DE19815943C2 - Verfahren zur erythrozytenseitigen Blutgruppen-Bestimmung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur erythrozytenseitigen Blutgruppen­ bestimmung.

Unter Blutgruppen im engeren Sinne versteht man alle genetisch determinierten Erythrozyteneigenschaften, die durch das Vorhandensein spezifischer Antigene (Blutgruppensubstanzen) an der Eythrozytenmembran charakterisiert und mit serologischen Labormethoden nachweisbar sind. Die Blutgruppenbestimmung hat praktische Bedeutung bei der Transfusions­ behandlung zur Vermeindung und Klärung von Transfusionszwischenfällen, bei Transplantationen, in der Schwangerenvorsorge, in der Gerichtsmedizin u. v. m.. Das am längsten bekannte und bei der Blutgruppenbestimmung standardmäßig verwendete Blutgruppensystem ist das AB0-System mit den Blutgruppen (Phänotypen) A, B, AB und 0. Die Blutgruppe einer Probe wird durch Nachweis der Blutgruppensubstanzen durch spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen bei Zufuhr eines die jeweiligen Antikörper enthaltenden Serums, hier als Blutgruppenserum bezeichnet, bestimmt.

Die durch spezifische Antikörper ausgelöste Reaktion der an die Eythrozyten­ membran gebundenen Blutgruppensubstanzen mit den zugeführten Anti­ körpern äußert sich in einem Vernetzen und Verklumpen der Erythrozyten, das makroskopisch sichtbar gemacht werden kann und als Hämagglutination bezeichnet wird. Durch Analyse der Hämagglutinationsreaktion einer Erythrozytenprobe mit verschiedenen Antiseren kann das Muster der in der Erythrozytenprobe vorhandenen Antigene und damit schließlich die Blutgruppe bestimmt werden. Zur Sicherheit der Blutgruppenbestimmung wird weiterhin eine Serumgegenprobe vorgenommen, bei welcher im Blutserum derselben Probe enthaltene Antikörper durch spezifische Reaktionen nachgewiesen werden.

Die Hämagglutination kann auf verschiedene Weise sichtbar gemacht werden. Ein bisher bekanntes Verfahren zur Blutgruppenbestimmung verwendet Rundboden-Mikrotiterplatten, wobei in die Vertiefungen der Platte eine Serie von verschiedenen Antiseren, insbesondere Anti-A, Anti-B, Anti-D und Rhesuskontrollserum zur Bestimmung der Blutgruppe im AB0-System, einpipettiert und mit den zu testenden Erythrozyten in verdünnter Form versetzt wird. Nach einer Inkubationszeit wird die Platte anzentrifugiert und anschließend vorsichtig aufgeschüttelt. Bei einer positiven Antigen-Antikörper- Reaktion haben sich die Erythrozyten zu einem Klumpen agglutiniert, der sich durch den Zentrifugierschritt in der Mitte der Vertiefung ansammelt und durch das Aufschütteln möglichst nicht zerstört wird. Eine positive Reaktion ist demnach als eine punkt- oder knopfförmige Erythrozytenansammlung in der Mitte einer Vertiefung optisch zu detektieren. Demgegenüber besteht bei einer negativen Antigen-Antikörper-Reaktion, d. h. nicht erfolgter Agglutination, keine Verbindung zwischen den Erythrozyten. Die nach dem Zentrifugierschritt in der Vertiefungsmitte angesammelten Erythrozyten veteilen sich demnach durch das Aufschütteln über einen Großteil des U-förmigen Vertiefungsbodens. Eine negative Reaktion ist somit durch einen flächigen, über den Boden der Vertiefung ausgedehnten Erythrozytenfleck optisch detektierbar.

