreiben wir hier erstmals die orientierte Konjugation von synthetischen T-Zell Determinanten an CPS aus E. coli K1 (poly-α 2-8 NeuNAc; strukturidentisch mit CPS aus N. meningitidis der Gruppe B), die hier am Beispiel des Gruppe B Polysaccharids von N. meningitidis erläutert werden

Beschreibung von Ausführungsbeispielen

Das Anwendungsbeispiel der Erfindung besteht aus zwei Teilen; einmal die Darstellung des neuen immunogenen Konjugats und anschließend aus der mit diesem Konjugat durchgeführten Vakzinierungsstudie. Jeder dieser Teile besteht aus einzelnen Aspekten.

I. Darstellung des Konjugats (siehe Übersichtsschema Abb. 4) 1. Isolierung des poly-α(2-8)NeuNAc CFS aus E.coli K1

Das CPS von E.coli K1 ist wie dargelegt strukturidentisch mit dem CPS aus N. meningitidis Gruppe B und besteht aus Wiederholungseinheiten von NeuNAc, die α(2-8) verknüpft sind. Aufgrund der einfacheren Kulturbedingungen wurde das CPS nach dem Stand der Technik aus E.coli K1 isoliert. Der E. coli Stamm 21451 (O1 : K1) wurde in DO-Medium supplementiert mit 10% dialysierbarem Hefeextrakt und 0,4% Glucose mit Hilfe einer 10% Starter-Kultur über Nacht bei 37°C inkubiert. Bakterien wurden anschließend durch Zentrifugation bei 16 000 × g/8°C/30' entfernt. In einer Modifikation der in der Literatur vielfach beschriebenen Methoden wurde zur Vermeidung von Kontaminationen das CPS ausschließlich aus dem Überstand mit Hilfe von 0.2% Cetavlon (Hexadecyltrimethylammonium Bromid) über Nacht bei Raumtemperatur gefällt und durch Zentrifugation (17 000 × g/30') abgetrennt. Das Präzipitat wurde in Ag. dest. gelöst und mit einem gleichen Volumen an 2 M CaCl₂ versetzt, auf 80% EtOH gebracht und wieder über Nacht bei 4°C gefällt. Diese Präzipitation wurde mehrfach wiederholt. Zur Entfernung von etwaigen Proteinverunreinigungen wurde das erhaltene Polysaccharid einer gründlichen Extraktion mit Acetat-gepuffertem Phenol unterzogen. Nach der Entfernung des Phenols durch ausgiebige Dialyse zeigte die Präparation in mehreren analytischen Verfahren keine nachweisbaren Proteinverunreinigungen mehr.

2. Periodat-Oxidation

Das in 1. erhaltene Präparat wurde als besonderer Aspekt dieser Erfindung einer sehr milden Periodatoxidation in der Kälte unterzogen, um statistisch nur einen sehr kleinen Teil (∼ < 25%) der einzelnen Untereinheiten zu oxidieren und gleichzeitig die Kettenlänge der Polysaccharide möglichst lang zu belassen. Nach Zerstörung des überschüssigen Periodats durch Glycerin mit anschließendem Pufferwechsel mit dem hier eingesetzten heterobifunktionellen Crosslinker umgesetzt.

3. Crosslinker (siehe Abb. 5)

Als besonderer Aspekt dieser Erfindung enthält der eingesetzte heterobifunktionelle Crosslinker (4-(4-N-maleimidophenyl) butyric acid hydrazide; MBPH) an einer Seite eine reaktive Hydrazinfunktion zur Bildung einer Schiff'chen Base mit den durch die Periodatoxidation erhaltenen Aldehydfunktionen des zu kuppelnden Polysaccharids. Als weitere funktionelle Gruppe enthält der Crosslinker eine Maleimidofunktion, an die sich die -SH Gruppe des Cysteins addiert, das zum Zweck der orientierten Kupplung in die Sequenz des synthetischen Peptids zusätzlich eingeführt wurde. Nach erfolgter Kupplungsreaktion wird das CPS-X-linker Konjugat von nicht umgesetzten Reagentien per FPLC getrennt.

