DE19804216C2 - Verfahren zum Nachweis von zentralnervösem Gewebe in Erzeugnissen, insbesondere in Fleischerzeugnissen, sowie ein Testkit hierzu - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von spezifischem Risikomaterial, vorzugsweise von zentralnervösem Gewebe wie insbesonders Gehirnzusätzen sowie Zusätzen von zentralem Nervengewebe in Erzeugnissen wie Lebensmitteln und pharmazeutischen Präparaten und ein Testkit zur Durchführung des Verfah­ rens.

Es ist bekannt, daß von mit Scrapie erkrankten Schafen und Ziegen stammendem Gewebe Rinderwahnsinn (Bovine spongi­ forme Enzephalopathie, BSE) bei Rindern erzeugt werden kann. Hierbei hat es sich gezeigt, daß der Erreger offen­ bar auch durch den Verzehr von infiziertem Fleisch bzw. Fleischprodukten auch auf den Menschen übertragen werden kann und dort zu einer neuen Variante der Jakob-Creutz­ feldt-Erkrankung (nvCJD) führen kann. Da weiterhin gefun­ den wurde, daß sich die für die Auslösung der Erkrankung verantwortlichen infektiösen Proteine (Prione) besonders in den Nerven und im Gehirn ansammeln, stellen Gewebe aus diesen Organen auch unter Berücksichtigung von nach nicht entdeckten Erregern und Agenzien ein hohes Infektionsri­ siko dar. Daher werden derartige von Rindern, Schafen und Ziegen stammende Organe, die üblicherweise eine hohe Prionen-konzentration enthalten, als "spezifiziertes Risikomaterial" (SRM) bezeichnet.

Rechtsvorschriften wie die Entscheidung der Kommission 97/534/EG (Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften Nr. L 1997, 216: 95-98) sehen vor, daß derartiges spezielles, bei der Schlachtung anfallendes Risikomaterial getrennt gesammelt, eingefärbt und auch getrennt von übrigen Schlachtabfällen beseitigt werden muß. Hierzu gehören auch Augen, Mandeln oder die Milz derartiger Tiere.

Da bei der Verarbeitung von Lebensmitteln, insbesondere von Fleischerzeugnissen wie Würsten, das Zusetzen von Hirngewebe auch technische Wirkungen wie bessere Emul­ gierbarkeit (Brühwurstbrät) und erhöhte Stabilität (Beefburger) bietet, ist es zum Schutze des Verbrauchers notwendig, die Einhaltung des zuvor genannten Verwer­ tungsverbotes im Rahmen der Lebensmittelüberwachung zu kontrollieren. Dabei wurden bislang von den zu untersu­ chenden Lebensmitteln, wie z. B. Fleischerzeugnissen histologische Präparate hergestellt, welche anschließend von besonders geschulten Fachleuten lichtmikroskopisch untersucht wurden. Mit diesem Verfahren können neben den zu erwartenden Bestandteilen der Muskulatur und Bindege­ webe auch nicht erwünschte Gewebe identifiziert werden, wie Niere, Pansen oder auch Haut.

Es hat sich jedoch gezeigt, daß der Zusatz von Hirngewebe mittels lichtmikroskopischer Routinediagnostik, d. h. durch Anfertigen von 10 µm Kryoschnitten und Färbung mit Picroindigocarmin/Karmalaun nicht erfaßt werden. Dies gilt auch für Ultradünnschnitte mit herkömmlicher Färbetechnik (Hämatoxylin/Eosin) sowie für Spezialfärbungen (Silberim­ prägnierung, Neurofibrillen, Markscheiben, Nissl-Färbung). Auch ZNS-charakteristische Bestandteile wie Hirnhaut, oder Zellstrukturen wie Astrozyten sind mittels den oben genannten Verfahren nicht identifizierbar.

Es besteht daher Bedarf an einem schnellen Testverfahren, mit dem die Verwendung derartiger unerlaubter spezifi­ zierter Risikomaterialien auch noch in geringen Mengen nachgewiesen werden kann.