Dieses Verfahren ist jedoch nur aufwendig automatisierbar. Zum einen ist ein Zentrifugier- und ein Aufschüttelungsschritt technisch sehr aufwendig zu realisieren. Zum anderen hängt die Zuverlässigkeit der Detektion einer positiven Reaktion von der Stärke der Antikörper-Antigen-Bindung ab: Bei schwachen Bindungen kann der agglutinierte Erythrozytenklumpen durch äußere Störungen, insbesondere durch das Aufschütteln, wieder getrennt und somit fälschlich als negative Reaktion diagnostiziert werden. Aus diesem Grunde ist wegen des eventuell fehlenden klaren Sedimentationsbildes auch die automatische Unterscheidung zwischen positiver und negativer Reaktion, z. B. mittels automatischer photometrischer Auswertung, nicht ohne weiteres möglich, sondern muß von einer erfahrenen Bedienperson vorgenommen oder zumindest überprüft werden.

Ein weiteres Verfahren verwendet zur Detektion von Antikörper-Antigen- Reaktionen speziell präparierte Mikrotiterplatten, bei denen in den V-Boden der einzelnen Vertiefungen einen treppenförmige Struktur eingefräst ist. Die Breite der einzelnen Treppen liegt in der Größenordnung von einigen Mikrometern. In den Vertiefungen der Platte werden in bekannter Weise Antiseren mit Erythrozyten- und Blutserumsproben zur Reaktion gebracht und nach einer Inkubationszeit ausgewertet. Findet in einer Vertiefung keine Antikörper- Antigen-Reaktion statt, so sammeln sich die Erythrozyten in der Mitte der V- förmigen Vertiefung und sind als punkt- oder knopfförmiges Sediment detektierbar. Bei einer positiven Reaktion vernetzen jedoch die Erythrozyten und bilden ein flächig agglutiniertes Gebilde, das durch die treppenförmige Struktur gehalten wird. Dieselbe Reaktion in einer V-Boden-Mikrotiterplatte ohne Treppenstruktur würde zu einem Erythrozytenklumpen in der Vertiefungsmitte führen und wäre somit nicht von einer negativen Reaktion unterscheidbar. In diesem Fall ist eine positive Reaktion aufgrund der treppenförmigen Struktur jedoch als flächiger, über den Boden der Vertiefung ausgedehnter "Teppich" aus agglutinierten Erythrozyten optisch detektierbar.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß es als klassische Sedimentationsmethode, bei welcher keine zusätzlichen mechanischen Eingriffe notwendig sind, gut automatisierbar ist. Weiterhin ist auch die Auswertung aufgrund klarer Sedimentationsbilder, die gegenüber mechanischen Störungen relativ stabil sind, automatisiert photometrisch oder mit einer Videokamera möglich. Problematisch ist hingegen der hohe Aufwand zur Herstellung der betreffenden Mikrotiterplatten durch Einfräsen der Treppenstruktur. Aus diesem Grunde liegen die Preise der Mikrotiterplatten so hoch, daß eine einmalige Verwendung wirtschaftlich nicht tragbar ist. Zum Mehrwegbetrieb hingegen sind aufwendige Reinigungs- und Sterilisationsschritte notwendig, um keine verfälschten Ergebnisse zu erhalten. Weiterhin ist die Lebensdauer der Mikrotiterplatten erfahrungsgemäß auf etwa 50 bis 80 Einsätze begrenzt.

Die Verwendung von Rinderalbumin beim Antikörpernachweis ist an sich bekannt. Dabei wird das Serum eines jeden Blutspenders vor jeder Spende mit Testerythrozyten in einem Dreistufentest auf das Vorliegen von Antikörpern untersucht. In der ersten Stufe, der Kochsalzphase, wird eine 5%ige Testerythrozytensuspension mit Serum des Blutspenders vermengt und zentrifugiert. Verklumpen die Erythrozyten, enthält das Serum komplette Antikörper vom IgM-Typ. In der zweiten Stufe, der Supplementphase, wird das Serum-Testerythrozytengemisch mit Supplement versetzt. Supplement ist dabei der Oberbegriff für eiweißhaltige Lösungen wie AB-Serum und Rinderalbumin sowie makromolekulare Lösungen wie Dextran, Gelatine und Lösungen niedriger Ionenstärke (R. Eckstein: Immunhämatologie und Transfusionsmedizin, Gustav Fischer Verlag 1993, Seiten 10-11).

