DE19637718A1

DE19637718A1 - Rekombinante inaktive Core-Streptavidin Mutanten

Info

Publication number: DE19637718A1
Application number: DE19637718A
Authority: DE
Inventors: Eberhard Dr Kopetzki; Urban Schmitt; Rainer Dr Mueller; Arno Dr Deger; Richard Dr Engh; Hans Dr Rer Nat Brandstetter
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1996-09-16
Publication date: 1997-10-02
Also published as: US6417331B1; JPH1028589A; EP0799890A2; ES2325190T3; EP0799890B1; US6312916B1; JP3097905B2; DE59713009D1; EP0799890A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Muteine von Avidin und Streptavidin mit einer verringerten Bindungsaffinität für Biotin sowie deren Verwendung als Entstörungsreagenzien in Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, z. B. in diagnostischen Tests wie etwa in Immuno- und Nukleinsäurehybridisierungsassays. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von Muteinen von Avidin und Streptavidin als regenerierbare Systeme zur Bindung von Biotin, z. B. zur Analyse biotinylierter Moleküle, zur Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen sowie zur Affinitätsreinigung biotinylierter Moleküle.

In Nachweisverfahren zur Bestimmung von Analyten wie etwa Immuno- und Nukleinsäurehybridisierungsassays erfolgt die Bestimmung des Analyten häufig über eine hochaffine Wechselwirkung zwischen den Partnern eines spezifischen Bindungspaares. Ein typisches Beispiel für ein spezifisches Bindungspaar stellt der Avidin/Streptavidin- Biotin-Komplex dar. Bei der Verwendung des Avidin/Streptavidin- Biotin-Bindungspaares wird dessen hohe Bindungsaffinität genutzt. Dabei wird beispielsweise eine mit Avidin/Streptavidin beschich tete Festphase verwendet, an die ein biotinylierter Komplex aus Analyt und spezifischem Rezeptor binden kann. In anderen Testfor maten kann Avidin/Streptavidin auch in löslicher Form eingesetzt werden.

Neben den spezifischen Wechselwirkungen treten jedoch oftmals auch Nebenreaktionen, wie beispielsweise unerwünschte Wechselwirkungen und unspezifische Bindereaktionen zwischen den Testkomponenten und weiteren in der Probe oder an der Festphase vorliegenden Bestand teilen auf. Insbesondere binden an immobilisiertes oder lösliches Avidin und Streptavidin oftmals weitere in der Testprobe vor liegende Substanzen und verursachen dadurch falsch positive oder falsch negative Testergebnisse. Weiterhin können diese Wechselwir kungen auch eine Erhöhung des Hintergrundsignals und eine stärkere Streuung der Signale bewirken, wodurch die Sensitivität und Spezifität des betreffenden Tests herabgesetzt wird.

Es wurden verschiedene Versuche unternommen, diese unspezifischen Wechselwirkungen zu reduzieren. So ist es beispielsweise bekannt, daß unterschiedliche Kohlenhydratkomponenten und unterschiedliche Proteine, Proteingemische oder Proteinfraktionen sowie deren Hydrolysate unspezifische Wechselwirkungen zwischen den Testkom ponenten und dem Analyten in Immunoassays reduzieren können (Robertson et al., J. of Immun. Med. 26 (1985) 195; EP-A-260 903; US-A-4,931,385). Der Einsatz von derartigen Kohlenhydrat- und Proteinkomponenten hat jedoch den Nachteil, daß durch darin enthaltene Bestandteile wiederum weitere Störungen des Tests ausgelöst werden können. Enzymatisch hergestellte Hydrolysate können zudem mit den bei der Herstellung verwendeten Proteasen verunreinigt sein und weisen in der Regel keine einheitliche Qualität auf, da sich die Spaltung nur schwer steuern läßt. Solche Verunreinigungen von Proteasen können Testkomponenten angreifen und schon in geringen Mengen zur Beeinträchtigung der Testfunktio nen und der Lagerstabilität führen.

Weiterhin wurde zur Verringerung unspezifischer Wechselwirkungen auch der Einsatz von chemisch modifizierten Proteinen, ins besondere von succinylierten oder acetylierten Proteinen be schrieben (US-A-5,051,356; EP-A-0 525 916). Mit diesen Substanzen können jedoch viele der falsch positiven oder falsch negativen Ergebnisse bei Tests auf Antikörper aus Serum nicht vermieden werden.

Zur Vermeidung von unspezifischen Wechselwirkungen wurde weiterhin vorgeschlagen, den Testreagenzien ultrafeine Partikel mit einer maximalen Durchschnittsgröße von 0,2 µm zuzusetzen, welche so ausgebildet sind, daß sie an die Störkomponenten binden und sie abfangen (EP 0 163 312). Hierzu ist jedoch eine spezielle Vorbereitung dieser ultrafeinen Partikel nötig, und zudem muß die Art der in der Probe vorhandenen unspezifischen Faktoren bekannt sein.

In DE-A-44 07 423 und DE-A-44 34 093 wurde vorgeschlagen, Störungen, die aufgrund von unspezifischen Wechselwirkungen zwischen Probenbestandteilen und einer Streptavidin-beschichteten Festphase auftreten mittels einer Vorreaktion abzufangen. Die Vorreaktion wird geeigneter Weise an einer Festphase durchgeführt, die der aktiven Streptavidin-beschichteten Festphase möglichst ähnlich ist, an die aber die Probemoleküle nicht spezifisch binden können. Die unspezifischen Bestandteile binden dagegen auch an die inaktive Festphase und können dadurch entfernt werden.

Gemäß DE-A-44 07 423 kann Streptavidin durch kovalente Derivati sierung oder kovalente Modifizierung inaktiviert werden. Nachtei lig ist es jedoch, daß dabei eine aufwendige nachträgliche chemische Modifizierung notwendig ist. Zudem kann durch eine chemische Derivatisierung der Bereich um das aktive Zentrum des nativen Streptavidins auf unerwünschte Weise verändert werden, wodurch sich die Entstörungswirkungen verschlechtern und sogar zusätzliche störende Wechselwirkungen auftreten können. Unspezi fische Wechselwirkungen, die an der Biotinbindungstasche auf treten, können durch kovalente Modifizierungen nicht entstört werden.

Das Avidin/Streptavidin-Biotin-System ist aufgrund seiner starken, nicht-kovalenten Affinität der Bindungspartner (KA ungefähr 10¹⁵ l/mol) Gegenstand zahlreicher Untersuchungen. Die hohe Bindungs affinität wurde vor allem auf Wechselwirkungen zwischen Trypto phanresten des Streptavidins und Biotin zurückgeführt. Durch Veränderung der Tryptophanreste (Chilkoti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 1754-1758, Sano und Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 3180-3184) konnte jedoch eine signifi kante Verringerung der Bindungsaffinität der Streptavidinvarianten zu Iminobiotin erzielt werden. Ein eindeutiger Nachweis für eine Verringerung der Bindungsaffinität zu Biotin konnte hingegen nicht gezeigt werden (vgl. Chilkoti et al., Supra, Fig. 1A und B). Für eine Verwendung als Entstörungsreagenz sind solche Varianten deshalb ungeeignet, da sie aufgrund ihrer immer noch recht hohen Bindungsaffinität auch spezifische Reaktionen mit biotinylierten Testkomponenten eingehen können.

Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Reagenz bereitzustellen, mittels dessen störende Einflüsse auf Nachweis verfahren zur Bestimmung eines Analyten, z. B. Immuno- oder Nukleinsäurehybridisierungsassays, verringert werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Biotin bindefähiges Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen von Avidin und Streptavidin, worin sich das Mutein (a) um mindestens eine Aminosäure vom nativen Polypeptid unterscheidet, und (b) eine Bindungsaffinität zu Biotin von weniger als 10¹⁰ l/mol aufweist.

