DE19729641A1 - Antihämolytische liposomale Zubereitung und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine antihämolytische liposomale Zubereitung und ein Verfahren zu deren Herstellung, insbesondere eine liposomale Zube­ reitung, die Sulfolipid, Phophatidylcholin und Cerebrosid umfaßt, zur Be­ handlung von Hämolyse, insbesondere komplement-induzierter Hämoly­ se.

Einige Krankheiten und Störungen sind von einer Hämolyse der Erythro­ zyten begleitet, beispielsweise die Säuglingskrankheit der paroxysmalen, nächtlichen Hämoglobinurie. Eine Hämolyse ist möglich während einer Bluttransfusion, wenn die Wahl des Blutes nicht völlig akkurat war, oder während einer Knochenmarkstransplantation im Falle einer falschen Blutgruppenunverträglichkeit.

Die EP 0 394 035 A2 beschreibt die löslichen Formen von Glycoprotein-MACIF (membrane attack complex inhibition factor) in Erythrozytenmem­ bran zum Schutz gegen Hämolyse. Neuerlich wird das Protein mit MACIF-Aktivität beim Menschen aus den transformierten Zellen mit den Expres­ sionsvektoren erhalten, welche die Gene zum Kodieren dieses Proteins enthalten. Die Verwendung dieses Proteins als therapeutisches Mittel ist jedoch aufgrund seines hohen Preises und möglicher Nebenwirkungen be­ schränkt.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine antihämolytische Zubereitung zur Behandlung von Hämolyse sowie ein Verfahren zu deren Herstellung vorzusehen.

Dieses Ziel wird durch eine antihämolytische liposomale Zubereitung ge­ mäß Anspruch 1 sowie ein Verfahren gemäß Anspruch 3 erreicht. Vorteil­ hafte Ausgestaltungen des Anmeldungsgegenstandes sind in den Unter­ ansprüchen angegeben.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine antihämolytische liposomale Zu­ bereitung, umfassend
16-90 Gew.-% Sulfolipide,
5-70 Gew.-% Phosphatidylcholin,
5-40 Gew.-% Cerebrosid und
0-30 Gew.-% Cholesterol,
wobei die Sulfolipide eines oder mehrere sind, gewählt aus der Cerebrosid­ sulfat, Sulfolactosylceramid, Sulfogalactosyldiacylglycerin und Sulfoga­ lactosylalkylacylglycerin umfassenden Gruppe.

Ein bevorzugtes Sulfolipid ist Cerebrosidsulfat.

Die erfindungsgemäße Zubereitung kann durch ein Verfahren erhalten werden, welches die folgenden zwei Schritte umfaßt:

• i) Vorsehen einer Lipidmischung mit der obengenannten Zusammen­ setzung unter Verwendung im Handel erhältlicher Lipide oder aus Gehirn oder Rückenmark von Säugern extrahierter Lipide; und
• ii) Dispergieren der Lipidmischung in isotonischer Lösung.

Die Konzentration einer 50%igen Aktivität (IC₅₀) der Zubereitung beträgt 4-120 µg/ml in Abhängigkeit des Gehaltes an Sulfolipid und anderen pola­ ren Lipiden.

Ein bequemes Verfahren zur Herstellung der antihämolytischen liposoma­ len Zubereitung umfaßt folgende Schritte:

• i) Homogenisieren des Gehirns oder Rückenmarks von Säugern;
• ii) Entfernen des Wassers und neutraler Lipide durch Aceton;
• iii) Extrahieren der polaren Lipide durch einen niederen Alkohol, vor­ zugsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol;
• iv) Eindampfen der Extrakte unter verringertem Druck;
• v) Auflösen des Rückstandes mit Chloroform oder Methylendichlorid;
• vi) Ausfällen der polaren Lipide durch Aceton;
• vii) mehrfaches Wiederholen der Schritte v) und vi);
• viii) Entfernen des organischen Lösungsmittels zur Erzielung der Lipid­ mischung.

Die mittels solchen Verfahren erhaltene Lipidmischung enthält 18-40% Cerebrosidsulfat, 10-30% Phosphatidylcholin, 15-30% Cerebrosid, 10-25% Phosphatidylethanolamin und weiterhin Phosphatidylserin und Sphingomyelin etc. Die Konzentration einer 50%igen Aktivität (IC₅₀) die­ ser Zubereitung beträgt 4-15 µg/ml.