Die Verwendung von Rinderalbumin beim Antikörpernachweis ist an sich bekannt. Das Serum eines jeden Blutspenders wird vor jeder Spende mit Test­ erythrozyten in einem Dreistufentest auf das Vorliegen von Antikörpern unter­ sucht. In der ersten Stufe, der Kochsalzphase, wird eine 5%ige Testerythro­ zytensuspension mit Serum des Blutspenders vermengt und zentrifugiert. Verklumpen die Erythrozyten, enthält das Serum komplette Antikörper vom IgM-Typ. In der zweiten Stufe, der Supplementphase, wird das Serum-Test­ erythrozytengemisch mit Supplement versetzt. Supplement ist der Oberbegriff für eiweißhaltige Lösungen wie AB-Serum und Rinderalbumin sowie makro­ molekulare Lösungen wie Dextran, Gelatine und Lösungen niedriger Ionenstärke (R. Eckstein: Immunhämatologie und Transfusionsmedizin, Gustav Fischer Verlag 1993, Seiten 10-11).

Aus der Firmendruckschrift: DADE IgM Anti-D (MS-201), 09.96, der Firma DADE Diagnostika GmbH, München, ist die Verwendung einer Verdünnungs­ lösung von 4,5-6,5 Gew/Vol.% Rinderalbumin und 0,1 Gew/Vol.% Natriumazid als Konservierungsmittel in Zusammenhang mit dem Einsatz von D-Antigen (RH1) bekannt geworden. Das monoklonale D-Antigen ist gentechnischer Her­ kunft, die polyklonalen D-Antigene sind humanen oder tierischen Ursprungs und werden aus dem Serum gewonnen. Die Verdünnungslösung wird hier als Reagenz verwendet, jedoch gelangen vorbehandelte Mikrotiterplatten zum Einsatz. Ebenso sind ein Waschschritt, ein Zentrifugierschritt und ein Aufschüttelungs­ schritt notwendig.

Durch die DE 195 49 049 ist eine Testplatte für einen Agglutinationstest mit einer Vielzahl von darin ausgebildeten Vertiefungen bekannt geworden, die jede an einer Oberfläche anhaftendes Protein A und/oder Protein G aufweisen; diese sind aber nur in der Lage, IggAntikörper nachzuweisen. Durch die EP 0 408 280 A2 ist eine Testplatte aus Polycarbonat mit V-förmigen Vertiefungen, die am tiefsten Punkt gerundet sind, für DNA-Untersuchungen bei Erhitzung, bekannt geworden, welche für mehrere Erhitzungszyklen ausgelegt ist, weshalb die Testplatte bis 125 Grad Celsius hitzebeständig ist.

Durch die Literaturstelle J. H. Spindler, M. Kerowgan, H. Eichler, S. F. Goldmann: Photometric Evaluation of the Solid-Phase Antiglobulin Test Using Length Measurement of the Absorption Curve, Vox Sang 1998; 74, 36-41 ist ein photo­ metrisches Auswerteverfahren über die Vermessung der Kurvenlänge des Sedimentationsbildes in Mikrotiterplatten vorgeschlagen worden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur erythrozytenseitigen Blutgruppen-Bestimmung anzugeben, welches sowohl in der Präparation als auch in der Auswertung der Proben einfach und kostengünstig automatisierbar ist und die Verwendung von Einweg- Mikrotiterplatten erlaubt.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur erythrozytenseitigen Blutgruppen-Bestimmung gemäß Anspruch 1, bei welchem in vorteilhafter Weise handelsübliche Einweg-Spitzboden-Mikrotiterplatten Verwendung finden. Bei dem Verfahren handelt es sich um ein klassisches Sedimentationsverfahren ohne eine Zentrifugationsphase oder ein Aufschütteln der Proben. Es ist somit hinsichtlich der Präparation der Proben leicht automatisierbar, insbesondere mit Pipettierautomaten bekannter Bauart durchführbar.