Die Bindungsaffinität für die Reaktion

Streptavidin/Biotin-Komplex ⇄ Streptavidin + Biotin

beträgt etwa 10¹⁵ l/mol. Das als Fängersystem verwendete Streptavi din/Biotin-System verfügt damit über eine der stärksten bekannten nicht-kovalenten Wechselwirkungen zwischen einem Protein und einem Liganden. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß durch Austausch von einer oder mehreren Aminosäuren von Streptavidin oder Avidin ein Polypeptid erhalten wird, das einerseits bei rekombinanter Herstellung renaturierbar ist und andererseits eine herabgesetzte Bindungsaffinität zu Biotin auf < 10¹⁰ l/mol herabgesetzt werden kann, wobei die erfindungsgemäßen Muteine vorzugsweise weiterhin eine Struktur aufweisen, die der Struktur des aktiven Polypeptids entspricht. Die erfindungsgemäßen Muteine zeigen vorzugsweise eine hohe immunologische Kreuzreaktivität mit dem nativen Polypeptid. Weiterhin ist es bevorzugt, daß sie zur Dimerisierung bzw. Tetramerisierung in der Lage sind. Über raschenderweise besitzen die Muteine trotz der herabgesetzten Bindungsaffinität zu Biotin wie natives Streptavidin bzw. Avidin die Fähigkeit zur Bindung an störende Probenbestandteile, wie sie in biologischen Proben, z. B. Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Vollblut etc. vorkommen können.

Aufgrund ihrer besonderen Eigenschaften können die erfindungs gemäßen Muteine für verschiedenste Anwendungen eingesetzt werden. Ein Herabsetzen der Bindungsaffinität ist gleichbedeutend mit der Verringerung der Wechselwirkungen zwischen Biotin und den Muteinen. Erfindungsgemäße Muteine können so ausgestaltet sein, daß sie überhaupt nicht an Biotin binden, oder aber daß eine relativ lockere reversible Bindung vorliegt. Da die räumliche Struktur der Muteine im Vergleich zum nativen Polypeptid vorzugs weise nicht signifikant verändert ist, werden Wechselwirkungen mit anderen Substanzen nicht beeinflußt. Auf diese Weise wird ein Reagenz erhalten, das in seiner räumlichen Struktur und seinen Bindungseigenschaften dem nativen Streptavidin bzw. Avidin entspricht, mit Ausnahme der veränderten Bindefähigkeit zu Biotin.

Als Testproben können allgemein wäßrige Proben eingesetzt werden. Insbesondere werden biologische Proben wie Körperflüssigkeiten wie z. B. Vollblut, Blutplasma, Serum, Speichel, Gewebsflüssigkeit, Liquor oder Urin verwendet.

Der Austausch von bestimmten Aminosäuren durch Mutagenese erlaubt eine definierte Herstellung von Muteinen. Im Gegensatz zu anderen Modifizierungen von Streptavidin, wie beispielsweise chemischer Derivatisierung, bleibt die Struktur der erfindungsgemäßen Muteine erhalten. Es können somit keine störenden Wechselwirkungen zwischen zusätzlich eingeführten Derivatisierungsreagenzien und Bestandteilen der zu testenden Probe auftreten.

Die Bindungsaffinität der erfindungsgemäßen Muteine zu Biotin beträgt bevorzugt < 10⁹ l/mol, stärker bevorzugt < 10⁸ l/mol, noch stärker bevorzugt < 10⁷ l/mol, besonders bevorzugt < 10⁶ l/mol und am meisten bevorzugt < 10⁵ l/mol.

Bevorzugt zeigen erfindungsgemäße Streptavidin- oder Avidinmuteine eine Regenerierbarkeit bei Immobilisierung auf einer Sensorchip- Oberfläche, z. B. einer BIAcore-Oberfläche.

Im Falle eines Streptavidinmuteins werden bevorzugt eine oder mehrere Aminosäuren an den Positionen Leu25, Ser27, Tyr43, Ser45, Val47, Gly48, Ser88, Thr90, Leu110 oder/und Asp128 durch eine andere Aminosäure ausgetauscht. Durch den Austausch einer Aminosäure mit einem kleinen Rest durch eine Aminosäure mit einem größeren Rest kann eine Verringerung der Bindefähigkeit von Biotin erreicht werden, beispielsweise durch den Austausch von Leu oder Ser gegen Trp, Arg, Tyr, Phe oder His. Weiterhin kann die Biotinbindungsfähigkeit auch durch eine zusätzlich eingeführte Disulfidbrücke, die die Zugänglichkeit der Biotinbindungstasche verringert, vermindert oder blockiert werden. Eine zusätzliche Disulfidbrücke kann beispielsweise durch den Austausch von zwei Aminosäuren durch zwei Cysteine im passenden räumlichen Abstand ausgebildet werden. Es ist auch möglich, die Biotinbindungs fähigkeit durch zusätzliche ionische Wechselwirkungen zu ver ringern. Dazu kann beispielsweise eine positiv geladene Aminosäure wie Arg oder Lys eingeführt werden, die mit Asp128 ionische Wechselwirkungen ausbildet. Andererseits können auch eine positiv geladene und eine negativ geladene Aminosäure eingeführt werden, die miteinander eine Salzbrücke ausbilden und damit die Biotinbin dungstasche blockieren können. Vorzugsweise werden kleine und an der Oberfläche lokalisierte Aminosäuren wie z. B. Leu25, Ser27, Ser45 oder/und Leu110 durch voluminösere Aminosäuren wie z. B. Arg, Trp, Tyr, Phe oder His ausgetauscht.

Zur Erzielung der gewünschten Bindungsaffinität können auch Muteine von Streptavidin oder Avidin gebildet werden, in denen mindestens zwei Aminosäuren ausgetauscht sind. Bevorzugt werden bei Streptavidin mindestens zwei der Aminosäuren Leu25, Ser27, Ser45 und Leu110, z. B. die Aminosäurepaare Leu25 und Ser45, Ser27 und Ser45 sowie Ser45 und Leu110 durch geeignete Aminosäuren, insbesondere voluminösere Aminosäuren wie Arg, Trp, Tyr, Phe oder His ausgetauscht. Besonders bevorzugt werden Leu25 durch Trp und Ser45 durch Arg, Ser27 durch Arg und Ser45 durch Arg, Ser45 durch Trp und Leu110 durch Trp oder Ser45 durch Tyr und Leu110 durch Trp ausgetauscht.

Auch der Austausch von mehr als zwei Aminosäuren führt bei Streptavidin oder Avidin zu erfindungsgemäßen Muteinen. Vorzugs weise werden bei solchen Streptavidin-Mehrfachmutanten mindestens drei der Aminosäuren Leu25, Ser27, Ser45 und Leu110 vorzugsweise durch voluminösere Aminosäuren wie zuvor definiert ausgetauscht. In spezifischen Beispielen für Dreifach-Kombinationsmutanten wurde Leu25 gegen Trp, Ser45 gegen Trp und Leu110 gegen Trp oder Leu25 durch Trp, Ser45 durch Tyr und Leu110 durch Trp ausgetauscht.

In einer weiteren bevorzugten Mehrfach-Kombinantionsmutante sind mindestens zwei der Aminosäuren Leu25, Ser27, Ser45 und Leu110 sowie zusätzlich Trp120 mutagenisiert. Ein spezifisches Beispiel für eine solche Dreifachmutante enthält Austausche von Ser27 gegen Arg, Ser45 gegen Arg und Trp120 gegen Ala.

Im Falle eines Avidinmuteins werden bevorzugt eine oder mehrere Aminosäuren an den Positionen Leu14, Ser16, Tyr33, Thr35, Val37, Thr38, Ser75, Thr77, Leu99 und Ile117 ausgetauscht. Besonders bevorzugt sind Aminosäurenaustausche an den Positionen Leu14, Ser16, Thr35 oder/und Leu99. Diese Aminosäuren werden vorzugsweise durch voluminösere Aminosäuren wie etwa Arg, Tyr, Trp, Phe oder His ausgetauscht. Auch die anderen für Streptavidin genannten Austauschmöglichkeiten sind bei Avidin geeignet.

