DE19717837A1 - HPLC-Säule zur Untersuchung der Melaninaffinität vonSubstanzen - Google Patents
HPLC-Säule zur Untersuchung der Melaninaffinität vonSubstanzenInfo
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Description
Melanine sind Biopolymere von teilweise variabler kovalenter Struktur. Ihre einzelnen
Schichten bauen sich aus Pyrrolringen mit phenolischen OH-Gruppen, chinoiden
Gruppen und Carboxylfunktionen auf. Nach dem Schwefelgehalt werden sie in die
schwefelfreien schwarzen Eumelanine und die schwefelhaltigen gelben bis
rotbraunen Phäomelanine eingeteilt. Die häufigste Vorstufe beider Melaninarten ist
L-DOPA, das nach Oxidation und nachfolgender Zyklisierung zu Eumelanin
polymerisiert. Die Bildung von Phäomelaninen beruht auf dem Einbau
schwefelhaltiger Gruppen, hauptsächlich von L-Cystein oder Glutathion, in das
polymerisierende Melanin (Prota 1995).
Die Bindung von Substanzen an Melanin ist in biologischen Systemen für eine
Vielzahl pathophysiologischer oder toxischer Effekte verantwortlich. Besondere
Bedeutung erhält beispielsweise die Melaninaffinität von Wirkstoffen bei
Langzeitbehandlung mit Neuroleptika, karzinogenen Substanzen oder
Antimalariamitteln (Larsson 1993).
So ist z. B. das Retina-schädigende Malariamittel Chloroquin noch ein Jahr
nach einmaliger i. v. Injektion in erheblichen Konzentrationen in der Retina
pigmentierter Tiere nachweisbar (Lindquist 1973), so daß sich seine Retina-toxischen
Effekte durch die Akkumulation im Retinamelanin und die andauernde, wenn auch
geringe Freisetzung aus diesem Speicher erklären lassen.
Hieraus ergibt sich unmittelbar die Frage nach Möglichkeiten, die
Melaninaffinität von Wirkstoffen zu prüfen und gebundene schädliche Substanzen
wieder aus ihrer Melaninbindung zu verdrängen.
Ein wesentliches Problem bei der Untersuchung der Melaninaffinität verschiedener
Substanzen liegt in der Tatsache, daß (1) Eumelanine in Wasser und organischen
Lösungsmitteln unlöslich sind, (2) spektroskopische Untersuchungen aufgrund der
starken Eigenabsorption von Melanin nicht durchführbar sind und (3) Melanine durch
ihre variable kovalente Struktur eine deutliche Heterogenität des Molekulargewichtes
aufweisen.
Aufgrund dieser Einschränkungen wurde bislang die Melaninbindung von Wirkstoffen,
vor allem von Medikamenten und Giften, mittels radioaktiv markierter Liganden mit
nachfolgender Radioaktivitätsmessung durchgeführt.
Die in Patentanspruch 1 angegebene Erfindung umgeht das grundsätzliche Problem
der Vergleichbarkeit radioaktiv markierter und nicht markierter Substanzen. Der
Vorteil einer affinitätschromatographischen Analyse des Bindungsverhaltens beruht
auf der Verwendung von "nativen", nicht radioaktiv markierten Substanzen. Das
Problem der Radiolyse entfällt. Auch ist jegliches Strahlenrisiko infolge eines
Umgangs mit radioaktiven Stoffen ausgeschlossen.
Darüberhinaus ist die radioaktive Markierung mit einem erheblichen, d. h.
teuren Syntheseaufwand verbunden. Native Substanzen sind deswegen sehr viel
billiger als entsprechende radioaktiv markierte Stoffe, was eine gewerbliche
Verwendung der zu patentierenden Erfindung fördert.
In der Literatur wurde bereits eine Synthesemethode für ein Affinitätsgel
(Säulenmaterial), ausgehend von käuflich erhältlichem L-DOPA-Melanin,
beschrieben (Ibrahim und Aubry 1995). Eigene Experimente zeigten, daß diese
Methode jedoch in vielen Schritten nicht reproduzierbar ist. Beispielsweise
beschreiben Ibrahim und Aubry (1995) die Lösung von getrocknetem L-DOPA-
Melanin in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 50 mg/ml. Die Lösung
ist nicht nachvollziehbar und widerspricht jeglicher Literatur, beispielsweise Prota
(1988). Aufgrund dieser unbefriedigenden Situation wurde eine grundlegend
veränderte Synthesemethode entwickelt. Der Gesichtspunkt der Kostenreduktion
wurde auch hier im Hinblick auf eine künftige gewerbliche Anwendung berücksichtigt.