In bekannter Weise werden handelsübliche Antiseren/Blutgruppenseren zur Detektion der einzelnen Blutgruppensubstanzen und damit zur Bestimmung der Blutgruppe durch Auswertung der Reaktionen einer Probe mit einer Serie von Antiseren herangezogen. In einer Ausprägung der Erfindung wird zur Bestimmung der Blutgruppe im AB0-System eines oder eine Kombination der folgenden Blutgruppenseren verwendet: Anti-A-, Anti-B-, Anti-D- und Rhesuskontroll-Serum. Es liegt jedoch auf der Hand, daß beliebige andere Blutgruppenseren ebenso zur Bestimmung weiterer Blutgruppenmerkmale im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens herangezogen werden können, z. B. AgC, C, c, E, e, K.

Die handelsüblichen Antiseren werden mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, wobei die zum Erhalt einer zuverlässigen Reaktion optimalen Verdünnungsverhältnisse wegen möglicher Konzentrations- und/oder Wirksamkeitsschwankungen zwischen Seren verschiedener Hersteller oder zwischen verschiedenen Chargen jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung, z. B. mittels einer geometrischen Verdünnungsserie, ermittelt wurden.

Erfindungsgemäß ist den verdünnten Blutgruppenseren jeweils Albumin, vorzugsweise Bovines Albumin, derart zugesetzt ist, daß die Albumin- Konzentration des somit entstandenen Reagenzes jeweils 0,05 mg/ml bis 2,2 g/ml beträgt. In einer vorteilhaften Ausführung der Erfindung beträgt die Albumin-Konzentration für alle Reagenzien 0,1 mg/ml bis 1,0 g/ml, in einer weiteren Ausführung 0,2 mg/ml bis 1,0 mg/ml. Zuverlässige Reaktionsergebnisse wurden weiterhin mit einer Albumin-Konzentration von 0,3 mg/ml bis 0,4 mg/ml für alle Reagenzien erzielt.

Die obengenannte Vortitrierung zur Ermittlung der optimalen Verdün­ nungsverhältnisse wird ebenfalls unter Zusatz von Albumin in der bei der Blutgruppenbestimmung verwendeten Konzentration durchgeführt.

Zur Konservierung wird den Reagenzien vorzugsweis Natrium-Acid oder ein anderes Konservierungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 0,02 mg/ml, vorzugsweise 0,016 bis 0,02 mg/ml, in der Gesamtlösung zugefügt.

Manuell oder mittels eines Pipettierautomaten wird ein vorbestimmtes Volumen, in der Regel 25 µl, eines oder mehrerer der zuvor angesetzten Reagenzien in jeweils eine V-förmige Vertiefung der Mikrotiterplatte einpipettiert. Zur vollständigen Zuordnung einer Blutprobe zu einer Blutgruppe des AB0-Systems mit Rhesusfaktoren sind erythrozytenseitig die vier genannten Seren, Anti-A-, Anti-B-, Anti-D- und Rhesuskontroll-Serum, ausreichend. Sollen weitere Blutgruppenmerkmale bestimmt werden, müssen je zu untersuchender Erythrozytenprobe weitere Vertiefungen der Mikrotiterplatte mit dem entsprechenden Reagenz befüllt werden. Auf einer Mikrotiterplatte können je nach Anzahl der zu bestimmenden Blutgruppen­ merkmalen die Blutgruppen einer Mehrzahl von Proben typisiert werden. Im Falle einer automatischen Pipettierung kann der Pipettierautomat in einfacher Weise entsprechend programmiert werden.