Die für natives Streptavidin kodierende DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO. 1 dargestellt. Die entsprechende Proteinsequenz ist in SEQ ID NO. 2 dargestellt. Die angegebenen Nummern von Aminosäuren beziehen sich auf diese Sequenz. Die Nukleinsäuresequenz von nativem Avidin ist in SEQ ID NO. 3 dargestellt. SEQ ID NO. 4 zeigt die Aminosäuresequenz von Avidin. Die Numerierung der Aminosäuren erfolgt entsprechend dieser Sequenz.

Erfindungsgemäß können Muteine auch von Avidin- und Streptavidin varianten hergestellt werden, die in ihrer ursprünglichen Form mit Biotin bindefähig sind. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Muteine eines verkürzten Streptavidins (rekombinantes Core-Streptavidin) Dieses Core-Streptavidin wird vorzugsweise von der in SEQ ID NO. 15 angegebenen Nucleotidsequenz kodiert und enthält in Sequenz ID NO. 16 gezeigte Aminosäuresequenz. Die Herstellung dieses Core- Streptavidins ist in WO 93/09144 beschrieben. Bevorzugte Muteine des Core-Streptavidins enthalten Mutationen, wie sie bereits für natives Streptavidin beschrieben wurden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für ein Streptavidin- oder Avidin-Mutein kodierende Nukleinsäure. Diese Nukleinsäure kann z. B. durch ortsspezifische in vitro Mutagenese einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 15 hergestellt werden. Die erfindungsgemäße Nuklein säure kann auf einem Vektor lokalisiert sein, z. B. auf einem prokaryontischen Plasmid, vorzugsweise einem in E. coli replizier baren Plasmid. Die Nukleinsäure befindet sich auf dem Vektor vorzugsweise in operativer Verknüpfung mit einem Promotor, der eine Expression im jeweiligen Wirtsorganismus erlaubt.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die mit einem Vektor, der ein Avidin- oder Streptavidinmutein-Gen enthält, transformiert ist. Vorzugsweise ist die Zelle eine prokaryontische Zelle, insbesondere eine gram-negative Bakterienzelle, z. B. eine E. coli Zelle.

Die Muteine werden vorzugsweise durch rekombinante Expression in einer geeigneten Wirtszelle, insbesondere einer prokaryontischen Wirtszelle wie etwa E. coli hergestellt. Dabei fallen die Muteine üblicherweise in Form von inaktiven inclusion bodies an, die unter geeigneten Bedingungen renaturiert werden können.

Die Muteine können nach der Renaturierung und Reinigung ohne weitere Behandlung in löslicher Form oder nach Immobilisierung auf einer Festphase als Entstörungsreagenz eingesetzt werden. Weiterhin können die Muteine auch in Form eines löslichen oder immobilisierten Polymer-Konjugats eingesetzt werden. Derartige Polymer-Konjugate können durch chemische Kopplung von mehreren Muteinmolekülen untereinander oder durch Kopplung mit anderen Makromolekülen wie etwa Polypeptiden, Proteinen, Kohlenhydraten etc. hergestellt werden.

Bevorzugt sind Konjugate des Muteins mit einem weiteren Polypeptid oder Protein. Besonders bevorzugt handelt es sich um ein Konjugat mit einem Albumin, z. B. Rinderserumalbumin. Die Herstellung von Polymer-Konjugaten der Muteine und gegebenenfalls weiteren Makromolekülen kann nach bekannten Methoden erfolgen (siehe z. B. EP-A-0 269 092).

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines der oben beschriebenen Muteine als Entstörungsreagenz für Assays zum Nachweis eines Analyten, in denen das Streptavidin/Avidin-Biotin- Bindepaar als Testkomponente enthalten ist. Dabei können die Muteine in löslicher oder/und immobilisierter Form eingesetzt werden. In einer Ausführungsform können die Muteine zusammen mit einer nicht-modifizierten Streptavidin/Avidin-Festphase in einem heterogenen Assay, z. B. einem immunologischen oder/und Hybridis ierungsassay, verwendet werden. Dabei können die Muteine dem Testansatz in löslicher oder/und immobilisierter Form, z. B. in Form einer separaten Festphase, zugesetzt werden.

Der Test kann als Einschritt- oder Zweischrittverfahren durch geführt werden, d. h. die zu bestimmende Probe kann mit Mutein und nicht-modifiziertem Streptavidin/Avidin zusammen oder in separaten Reaktionsschritten in Kontakt gebracht werden.

Darüberhinaus können die erfindungsgemäßen Muteine auch in anderen Testformaten, z. B. in homogenen Assays, Agglutinationsassays etc. eingesetzt werden, sofern als Testkomponenten das Streptavidin/- Avidin-Biotin-Bindepaar vorhanden ist. In diesem Zusammenhang umfaßt der Begriff Biotin sowohl Biotin in freier Form als auch in Form von biotinylierten Substanzen, wie etwa biotinylierten Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, Lipiden, Peptiden oder Polypepti den. Weiterhin umfaßt der Begriff auch Biotinanaloga- und derivate wie etwa Iminobiotin, Desthiobiotin und Streptavidinaffinitäts peptide.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Entstörungsreagenz zur Verringerung oder/und Vermeidung von unspezifischen Wechsel wirkungen in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, wobei das Entstörungsreagenz eines der oben beschriebenen Muteine enthält. Dieses Entstörungsreagenz kann in löslicher Form vorliegen oder/und an einer Festphase immobilisiert sein, bevorzugt an einer Membran, einer Mikrotiterplatte, einem Mikroreagenzgefäß oder an Mikrobeads. Durch das Entstörungsreagenz können Substanzen, die unspezifische Wechselwirkungen mit Assaybestandteilen eingehen, abgefangen werden, wodurch eine Verbesserung der Testsensitivität erreicht wird. Das Entstörungs reagenz weist im Vergleich zu nicht-modifiziertem Avidin bzw. Streptavidin eine im wesentlichen unveränderte Bindungsfähigkeit gegenüber den Störkomponenten auf, so daß störende Bestandteile der Testprobe wirksam abgefangen werden. Im Gegensatz zu nativem Avidin bzw. Streptavidin weist das Entstörungsreagenz jedoch praktisch eine für den Test zu vernachlässigende Affinität zu Biotin auf, weshalb der Nachweis des Analyten in der Testprobe nicht wesentlich beeinflußt wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Testprobe, umfassend die Verwendung des spezifischen Bindepaars Streptavidin/Avidin-Biotin, wobei man als Entstörungs reagenz ein Mutein von Streptavidin oder Avidin mit einer Bindungsaffinität zu Biotin < 10¹⁰ l/mol zugibt.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren ein heterogener Assay, bei dem die Bestimmung des Analyten über die Bindung an eine Festphase erfolgt, wobei an dieser Festphasenbindung das Streptavidin/Avidin- Bindepaar beteiligt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Testformats wird eine Festphase verwendet, die mit Streptavidin beschichtet ist und an die eine biotinylierte Testkomponente binden soll. Einem der artigen Testformat kann das erfindungsgemäße Entstörungsreagenz in löslicher oder/und immobilisierter Form zugesetzt werden. Ein immobilisiertes Entstörungsreagenz wird vorzugsweise in Form einer separaten inaktiven Festphase zugesetzt, wobei die Testprobe entweder zuerst mit der inaktiven Festphase alleine und erst später mit der aktiven Festphase oder gleichzeitig mit aktiver und inaktiver Festphase in Kontakt gebracht wird.

Bei Verwendung eines löslichen Entstörungsreagenz ist ein Einschritt-Test bevorzugt, bei dem das Entstörungsreagenz zusammen mit allen anderen Testkomponenten in der Probenflüssigkeit vorliegt.

Auch bei Verwendung einer biotinylierten Festphase und löslichem Streptavidin/Avidin als Testkomponente kann das erfindungsgemäße Entstörungsreagenz erfolgreich eingesetzt werden, z. B. in löslicher Form oder in Form einer separaten inaktiven Festphase.

