DE19717837C2

DE19717837C2 - HPLC-Säule zur Untersuchung der Melaninaffinität von Substanzen

Info

Publication number: DE19717837C2
Application number: DE1997117837
Authority: DE
Inventors: Thomas Feuerstein; Rainer Knoerle; Norbert Limberger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-04-26
Filing date: 1997-04-26
Publication date: 1999-10-28
Anticipated expiration: 2017-04-27
Also published as: DE19717837A1

Description

Melanine sind Biopolymere von teilweise variabler kovalenter Struktur. Ihre einzelnen Schichten bauen sich aus Pyr rolringen mit phenolischen OH-Gruppen, chinoiden Gruppen und Carboxylfunktionen auf. Nach dem Schwefelgehalt werden sie in die schwefelfreien schwarzen Eumelanine und die schwefelhaltigen gelben bis rotbraunen Phäomelanine eingeteilt. Die häufigste Vorstufe beider Melaninarten ist L-DOPA, das nach Oxidation und nachfolgender Zyklisierung zu Eumelanin polymerisiert. Die Bildung von Phäomelaninen beruht auf dem Einbau schwefelhaltiger Gruppen, haupt sächlich von L-Cystein oder Glutathion, in das polymerisierende Melanin (Prota 1995).

Die Bindung von Substanzen an Melanin ist in biologischen Systemen für eine Vielzahl pathophysiologischer oder to xischer Effekte verantwortlich. Besondere Bedeutung erhält beispielsweise die Melaninaffinität von Wirkstoffen bei Langzeitbehandlung mit Neuroleptika, karzinogenen Substanzen oder Antimalariamitteln (Larsson 1993).

So ist z. B. das Retina-schädigende Malariamittel Chloroquin noch ein Jahr nach einmaliger i. v. Injektion in erhebli chen Konzentrationen in der Retina pigmentierter Tiere nachweisbar (Lindquist 1973), so daß sich seine Retina-toxi schen Effekte durch die Akkumulation im Retinamelanin und die andauernde, wenn auch geringe Freisetzung aus diesem Speicher erklären lassen.

Hieraus ergibt sich unmittelbar die Frage nach Möglichkeiten, die Melaninaffinität von Wirkstoffen zu prüfen und ge bundene schädliche Substanzen wieder aus ihrer Melaninbindung zu verdrängen.

Ein wesentliches Problem bei der Untersuchung der Melaninaffinität verschiedener Substanzen liegt in der Tatsache, daß (1) Eumelanine in Wasser und organischen Lösungsmitteln unlöslich sind, (2) spektroskopische Untersuchungen aufgrund der starken Eigenabsorption von Melanin nicht durchführbar sind und (3) Melanine durch ihre variable kova lente Struktur eine deutliche Heterogenität des Molekulargewichtes aufweisen.

Aufgrund dieser Einschränkungen wurde bislang die Melaninbindung von Wirkstoffen, vor allem von Medikamenten und Giften, mittels radioaktiv markierter Liganden mit nachfolgender Radioaktivitätsmessung durchgeführt.

Die in Patentanspruch 1 angegebene Erfindung umgeht das grundsätzliche Problem der Vergleichbarkeit radioaktiv markierter und nicht markierter Substanzen. Der Vorteil einer affinitätschromatographischen Analyse des Bindungsver haltens beruht auf der Verwendung von "nativen", nicht radioaktiv markieren Substanzen. Das Problem der Radiolyse entfällt. Auch ist jegliches Strahlenrisiko infolge eines Umgangs mit radioaktiven Stoffen ausgeschlossen.

Darüberhinaus ist die radioaktive Markierung mit einem erheblichen, d. h. teuren Syntheseaufwand verbunden. Native Substanzen sind deswegen sehr viel billiger als entsprechende radioaktiv markierte Stoffe, was eine gewerbliche Ver wendung der zu patentierenden Erfindung fördert.