Zu dem in eine V-förmige Vertiefung pipettierten Reagenz wird jeweils ein vorbestimmtes Volumen, in der Regel ebenfalls 25 µl, einer mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnten Erythrozytensuspension hinzu­ gefügt. Das Verdünnungsverhältnis der Erythrozytensuspension beträgt etwa 1 : 60 bis 1 : 120, vorzugsweise 1 : 81. Jede Blutprobe wird mit jedem der verwendeten Seren in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte zusammengeführt. Im Falle einer automatischen Pipettierung kann der Pipettierautomat in einfacher Weise entsprechend programmiert werden.

Die je nach Anzahl zu typisierende Blutproben und Anzahl zu bestimmender Blutgruppenmerkmale ganz oder teilweise befüllte Mikrotiterplatte wird bei Temperaturen von etwa 15°C bis 30°C für etwa 50 bis 70 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, inkubiert. Dabei agglutinieren die Erythrozyten bei einer positiven Antikörper-Antigen-Reaktion und bilden einen schon mit bloßen Auge sichtbaren "Rasen" bzw. "Teppich", der den Spitzboden der Vertiefungen der Mikrotiterplatte flächig weitgehend bedeckt. Diese Rasenbildung wird durch das Zufügen von Albumin erzielt und ist nach der Inkubation gegenüber mechanischen Störungen und auch über mehrere Stunden, ggfs. sogar Tage, weitgehend stabil. Bei einer negativen Antikörper-Antigen-Reaktion sedimentieren die Erythrozyten in der Mitte der Vertiefung am tiefsten Punkt des Bodens und sind als Erythrozytenklumpen optisch detektierbar. Negative und positive Reaktionen sind bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgrund einer deutlichen punktförmigen bzw. flächigen Sedimentation stets klar unter­ scheidbar. Bei einer Inkubationszeit von etwa 60 Minuten bei Zimmer­ temperatur wurden zuverlässige Ergebnisse beobachtet.

An die Inkubationsphase direkt anschließend oder auch einige Stunden bis sogar Tage später erfolgt die optische Auswertung der Sedimentationsbilder zur Erfassung einer Erythrozytenagglutination durch Antigen-Antikörper- Reaktion. Die optische Auswertung kann manuell, d. h. schon nach Augen­ maß, durch eine Bedienperson erfolgen, die wegen der erzielbaren klaren Sedimentationsbilder nicht gesondert geschult sein muß. Vorteilhaft werden die Mikrotiterplatten jedoch automatisch ausgewertet; eine automatische Auswertung, z. B. photometrisch oder durch Auswertung von Bildern einer Videokamera, ist wegen der durch die Erfindung erzielbaren klaren Sedimentationsbilder zuverlässig möglich. Dies führt zu erheblichen Zeit- und Kosteneinsparungen sowie zu einer erhöhten Verwechslungssicherheit der Proben.

Eine hinsichtlich der automatischen Auswertung der Sedimentationsbilder zur Analyse, ob in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Antikörper- Antigen-Reaktion stattgefunden hat, besonders vorteilhafte Weiterbildung des Verfahrens ist die Auswertung der Sedimentationsbilder mittels eines Photometers. Dabei wird die Absorption oder Transmission des in einer Vertiefung enthaltenen Erythrozyten-Reagenz-Gemischs entlang einer vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet. Diese Linie verläuft vorzugsweise durch den Mittelpunkt der Vertiefung und reicht von einem Rand der Vertiefung bis zum nächsten. Die Aufzeichnung des Absorptions- bzw. Transmissionsprofils wird für alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte wiederholt und die so ermittelten örtlichen Profile ausgewertet.