Es ist bereits ein Verfahren zum Nachweis von uner­ wünschten Zutaten in Fleischerzeugnissen bekannt und zwar im besonderen in Hinblick auf die bovine spongiforme Enzephalophathie (BSE) [Fleischwirtschaft 77 (9), 836-840 (1997), E. Lücker und M. Bülte]. Dabei wird mit einem enzymatisch-photometrischen Verfahren der Cholesteringe­ halt bestimmt, wodurch sich bereits ein Zusatz von 2% Gehirngewebe in Brühwürsten nachweisen läßt. Dieses Verfahren hat zwar den Vorteil, daß es sich auf einfache Weise mit geringen instrumentellem Zeit- und Kastenaufwand durchführen läßt. Es weist jedoch den Nachteil auf, daß es nicht möglich ist, festzustellen, ob ein erhöhter Chole­ steringehalt durch verbotene Hirnzusätze oder durch Zusätze wie Eigelb, Leber oder pflanzliche 3-β-Hydroxy­ sterine hervorgerufen wird. Daher kann er in der Praxis nur zum Auffinden von Verdachtsproben dienen.

Das glycolytische Enzym Enolase, eine 2-Phospho-D-gly­ cerat-Hydrolase (Cras P., Martin J. J., Gheuens, J., γ-enolase and glial fibrillary acidic protein in nervous system tumors. An immunohistochemical study using specific monoclonal antibodies, Acta Neuropathol. 1988, 75: 377-84 und Cras P., Soler Federsppiel, S. Gheuens J., Martin. J.-J., Lowenthal A., Demonstration of neuron-specific enolase in nonneuronal tumors using a specific monoclonal antibody, Ann. Neurol. 1986, 20: 106-7) ist als Marker für neuronale und nichtneuronale Tumore bekannt.

Die Erfindung hat daher zum Ziel, den weiterhin bestehen­ den Bedarf an einem spezifischen, leicht durchzuführenden Verfahren zu befriedigen, mit dem spezifiziertes Risiko­ material, insbesondere Gehirn- und Nervengewebe nach bei einem geringen Gehalt zweifelsfrei nachgewiesen werden kann. Ein derartiges Testverfahren soll preiswert, schnell durchführbar und automatisierbar sein, damit es als Routineverfahren generell einsetzbar ist.

Dieses Ziel wird nun mittels dem erfindungsgemäßen Ver­ fahren nach Anspruch 1 erreicht.

Es wurde nämlich gefunden, daß sich der Zusatz von Ge­ hirnmasse bzw. zentralem Nervengewebe durch den Gehalt an γ,γ-Enolase (EC 4.2.1.11, neuronenspezifische Enolase) nachweisen läßt, wobei der Gehalt direkt proportional zur zugesetzten Gehirnmasse bzw. Nervenmasse ist. Dies ist umso überraschender, weil umfangreiche Untersuchungen der Erfinder gezeigt haben, daß in erhitzten Fleischerzeug­ nissen wie Brüh- und Kochwürsten mit definierten Hirnzu­ sätzen bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese und beim Isoelektrischen Fokussieren (PAGIF) keine spezifischen Banden erhalten werden, die sich vom gleichen Produkt ohne Hirnzusatz unterscheiden, da sowohl die Struktur als auch die elektrochemischen bzw. proteinchemischen Eigenschaften der ZNS-spezifischen Proteine bei der Erhitzung während der Wurstherstellung (mindestens 80°C über etwa 60 Minu­ ten) nachhaltig beeinträchtigt werden. Dies gilt auch für den Nachweis von derartigen charakteristischen Proteinen mittels immunologischer Methoden.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß sich trotz der oben beschriebenen Proteindenaturierung ein spezifischer Nachweis von Hirngewebe bzw. zentralem Nervengewebe in Erzeugnissen bzw. Präparaten durchführen läßt. Vorzugs­ weise wird der Nachweis mittels γ,γ-Enolase-spezifischen Antikörpern durchgeführt. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß sich der Nachweis auch mittels polyklonalen γ,γ-Enolase-Antikörpern spezifisch durch­ führen läßt.

