DE19750172C1

DE19750172C1 - DNA mit Promotor-Aktivität für Zellzyklus-Gen

Info

Publication number: DE19750172C1
Application number: DE1997150172
Authority: DE
Inventors: Michael Dipl Chem Dr Knehr; Monika Dipl Biol Poppe
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1997-11-12
Filing date: 1997-11-12
Publication date: 1998-10-01
Anticipated expiration: 2017-11-13
Also published as: WO1999024605A2; WO1999024605A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA mit Promotor-Aktivität, die in Ver bindung mit einem Zellzyklus-Gen stehen kann, ein eine solche DNA enthalten des System und die Verwendung beider.

Zellzyklus ist die Bezeichnung für den Zeitraum und die Vorgänge zwischen zwei Zellteilungen. Bei eukaryotischen Zellen umfaßt der Zellzyklus vier Phasen, nämlich die Phasen G1, S, G2 und M. G1 und G2 sind die Phasen, in denen sich die Zelle für die DNA-Synthese in der S-Phase bzw. für die Mitose in der M-Pha se vorbereitet. Der Zellzyklus unterliegt einer genauen Kontrolle. Als wichti ger Kontrollpunkt wird dabei der Übergang von der G1- zur S-Phase angesehen. Die Kontrolle des Zellzyklus ist allerdings im Detail noch nicht verstanden. Insbe sondere ist nicht bekannt, welche Faktoren für eine gestörte Kontrolle des Zellzyklus, wie sie bei Tumoren vorliegt, verantwortlich sind.

Der vorliegenden Erfindung liegt so mit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem die Kontrolle des Zellzyklus untersucht und gegebenenfalls in sie eingegriffen werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine DNA mit Promotor-Aktivi tät, die in Verbindung mit einem Zellzyklus-Gen stehen kann, wobei die DNA gemäß Anspruch 1 charakterisiert ist.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß das als ein Mitose-Protein bekanntes Centromer-Protein C (CENP-C) auch am Übergang der G1- zur S-Phase beteiligt ist. Der Anmelder hat erkannt, daß dabei die maximale Expression von CENP-C in der G1-Phase liegt. Ferner hat er den DNA-Be reich mit Promotor-Aktivität von CENP-C identifiziert, charakterisiert und herausgefunden, daß dieser wichtige Kontrollmotive des Zellzyklus in Form von DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, wie der E2F-Familie, enthält. Desweiteren hat der Anmelder gefunden, daß der DNA-Bereich durch Tumor suppressor-Proteine, wie pRB und p107, reguliert wird. Dies läßt vermuten, daß CENP-C bei hoher Expression onkogene Eigenschaften besitzt.

Erfindungsgemäß werden diese Erkenntnisse dazu genutzt, eine DNA mit Promo tor-Aktivität bereitzustellen, die in Verbindung mit einem Zellzyklus-Gen, ins besondere dem Gen für CENP-C, stehen kann, wobei die DNA die Basensequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz umfaßt. Die DNA von Fig. 1 wurde als pUC18/5386 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) am 5. August 1997 unter DSM 11671 hinterlegt.

Der Ausdruck "eine durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Se quenz" weist darauf hin, daß die DNA von Fig. 1 oder ein Teil davon Additionen Deletionen, Substitutionen und/oder Inversionen von ein oder mehreren Basen paaren aufweis n kann. Eine solche DNA weist ebenfalls eine Promotor-Aktivität auf und ist durch Hybridisierung mit der DNA von Fig. 1 oder einem Teil davon ermittelbar. Der Ausdruck "Hybridisierung" weist auf eine Hybridisierung unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der als Probe verwendeten DNA, hin. Zum Nachweis einer Promo tor-Aktivität können übliche Verfahren verwendet werden. Beispielsweise kann ein Reporter-Gen, z. B. ein Luciferase-Gen, an das 3'-Ende der auf ihre Promotor-Ak tivität hin zu testenden DNA ligiert werden. Das erhaltene DNA-Molekül kann in Zellen transfiziert und die Expression des Luciferase-Gens bestimmt werden, wodurch die Promotor-Aktivität nachgewiesen wird.

In bevorzugter Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße DNA die folgen den Basenpaare der Basensequenz von Fig. 1:

-438/+1527;
-276/+1527;
-65/+1527;
+87/+1527;
-438/+746;
-438/+596;
-438/+407;
-438/+212.

Eine erfindungsgemäße DNA kann als solche oder in einem System mit jeglicher anderen DNA vorliegen. Letztere ist vorzugsweise eine zu transkribierende DNA, wie ein Reporter-Gen, z. B. ein Luciferase-Gen, oder ein Struktur-Gen. Der Fach mann weiß, in welcher Weise er eine erfindungsgemäße DNA mit einer anderen, insbesondere einer zu transkribierenden DNA, verbinden kann. Auch sind ihm hierzu geeignete Vektoren bekannt. Ergänzend wird auf Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbour Laborato ry, verwiesen.