Die dieser Patentanmeldung zugrunde liegende Synthesevorschriften für die
Herstellung von Melaninen (Eumelanin und Phäomelanin) und die kovalente
Kopplung der Melanine an Kieselgel (als Säulenmaterial) sind folgende:
L-DOPA (1 g, 5.07 mmol) wird in 400 ml eines 100 mM Kaliumphosphatpuffers (pH
8.0) gelöst und eine Woche bei Raumtemperatur und normalem Tageslicht stehen
gelassen. Die Autooxidation führt hierbei zu kolloidal gelöstem synthetischem
Eumelanin. Im Gegensatz zu der Synthesevorschrift von Ibrahim und Aubry (1995),
die von getrocknetem, kommerziell erhältlichem L-DOPA-Melanin ausgeht, liegt bei
unserem Verfahren kolloidal gelöstes Eumelanin vor. Dieses zeichnet sich durch eine
relativ konstante Teilchengröße von etwa 10 nm Durchmesser aus (Zajac et al. 1994);
die Suspension von getrocknetem, unlöslichem L-DOPA-Melanin liefert keine auch
nur annähernd homogene Partikelgröße, sondern wesentlich größere Teilchen (<< 10
nm ∅). Die entscheidenden Vorteile der Homogenität relativ kleiner Teilchen um 10
nm sind (1) die stabilere Kopplung infolge von zahlreicheren Bindungsarmen pro
Kopplungspartner (Kieselgel und Melanin) im Vergleich zu einem viel größeren
Melanin-Partikel als Kopplungspartner und (2) die dadurch bedingte Homogenität des
Säulenmaterials selbst. Diese Homogenität des Säulenmaterials entscheidet über die
Qualität einer Chromatographiesäule.
Zur Synthese von Phäomelanin werden äquimolare Mengen von L-DOPA (1 g, 5.07
mmol) und L-Cystein (1.54 g, 5.07 mmol) in 400 ml eines 100 mM
Kaliumphosphatpuffers (pH 11.0) gelöst und eine Woche bei Raumtemperatur und
normalem Tageslicht stehen gelassen. Die Autooxidation führt hierbei zu gelöstem
synthetischem Phäomelanin. (Phäomelanine unterscheiden sich von Eumelaninen
durch ihre Wasserlöslichkeit, Prota 1995.)
Die kovalente Kopplung des kolloidal gelösten Eumelanins und des gelösten
Phäomelanins erfolgt durch Ausbildung von Peptidbindungen zwischen den
Carboxylatgruppen der Melanine und den Aminofunktionen des als Trägermaterial
dienenden Aminopropylkieselgels (APS, Polygosil 60-10 NH2 der Firma Macherey-
Nagel). Diese Peptidbindungen werden unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-
dimethylaminopropyl)carbodiimid Methiodid (EDC), einem in der Peptidsynthese
gebräuchlichen und kostengünstigen Reagenz, gebildet.
Zur Kopplung des Eumelanins werden 60 ml der kolloidalen Lösung
(entsprechend 150 mg Eumelanin) mit 300 ml Wasser versetzt; nach Zugabe von 3 g
APS werden 75 mg EDC zugesetzt. Der Ansatz wird unter Lichtausschluß für 18 h
geschüttelt. Die erfolgreiche Kopplung erkennt man dadurch, daß sich der Überstand
entfärbt.
Zur Kopplung des Phäomelanins werden 60 ml der Lösung (entsprechend 150
mg Phäomelanin) mit 1 M HCl auf pH 8.0 gebracht und mit Wasser auf 300 ml
verdünnt. Das weitere Verfahren entspricht der o.a. Vorschrift für Eumelanin.
Nach Sedimentierung wird das entstandene Gel (etwa 3 g) mehrfach mit einem
Gemisch (ca. 50 ml) aus 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0) und 10% n-Propanol
(v/v) aufgeschlämmt. Anschließend wird das Gel dreimal mit je 50 ml DMSO/Wasser
(1 : 1), sechsmal mit je 50 ml Wasser und sechsmal mit je 50 ml Methanol gespült.