Der Nachweis des Analyten im erfindungsgemäßen Verfahren kann auf an sich bekannte Weise über eine indirekte oder direkte Markierung erfolgen. Mit direkt markierten Nachweisreagenzien erfolgt der Nachweis dadurch, daß das Nachweisreagenz z. B. an den Analyten bindet und einen detektierbaren Komplex bildet, der die Markierung trägt oder kompetitiv zu dem Analyten an eine spezifische Bindungsstelle bindet. Nachweisreagenzien mit indirekter Markie rung umfassen mehrere Komponenten, wobei die Komponente die an den Analyten bindet unmarkiert ist und mit einer weiteren Komponente, die eine Markierung trägt, bindefähig ist.

Geeignete Markierungen sind dem Fachmann bekannt. Es können z. B. radioaktive Markierungen, Chemilumineszenz-, Fluoreszenz- oder Elektrochemilumineszenzmarker, gefärbte Partikel wie z. B. Metallsolpartikel oder gefärbter oder ungefärbter Latex verwendet werden. Die Markierung kann auch ein indirektes Signal liefern wie z. B. bei Enzymmarkierungen mit Enzymen wie Peroxidase, β-Galacto sidase oder alkalischer Phosphatase.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Testprobe, der ein Biotin-bindefähiges Polypeptid sowie weitere Komponenten des jeweiligen Assays und ein Entstörungs reagenz enthält, das ein erfindungsgemäßes Mutein umfaßt. Das Entstörungsreagenz kann in löslicher Form vorliegen oder auf einer Festphase, insbesondere auf einer Mikrotiterplatte, einem Mikroreagenzgefäß, einer Membran oder auf Mikrobeads immobilisiert sein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Muteinen von Avidin und Streptavidin, in denen mindestens eine Aminosäure des nativen Polypeptids ausgetauscht ist und die eine Bindungsaffinität zu Biotin im Bereich von 10⁵ bis 10¹¹ l/mol aufweisen, als regenerierbares System zur Bindung biotinylierter Substanzen. Bevorzugt werden Muteine mit einer Bindungsaffinität zu Biotin im Bereich von 10⁵ bis 10¹⁰ l/mol und insbesondere 10⁵ bis 10⁸ l/mol verwendet.

Das regenerierbare System zur Bindung biotinylierter Substanzen umfaßt vorzugsweise eine Festphase, an der die Streptavidinmuteine immobilisiert sind. Beispiele für geeignete Festphasen sind Sensorchips (z. B. das Biacore-System der Fa. Kabi Pharmacia), Reaktionsgefäße wie etwa Polystyrolröhrchen oder Küvetten, Microtiterplatten, Microbeads, Latexpartikel und Trägermaterialien für Affinitätssäulen. Unter der Bezeichnung "biotinylierte Substanzen" sind insbesondere Biotin- und Biotinanaloga-Konjugate zu verstehen, wobei Biotinanaloga solche Substanzen sind, die mit der Biotinbindungstasche von (nativem) Streptavidin bzw. Avidin einen Komplex ausbilden wie etwa Iminobiotin, Desthiobiotin und Streptavidinaffinitätspeptide.

Der Vorteil der erfindungsgemäßen regenerierbaren Festphasen gegenüber einer mit nativem Streptavidin/Avidin beschichteten Festphase besteht darin, daß einerseits eine ausreichend hohe Bindungsaffiniät für Biotin (in Form von freiem Biotin oder biotinylierten Substanzen) besteht, so daß die Festphase in Assays zum Nachweis von Analyten, zur Untersuchung von Rezeptor-Ligand- Wechselwirkungen und zur Reinigung bzw. Analyse biotinylierter Substanzen eingesetzt werden kann. Andererseits ist die Bindungs affinität der Festphase zu Biotin oder einer biotinylierten Substanz ausreichend gering, daß eine Regenerierung der Festphase, d. h. eine Ablösung des Biotins möglich ist. Diese Ablösung erfolgt vorzugsweise durch Verringerung des pH-Werts auf pH < 4, 5 oder/und durch Zugabe chaotroper Substanzen, d. h. Substanzen, welche die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen stören. Alternativ kann die Ablösung zur Isolierung der biotinylierten Substanzen auch durch Zugabe von freiem Biotin oder/und Biotinanaloga erfolgen. Besonders bevorzugt ist die Gradientenelution.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die regenerierbare Festphase als Affinitätsmatrix eingesetzt. Diese Affinitätsmatrix dient zur Reinigung von biotinylierten Substanzen beispielsweise biotinylierten Antikörpern bzw. zur Auftrennung solcher Substanzen nach der Anzahl der pro Molekül angebundenen Biotinreste. Werden als Matrix nicht-modifiziertes Streptavidin oder Avidin verwendet, können die mit der Matrix in Kontakt gebrachten Substanzen aufgrund der hohen Bindungsaffinität praktisch nicht wieder freigesetzt werden. Im Stand der Technik wurde zur Lösung dieses Problems versucht, Avidin durch Behandlung mit Harnstoff in seine Monomeren zu überführen, bzw. Iminobiotin anstelle von Biotin zu verwenden um die Bindungsaffinität herabzusetzen. Diese Verfahren sind jedoch aufwendig und mit zusätzlichen Problemen verbunden. Unter Verwendung von erfindungsgemäßen Muteinen können Affinitäts matrices mit Bindungsaffinitäten zu Biotin hergestellt werden, die eine reversible Bindung und damit eine Rückgewinnung des Analyten ermöglichen.

Weiterhin ist es bevorzugt, die erfindungsgemäße, regenerierbare Festphase zur Bestimmung von Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen zu verwenden, z. B. als beschichteten Sensorchip. Die Bindung von Molekülen an diese Oberfläche kann z. B. durch Oberflächenplasmo nenresonanz-Spektroskopie untersucht werden.

Die in der vorliegenden Anmeldung genannten Plasmide und Mikroor ganismen wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroderweg 1B, D-30300 Braunschweig gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrag unter den folgenden Hinterlegungsnummern hinterlegt:
E. coli K12RM82: DSM 5445 am 2. Oktober 1991
pUBS500: DSM 6720 am 20. September 1991
In der Sequenzliste zeigt
SEQ ID NO. 1 die für Streptavidin kodierende Nukleotidsequenz einschließlich der Signalpeptid-kodierenden Se quenz,
SEQ ID NO. 2 die Aminosäuresequenz von Streptavidin einschließ lich der Signalsequenz,
SEQ ID NO. 3 die für Avidin kodierende Nukleotidsequenz ein schließlich der Signalpeptid-kodierenden Sequenz,
SEQ ID NO. 4 die Proteinsequenz von Avidin einschließlich der Signalsequenz,
SEQ ID NO. 5 die Nukleotidsequenz des Primers N1,
SEQ ID NO. 6 die Nukleotidsequenz des Primers N2,
SEQ ID NO. 7 die Nukleotidsequenz des Primers N3,
SEQ ID NO. 8 die Nukleotidsequenz des Primers N4,
SEQ ID NO. 9 die Nukleotidsequenz des Primers N5,
SEQ ID NO. 10 die Nukleotidsequenz des Primers N6,
SEQ ID NO. 11 die Nukleotidsequenz des Primers N7,
SEQ ID NO. 12 die Nukleotidsequenz des Primers N8,
SEQ ID NO. 13 die Nukleotidsequenz des Primers N9,
SEQ ID NO. 14 die Nukleotidsequenz des Primers N10,
SEQ ID NO. 15 die für Core-Streptavidin gemäß WO 93/09144 kodie rende Nukleotidsequenz und
SEQ ID NO. 16 die Aminosäuresequenz von Core-Streptavidin.

Fig. 1 zeigt die Plasmidkarte des core-Streptavidin- Expressionsplasmids pSAM-Core.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.

Beispiel 1 Konstruktion von Core-Streptavidin Mutantengenen

Das Plasmid pSAM-core wurde gemäß WO 93/09144 hergestellt.