Mit einem vorstehenden System, insbesondere einem, das eine erfindungs gemäße DNA zusammen mit einem Reporter-Gen umfaßt, ist es möglich, die Promotor-Aktivität einer erfindungsgemäßen DNA unter den verschiedensten Bedingungen zu testen. Damit können Substanzen gefunden werden, mit denen die Promotor-Aktivität beeinflußt werden kann. Solche Substanzen können aktivierend bzw. inhibierend sein.

Eine erfindungsgemäße DNA kann in Verbindung mit einem Zellzyklus-Gen, insbesondere dem Gen für CENP-C, stehen. Somit stellt eine erfindungsgemäße DNA ein Mittel dar, die Kontrolle des Zellzyklus zu untersuchen bzw. besser zu verstehen. Ferner wird durch die angesprochenen Substanzen eine Möglichkeit gegeben, regulierend in die Kontrolle des Zellzyklus einzugreifen. Solches bietet sich besonders an, wenn die Kontrolle des Zellzyklus gestört ist, wie es bei Tumoren der Fall ist. Insofern stellt die vorliegende Erfindung eine Möglichkeit dar, therapeutisch bei Tumorerkrankungen eingreifen zu können.

Desweiteren wird durch die vorliegende Erfindung die Möglichkeit gegeben, ein Struktur-Gen zeitlich gezielt zu exprimieren. Dies kann große Bedeutung für gentherapeutische Maßnahmen, insbesondere im Bereich der Tumorbehandlung, haben.

Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die Basensequenz einer erfindungsgemäßen DNA. Diese umfaßt 772 bp Promotorbereich, 18 bp Exon 1, 1140 bp Intron 1, 48 bp Exon2 und 1669 bp Intron2 des CENP-C-Gens. Ferner sind DNA-Bindungsstellen für die in nachstehend er Tabelle 1 aufgeführ ten Transkriptionsfaktoren angegeben.

Tabelle 1

Fig. 2 zeigt DNA-Konstrukte, in denen eine erfindungsgemäße DNA mit einem Luciferase-Gen verbunden ist, und die Expression des letzte ren. Die DNA-Konstrukte sind durch die Angabe (±) charakteri siert und die Expression des Luciferase-Gens ist in % angegeben.

Die vorliegende Erfindung wird durch das Beispiel erläutert.

Beispiel Expression eines Luciferase-Gens unter der Kontrolle einer erfin dungsgemäßen DNA

Ausgehend von der Basensequenz von Fig. 1 wurden 8 DNA-Konstrukte herge stellt, in denen eine erfindungsgemäße DNA mit einem Luciferase-Gen verbun den wurde. Als Vektor wurde der bekannte Vektor pXP1 verwendet, der das Luciferase-Gen enthält. Die erhaltenen DNA-Konstrukte wurden zur Transfektion von NIH3T3-Zellen verwendet und es wurde die Luciferase-Aktivität in üblicher Weise bestimmt. Kontrollen, die keine erfindungsgemäße DNA enthielten, zeigten keine Expression des Luciferase-Gens.

Aus Fig. 2 geht hervor, daß eine erfindungsgemäße DNA eine Promotor-Aktivität aufweist, wobei jene der erfindungsgemäßen DNA (-438/+1527) am stärksten ist.

Claims

1. DNA mit Promotor-Aktivität, umfassend die Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche Sequenz, wobei letztere Se quenz mit der DNA von Fig. 1 hybridisiert und eine Promotor-Aktivität aufweist.

2. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare -438/+1527 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

3. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare -276/+1527 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

4. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare -65/+1527 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

5. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare +87/+1527 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

6. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare -438/+746 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

7. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare -438/+596 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

8. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare -438/+407 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

9. DNA nach Anspruch 1, wobei die DNA die Basenpaare -438/+212 der Basensequenz von Fig. 1, wobei Fig. 1 Bestandteil dieses Anspruchs ist, umfaßt.

10. System, umfassend eine DNA nach einem der Ansprüche 1-9 und eine zu transkribierende DNA.

11. System nach Anspruch 10, wobei die zu transkribierende DNA ein Repor ter-Gen ist.

12. System nach Anspruch 10, wobei die zu transkribierende DNA ein Struk tur-Gen ist.

13. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1-9 bzw. des Systems nach Anspruch 10 oder 11 zur Untersuchung der Kontrolle des Zellzyklus.

14. Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1-9 bzw. des Systems nach Anspruch 10 oder 11 zur Identifizierung von die DNA nach einem der Ansprüche 1-9 aktivierenden bzw. inhibierenden Substanzen.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Substanzen zur Regulierung der Kontrolle des Zellzyklus eingesetzt werden.