Erfindungsgemäß wurde auch gefunden, daß sich die Emp­ findlichkeit des Nachweises von γ,γ-Enolase beträchtlich steigern läßt, wenn die zu untersuchende Probe vorher einer Fettextraktion unterzogen wird. Auf diese Weise ist es möglich, noch 0,25% Zusatz an Rinderhirn in Fleischer­ zeugnissen selektiv nachzuweisen.

Die erfindungsgemäße Fettextraktion wird mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels durchgeführt. Vorzugsweise werden nicht-protonische apolare Lösungsmittel wie Petro­ leum-Benzin, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff oder Ether verwendet. Auch die Extraktion mittels Gasen im überkri­ tischen Zustand, wie beispielsweise CO₂ ist möglich. Optimale Bedingungen werden bei der isothermischen Ex­ traktion im Rückfluß (Soxhlet) erreicht. Die Reduktion des Fettgehaltes sollte bezogen auf den Fettgehalt der Probe mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, im besonderen mindestens 30% bzw. bezogen auf die Probenmasse mindestens 2%, zweckmäßigerweise mindestens 5% und vorzugsweise mindestens 8% und im besonderen mindestens 15% betragen. In der Praxis hat es sich gezeigt, daß je nach Probe eine Extraktion im Bereich von 15-60% zweckmäßig ist. Vorzugsweise wird die Fettextraktion an der nativen Probe durchgeführt. Extraktion mit anderen Mitteln wie SDS oder Tensiden wie Temed oder Nonidet sind zwar möglich, jedoch werden die zuvor genannten Lösungsmittel bevorzugt. Gleiches trifft auf die Proteinanreicherung mittels umgekehrter Filtration (Zentrisart, Sartorius) zu.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, mittels geeigneten Antikörpern gegen Spezies-spezifische γ,γ-Enolase Hirn- und Nervenzusätze von unterschiedlichen Tierarten zu bestimmen. Dabei werden die γ,γ-Enolasen von verschie­ denen Tierarten nach einer einfachen und reproduzierbaren Reinigung aus Gehirngewebe und aus Rous-Sarkoma­ transformierten Zellen von verschiedenen Tierarten gewon­ nen (Eigenbrodt, E., P. Fister, H. Rübsamen, R. R. Fries, Influence of transformation by Raus sarcame virus an the amount, phasphorylation and enzyme kinetic properties of enolase, The EMBO Journal, Vol. 2: 1565-1570, 1983). Nach der Isolierung und Reinigung des so erhaltenen Enzyms kann dieses nach bekannten Verfahren zur Herstellung von poly- und monoklonalen Antikörpern verwendet, werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens. In einer bevorzugten Ausführungsfarm wird dabei ein an γ,γ-Enolase bindender Antikörper, vorzugs­ weise ein spezifischer Antikörper mittels bekannten Verfahren an eine Festphase immobilisiert. Die zu unter­ suchende Probe wird dann mit dem vorzugsweise gelösten Enzym in Kontakt gebracht und in einem geeigneten Puffer­ system mittels der Antikörper an die Festphase gebunden. Nach Waschen des so erhaltenen immobilisierten Antikörper-Enolase-Komplexes wird dann ein weiterer, mit einem Marker versehener sekundärer Antikörper zugesetzt, der an ein anderes Epitop der γ,γ-Enolase bindet und die Menge des Markers bestimmt. Die Menge an gebundenem Marker ist direkt proportional der Menge der Enolase in der Probe. Zweckmäßigerweise enthält der Testkit Referenzma­ terial mit unterschiedlichen Hirn- und/oder Nervenzusätzen zur Sicherung der Analysenqualität.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Analytenkonzen­ tration mittels Biosensoren zu bestimmen, wie z. B. amperometrische Sensoren, potentiometrische, ionenselek­ tive patentiometrische oder photometrische Sensoren oder auch solche mittels Halbleiterelektroden wie Feldeffekt­ transistoren (FET), chemosensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET), suspended-gate-Feldeffekttransistoren (SGFET) oder ionensensitiven Feldeffekttransistoren. Derartige Biosensoren sind zusammenfassend in E. A. H. Hall und G. Hummel in "Biosensoren", Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere Entwicklungen von ionensensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind unter anderem von F. Aberl und H. Wolf in "Aktuelle Trends in der Immunsensorik, Labor 2000, S. 70-96, (1993)" beschrieben. Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächen­ wellenelementen, welche als Mikrowaagen verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper (der sog. Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat immobi­ lisiert und nach Bindung mit der zu analysierenden γ,γ-Enolase gemessen. Derartige Sensoren sind bei­ spielsweise von A. Leidl et al. in "Proceedings of the second international symposium on miniaturized total analyses system µTAS", Basel 1996, beschrieben. Quarzkri­ stallmikrowaagen, wie sie von C. Köslinger et al., Fresenius J. Anal. Chem. (1994), 349, 349-354 beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen.