Vorzugsweise wird die Auswertung nach der Kurvenlängenmethode vorgenommen. Dabei wird für eine feste Profilbreite, d. h. für ein vorbestimmtes Intervall Δx, die Länge L des Profils bzw. ein Maß dafür ermittelt, z. B. durch Summation der Abstände aller oder einzelner Punkte des gemessenen Profils im zweidimensionalen Datenraum. Eine positive bzw. negative Reaktion wird diagnostiziert, wenn die Profillänge L der Absorptionskurve unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmbaren Wertes liegt. Falls die Transmission gemessen wurde, sind die Verhältnisse umgekehrt. Denn bei einer positiven Reaktion ist über den Großteil der Breite der Vertiefung eine erhöhte Absorption bzw. verminderte Transmission zu beobachten. Dies führt zu einem flachen Profil mit verkürzter Kurvenlänge. Bei einer negativen Reaktion konzentriert sich das absorbierende Material auf einen engen räumlichen Bereich, was zu einem stark ausgeprägten Absorptionsmaximum bzw. Transmissionsminimum und damit zu einer verlängerten Kurvenlänge führt.

Die erfindungsgemäße Wirkung der "Rasenbildung" im Falle einer positiven Antigen-Antikörper-Reaktion kann anstelle von Albumin auch mit Ovalbumin, Thyreoglobulin, Fibrinogen, Gewebsantigenen, Bromelin oder Papain oder eine Mischung dieser Substanzen einschließlich Albumin erzielt werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich in vorteilhafter Weise handelsübliche Einmal-Mikrotiterplatten zur erythrozytenseitigen Blut­ gruppenbestimmung in einem einfachen klassischen Sedimentations­ verfahren einsetzen. Die Sedimentationsbilder lassen eine eindeutige Unter­ scheidung zwischen positiven und negativen Reaktionen zu. Das Verfahren kann in einfacher Weise automatisiert werden, insbesondere unter Einsatz eines Pipettierautomaten und einer automatisierten optischen Auswertung der Sedimentationsbilder. Dadurch wird ein hoher Probendurchsatz bei minimalen Materialkosten und erhöhter Verwechslungssicherheit erzielt.

Im folgenden ist ein Beispiel für die erfindungsgemäßen Mischungs­ verhältnisse zur Bestimmung von Blutgruppen im AB0-System und die Durchführung des Verfahrens beschrieben:

• a) 500 µl handelsübliches Anti-A-Serum wird mit 32 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, entsprechend einer Verdünnung von 1 : 65. Der Lösung wird 50 µl 10%ige Natrium-Acid-Lösung und 50 µl 22%iges Rinderalbumin zugefügt. Dies entspricht einer Albumin-Konzentration von 0,337 mg/ml bzw. einer Albumin-Verdünnung von 1 : 652.
• b) 2 ml handelsübliches Anti-B-Serum wird mit 30 ml physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, entsprechend einer Verdünnung von 1 : 16. Der Lösung wird ebenfalls 50 µl 10%ige Natrium-Acid-Lösung und 50 µl 22%iges Rinderalbumin zugefügt. Dies entspricht einer Albumin-Konzentration von 0,343 mg/ml bzw. einer Albumin-Verdünnung von 1 : 642.
• c) Anti-D-Serum und Rhesus-Kontrollserum wird wie im Fall b) angesetzt und verdünnt.

Mittels eines Pipettierroboters werden je 25 µl der unter a), b) und c) genannten Reagenzien zur Anti-A-, Anti-B-, Anti-D-Bestimmung und Rhesuskontrolle in die Vertiefungen einer V-Boden-Mikrotiterplatte einpipettiert. Anschließend werden je 25 µl der zu untersuchenden Spender- Erythrozyten, die im Verhältnis 1 : 81 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt sind, mittels des Pipettierroboters zugefügt. Nach einer Stunde Sedimentation, Inkubation bei Raumtemperatur, werden die Reaktionen photometrisch ausgewertet. Bei einer positiven Reaktion hat über die spezifischen Antikörper eine Vernetzung der Erythrozyten stattgefunden. Es bildet sich ein kompletter Rasen über die gesamte Bodenfläche. Die Rasenbildung wird durch Albumin gefördert und stabilisiert. Bei einer negativen Reaktion sind die Erythrozyten in der Spitze des V-Bodens sedimentiert. Zur Auswertung der Reaktionen eignet sich besonders die Kurvenlängen-Methode.