Die erfindungsgemäße, liposomale Zubereitung kann mittels folgenden Verfahren erhalten werden.

Die antihämolytische Lipidzusammensetzung wird erhalten durch Auflö­ sen der Mischung der Sulfolipide enthaltenden, polaren Lipide in Chloro­ form, Methanol und/oder Ethanol. Nach Entfernung des Lösungsmittels wird eine isotonische Lösung zugegeben. Dann wird die Lipidzubereitung homogenisiert und durch ausreichendes Schütteln und Ultraschallbe­ handlung dispergiert. Schließlich wird die Dispersion durch ein Mem­ branfilter der Größe 0,7 µm oder 0,4 µm unter sterilen Bedingungen fil­ triert. Die Größe der erfindungsgemäßen Liposomen beträgt weniger als 1 µm, vorzugsweise nicht mehr als 0,5 µm, da dies für eine intravenöse Ver­ abreichung erforderlich ist.

Die Indikationen der erfindungsgemäßen, antihämolytischen liposomalen Zubereitungen sind die folgenden.
1) Inhibierung komplement-induzierter Hämolyse
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann die komplementär induzierte Hämolyse inhibieren, wie etwa die Hämolysekrankheit von Neugeborenen, paroxysmale, nächtliche Hämoglobinurie. Die wirksame Konzentration bei einer solchen Hämolyse beträgt etwa 0,5 µg/ml bis 20 mg/ml.
2) Inhibierung hypotonischer Hämolyse
Es ist gut bekannt, daß Zellen von Säugern in hypotonischer Lösung zer­ brechen aufgrund des Unterschieds der Osmolalität innerhalb und außer­ halb der Zelle. Es können zahlreiche Infektionen von einer hypotonischen Hämolyse begleitet sein. Die erfindungsgemäße Zubereitung besitzt eine stark negative Ladung aufgrund stark saurer Gruppen im Sulfolipid. Da­ her kann diese Zubereitung zum Schutz gegen hypotonische Hämolyse eingesetzt werden. Eine wirksame Konzentration beträgt in diesem Falle 0,01 mg/ml bis 0,1 mg/ml.
3) Brauchbarkeit für die Lagerung von Blut und Erythrozyten enthal­ tenden Produkten
Die vorliegende Zubereitung eignet sich für die Lagerung und Handhabung von Blut und Blut enthaltenden Produkten, Geweben oder Organen. Sol­ che Blutprodukte können weiterhin Blutlagerungsadditive enthalten, bei­ spielsweise ein Antikoagulans und Nährbestandteile. Typische Additive umfassen Natriumchlorid, Citronensäure, Natriumcitrat, Glucose, Natri­ umdihydrogenphosphat, Glycerin, Folsäure, Adenin und L-Ascorbinsäu­ re. Die erfindungsgemäße Zubereitung eignet sich ebenfalls als Blut­ lagerungsadditiv.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher er­ läutert, ohne die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken.

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht ein erfindungsgemäßes Herstellungsver­ fahren aus Rinderrückenmark. Dieses Verfahren eignet sich für beliebige andere Quellen, beispielsweise Rückenmark von beliebigen Säugern, Ge­ hirn von beliebigen Säugern und beliebiges Säugergewebe, das Sulfolipid enthält.

Stufe 1: Erzielen einer Sulfolipid umfassenden Lipidmischung

Frisches oder schnell gefrorenes Rückenmark von Rindern (1 kg) wird mit 0,5-1 l Aceton in einem Gewebezerkleinerer homogenisiert. Das zerklei­ nerte Rückenmark wird in einen Reaktor gegeben und gekühltes (-10°C) Aceton (2,5 l) zugefügt. Die Mischung wird 5 Minuten gerührt und dann über ein Nutschen-Filter filtriert. Das Aceton wird entfernt. Der Rück­ stand wird in einen Reaktor überführt. Gekühltes (-10°C) Aceton (3 l) wird in den Reaktor gegeben und es wird intensiv während 2 Stunden gerührt. Der Rückstand wird auf einem Nutschen-Filter (Acetonextrakt 2) filtriert. Diese Arbeitsweise wird noch einmal wiederholt (Acetonextrakt 3). Der Rückstand wird mit 0,2 l Ethanol auf einem Nutschen-Filter gewaschen. Die Acetonextrakte 2 und 3 können zur Abtrennung von Cholesterol ver­ wendet werden. Der Rückstand wird in einen Reaktor eingebracht. Ethanol (3 l) wird zugefügt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 20-22°C ge­ rührt. Der Rückstand wird auf einem Nutschen-Filter filtriert. Der Etha­ nolextrakt (Extrakt 1) wird in einen Gefrierschrank (-10 bis -20°C) gege­ ben. Der Rückstand wird in einen Reaktor eingebracht und Petroleumet­ her (4 l) hinzugefügt. Die Mischung wird 2 Stunden bei 20-22°C gerührt. Der Rückstand wird auf einem Nutschen-Filter filtriert. Der Petroleume­ therextrakt (Extrakt 2) wird in einen Gefrierschrank (-10 bis -20°C) gege­ ben. Der Rückstand wird in einen Reaktor eingebracht und Petroleumet­ her (3 l) hinzugefügt. Die Mischung wird intensiv 2 Stunden bei 20-22°C gerührt. Der Rückstand wird auf einem Nutschen-Filter filtriert. Der Pe­ troleumetherextrakt (Extrakt 3) wird in einen Gefrierschrank (-10 bis -20°C) gegeben.