Beispiel 1:

Es wurden Brühwürste mit definierten Zusätzen an Rinder­ hirn hergestellt, wie dies bei Lücker und Bülte [(1997) Fleischwirtschaft 77, Seite 136-840 (1997)] beschrieben ist. Bei diesen Brühwurststandards betrug der Anteil an Hirn 0%, 1%, 2%, 3,8%, 7,4%, 13,8% und 33,3% (BWS-a bis g). Bei einem zusätzlichen Standard wurde anstelle des Hirns 16% Eigelb zugesetzt (BWS-Ei). Die Proben wurden unter Kühlung mit Tris-Harnstoff-Puffer im Potter extra­ hiert (Extraktionspuffer: TRIS-Harnstoff-Puffer aus 20 mM Tris(Hydroxymethyl)-Amminomethan, 8 M Harnstoff, pH 7,6 und 15 Minuten bei 2500 UpM zentrifugiert und zweifach filtriert. Das Filtrat wurde im Verhältnis 50 : 1 mit Probenpuffer (TRIS-SDS-Mercaptoethanal-Harnstoff, Proben­ puffer zu gleichen Teilen aus Sammelgelpuffer, 10%igem Gew./Vol. 2-Mercaptoethanol, 10%igem Gew./Vol. SDS und 8 M Harnstoff; Sammelgelpuffer: 0,5 Tris(Hydroxymethyl)- Amminomethan, 1% Gew./Vol. SDS) verdünnt. Diese Probenex­ trakte können bei -18°C über mehrere Monate hindurch ahne Qualitätsverluste gelagert werden.

Die Proteinkonzentration der Extrakte wurde mit einem Proteintest von Bio-Rad (Richmond, USA) bestimmt. Die Proteine wurden mittels einer SDS-Gel-Elektrophorese mit 10%igen Acrylamidgelen nach Laemmli [Nature, 227, 680-685 (1970)] aufgetrennt. Dabei wurde bei jeder Probe 10-100 µg Protein aufgetragen. Nach der Auftrennung wurde mit Coomassie-Blau angefärbt, wobei als Marker der Molekular­ masse-Kalibrierungskit LMW von Pharmacia (Uppsala, Schwe­ den) verwendet wurde.

Die aufgetrennten extrahierten Proteine wurden dann im Elektroblotverfahren (CTI, Idstein/Taunus) auf Nitrocellulose-Membranen (Optitran BA-S85, Schleicher und Schuell) bzw. auf PVDF-Membranen (Immobilon-P., Millipore, Bedford/USA) übertragen und mittels primärer poly- bzw. monoklonaler Antikörper in Verbindung mit sekundären Antikörpern markiert, die mit Peroxidase konjugiert waren (direkt bzw. biotinyliert). Als Substrat, für die Farbre­ aktion wurde 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochloridhydrat (DAB, Aldrich, Milwaukee, USA) verwendet.