4. Auswahl und Synthese der Th-Zell Epitope (siehe Abb. 6)

Zur Anwendung kommt in diesem Beispiel ein in der Literatur berichtetes T Zell Epitope des "heat-shock proteins - Hsp60 [J. Immunol. 154 : 5977-5985 (1995)], das nach dem Stand der Technik mit Hilfe der Festphasensynthese dargestellt und gereinigt wurde (Research Genetics, Huntsville AL, USA). Als besonderer Aspekt dieser Erfindung wurden die Peptide jeweils mit einem zusätzlichen Cys entweder N- oder C-terminal synthetisiert, um hier durch die Addition der endständigen -SH Funktion an die Maleiimid-Funktion des Crosslinkers die Möglichkeit zu einer orientierten endständigen Modifikation der CPS zu geben. Als weiterer besonderer Aspekt der im zweiten Teil erläuterten Immunisierungsstudie wurde für die tierexperimentellen Untersuchungen die humane Sequenz des betreffenden Hsp60 Fragments (aa458-474) eingesetzt, die sich von der entsprechenden Sequenz für Balb/c Mäuse nur um einen einzigen Aminosäureaustausch an Pos. 471 unterscheidet.

5. Kupplung des synthetischen T-Zell Epitopes an das partiell oxidierte CPS

Nach Aktivierung des synthetischen Peptides durch Reduktion der Cysteine werden die Peptide mit den partiell oxidierten Polysacchariden über Nacht inkubiert. Das Kupplungsprodukt wird darauf über FPLC von nicht umgesetzten Bestandteilen getrennt. Die Analyse des entstandenen Konjugats nach dem Stand der Technik zeigt ein Verhältnis von 1 : 7 von Polysaccharid (mittleres Molekulargewicht zu 50 000 angesetzt) zu konjugiertem Peptid.

II. Immunisierungsstudie in Balb/c MÄusen mit den unter (I) dargestellten neuen CPS-Peptide (T_h) Konjugaten 6. Immunogen

Die in Teil A dargestellten modifizierten CPS aus E.coli K1 in PBS (phosphate buffered saline) werden mit dem Adjuvans MPL/TDM nach Angaben des Herstellers (SIGMA, Richmond, CA, USA) 1 : 1 versetzt. Die einzelnen Mäusen werden i.p. mit 200 µl entsprechend ca. 30 bis 150 µg CPS immunisiert und je nach der betreffenden Versuchsplanung mehrmals geboostert. Zur Bestimmung der spezifischen humoralen Immunantwort werden die Mäuse in der Regel zwischen 10 und 12 Tagen nach der letzten Immunisierung durch retroorbitale Punktion geblutet. Nach erfolgter Gerinnung wird das Serum durch Zentrifugation gewonnen. Die Analyse der spezifischen humoralen Antikörperantwort erfolgt in einem ELISA-System, bei dem die ELISA-Platte mit K1 Polysacchariden beschichtet ist. Ebenfalls mit Hilfe des ELISA wurden die Endpunkttiter und die Subklassen der CPS-spezifischen IgG-Antikörper bestimmt.

7. Analyse der Bakterizidie

Die Untersuchung der Bakterizidie der erhaltenen Antikörper wurde mit Hilfe des N. meningitidis Gruppe B Stammes M986 nach dem bekannten Stand der Technik durchgeführt.

8. Anwendung des Verfahrens zur gezielten Modifikation von N.menigitidis Gruppe A und Gruppe C CPS

Um die allgemeine Anwendbarkeit des Verfahrens zur Modifikation von Polysacchariden mit synthetischen Peptiden u. a. zur Darstellung von Vakzinen nachzuweisen, wurden auch die CPS aus N. meningitidis der Gruppen A und C mit Hilfe dieses Verfahrens mit synthetischen T-Zell Epitopen modifiziert. Immunisierungsstudien zeigen, daß auch diese CPS dadurch wesentlich an Immunogenität gewinnen und eine Immunisierung mit diesen Konjugaten zur Induktion hochtitriger spezifischer Antiseren führt. Als besonderes Merkmal ergibt sich, daß die Immunisierung mit CPS A und CPS C Konjugaten, die mit dem hier beschriebenen Verfahren und dem identischen synthetischen T-Zell Epitop konjugiert worden waren, im Gemisch zu jeweils weit höheren spezifischen Antikörpertitern führt, als die getrennte Immunisierung mit der gleichen Menge Konjugat. Dieses Ergebnis zeigt einen Adjuvans-Effekt der Polysaccharid-Konjugate.