Die Extrakte 1, 2 und 3 werden im Vakuum zur Trockne bei 35-40°C einge­ dampft. Der Rückstand wird in 0,5 l Chloroform unter Rühren gelöst. Ace­ ton (2,5 l) wird zu der Lipidlösung unter Rühren gegeben. Die Mischung wird während 18 Stunden (beispielsweise über Nacht) in einen Gefrier­ schrank (0-4°C) gegeben. Das Präzipitat wird zentrifugiert. Die überste­ hende Lösung wird entfernt. Das Präzipitat wird unter Rühren in Chloro­ form (0,3 l) gelöst. Es wird Aceton (1,5 l) zu der Lipidlösung gegeben. Die Mischung wird während 18 Stunden in einen Gefrierschrank (0-4°C) gege­ ben. Das Präzipitat wird zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird ent­ fernt. Das Präzipitat wird in Chloroform (0,3 l) gelöst. Ethanol (1,2 l) wird zu der Lipidlösung unter Rühren gegeben. Die Mischung wird auf 1/3 des Volumens eingedampft.

Die Mischung wird während 18 Stunden in einen Gefrierschrank (0-4°C) gegeben. Das Präzipitat wird zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird entfernt. Das Präzipitat wird in Chloroform (0,3 l) gelöst. Ethanol (1,5 l) wird zu der Lipidlösung unter Rühren gegeben. Die Mischung wird wäh­ rend 18 Stunden in einen Gefrierschrank (0-4°C) gegeben. Das Präzipitat wird zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird entfernt. Das Präzipitat wird in Chloroform (0,3 l) gelöst. Physiologische Kochsalzlösung (0,3 l) und Ethanol (0,1 l) werden zu der Lipidlösung gegeben. Die Mischung wird während 5 Minuten gemischt. Die Chloroformlösung wird in einem Ab­ scheidetrichter getrennt. Die Wasserschicht wird entfernt. Die Chloro­ formlösung wird mittels 0,1-0,2 kg Na₂SO₄ (wasserfrei) entwässert. Dann wird sie für 2 Stunden in einen Gefrierschrank (0-4°C) gegeben. Die Chlo­ roformlösung wird durch Filtration abgetrennt. Das Na₂SO₄ wird ent­ fernt. Die Chloroform-Lipidlösung wird zur Lagerung in einen Gefrier­ schrank (-10 bis -20°C) gegeben. Es wird die Konzentration der Lipide bestimmt.

Stufe 2: Erzielung einer erfindungsgemäßen Zubereitung

Die Chloroformlösung wird eingedampft, in physiologischer Kochsalzlö­ sung (oder einer anderen isotonischen Lösung) bis zu einer Konzentration der Lipide von 2,6% dispergiert. Die Liposom-Dispersion wird 3-4 mal durch eine Mikrofluidisiervorrichtung geführt (bis zu konstanter OD). Die Dispersion wird sterilisiert. Die Dispersion wird durch ein Filter (0,4 µm) filtriert. Die Endkonzentration der Lipide wird bestimmt. Die Dispersion wird bis zu 2% mit steriler isotonischer Lösung verdünnt. Die Zubereitung wird unter sterilen Bedingungen in eine Flasche abgefüllt.