Kurzbeschreibung der Zeichnung, in der zeigen:

Fig. 1 die Aufsicht auf eine Spitzboden-Mikrotiterplatte

Fig. 2a und 2b im Querschnitt eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit V-förmigen Boden sowie einer negativen bzw. einer positiven Antigen-Antikörper-Reaktion.

Fig. 1 zeigt die Aufsicht auf eine Spitzboden-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, die in 12 Reihen zu je 8 Stück angeordnet sind. In die Felder 1A und 1E ist Anti-A-Serum, in die Felder 1B und 1F Anti-B-Serum, in die Felder 1C und 1G Anti-D-Serum und in die Felder 1D und 1H Rhesus- Kontrollserum der oben beschriebenen Zusammensetzung und Menge pipettiert. In die Felder 1A bis 1D wurde Erythrozytensuspension einer ersten Blutprobe, in die Felder 1E bis 1H einer zweitem Blutprobe zugefügt.

Nach einer Inkubationszeit von etwa einer Stunde ergibt sich das in Fig. 1 dargestellte Bild. In den Feldern 1A, 1B, 1C, 1E und 1G hat sich aufgrund einer positiven Antigen-Antikörper-Reaktion ein "Rasen" ausgebildet, der die schräge Bodenfläche bedeckt. In den übrigen Feldern sind die Erythrozyten in der Mitte der Vertiefung sedimentiert und sind als "Knopf" sichtbar.

Für die erste Probe (Felder 1A bis 1D) ergibt sich folgendes Ergebnis: Anti-A positiv, Anti-B positiv, Anti-D positiv, Rhesuskontrolle negativ, d. h. die Blutgruppe wurde zu AB positiv bestimmt. Für die zweite Probe (Felder 1E bis 1H) ergibt sich folgendes Ergebnis: Anti-A positiv, Anti-B negativ, Anti-D positiv, Rhesuskontrolle negativ, d. h. die Blutgruppe wurde zu A positiv bestimmt.

Die Fig. 2a und 2b zeigen je eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit V- förmigen Boden im Querschnitt. Weiterhin ist schematisch eine negative (Fig. 2a) bzw. eine positive (Fig. 2b) Antigen-Antikörper-Reaktion dargestellt. In Fig. 2a sind die Erythrozyten aufgrund der Schwerkraft und aufgrund einer fehlenden Brückenbildung durch spezifische Antigen-Antikörper- Reaktion in die Mitte der Vertiefung gerutscht. In Fig. 2b wurden die Erythrozyten aufgrund der spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion vernetzt und bilden einen Rasen, der die schräge Bodenfläche bedeckt. Albumin dient dabei zur Stabilisierung der Vernetzung.

Das Verfahren ist in allen Bereichen, in denen routinemäßig Blut unter­ sucht und typisiert wird, gewerblich anwendbar, insbesondere bei den großen Blutspendediensten und in Krankenhäusern.

Claims (18)