Das fertige Säulenmaterial wird in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0) und
10% n-Propanol (v/v) bei 4°C gelagert.
Zum Packen der Säule wird das Säulenmaterial in Eluent (100 mM
Kaliumphosphatpuffer (pH 7.0) und 10% n-Propanol (v/v)) aufgeschlämmt und durch
einen Einfüllstutzen mit einer Flußrate von 4 ml/min in die Säule gepreßt.
Fig. 1 zeigt die Säule und den Einfüllstutzen im Maßstab 1 : 1.
Am Beispiel der geprüften Eumelaninaffinitäten des Neuroleptikums Haloperidol und
des Antidepressivums Desipramin soll der Gebrauch der zum Patent angemeldeten
Säule beschrieben werden:
2 ml einer äquimolaren Lösung von Haloperidol und Natriummaleat oder Desipramin und Natriummaleat im Eluenten werden auf die Säule aufgetragen. Die Konzentrationsbereiche der Substanzen reichen von 5 bis 80 µM, entsprechend einer auf die Säule aufgetragenen Teilchenzahl N0 von 10 bis 160 nmol. Bei isokratischer Elution (Flußrate 2 ml/min) wird der Beginn der Wanderungsfront (Retention) der Substanzen ermittelt. In Abwandlung der bisher in der Literatur (Ibrahim und Aubry 1995; Radwanska et al. 1995) beschriebenen Methode wird durch den Einsatz von Natriummaleat das Leervolumen der Säule in jedem Lauf bestimmt, so daß die für die Charakterisierung der Bindung notwendige Retention auf der Säule für jede Konzentration von Haloperidol oder Desipramin durch Vergleich mit dem jeweiligen Leervolumen exakt bekannt ist.
2 ml einer äquimolaren Lösung von Haloperidol und Natriummaleat oder Desipramin und Natriummaleat im Eluenten werden auf die Säule aufgetragen. Die Konzentrationsbereiche der Substanzen reichen von 5 bis 80 µM, entsprechend einer auf die Säule aufgetragenen Teilchenzahl N0 von 10 bis 160 nmol. Bei isokratischer Elution (Flußrate 2 ml/min) wird der Beginn der Wanderungsfront (Retention) der Substanzen ermittelt. In Abwandlung der bisher in der Literatur (Ibrahim und Aubry 1995; Radwanska et al. 1995) beschriebenen Methode wird durch den Einsatz von Natriummaleat das Leervolumen der Säule in jedem Lauf bestimmt, so daß die für die Charakterisierung der Bindung notwendige Retention auf der Säule für jede Konzentration von Haloperidol oder Desipramin durch Vergleich mit dem jeweiligen Leervolumen exakt bekannt ist.
Aus den ermittelten Retentionen wird jeweils eine Bindungskurve erstellt.
Hierbei beschreibt V das Retentionsvolumen der untersuchten Substanz Haloperidol
oder Desipramin (Produkt aus Flußrate und Retentionszeit); V0 ist das aus der
Retention von Natriummaleat berechnete Leervolumen der Säule. Die Differenzen
V-V0 werden gegen die Teilchenzahl von Haloperidol oder Desipramin auf der Säule
als Datenpunkte aufgetragen. An diese Meßpunkte wird in einem deskriptiven Ansatz
die Funktion D + 1/(N0 c) mittels nichtlinearer Regressionsanalyse angepaßt. Die zu
schätzenden Parameter der entstehenden Kurven sind c und D; sie charakterisieren
die Affinität von Haloperidol oder Desipramin zu Melanin (Fig. 2).
Der Vergleich der Parameter cHaloperidol und DHaloperidol mit cDesipramin und DDesipramin
läßt aufgrund der sich nicht überlappenden 95%-Konfidenzintervalle (CI95) der
Schätzer klar erkennen, daß die Eumelaninaffinitäten der untersuchten Substanzen
unterschiedlich sind.