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht ein Herstellungsverfahren einer antihä­ molytischen Zusammensetzung in Form einer Fettemulsion aus Rinder­ rückenmark und Sojabohnenöl. Dieses Verfahren eignet sich für beliebige andere Quellen, wie Rückenmark eines beliebigen Säugers, Gehirn eines beliebigen Säugers und irgendein Sulfolipid enthaltendes Säugergewebe. Hinsichtlich den Triglyceriden kann ebenso irgendein bekannter Typ von Fetten und Ölen bei der Erfindung verwendet werden, jedoch ist es er­ wünscht, ein eßbares Öl einzusetzen, wie Sojabohnenöl, Maisöl, Kokos­ nußöl. Rapsöl, Sesamöl oder Erdnußöl.

Sämtliche Arbeitsgänge werden unter Stickstoffatmosphäre durchge­ führt.

Stufe 1: Erzielen einer Sulfolipid enthaltenden Lipidmischung

Diese Stufe ist die gleiche wie in Beispiel 1.

Stufe 2: Erzielen einer antihämolytischen Fettemulsion

Sojabohnenöl (100 Teile Öl auf 12-16 Teile der Zubereitung aus Beispiel 1 und 25 Teile Glycerin) wird in die Chloroformlösung gegeben, danach wird eingedampft, in physiologischer Kochsalzlösung (oder irgendeiner ande­ ren isotonischen Lösung) bis zu einer Konzentration der polaren Lipide von 2,6% dispergiert. Die Dispersion wird 3-4 mal durch eine Mikrofluidi­ siervorrichtung geführt (bis zu konstanter OD). Die Dispersion wird steri­ lisiert. Die Dispersion wird durch ein Filter (0,4 µm) filtriert. Die Endkon­ zentration der Lipide wird bestimmt. Die Dispersion wird bis zu 2% polare Lipide mit steriler isotonischer Lösung verdünnt. Die Zubereitung wird unter sterilen Bedingungen in eine Flasche abgefüllt.

Beispiel 3-6

Diese Beispiele veranschaulichen die Inhibierung von Immun-Hämolyse durch die erfindungsgemäße Zubereitung bei der Hämolysekrankheit Neugeborener (in vitro).

Verfahren

Es wurden Erythrozyten von Kindern mit hämolytischer Krankheit Neuge­ borener und Serum von deren Müttern verwendet. Das Blut von der Stirn des Kindes (1 ml) wird defibriniert, dann physiologische Kochsalzlösung zu den Erythrozyten (9 ml + 1 ml) gegeben, und die Mischung sanft wäh­ rend 0,5 Minuten gerührt. Dann wird die Probe zentrifugiert (3 Minuten, 3000 U/min) und der Überstand dekantiert. Diese Prozedur wird zweimal wiederholt, wobei 0,9 ml physiologische Kochsalzlösung zu 0,3 ml Er­ ythrozyten gegeben werden.

Das Blut der Mutter (3 ml) wird bei 20°C 2 Stunden stehengelassen, dann zentrifugiert (3 Minuten, 300 U/min). Das Serum wird zehnfach mit physi­ ologischer Kochsalzlösung verdünnt.

Experiment: 0,5 ml Erythrozyten werden mit 0,5 ml der erfindungsgemä­ ßen Zubereitung, 0,5 ml Serum und 0,5 ml physiologischer Kochsalzlö­ sung vermischt.

Nullversuch: 0,5 ml Erythrozyten werden mit 0,5 ml Serum und 1,0 ml physiologischer Kochsalzlösung vermischt.

Überwachung der Lichtstreuung: 0,5 ml der Zubereitung werden mit 0,5 ml Serum und 1,0 ml physiologischer Kochsalzlösung vermischt. Um den Prozentsatz der Hämolyse zu berechnen, wurde eine Gesamthämolyse durchgeführt. Bei sämtlichen Proben wird die OD₄₁₈ gemessen. Der Grad der Hämolyse wird gemäß folgender Gleichung berechnet:

H = (OD_ex - OD_Ls - OD_b1) × 100/OD₁₀₀

worin bedeuten: OD_ex - OD beim zu untersuchenden Experiment, OD_b1 - OD beim Nullversuch, OD₁₀₀ - OD bei 100% Hämolyse; OD_Ls - optische Dichte einer Zubereitung, verdünnt bis zu der Konzentration gleich der Konzentration einer Zubereitung beim Experiment (Kontrolle der Liposo­ menstreuung).