1. Verfahren zur erythrozytenseitigen Blutgruppen-Bestimmung, gekennzeichnet durch

• 1. 1.1 die Verwendung von Spitzboden- oder V-Boden-Mikrotiterplatten;
• 2. 1.2 Einpipettieren eines vorbestimmten Volumens eines oder mehrerer mit phy­ siologischer Kochsalzlösung verdünnter Blutgruppenseren in jeweils eine Vertiefung der Mikrotiterplatte, wobei die Verdünnungsverhältnisse des Se­ rums bzw. der Seren jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung ermit­ telt wurden und wobei der Lösung jeweils Albumin derart zugesetzt ist, daß die Albumin-Konzentration des einpipettierten Reagenzes 0,05 mg/ml bis 2,2 g/ml beträgt;
• 3. 1.3 Hinzufügen eines vorbestimmten Volumens mit physiologischer Kochsalz­ lösung verdünnter Erythrozyten des zu typisierenden Bluts zu den jeweiligen Reagenzien;
• 4. 1.4 Inkubation bei Temperaturen von etwa 15°C bis 30°C;
• 5. 1.5 optische Auswertung des Sedimentationsbildes zur Erfassung einer Erythrozytenagglutination durch Antigen-Antikörper-Reaktion nach der optischen Unterscheidung, ob eine Bedeckung der schrägen Bodenfläche (Rasenbildung) der Vertiefung oder eine Bedeckung nur in der Mitte der Vertiefung (Knopfbildung) der Mikrotiterplatten stattgefunden hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse, ob in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Antikörper- Antigen-Reaktion stattgefunden hat, anhand des Sedimentationsbildes optisch durch eine Bedienperson oder automatisch auf photometrischem Weg oder videogesteuert vorgenommen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse, ob in einer Vertiefung der Mikrotiterplatte eine Antikörper- Antigen-Reaktion stattgefunden hat, photometrisch erfolgt, indem die Absorption des in der Vertiefung enthaltenen Erythrozyten-Reagenz-Gemischs entlang einer vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet und das so ermittelte örtliche Absorptionsprofil ausgewertet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die optische Auswertung des Sedimentationsbildes durch Aufsicht auf die Mikrotiterplatte oder durch Messung der Transmission erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt 1.2. zur Blutgruppenbestimmung im AB0-System ein vorbestimmtes Volumen eines oder mehrerer der folgenden Reagenzien in jeweils eine Vertiefung der Mikrotiterplatte einpipettiert wird:

• a) Mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-A-Serum,
• b) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-B-Serum,
• c) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Anti-D-Serum,
• d) mit physiologischer Kochsalzlösung verdünntes Rhesuskontroll- Serum,

wobei die Verdünnungsverhältnisse der Seren jeweils in bekannter Weise durch Vortitrierung ermittelt wurden und wobei der Lösung jeweils Albumin derart zugesetzt ist, daß die Albumin-Konzentration 0,05 mg/ml bis 2,2 g/ml beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die im Schritt 1.3. hinzugefügten Erythrozyten im Verhältnis 1 : 60 bis 1 : 120 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 5 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubationszeit im Schritt 1.4. wenigstens 30 Minuten, vorzugsweise wenigstens 60 Minuten beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Albumin-Konzentration für alle Reagenzien 0,1 mg/ml bis 1,0 g/ml beträgt.

9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Albumin-Konzentration für alle Reagenzien 0,2 mg/ml bis 1,0 mg/ml beträgt.

10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Albumin-Konzentration für alle Reagenzien 0,3 mg/ml bis 0,4 mg/ml beträgt.

11. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß für eine feste Profilbreite die Profillänge ermittelt wird und eine positive bzw. negative Reaktion diagnostiziert wird, wenn die Profillänge unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmbaren Wertes liegt.

12. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte 1.1. bis 1.3. vollautomatisch unter Verwendung eines Pipet­ tierautomaten durchgeführt werden.

13. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zum Ansetzen der Reagenzien a) bis d) Rinderalbumin verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt 1.4. bei Zimmertemperatur für etwa 60 min. durchgeführt wird.

15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Erythrozyten einer Probe jeweils mit allen der Reagenzien a) bis d) zur Reaktion gebracht werden und die Blutgruppe durch Kombination der jeweiligen Reaktionsergebnisse (positive bzw. negative Antikörper-Antigen-Reaktion) bestimmt wird.

16. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien a) bis d) zur Konservierung Natrium-Acid in einer Konzentration von 0,01 bis 0,02 mg/ml enthalten.

17. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Albumin Ovalbumin, Thyreoglobulin, Fibrinogen, Gewebs­ antigene, Bromelin oder Papain oder eine Mischung dieser Substanzen einschließlich Albumin verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der vorangegangenene Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das im Schritt 1.2. und 1.3. genannte vorbe­ stimmte Volumen 15 bis 50 µl, vorzugsweise 25 µl beträgt.