Der DNA-Bereich stromauf- und stromabwärts von der einzuführenden Mutation wurde bis zur nächsten singulären Restriktionsendonu kleaseschnittstelle im pSAM-Core-Expressionsvektor entfernt und durch ein entsprechendes chemisch hergestelltes DNA-Segment mit der gewünschten Mutation ersetzt (DNA-Adaptor). Die Manipulation der DNA wurde dabei mit Standardmethoden durchgeführt, wie sie bei Sambrook et al., In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 beschrieben sind. Die verwendeten molekularbiologischen Reagenzien wurden nach den Angaben der Hersteller eingesetzt.

Die Proteinkonzentrationen der Fusionsproteine und Peptide wurde anhand der optischen Dichte (OD) bei 280 nm unter Verwendung von mittels der Aminosäuresequenzen errechneten molaren Extinktions koeffizienten (z. B. für Core-SA:ε=41820 cm²/mol) bestimmt.

Konstruktion der Streptavidin-Mutanten Einfachmutanten 1.1. pSA-Leu25Trp

Zur Konstruktion des Leu25Trp CORE-SA Mutantengens wurde das Plasmid pSAM-CORE mit den singulär schneidenden Restriktions endonukleasen NcoI und SalI verdaut und das ca. 2.9 kBp lange NcoI/SalI-pSAM-CORE Vektorfragment nach Isolierung mittels Agarosegelelektrophorese mit dem Leu25Trp-Adaptor ligiert. Der Leu25Trp-Adaptor wurde durch Hybridisierung aus den komplementären Oligonukleotiden N1 und N2 (Reaktionspuffer: 12,5 mmol/l Tris-HCl, pH 7,0 und 12,5 mmol/l MgCl₂ N-Konzentration: jeweils 1 pmol/60 µl) hergestellt. N1 und N2 wurden jeweils so entworfen, daß nach Hybridisierung die für die Klonierung relevanten NcoI bzw. SalI- Überhänge entstehen.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Leu25Trp wurde durch Restriktions kartierung (Deletion der BanI-Restriktionsendonukleaseschnitt stelle durch stumme Mutation im Leu25Trp-Adaptor) und die DNA- Sequenz des Adaptorbereichs durch DNA-Sequenzierung überprüft.

Leu25Trp-Adaptor 1.2. pSA-Ser27Arg

Zur Herstellung des Ser27Arg CORE-SA Mutantengens wurde das Plasmid pSAM-CORE mit den singulär schneidenden Restriktions endonukleasen NcoI und HindIII verdaut und das ca. 400 Bp lange Streptavidin-Fragment sowie das ca. 2.5 kBp pSAM-CORE Vektor fragment mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Die gewünschte Mutation Ser27Arg wurde mittels PCR-Technik durch Amplifikation des 400 Bp langen Fragments mit dem entsprechend entworfenem 5′- Mutageneseprimer N3 eingeführt. Das so gewonnene PCR-Produkt wurde danach mit NcoI und HindIII nachgeschnitten, mittels Agarosegel elektrophorese gereinigt und mit dem wie o. a. isolierten 2.5 kBp pSAM-CORE Vektorfragment ligiert.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Ser27Arg wurde durch Restriktions kartierung (Deletion der SalI-Restriktionsendonukleaseschnitt stelle durch Einführung der Mutation Ser27Arg) und die mutierte DNA-Sequenz des 5′-Bereichs durch DNA-Sequenzierung überprüft.

Ser27Arg

Die PCR wurde mit dem 5′-Mutageneseprimer N3 (besitzt gewünschte Ser27Arg Mutation) und dem 3′-Steptavidinprimer N4 (Sequenz gegenüber pSAM-CORE unverändert) durchgeführt.

1.3. pSA-Ser45Arg

Zur Konstruktion des Ser45Arg CORE-SA Mutantengens wurde das Plasmid pSAM-CORE mit den singulär schneidenden Restriktions endonukleasen SacI und HindIII verdaut und das ca. 300 Bp lange Streptavidin-Fragment sowie das ca. 2.6 kBp pSAM-CORE Vektor fragment mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Die gewünschte Mutation Ser45Arg wurde mittels PCR-Technik durch Amplifikation des ca. 300 Bp langen Fragments mit dem entsprechend entworfenem 5′-Mutageneseprimer N5 eingeführt. Das so gewonnene PCR-Produkt wurde danach mit SacI und HindIII nachgeschnitten, mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit dem wie o.a. isolierten 2.6 kBp pSAM-CORE Vektorfragment ligiert.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Ser45Arg wurde durch Restriktions kartierung (zusätzliche AvaII-Restriktionsendonukleaseschnitt stelle durch stumme Mutation im N5-Mutageneseprimer) und die mutierte DNA-Sequenz des 5′-Bereichs durch DNA-Sequenzierung überprüft.

Ser45Arg

Die PCR wurde mit dem 5′-Mutageneseprimer N5 (besitzt die gewünschte Mutation Ser45Arg) und dem 3′-Streptavidinprimer N4 (Sequenz gegenüber pSAM-CORE unverändert) durchgeführt.

1.4. pSA-Trp120Ala

Zur Konstruktion des Trp120Ala CORE-SA Mutantengens wurde das Plasmid SAM-CORE mit den singulär schneidenden Restriktions endonukleasen NsiI und SpeI verdaut und das ca. 2.9 kBp lange NsiI/SpeI-pSAM-CORE Vektorfragment nach Isolierung mittels Agarosegelelektrophorese mit dem Trp120Ala-Adaptor ligiert. Der Trp120Ala-Adaptor wurde durch Hybridisierung aus den komplementä ren Oligonukleotiden N9 und N10 (Reaktionspuffer: 12,5 mmol/l Tris-HCl, pH 7,0 und 12,5 mmol/l MgCl₂; N-Konzentration: jeweils 1 pmol/60 µl) hergestellt. N9 und N10 wurden jeweils so entworfen, daß nach Hybridisierung die für die Klonierung relevanten NsiI bzw. SpeI-Überhänge entstehen.

Das neu entstandene Plasmid pSA-Trp120Ala wurde durch Restrik tionskartierung (Deletion der NsiI-Restriktionsendonuklease schnittstelle durch gewünschte Mutation im Trp120Ala-Adaptor) und die DNA-Sequenz des Adaptorbereichs durch DNA-Sequenzierung überprüft.

Trp120A1a-Adaptor Zweifach-Kombinationsmutanten 1.5. pSA-Leu25Trp/Ser45Arg

Zur Konstruktion des Leu25Trp/Ser45Arg CORE-SA Mutantengens wurden die Plasmide pSA-Leu25Trp und pSA-Ser45Arg mit den singulär schneidenden Restriktionsendonukleasen NcoI und SacI verdaut und das 82 Bp lange Fragment von pSA-Leu25Trp sowie das ca. 2.8 kBp lange Vektorfragment von pSA-Ser45Arg mittels Agarosegelelek trophorese isoliert. Anschließend wurden beide Fragmente mitein ander ligiert.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Leu25Trp/Ser45Arg wurde mittels Restriktionskartierung (fehlende BanI-Restriktionsendonuklease schnittstelle aus pSA-Leu25Trp und zusätzliche AvaII-Restriktions endonukleaseschnittstelle aus pSA-Ser45Arg) und die DNA-Sequenz mittels DNA-Sequenzierung im 5′-Bereich überprüft.

1.6. pSA-Ser27Arg/Ser45Arg

Zur Konstruktion des Ser27Arg/Ser45Arg CORE-SA Mutantengens wurden die Plasmide pSA-Ser27Arg und pSA-Ser45Arg mit den singulär schneidenden Restriktionsendonukleasen NcoI und SacI verdaut und das 82 Bp lange Fragment von pSA-Ser27Arg sowie das ca. 2.8 kBp lange Vektorfragment von pSA-Ser45Arg mittels Agarosegelelek trophorese isoliert. Anschließend wurden beide Fragmente mitein ander ligiert.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Ser27Arg/Ser45Arg wurde mittels Restriktionskartierung (fehlende SalI-Restriktionsendonuklease schnittstelle aus pSA-Ser27Arg und zusätzliche AvaII-Restriktions endonukleaseschnittstelle aus pSA-Ser45Arg) und die DNA-Sequenz mittels DNA-Sequenzierung im 5′-Bereich überprüft.