Diese Experimente wurden bei einer Endkonzentration der Zubereitung von 0,04 mg/ml, 0,2 mg/ml und 1 mg/ml gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Hämolyse (%) bei verschiedenen Konzentrationen der erfin­ dungsgemäßen Zubereitung

Es ist ersichtlich, daß bei Abwesenheit der Zubereitung eine Hämolyse von etwa 20% bis etwa 50% In Abhängigkeit der Schwere der Krankheit auftrat. Bei sämtlichen Fällen war praktisch eine vollständige Hemmung der Hä­ molyse bei der Konzentration der Zubereitung von 0,2 mg/ml und mehr zu beobachten.

Beispiele 7-14

Diese Beispiele veranschaulichen die Inhibierung der Hämolyse durch die erfindungsgemäße Zubereitung im Falle der Immun-Hämolyse bei Säu­ gern (bei Schafen und bei Kaninchen) und ebenso das Verfahren zur Be­ handlung von Krankheiten und Störungen, welche von der komplement­ induzierten Hämolyse begleitet werden. Die lethale Dosis des antihämoly­ tischen Serums wurde bei Tieren eingeführt. Die erfindungsgemäße Zube­ reitung (20 mg/ml) wurde in die Versuchstiere durch intravenöse Verab­ reichung während 10 Minuten eingeführt. Physiologische Kochsalzlösung wurde bei den Kontrolltieren eingeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Antihämolytische Aktivität der Zubereitung in vivo. Inhibierung der komplement-induzierten Hämolyse bei Tieren

Die Tiere, welche nicht die erfindungsgemäße Zubereitung erhielten, wa­ ren in 6-36 h nach Verabreichung der lethalen Dosis an hämolytischem Serum tot. Die Konzentration an Blutbilirubin der Kontrolltiere erhöhte sich auf 29-36 µM, die Konzentration an Erythrozyten der Kontrolltiere verringerte sich um das Doppelte in 4-6 Stunden.

Die Tiere, welchen die Zubereitung in einer Dosis von 14-16 mg/kg verab­ reicht wurde, zeigten einigen Störungen (Schwäche, häufiges Luftholen, Mattigkeit), sie erholten sich jedoch innerhalb 24 Stunden (Beispiele 7, 11). Bei einer Verabreichung von 21 mg/kg der Zubereitung oder mehr wa­ ren alle Tiere gesund.

Die Konzentration an Blutbilirubin bei den Versuchstieren war gleich Null, die Konzentration an Erythrozyten der Versuchstiere änderte sich nicht.

Diese Beispiele zeigen, daß die therapeutische Dosis etwa 20 mg/kg Ge­ wicht beträgt.

Claims (4)

1. Antihämolytische liposomale Zubereitung, umfassend
16-90 Gew.-% Sulfolipide,
5-70 Gew.-% Phosphatidylcholin,
5-40 Gew.-% Cerebrosid, und
0-30 Gew.-% Cholesterol,
wobei die Sulfolipide eines oder mehrere sind, gewählt aus der Cerebrosid­ sulfat, Sulfolactosylceramid, Sulfogalactosyldiacylglycerin und Sulfoga­ lactosylalkylacylglycerin umfassenden Gruppe.

2. Antihämolytische liposomale Zubereitung nach Anspruch 1, wobei das Sulfolipid Cerebrosidsulfat ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer antihämolytischen liposomalen Zu­ bereitung, umfassend die folgenden Schritte:

• i) Vorsehen einer Lipidmischung der in Anspruch 1 angegebenen Zu­ sammensetzung unter Verwendung im Handel erhältlicher Lipide oder aus dem Gehirn oder Rückenmark von Säugern extrahierter Li­ pide; und
• ii) Dispergieren der Lipidmischung in einer isotonischen Lösung.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Lipidmischung durch folgende Schritte erhalten wird:

• i) Homogenisieren des Gehirns oder Rückenmarks von Säugern;
• ii) Entfernen des Wassers und neutraler Lipide durch Aceton;
• iii) Extrahieren der polaren Lipide durch einen niederen Alkohol, vor­ zugsweise Methanol, Ethanol oder Isopropanol;
• iv) Eindampfen der Extrakte unter verringertem Druck;
• v) Auflösen des Rückstandes mit Chloroform oder Methylendichlorid;
• vi) Ausfällen der polaren Lipide durch Aceton;
• vii) mehrfaches Wiederholen der Schritte v) und vi);
• viii) Entfernen des organischen Lösungsmittels zur Erzielung der Lipid­ mischung.