In der Literatur wurde bereits eine Synthesemethode für ein Affinitätsgel (Säulenmaterial), ausgehend von käuflich er hältlichem L-DOPA-Melanin, beschrieben (Ibrahim und Aubry 1995). Eigene Experimente zeigten, daß diese Methode jedoch in vielen Schritten nicht reproduzierbar ist. Beispielsweise beschreiben Ibrahim und Aubry (1995) die Lösung von getrocknetem L-DOPA-Melanin in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 50 mg/ml. Die Lösung ist nicht nachvollziehbar und widerspricht jeglicher Literatur, beispielsweise Prota (1988). Aufgrund dieser unbefriedigen den Situation wurde eine grundlegend veränderte Synthesemethode entwickelt. Der Gesichtspunkt der Kostenreduktion wurde auch hier im Hinblick auf eine künftige gewerbliche Anwendung berücksichtigt.

Die dieser Patentanmeldung zugrunde liegende Synthesevorschriften für die Herstellung von Melaninen (Eumelanin und Phäomelanin) und die kovalente Kopplung der Melanine an Kieselgel (als Säulenmaterial) sind folgende:

Herstellung von Eumelanin

L-DOPA (1 g, 5.07 mmol) wird in 400 ml eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 8.0) gelöst und eine Woche bei Raumtemperatur und normalem Tageslicht stehen gelassen. Die Autooxidation führt hierbei zu kolloidal gelöstem syn thetischem Eumelanin. Im Gegensatz zu der Synthesevorschrift von Ibrahim und Aubry (1995), die von getrocknetem, kommerziell erhältlichem L-DOPA-Melanin ausgeht. liegt bei unserem Verfahren kolloidal gelöstes Eumelanin vor. Die ses zeichnet sich durch eine relativ konstante Teilchengröße von etwa 10 nm Durchmesser aus (Zajac et al. 1994); die Suspension von getrocknetem, unlöslichem L-DOPA-Melanin liefert keine auch nur annähernd homogene Partikelgröße, sondern wesentlich größere Teilchen (<< 10 nm ). Die entscheidenden Vorteile der Homogenität relativ kleiner Teil chen um 10 nm sind (1) die stabilere Kopplung infolge von zahlreicheren Bindungsarmen pro Kopplungspartner (Kie selgel und Melanin) im Vergleich zu einem viel größeren Melanin-Partikel als Kopplungspartner und (2) die dadurch be dingte Homogenität des Säulenmaterials selbst. Diese Homogenität des Säulenmaterials entscheidet über die Qualität ei ner Chromatographiesäule.

Herstellung von Phäomelanin

Zur Synthese von Phäomelanin werden äquimolare Mengen von L-DOPA (1 g, 5.07 mmol) und L-Cystein (1.54 g, 5.07 mmol) in 400 ml eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 11.0) gelöst und eine Woche bei Raumtemperatur und normalem Tageslicht stehen gelassen. Die Autooxidation führt hierbei zu gelöstem synthetischem Phäomelanin. (Phäo melanine unterscheiden sich von Eumelaninen durch ihre Wasserlöslichkeit, Prota 1995.)

Kopplung der Melanine an Kieselgel

Die kovalente Kopplung des kolloidal gelösten Eumelanins und des gelösten Phäomelanins erfolgt durch Ausbildung von Peptidbindungen zwischen den Carboxylatgruppen der Melanine und den Aminofunktionen des als Trägermaterial dienenden Aminopropylkieselgels (APS, Polygosil 60-10 NH₂ der Firma Macherey-Nagel). Diese Peptidbindungen wer den unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid Methiodid (EDC), einem in der Peptidsyn these gebräuchlichen und kostengünstigen Reagenz, gebildet.

Zur Kopplung des Eumelanins werden 60 ml der kolloidalen Lösung (entsprechend 150 mg Eumelanin) mit 300 ml Wasser versetzt; nach Zugabe von 3 g APS werden 75 mg EDC zugesetzt. Der Ansatz wird unter Lichtausschluß für 18 h geschüttelt. Die erfolgreiche Kopplung erkennt man dadurch, daß sich der Überstand entfärbt.