Der Einsatz der nach dem beschriebenen Verfahren erhaltenen modifizieren Kapselpolysaccharide (CPS) zur Immunisierung liefert eine spezifische hochtitrige, bakterizide humorale Immunantwort (Abb. 7, 8), die praktisch über die gesamte natürliche Lebensspanne der Versuchtiere anhält und auch nach einem sehr langen Zeitintervall hervorragend stimuliert werden kann, d. h. es wird ein sehr gutes immunologisches Gedächtnis induziert (Abb. 9). Etwaige durch die Immunisierungen verursachte Nebenwirkungen waren nicht zu erkennen. Nicht modifizierte Polysaccharide erzeugen in der Regel nur eine schwache humorale Immunantwort mit IgM oder IgG₃ Antikörpern. Demgegenüber erzeugen die mit dem hier beschriebenen Verfahren modifizierten Polysaccharide eine hochtitrige IgM und IgG Antwort mit größtenteils IgG₁ Antikörpern, die von nicht modifizierten Polysacchariden nicht induziert werden.

Claims

1. Verfahren aus mehreren folgerichtigen Teilschritten zur Konjugation (Modifikation) von (bakteriellen) (Kapsel-)Polysacchariden (CPS) zur Erzeugung von T-Zell-abhängigen Konjugaten mit der Möglichkeit des Einsatzes zur Induktion einer polysaccharid-spezifischen humoralen Immunantwort und in höheren Organismen zum Einsatz als Vakzine zur Erzeugung einer protektiven Immunantwort gegen die Erreger, die diese (Kapsel-) Polysaccharide oder serologisch kreuzreagierende CPS exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß statistisch verteilt an den Untereinheiten des betreffenden (Kapsel-) Polysaccharids (nachstehend als "CPS" bezeichnet) durch milde Oxidation mit Periodat Aldehydfunktionen erzeugt werden

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an die unter 1. erzeugten Aldehydfunktionen ein heterobifunktioneller Crosslinker mit den Merkmalen eines Hydrazin derivats am einen Ende des Moleküls und einer Maleimidofunktion am entgegengesetzten Ende des Moleküls (bevorzugt 4-(4-N-maleimidophenyl) butyric acid hydrazide; MBPH) über den Weg einer Schiff'chen Base gebunden und diese mit NaCNBH₃ reduziert wird

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß an den heterobifunktionellen Crosslinker an die Maleimidofunktion die -SH Gruppe eines endständigen Cysteins (bevorzugt N- oder C- terminal oder in anderen Fällen auch an anderer Stelle der Sequenz) als Bestandteil der Sequenz eines synthetischen Peptides von 10-18 Aminosäuren Länge addiert wird und auf diese Weise eine orientierte endständige kovalente Verknüpfung eines synthetischen Peptides mit Hilfe eines hetero-bifunktionellen Crosslikers an das Polysaccharid erzeugt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und/oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das konjugierte synthetische Peptid einem dem jeweiligen genetischen Hintergrund entsprechendem T-Zell Epitop entspricht, wobei die identifizierte Sequenz des betreffenden T-Zell Epitops an einzelnen oder mehreren Positionen durch Aminosäureaustausche verändert werden kann.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, und/oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das synthetische T-Zell Epitop mit einem natürlichen oder zusätzlichen Cystein am N- oder C-Terminus synthetisiert wird, um die orientierte endständige Konjugation mit dem beschriebenen Verfahren zu erreichen.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 und/oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß jedes beliebige Polysaccharid, das mit Periodat oxidierbar ist, mit diesem Verfahren zu einem T-Zell abhängigen Antigen modifiziert werden kann.

7. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, und/oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß durch die orientierte Konjugation mit synthetischen T-Zell Epitopen die gegen das CPS gerichtet humorale Immunantwort Merkmale einer gegen ein Protein gerichteten Antwort erhält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6 und/oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß CPS unterschiedlicher Sequenz und/oder unterschiedlicher Herkunft aus verschiedenen biologischen oder synthe tischen Quellen, so z. B. aus unterschiedlichen bakteriellen Species oder Serogruppen, mit dem gleichen synthetischen Peptid modifiziert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 und/oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß modifizierte CPS unterschiedlicher Sequenz gleichzeitig zur Immunisierung eingesetzt werden können, wobei die modifizierten CPS gegenseitig eine Adjuvans-Wirkung zeigen und die spezifische Immunantwort gegen jedes CPS einen synergistischen Effekt zeigt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, und/oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die so modifizierten CPS Konjugate zur Erzeugung spezifischer monoklonaler Antikörper eingesetzt werden.