Als Antikörper wurden sowohl poly- als auch monoklonale Antikörper verwendet. Polyklonale Antikörper, die gegen γ,γ-Enolase gerichtet sind, z. B. Rabbit N 535 γ-Enolase, werden von Genosys hergestellt und durch IC Chemikalien GmbH, Ismaning/DE vertrieben. Ihre Kreuzreak­ tivität mit α-Enolase wird als < 10% angegeben. Monoklonale Antikörper, die gegen die humane γ,γ-Enolase gerichtet sind, werden von DAKO, Hamburg/DE vertrieben.

Weitere erfindungsgemäß zu verwendende monoklonale Anti­ körper sind aus Zellinien erhältlich, die dem Mäusezell­ klan BBS/NC/VI-H14 entstammen. Diese monoklonalen Anti­ körper zeigen keine Kreuzreaktivität mit humaner α- oder β-Enalase. Soler Federsppiel, B. S., P. Cras, J. Gheueus, D. Andries, A. Lowenthal, Human γ,γ-Enolase: Two-site immunoradiometric assay with a single monoclonal antibody, Journal of Neurochemistry 1987, 48: 22-28.

Beispiel 2:

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei die Wurstproben jedoch manuell mit einem Messer fein zerkleinert wurden. Von diesem gehackten Material wurden 10 g auf einen Faltenfil­ ter (Schleicher und Schuell, Nr. 597¹/₂) eingewogen und der Filter mit dem Probenmaterial in eine Extraktionshülse aus Filterpapier (Schleicher und Schuell, Nr. 603) einge­ bracht, mit Watte verschlossen und in einen Extraktions­ apparat nach Soxhlet eingesetzt. Dabei wurde das 1,5-fache des Extraktionsaufsatzes an Petroleum-Benzin in den Extrakti­ onskolben gegeben und acht Stunden unter Rückfluß extra­ hiert. Nach Rückdestillierung des Lösungsmittels wurden die Extraktionshülsen entnommen und bei Raumtemperatur (etwa 1 Stunde) getrocknet. Im Durchschnitt wurde ca. 36% des Fettgehaltes der Probe extrahiert.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle angegeben.

Tabellarische Auflistung der Ergebnisse (semiquantitativ) aus Beispiel 1 (ohne Fettextraktion) und Beispiel 2 (mit Fettextraktion)

Claims (12)

1. Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis von zentralnervösem Gewebe in Erzeugnissen, insbe­ sondere in Fleischerzeugnissen, dadurch gekennzeich­ net, daß man zugesetztes Gehirn und/oder Nervengewebe durch den Gehalt an γ,γ-Enolase in einer zu unter­ suchenden Probe bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gehalt mittels anti-γ,γ-Enolase-Anti­ körpern bestimmt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die γ,γ-Enolase aus der zu untersuchenden Probe vor der Bestimmung extrahiert.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe lipophil extrahiert.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der aus der Hybridoma- Zellinie BBS/NC/VI-H14 erhältlich ist.

6. Testkit zum Nachweis von Zusätzen von zentralnervösem Gewebe in Erzeugnissen, insbesondere in Fleisch­ erzeugnissen, dadurch gekennzeichnet, daß er Anti­ körper gegen γ,γ-Enolase enthält.

7. Testkit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, erhält­ lich aus der Hybridoma-Zellinie BBS/NC/VI-H14 ist.

8. Testkit nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß er einen markierten Antikörper enthält.

9. Testkit nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er einen an einer Festphase gebun­ denen anti-γ,γ-Enolase-Antikörper enthält.

10. Testkit nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er einen Elisa- oder Biosensortest enthält.

11. Testkit nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch ge­ kennzeichnet, daß er Mittel zur lipophilen Extraktion enthält.

12. Testkit nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß er für die analytische Quali­ tätssicherung Referenzmaterial mit unterschiedlichen Hirnzusätzen enthält.