Zur Kopplung des Phäomelanins werden 60 ml der Lösung (entsprechend 150 mg Phäomelanin) mit 1 M HCl auf pH 8.0 gebracht und mit Wasser auf 300 ml verdünnt. Das weitere Verfahren entspricht der o. a. Vorschrift für Eumelanin.

Aufarbeitung der Säulenmaterialien

Nach Sedimentierung wird das entstandene Gel (etwa 3 g) mehrfach mit einem Gemisch (ca. 50 ml) aus 100 mM Ka liumphosphatpuffer (pH 7.0) und 10% n-Propanol (v/v) aufgeschlämmt. Anschließend wird das Gel dreimal mit je 50 ml DMSO/Wasser (1 : 1), sechsmal mit je 50 ml Wasser und sechsmal mit je 50 ml Methanol gespült.

Das fertige Säulenmaterial wird in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0) und 10% n-Propanol (v/v) bei 4°C gela gert.

Zum Packen der Säule wird das Säulenmaterial in Eluent (100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0) und 10% n-Pro panol (v/v)) aufgeschlämmt und durch einen Einfüllstutzen mit einer Flußrate von 4 ml/min in die Säule gepreßt. Fig. 1 zeigt die Säule und den Einfüllstutzen im Maßstab 1 : 1.

Einsatz der Säule zur Charakterisierung der Melaninaffinität verschiedener Stoffe

Am Beispiel der geprüften Eumelaninaffinitäten des Neuroleptikums Haloperidol und des Antidepressivums Desipra min soll der Gebrauch der zum Patent angemeldeten Säule beschrieben werden:

2 ml einer äquimolaren Lösung von Haloperidol und Natriummaleat oder Desipramin und Natriummaleat im Eluenten werden auf die Säule aufgetragen. Die Konzentrationsbereiche der Substanzen reichen von 5 bis 80 µM, entsprechend ei ner auf die Säule aufgetragenen Teilchenzahl N₀ von 10 bis 160 nmol. Bei isokratischer Elution (Flußrate 2 ml/min) wird der Beginn der Wanderungsfront (Retention) der Substanzen ermittelt. In Abwandlung der bisher in der Literatur (Ibra him und Aubry 1995; Radwanska et al. 1995) beschriebenen Methode wird durch den Einsatz von Natriummaleat das Leervolumen der Säule in jedem Lauf bestimmt, so daß die für die Charakterisierung der Bindung notwendige Retention auf der Säule für jede Konzentration von Haloperidol oder Desipramin durch Vergleich mit dem jeweiligen Leervolumen exakt bekannt ist.

Aus den ermittelten Retentionen wird jeweils eine Bindungskurve erstellt. Hierbei beschreibt V das Retentionsvolu men der untersuchten Substanz Haloperidol oder Desipramin (Produkt aus Flußrate und Retentionszeit); V₀ ist das aus der Retention von Natriummaleat berechnete Leervolumen der Säule. Die Differenzen V - V₀ werden gegen die Teilchen zahl von Haloperidol oder Desipramin auf der Säule als Datenpunkte aufgetragen. An diese Meßpunkte wird in einem deskriptiven Ansatz die Funktion D + 1/(N₀ ^c) mittels nichtlinearer Regressionsanalyse angepaßt. Die zu schätzenden Pa rameter der entstehenden Kurven sind c und D; sie charakterisieren die Affinität von Haloperidol oder Desipramin zu Melanin (Fig. 2).

Der Vergleich der Parameter c_Haloperidol und D_Haloperidol mit C_Desipramin und D_Desipramin läßt aufgrund der sich nicht über lappenden 95%-Konfidenzintervalle (CI₉₅) der Schätzer klar erkennen, daß die Eumelaninaffinitäten der untersuchten Substanzen unterschiedlich sind.