1.7. pSA-Ser45Trp/Leu110Trp

Zur Konstruktion des Ser45Trp/Leu110Trp CORE-SA Mutantengens wurde das Plasmid pSA-Ser45Arg mit den singulär schneidenden Restrik tionsendonukleasen SacI und NsiI verdaut und das 243 Bp lange Streptavidin-Fragment sowie das ca. 2.7 kBp lange pSA-Ser45Arg Vektorfragment mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Die gewünschten Mutationen Ser45Trp/Leu110Trp wurde anschließend mittels PCR-Technik durch Amplifikation des 243 Bp langen Fragments mit dem entsprechend entworfenen 5′-Mutageneseprimer N6 und dem entsprechend entworfenen 3′-Mutageneseprimer N7 eingeführt. Das so gewonnene PCR-Produkt wurde danach mit SacI und NsiI nachgeschnitten, mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit dem wie o.a. isolierten ca. 2.7 kBp pSA-Ser45Arg-Vektor fragment ligiert.

Das neuentstandene Plasmid wurde durch Restriktionskartierung (Deletion der in pSA-Ser45Arg zusätzlich durch stumme Mutation eingeführten AvaII-Schnittstelle durch Rückmutation in die ursprüngliche Sequenz sowie Deletion der HindII-Site durch die Leu110Trp-Mutation) und die gewünschten DNA-Mutationen durch DNA- Sequenzierung überprüft.

Ser45Trp/Leu110Trp

Die PCR wurde mit dem 5′-Mutageneseprimer N6 (besitzt gewünschte Mutation Ser45Trp und die SacI-Restriktionsendonukleaseschnitt stelle) und dem 3′-Mutageneseprimer N7 (besitzt gewünschte Mutation Leu110Trp und die NsiI-Restriktionsendonukleaseschnitt stelle).

1.8. pSA-Ser45Tyr/Leu110Trp

Zur Konstruktion des Ser45Tyr/Leu110Trp Core-SA Mutantengens wurde das Plasmid pSA-Ser45Arg mit den singulär schneidenden Restrik tionsendonukleasen SacI und NsiI verdaut und das 243 Bp lange Streptavidin-Fragment sowie das ca. 2.7 kBp lange pSA-Ser45Arg Vektorfragment mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Die gewünschten Mutationen Ser45Tyr/Leu110Trp wurde anschließend mittels PCR-Technik durch Amplifikation des 243 Bp langen Fragments mit dem entsprechend entworfenen 5′-Mutageneseprimer N8 und dem entsprechend entworfenen 3′-Mutageneseprimer N7 eingeführt. Das so gewonnene PCR-Produkt wurde danach mit SacI und NsiI nachgeschnitten, mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit dem wie o.a. isolierten ca. 2.7 kBp pSA-Ser45Arg-Vektor fragment ligiert.

Ser45Tyr/Leu110Trp

Die PCR wurde mit dem 5′-Mutageneseprimer N8 (besitzt gewünschte Mutation Ser45Tyr und die SacI-Restriktionsendonukleaseschnitt stelle) und dem 3′-Mutageneseprimer N7 (besitzt gewünschte Mutation Leu110Trp und die NsiI-Restriktionsendonukleaseschnitt stelle).

Dreifach-Kombinationsmutationen 1.9. pSA-Leu25Trp/Ser45Trp/Leu110Trp

Zur Konstruktion des Leu25Trp/Ser45Trp/Leu110Trp CORE-SA Mutanten gens wurden die Plasmide pSA-Leu25Trp und pSA-Ser45Trp/Leu110Trp mit den singulär schneidenden Restriktionsendonukleasen SalI und HindIII verdaut und das 352 Bp lange Fragment von pSA-Ser45Trp/- Leu110Trp sowie das ca. 2.6 kBp lange Vektorfragment von pSA- Leu25Trp mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Anschließend wurden beide Fragmente miteinander ligiert.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Leu25Trp/Ser45Trp/Leu110Trp wurde mittels Restriktionskartierung (fehlende HindII-Restriktions endonukleaseschnittstelle aus pSA-Ser45Trp/Leu110Trp und fehlende BanI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle aus pSA-Leu25Trp) und mittels DNA-Sequenzierung überprüft.

1.10. pSA-Leu25Trp/Ser45Tyr/Leu110Trp

Zur Konstruktion des Leu25Trp/Ser45Tyr/Leu110Trp CORE-SA Mutanten gens wurden die Plasmide pSA-Leu25Trp und pSA-Ser45Tyr/Leu110Trp mit den singulär schneidenden Restriktionsendonukleasen SalI und HindIII verdaut und das 352 Bp lange Fragment von pSA-Ser45Tyr/- Leu110Trp sowie das ca. 2.6 kBp lange Vektorfragment von pSA- Leu25Trp mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Anschließend wurden beide Fragmente miteinander ligiert.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Leu25Trp/Ser45Trp/Leu110Trp wurde mittels Restriktionskartierung (fehlende HindII-Restriktions endonukleaseschnittstelle aus pSA-Ser45Trp/Leu110Trp und fehlende BanI-Restriktionsendonukleaseschnittstelle aus pSA-Leu25Trp) und die DNA-Sequenz mittels DNA-Sequenzierung überprüft.

1.11. pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp

Zur Konstruktion des Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp CORE-SA Mutanten gens wurden die Plasmide pSA-Ser27Arg/Ser45Arg und pSA-Ser45Trp/- Leu110Trp mit den singulär schneidenden Restriktionsendonukleasen KpnI und HindIII verdaut und das 218 Bp lange Fragment von pSA- Ser45Trp/Leu110Trp sowie das ca. 2.7 kBp lange Vektorfragment von pSA-Ser27Arg/Ser45Arg mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Anschließend wurden beide Fragmente miteinander ligiert.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp wurde mittels Restriktionskartierung (fehlende HindII-Restriktions endonukleaseschnittstellen aus pSA-Ser27Arg/Ser45Arg und pSA- Ser45Trp/Leu110Trp und zusätzliche AvaII-Restriktionsendonuklea seschnittstelle aus pSA-Ser27Arg/Ser45Arg) und die DNA-Sequenz mittels DNA-Sequenzierung überprüft.

1.12. pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/Trp120Ala

Zur Konstruktion des Ser27Arg/Ser45Arg/Trp120Ala-CORE-SAMutanten gens wurde das Plasmid pSA-Ser27Arg/Ser45Arg mit den singulär schneidenden Restriktionsendonukleasen NsiI und SpeI verdaut und das ca. 2.9 kBp lange NsiI/SpeI-pSAM-CORE Vektorfragment nach Isolierung mittels Agarosegelelektrophorese mit dem Trp120Ala- Adaptor ligiert. Der Trp120Ala-Adaptor wurde durch Hybridisierung aus den komplementären Oligonukleotiden N9 und N10 (Reaktions puffer: 12,5 mmol/l Tris-HCl, pH 7,0 und 12,5 mmol/l MgCl2; N- Konzentration: jeweils 1 pmol/60µl) hergestellt. N9 und N10 wurden jeweils so entworfen, daß nach Hybridisierung die für die Klonierung relevanten NsiI bzw. SpeI-Überhänge entstehen.

Das neuentstandene Plasmid pSA-Ser27Arg/Ser45Arg/Trp120Ala wurde durch Restriktionskartierung (Deletion der NsiI-Restriktions endonukleaseschnittstelle durch gewünschte Mutation im Trp120Ala- Adaptor) und die DNA-Sequenz des Adaptorbereichs durch DNA- Sequenzierung überprüft.