Am Beispiel der Melanin-Bindung des Antidepressivums Desipramin in Gegenwart
des Neuroleptikums Haloperidol soll die Charakterisierung der Wechselwirkung
zwischen diesen beiden Substanzen beschrieben werden:
Zur Charakterisierung der Wechselwirkung wird die Affinitätssäule mit einer Haloperidollösung einer definierten Konzentration im Eluenten (z. B. 1 µM) äquilibriert. Dann werden 2 ml einer äquimolaren Lösung von Desipramin und Natriummaleat im Eluenten auf die Säule aufgetragen. Die Konzentrationsbereiche beider Substanzen reichen von 5 bis 80 µM, entsprechend einer auf die Säule aufgetragenen Teilchenzahl N0 von jeweils 10 bis 160 nmol. Bei isokratischer Elution in Gegenwart von Haloperidol (1 µM, Flußrate 2 ml/min) werden die Retentionszeiten von Natriummaleat und Desipramin ermittelt.
Zur Charakterisierung der Wechselwirkung wird die Affinitätssäule mit einer Haloperidollösung einer definierten Konzentration im Eluenten (z. B. 1 µM) äquilibriert. Dann werden 2 ml einer äquimolaren Lösung von Desipramin und Natriummaleat im Eluenten auf die Säule aufgetragen. Die Konzentrationsbereiche beider Substanzen reichen von 5 bis 80 µM, entsprechend einer auf die Säule aufgetragenen Teilchenzahl N0 von jeweils 10 bis 160 nmol. Bei isokratischer Elution in Gegenwart von Haloperidol (1 µM, Flußrate 2 ml/min) werden die Retentionszeiten von Natriummaleat und Desipramin ermittelt.
Aus den ermittelten Retentionen wird eine Bindungskurve von Desipramin in
Gegenwart von Haloperidol erstellt. Durch Vergleich der zu schätzenden Parameter c
und D in Abwesenheit (vgl. Fig. 2) und Gegenwart von Haloperidol lassen sich
Rückschlüsse auf die Veränderung des Bindungsverhaltens von Desipramin durch
Haloperidol und somit auf die Wechselwirkungen zwischen Desipramin und
Haloperidol bei der Melanin-Bindung ziehen (Fig. 3; beachte die unterschiedliche
Skalierung der Ordinate in Fig. 2 und 3).
Im folgenden sind die Bindungsparameter zu Fig. 2 und 3 aufgeführt:
Bindungsparameter für Haloperidol an Melanin
Bindungsparameter für Desipramin an Melanin
Bindungsparameter für Desipramin an Melanin unter 1 µM Haloperidol
Ibrahim H, Aubry AF (1995) Development of a melanin-based high-performance liquid
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interactions. Anal Biochem 229 : 272-277,
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Prota G (1988) Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev 8 : 525-556,
Prota G (1995) The chemistry of melanins and melanogenesis. Fortschr Chem Org Naturst 64 : 93-148,
Radwanska A, Frackowiak T, Ibrahim H, Aubry AF, Kaliszan R (1995) Chromatographic modelling of interactions between melanin and phenothiazine and dibenzazepine drugs. Biomed Chromatogr 9 : 233-237,
Zajac GW, Gallas JM, Cheng J, Eisner M, Moss SC, Alvarado SA (1994) The fundamental unit of synthetic melanin: a verification by tunneling microscopy of X-ray scattering results. Biochim Biophys Acta 1199 : 271-278.
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Claims (2)
1. Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)-Affinitätssäule zur Untersuchung der
Affinität von Substanzen zu Melanin,
dadurch gekennzeichnet, daß
die stationäre Phase (Säulenmaterial) aus mit Kieselgel kovalent verknüpftem
Eumelanin oder Phäomelanin besteht. Das verwendete Eumelanin wird in vitro aus L-
Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) synthetisiert; Phäomelanin wird in vitro aus L-DOPA
und Cystein synthetisiert. Die chemische Verknüpfungsmethode erlaubt auch den
Einsatz von Melaninen biologischen Ursprungs, wie z. B. dem Melanin der Netzhaut
des Auges.
Zur Charakterisierung des Bindungsverhaltens (entsprechend der Affinität) einer bestimmten Substanz an Melanin werden definierte Mengen der Substanz auf die Säule aufgetragen und die zugehörigen Retentionen bei isokratischer Elution ermittelt. Diese Retentionen hängen von den aufgetragenen Mengen ab und charakterisieren die Affinität der Substanz. Das Eigenvolumen der Säule wird durch Auftragen von nicht-melaninaffinem Natriummaleat bei jedem Lauf bestimmt.