Einsatz der Säule zur Charakterisierung der Wechselwirkungen mehrerer Stoffe mit Melanin

Am Beispiel der Melanin-Bindung des Antidepressivums Desipramin in Gegenwart des Neuroleptikums Haloperidol soll die Charakterisierung der Wechselwirkung zwischen diesen beiden Substanzen beschrieben werden:

Zur Charakterisierung der Wechselwirkung wird die Affinitätssäule mit einer Haloperidollösung einer definierten Kon zentration im Eluenten (z. B. 1 µM) äquilibriert. Dann werden 2 ml einer äquimolaren Lösung von Desipramin und Na triummaleat im Eluenten auf die Säule aufgetragen. Die Konzentrationsbereiche beider Substanzen reichen von 5 bis 80 µM, entsprechend einer auf die Säule aufgetragenen Teilchenzahl N₀ von jeweils 10 bis 160 nmol. Bei isokratischer Elution in Gegenwart von Haloperidol (1 µM, Flußrate 2 ml/min) werden die Retentionszeiten von Natriummaleat und Desipramin ermittelt.

Aus den ermittelten Retentionen wird eine Bindungskurve von Desipramin in Gegenwart von Haloperidol erstellt. Durch Vergleich der zu schätzenden Parameter c und D in Abwesenheit (vgl. Fig. 2) und Gegenwart von Haloperidol las sen sich Rückschlüsse auf die Veränderung des Bindungsverhaltens von Desipramin durch Haloperidol und somit auf die Wechselwirkungen zwischen Desipramin und Haloperidol bei der Melanin-Bindung ziehen (Fig. 3; beachte die unter schiedliche Skalierung der Ordinate in Fig. 2 und 3).

Im folgenden sind die Bindungsparameter zu Fig. 2 und 3 aufgeführt:

Bindungsparameter für Haloperidol an Melanin

Bindungsparameter für Desipramin an Melanin

Bindungsparameter für Desipramin an Melanin unter 1 µM Haloperidol

Literatur

Ibrahim H, Aubry AF (1995) Development of a melanin-based high-performance liquid chromatography stationary phase and its use in the study of drug-melanin binding interactions. Anal Biochem 229: 272-277, Larsson BS (1993) Interaction between chemicals and melanin. Pigment Cell Res 6: 127-133, Lindquist NG (1973) Accumulation of drugs on melanin. Acta Radiol Diagn 325: 1-92, Prota G (1988) Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev 8: 525-556, Prota G (1995) The chemistry of melanins and melanogenesis. Fortschr Chem Org Naturst 64: 93-148, Radwanska A, Frackowiak T, Ibrahim H, Aubry AF, Kaliszan R (1995) Chromatographic modelling of interactions bet ween melanin and phenothiazine and dibenzazepine drugs. Biomed Chromatogr 9: 233-237, Zajac GW, Gallas JM, Cheng J, Eisner M, Moss SC, Alvarado SA (1994) The fundamental unit of synthetic melanin: a veriflication by tunneling microscopy of X-ray scattering results. Biochim Biophys Acta 1199: 271-278.

Claims

1. Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)-Affinitätssäule zur Untersuchung der Affinität von Substanzen zu Melanin, dadurch gekennzeichnet, daß die stationäre Phase (Säulenmaterial) aus Eumelanin oder Phäomelanin besteht.

2. Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)-Affinitätssäule nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß Eumelanin in vitro aus L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) und das Phäomelanin in vitro aus L-DOPA und Cystein synthetisiert ist.

3. Verfahren zur Untersuchung der Wechselwirkung von Wirkstoffen A und B mit Melanin, bei dem eine Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC)-Affinitätssäule, deren stationäre Phase aus Eumelanin oder Phäomelänin besteht, mit dem Wirkstoff A äquilibriert wird, danach auf die Säule der Wirkstoff B in definierter Menge aufgetragen und bei isokratischer Elution die Retention als Maß für die Affinität des Wirkstoffes B zu Melanin in Gegenwart des Wirkstoffes A ermittelt wird, wobei der Eluent nach wie vor den Wirkstoff A in konstanter Konzentration enthält.