Beispiel 2 Charakterisierung von gereinigten inaktiven Core-Streptavidin Muteinen aus E. coli 2.1. Expression

Die Expression der Core-Streptavidin Muteine in E. coli, die Expressionsanalyse, die Präparation sowie die Reinigung von naturierten inaktiven Core-Streptavidin Muteinen erfolgte wie in der EP-A-0 612 325 für rekombinantes Core-Streptavidin beschrie ben. Bei der Doppelmutante SA-Ser27Arg/Ser45Arg und der Dreifach mutante SA-Ser27Arg/Ser45Arg/Leu110Trp wurde anstelle von Q-Sepharose zur Aufreinigung eine in 20 mM Na-Acetat, pH 5,0 äquilibrierte S-Sepharose verwendet. Die Elution erfolgte in 20 mM Na-Acetat, pH 5,0 mit 350 mM NaCl.

Die SA-Mutante Trp120Ala zeigte gegenüber den anderen Mutanten eine verringerte Säurestabilität, was auf eine unrichtige strukturelle Faltung sowie auf Störungen des Proteinrückgrats hinwies.

2.2. SDS-PAGE/Isoelektrische Fokussierung (IF)

Die Homogenität und Reinheit der naturierten gereinigten inaktiven Core-Streptavidin Muteinen wurde durch SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685) und Isoelektrische Fokussierung (Bark et al., J. Forensic Sci. Soc. 16 (1976) 115-120) untersucht.

Die naturierten gereinigten inaktiven Core-Streptavidin Muteine waren homogen (einbandig) in der SDS-PAGE-(Molekulargewicht ca. 13500 Da) und in den IF-Gelen mit einer Reinheit von < 98%.

Beispiel 3 Bestimmung der Affinität rekombinanter Streptavidin Mutanten

Die Affinität der Streptavidin-Muteine zu Biotinderivaten (Konstanten K_on, K_off und K_A) wurde mit dem BIAcore-System der Fa. Pharmacia im Vergleich zu Core-Streptavidin (Wildtyp-Streptavidin) bestimmt. Hierzu wurden die jeweiligen Streptavidin-Proben an der Oberfläche von Biosensor-Chips (CM5 Biosensor) immobilisiert. Die Oberflächenbeladung wurde so gewählt, daß ein Meßsignal von 500 bis 2000 Resonanzunits (rU) erzeugt wurde. Die Assoziations kinetiken wurden bei 25°C und 6 Konzentrationen (12,5, 25, 50, 100, 200 und 400 nmol/l) eines monobiotinylierten Fab′-Antikör perfragments für jeweils 3 min aufgenommen. Um den Einfluß der Rückbindung des Antikörpers zu untersuchen, wurden die Dis soziationskinetiken in Abwesenheit und Gegenwart von 10 µg/ml Core-Streptavidin verglichen. Die Spezifität der Bindung wurde durch einen Versuch mit dem gleichen Antikörper in nichtbiotiny lierter Form (negative Kontrolle) gezeigt.

Die Bindungskonstanten wurden sowohl von den gereinigten Strepta vidin-Muteinen als auch von den zu einem Polymer vernetzten Streptavidin-Muteinen (Streptavidin-Mutein-Thermo-Rinderserumal bumin-Konjugate, Herstellung: EP-A-0 269 092) bestimmt. Die Ergebnisse des Experiments sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Beispiel 4 Entstörexperiment

Es wurde ein Enzymuntest auf Anti-HCV-Antikörper durchgeführt und die Reduzierung von Teststörungen durch Zugabe der Streptavidin- Muteine SA-Ser27Arg/Ser45Arg (1), SA-Ser45Trp/Leu110Trp (2) und SA-Ser45Tyr/Leu110Trp (3) bestimmt.

Der Test wurde als Zwei-Schritt-Sandwichassay mit einer Streptavi din-Festphase durchgeführt. Im ersten Schritt wurden biotinylierte HCV-Peptide (EP-A-0 582 243, EP-A-0 484 787) bzw. Polypeptide (EP-A-0 696 640) plus Probe zugesetzt. Als zweiter Schritt wurde eine Reaktion der Festphasen-gebundenen Antikörper mit einem Anti- Human- IgG-Peroxidase-Konjugat durchgeführt. Anschließend wurde eine Indikatorreaktion mit ABTS als Substrat durchgeführt.

Die Durchführung des Tests war wie folgt:

Inkubationspuffer:
Na-Phosphat 40 mmol/l pH: 7,4
NaCl 7,1 g/L
Konservierungsmittel (z. B. Chloracetamid)
Plasma-Diagnostic-Base 200 g/L (Armour Pharmaceuticals Company, USA)
+ HCV-Peptide aus der Core, NS4 und NS3 Region und rekombinantes NS3 Polypeptid (biotinyliert)
± 25 µg/ml Streptavidin-Mutein unkonjugiert
bzw. 75µg/ml als Konjugat mit Thermo-RSA
± 25 µg/ml Core-Streptavidin (WT)

Konjugatpuffer:
Na-Phosphat 40 mmol/l pH: 7,4
NaCl 7,1 g/l
Konservierungsmittel (z. B. Chloracetamid)
Rinderserumalbumin 1 g/L
Rinder IgG 4 g/L
Triton X 100 1 g/L
Anti-human IgG-POD 15 U/L

Inkubationszeiten:
1. Schritt: 1 Stunde (Probe + Inkubationspuffer)
2. Schritt: 1 Stunde (+ Konjugatpuffer)
3. Schritt: 1 Stunde (Substratreaktion mit ABTS)
Testdurchführung am ES 600 bei 25°C
Messung der Substratlösung bei 422 nm

Proben:
5 falsch positive Anti-HGV-Negativproben (Störproben)
6 positive Anti HCV-Proben (Kontrolle)

Volumina:
Probe 20 µl, alle anderen Reagenzien jeweils 500 µl.

Die am Analysegerät ES 600 bei 422 nm gemessenen Extinktionswerte sind in den nachfolgenden Tabellen 2 und 3 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß der Zusatz der Streptavidin-Muteine eine sehr starke Signalabnahme bei den Negativserumproben, aber keine oder nur eine sehr geringe Signalabnahme bei den Positivser umproben bewirkt. Das Streptavidinmutein eignet sich daher hervorragend als Entstörungsreagenz.

Beispiel 5 Verwendung von Streptavidin-Muteinen als Affinitätsadsorbens 5.1 Fixierung von SA-Mutein an Spherosil-NH₂

Spherosil-NH₂ (Boehringer Mannheim, Bestell-Nummer: 576590) wurde mit der dreifachen Menge 10% (w/v) Glutardialdehyd aktiviert und dann mit 7 Volumina destilliertem Wasser gewaschen. Das Streptavi din-Mutein wurde an die entstandenen freien Aldehydgruppen mittels seiner freien Aminogruppen gekoppelt. Die verwendete SA-Mutein- Konzentration betrug 2 mg Streptavidin-Mutein pro ml aktiviertes Spherosil-NH₂ Gel. Das nicht an Spherosil gebundene Mutein wurde mit PBS-Puffer (50 mM K-Phosphat, pH 7,5, 150 mM NaCl) ausgewa schen.

Anschließend wurde das Adsorbens mit biotinylierten Substanzen beladen. Nichtbiotinylierte Substanzen wurden nicht gebunden und konnten somit von den biotinylierten Substanzen leicht abgetrennt werden. Auch eine Auftrennung biotinylierter Substanzen ent sprechend dem Biotinylierungsgrad (Anzahl der Biotingruppen pro Molekül) konnte durchgeführt werden.

Die an der Säule gebundenen biotinylierten Substanzen konnten mit einem Puffer pH < 4,5 oder/und durch Zugabe chaotroper Substanzen, wie z. B. Guanidiniumhydrochlorid, oder/und durch Zugabe von Biotin oder Biotinanaloga eluiert werden. Die Auftrennung von biotiny lierten Substanzen entsprechend dem Biotinylierungsgrad erfolgte bevorzugt mittels eines Biotin- oder Biotinanalogon-Gradienten.