Die Prüfung der Affinität von Substanzen zu Melanin ist deswegen wichtig, weil Wirkstoffe in biologischen Systemen (z. B. Medikamente) durch ihre Bindung an Melanin ihre gewünschte Wirkung verlieren können. Hierdurch können sich auch Wirkungen verändern, so daß neuartige, unerwünschte Nebenwirkungen entstehen.
Zur Charakterisierung des Bindungsverhaltens (entsprechend der Affinität) einer bestimmten Substanz an Melanin werden definierte Mengen der Substanz auf die Säule aufgetragen und die zugehörigen Retentionen bei isokratischer Elution ermittelt. Diese Retentionen hängen von den aufgetragenen Mengen ab und charakterisieren die Affinität der Substanz. Das Eigenvolumen der Säule wird durch Auftragen von nicht-melaninaffinem Natriummaleat bei jedem Lauf bestimmt.
Die Prüfung der Affinität von Substanzen zu Melanin ist deswegen wichtig, weil Wirkstoffe in biologischen Systemen (z. B. Medikamente) durch ihre Bindung an Melanin ihre gewünschte Wirkung verlieren können. Hierdurch können sich auch Wirkungen verändern, so daß neuartige, unerwünschte Nebenwirkungen entstehen.
2. Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC)-Affinitätssäule nach Patentanspruch
1, zur Untersuchung der Wechselwirkung mehrerer Wirkstoffe mit Melanin,
dadurch gekennzeichnet, daß
die Bindung des an Melanin angelagerten Wirkstoffs A durch den Wirkstoff B
beeinflußt wird. Dazu werden nach Äquilibrierung der Säule mit Wirkstoff A definierte
Mengen des Wirkstoffs B auf die Säule aufgetragen und die zugehörigen Retentionen
des Wirkstoffs B bei isokratischer Elution ermittelt, wobei der Eluent nach wie vor
Wirkstoff A in konstanter Konzentration enthält. Die Retentionen des Wirkstoffs B
hängen von den aufgetragenen Mengen ab und charakterisieren die Affinität des
Wirkstoffs B zu Melanin in Gegenwart von Wirkstoff A.
Die Prüfung der Wechselwirkungen mehrerer Wirkstoffe mit Melanin ist deswegen wichtig, weil sich die gewünschten Wirkungen oder die unerwünschten Nebenwirkungen eines Stoffs (z. B. eines Medikaments) durch seine Wechselwirkungen mit anderen Stoffen und Melanin verändern können.
Die Prüfung der Wechselwirkungen mehrerer Wirkstoffe mit Melanin ist deswegen wichtig, weil sich die gewünschten Wirkungen oder die unerwünschten Nebenwirkungen eines Stoffs (z. B. eines Medikaments) durch seine Wechselwirkungen mit anderen Stoffen und Melanin verändern können.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE1997117837 DE19717837C2 (de) | 1997-04-26 | 1997-04-26 | HPLC-Säule zur Untersuchung der Melaninaffinität von Substanzen |
Applications Claiming Priority (1)
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DE1997117837 DE19717837C2 (de) | 1997-04-26 | 1997-04-26 | HPLC-Säule zur Untersuchung der Melaninaffinität von Substanzen |
Publications (2)
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DE19717837A1 true DE19717837A1 (de) | 1998-10-29 |
DE19717837C2 DE19717837C2 (de) | 1999-10-28 |
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ID=7827945
Family Applications (1)
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---|---|---|---|
DE1997117837 Expired - Fee Related DE19717837C2 (de) | 1997-04-26 | 1997-04-26 | HPLC-Säule zur Untersuchung der Melaninaffinität von Substanzen |
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DE (1) | DE19717837C2 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001018125A1 (en) * | 1999-09-09 | 2001-03-15 | Carlo Ghisalberti | Synthetic vegetal melanins, process for their production and compositions containing thereof |
CN108927120A (zh) * | 2018-07-23 | 2018-12-04 | 华南师范大学 | 聚多巴修饰的磁粒及制法和在分离富集氧氟沙星中的应用 |
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1997
- 1997-04-26 DE DE1997117837 patent/DE19717837C2/de not_active Expired - Fee Related
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CN108927120B (zh) * | 2018-07-23 | 2021-03-26 | 华南师范大学 | 聚多巴修饰的磁粒及制法和在分离富集氧氟沙星中的应用 |
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