5.2 Fixierung von SA-Mutein an andere Träger

Eine Fixierung von Streptavidin-Muteinen an andere Chromatogra phiematerialien ist über alle für natives Streptavidin bekannten Verfahren möglich.

5.3. Beladung eines SA-Mutein Adsorbers mit biotinyliertem Rinderserum-Albumin (Bi-RSA)

Der in Beispiel 5.1. hergestellte Sperosil-NH₂ SA-Mutein Adsorber wurde in PBS-Puffer (50 mM K-Phosphat, pH 7,5, 150 mM NaCl) äquilibriert und in eine Chromatographiesäule überführt. Dann wurden 2 mg Bi-RSA in PBS pro ml SA-Mutein Adsorber aufgetragen. Nichtgebundenes Protein wurde mit 2 Säulenvolumina PBS ausgewa schen. Die Elution erfolgte in 50 mM Ammoniumacetat, pH 3,0 oder/und einem Gradienten von 0 bis 10 mM Iminobiotin oder Biotin.

5.4. Beladung eines SA-Mutein Adsorbers mit einem biotinylierten Fab-Antikörperfragment

Der in Beispiel 5.1. hergestellte SA-Mutein Adsorber wurde in PBS- Puffer mit 500 mM Ammoniumsulfat (PBS + AS-Puffer) äquilibriert und in eine Chromatographiesäule überführt. Dann wurden 2 mg Antikörperfragment pro ml SA-Mutein-Adsorber in PBS + AS-Puffer aufgetragen. Nichtgebundenes Protein wurde mit 2 Säulenvolumina PB+AS-Puffer ausgewaschen. Die Elution erfolgte mit PBS-Puffer, pH 7,2 und einem Gradienten von 0 bis 10 mM Biotin.

Claims

1. Biotin-bindefähiges Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen von Avidin und Streptavidin, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Mutein (a) um mindestens eine Aminosäure vom nativen Polypeptid unterscheidet, (b) eine Bindungsaffinität zu Biotin von weniger als 10¹⁰ l/mol aufweist.

2. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Streptavidin ist und mindestens eine der Aminosäuren an den Positionen Leu25, Ser27, Tyr43, Ser45, Val47, Gly48, Ser88, Thr90, Leu110 oder/und Asp 128 durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Streptavidin ist und mindestens eine der Aminosäuren an den Positionen Leu25, Ser27, Ser45 und Leu110 ausgetauscht ist.

4. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Streptavidin ist und mindestens eine der Aminosäuren Leu25, Ser27, Ser45 und Leu110 durch eine Aminosäure ausgewählt aus Arg, Trp, Tyr, Phe und His ausge tauscht ist.

5. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Aminosäuren ausgetauscht sind.

6. Polypeptid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Streptavidin ist und mindestens zwei der Aminosäuren Leu25, Ser27, Ser45 und Leu110 durch Amino säuren ausgewählt aus Arg, Trp, Tyr, Phe und His ausgetauscht sind.

7. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens drei Aminosäuren ausgetauscht sind.

8. Polypeptid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Streptavidin ist und mindestens drei der Aminosäuren Leu25, Ser27, Ser45 und Leu110 durch Amino säuren ausgewählt aus Arg, Trp, Tyr, Phe und His ausgetauscht sind.

9. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Avidin ist und mindestens eine der Aminosäuren an den Positionen Leu14, Ser16, Tyr33, Thr35, Val37, Thr38, Ser75, Thr77, Leu99 und Ile 117 ausgetauscht ist.

10. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Avidin ist und mindestens eine der Aminosäuren an den Positionen Leu14, Ser16, Thr35 und Leu99 ausgetauscht ist.

11. Polypeptid nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es Mutein von Avidin ist und mindestens eine der Amino säuren Leu14, Ser16, Thr35 und Leu99 durch eine Aminosäure ausgewählt aus Arg, Trp, Tyr, Phe und His ausgetauscht ist.

12. Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Avidin ist und mindestens zwei der Aminosäuren Leu14, Ser16, Thr35 und Leu99 durch Aminosäuren ausgewählt aus Arg, Trp, Tyr, Phe und His ausgetauscht sind.

13. Polypeptid nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein von Avidin ist und mindestens drei der Aminosäuren Leu14, Ser16, Thr35 und Leu99 durch Aminosäuren ausgewählt aus Arg, Trp, Tyr, Phe und His ausgetauscht sind.

14. Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Mutein eines rekombinanten Core-Streptavi dins mit der von in SEQ ID NO. 16 gezeigten Aminosäuresequenz handelt.

15. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es als polymeres Konjugat vorliegt.

16. Polypeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutein als Konjugat mit einem weiteren Polypeptid oder Protein vorliegt.

17. Polypeptid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Rinderserumalbumin-Mutein-Konjugat handelt.

18. Polypeptid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutein die Fähigkeit aufweist, Dimere oder/und Tetramere zu bilden.

19. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 18 kodiert.

20. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure nach Anspruch 19 enthält.

21. Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Vektor nach Anspruch 20 transformiert ist.

22. Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 18 als Entstörungsreagenz für Assays, die das Bindepaar Streptavidin/Avidin-Biotin als Testkomponenten enthalten.

23. Verwendung nach Anspruch 22 für heterogene immunologische Assays oder/und Hybridisierungsassays.

24. Entstörungsreagenz zur Verringerung oder/und Vermeidung von unspezifischen Wechselwirkungen in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mutein nach einem der Ansprüche 1-18 enthält.

25. Entstörungsreagenz nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutein in löslicher Form vorliegt.

26. Entstörungsreagenz nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutein an eine Festphase immobilisiert ist.

27. Entstörungsreagenz nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutein an einem Chip, einer Membran, einer Mikroti terplatte, einem Reaktionsgefäß oder an Mikrobeads immobili siert ist.

28. Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Testprobe, umfassend die Verwendung des spezifischen Bindepaares Streptavidin/Avidin-Biotin, wobei man der Testprobe ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zugibt.

29. Testkit zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis eines Analyten in einer Testprobe enthaltend ein Biotin bindefähiges Polypeptid sowie weitere Komponenten des jeweiligen Assays und zusätzlich ein Entstörungsreagenz nach einem der Ansprüche 24 bis 27.

30. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Entstörungsreagenz in löslicher Form vorliegt.

31. Testkit nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Entstörungsreagenz an eine Festphase immobilisiert ist.

32. Testkit nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich zum immobilisierten Entstörungsreagenz eine aktive Festphase mit einem Biotin-bindefähigen Polypeptid umfaßt.

33. Verwendung eines Biotin-bindefähigen Polypeptids, ausgewählt aus Muteinen von Avidin und Steptavidin, als regenerierbares System zur Bindung von Biotin, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Aminosäure des nativen Polypeptids ausgetauscht ist und das Mutein eine Bindungsaffinität zu Biotin von 10⁵-10¹¹ l/mol aufweist.

34. Verwendung nach Anspruch 33 zur Bestimmung von Rezeptor- Ligand-Wechselwirkungen.

35. Verwendung nach Anspruch 33 als Affinitätsmatrix.

36. Verwendung nach Anspruch 33 in einem Verfahren zur Bestimmung eines Analyten.

37. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutein an einer Festphase immobilisiert ist.

38. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphase aus Chips für Biosensoren, Mikrotiter platten, Reaktionsgefäßen, Mikrobeads und Chromatographiema terialien ausgewählt ist.

39. Verwendung nach einem der Ansprüche 33 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Regenerierung des Systems durch Verringerung des pH- Werts auf < 4,5 oder/und durch Zugabe einer chaotropen Substanz erfolgt.

40. Biotin-bindefähige regenerierbare Festphase, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Mutein von Streptavidin oder Avidin beschichtet ist, das eine Bindungsaffinität zu Biotin von 10⁵ bis 10¹¹ aufweist.