DE19631918A1

DE19631918A1 - Steigerung der Wirkung von Anti-Sinn-RNA in Zellen

Info

Publication number: DE19631918A1
Application number: DE1996131918
Authority: DE
Inventors: Dieter Prof Dipl Chem D Werner; Christof Dr Granzow; Marie Schubert; Karsten Dipl Chem Dr Rothbarth; Gunnar Dipl Chem Dittmar; Herrmann Stammer; Ivan Dipl Biol Todorov
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1996-08-07
Publication date: 1998-02-12
Also published as: WO1998005771A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen sowie ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens.

Neue Techniken zur Hemmung der Genexpression umfassen häufig den Einsatz von Anti-Sinn-RNA. Dies ist eine RNA, die zu Bereichen der mRNA eines Gens komplementär ist und an diese bindet. Es entsteht ein Duplexmolekül, das der Translation der mRNA entzogen ist. Damit kann eine Hemmung der Genexpres sion erreicht werden.

Es hat sich allerdings gezeigt, daß das Duplexmolekül häufig nicht stabil ist, d. h. die mRNA wird wieder frei für die Translation, wodurch die Hemmung der Genexpression schwach ist oder gar nicht eintritt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzu stellen, mit dem eine starke Hemmung der Genexpression erzielt werden kann.

Erfindungsgemäß wird dies durch ein Verfahren zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen erreicht, das die Expression einer (ds)RNAse in den die Anti-Sinn-RNA enthaltenden Zellen umfaßt.

Der Ausdruck "Anti-Sinn-RNA" umfaßt jegliches RNA-Molekül, das sich als Anti- Sinn-RNA eignet, d. h. komplementär zu Bereichen einer RNA, insbesondere mRNA und ganz besonders Regulationselementen dieser, ist und durch Bindung an diese Bereiche eine Hemmung der Genexpression bewirkt. Die Anti-Sinn-RNA kann auch DNA-Sequenzen umfassen. Ferner kann die Anti-Sinn-RNA als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors bzw. Vektorkonstrukts, das gele gentlich auch als "Minigen" bezeichnet wird, vorliegen. Ein solcher Vektor kann ein üblicher Expressionsvektor sein. Günstig kann es sein, wenn die Expression der für die Anti-Sinn-RNA kodierenden Sequenz unter der Kontrolle eines kon stitutiven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifi schen Promotors, steht.

Der Ausdruck "Wirkungssteigerung" weist darauf hin, daß die Wirkung einer Anti-Sinn-RNA, d. h. die Hemmung der Genexpression, gesteigert ist. Erfindungs gemäß wird dies dadurch erreicht, daß Duplexmoleküle aus mRNA und Anti- Sinn-RNA durch eine (ds)RNAse abgebaut werden und somit nur ein reduzierter Anteil der mRNA translatiert werden kann.

Der Ausdruck "(ds)RNAse" umfaßt jegliche RNAse, die doppelsträngige RNA erkennen und abbauen kann. Eine (ds)RNAse findet sich z. B. in dem Hefestamm Schizosaccharomyces pombe (pac1 + Gen). Ferner kann die (ds)RNAse als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Ein solcher Vektor kann ein üblicher Expressionsvektor sein. Günstig kann es sein, wenn die Expression der für die (ds)RNAse kodierenden Sequenz unter der Kontrolle eines konstituti ven oder induzierbaren Promotors, wie eines Gewebe- oder Tumor-spezifischen Promotors, steht.

Der Ausdruck "Zellen" umfaßt jegliche Zellen, in denen eine Anti-Sinn-RNA wirken, d. h. die Genexpression hemmen kann. Beispiele solcher Zellen sind Pflanzen- und tierische, insbesondere Säugetier- und ganz besonders mensch liche Zellen. Die Zellen können in einem Organismus oder außerhalb eines solchen vorliegen. Letztere können frisch isoliert oder in Kultur gehalten sein.

Der Ausdruck "Expression einer (ds)RNAse in Zellen, die eine Anti-Sinn-RNA enthalten" weist darauf hin, daß eine Anti-Sinn-RNA und eine (ds)RNAse in Zellen eingeführt werden. Dies kann durch übliche Verfahren erfolgen. Liegt die Anti-Sinn-RNA als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vor, eignen sich z. B. Transfektionstechniken, wie Elektroporation. Gleiches gilt für die (ds)RNAse, wenn sie in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegt. Liegt sie allerdings als solche, d. h. als Protein vor, sind insbesondere Techniken, wie Lipofektion, zu nennen. Das Vorliegen der Anti-Sinn-RNA bzw. der (ds)RNAse in den Zellen kann durch übliche Verfahren nachgewiesen werden. Dies sind z. B. Southern- und Northern-Blot für Nukleinsäuren, während Western-Blot und funktionelle Analysen (z. B. Enzymaktivitätsbestimmung) für Proteine als geeignet anzusehen sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Zellen, die eine (ds)RNAse exprimieren. Solche Zellen können durch übliche Verfahren erhalten werden. Günstig ist es, Zellen, wie vorstehend definiert, mit einem für eine (ds)RNAse kodierenden Vektor zu transfizieren. Dies kann durch übliche Trans fektionstechniken, wie Elektroporation, erfolgen. Der Vektor kann episomal verbleiben oder in das Genom der Zellen integrieren. Die Expression der (ds)RNAse kann daher transiert oder stabil sein, wobei letzteres bevorzugt ist. Zellen, die eine (ds)RNAse exprimieren, stellen ein Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen dar. Ferner stellen sie ein System dar, Anti-Sinn-RNAs zu konzipieren und in ihrer Wirkung zu testen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination aus einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse. Die Anti-Sinn-RNA kann als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Ebenso kann die (ds)RNAse als solche oder in Form eines sie kodierenden Vektors vorliegen. Günstig kann es sein, wenn die Kombination darin besteht, daß ein Vektor vorliegt, der sowohl für die Anti-Sinn-RNA als auch für die (ds)RNAse kodiert. Hinsichtlich des Vektors wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Eine Kombination aus einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse eignet sich als Mittel zur Durchführung des Verfahrens zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, die Wirkung einer Anti-Sinn-RNA in Zellen zu steigern. Damit kann eine starke Hemmung der Expression des entsprechenden Gens erreicht werden. Die vorliegende Erfindung findet somit eine breite Anwendung in der Medizin. Insbesondere kann an die Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen gedacht werden, bei denen einzelne Protei ne auslösend oder verstärkend sind. Dies sind z. B. Erkrankungen, bei denen Hormone eine große Rolle spielen, Tumorerkrankungen und virale Infektionen, wie HIV und AIDS. Desweiteren ermöglicht die vorliegende Erfindung, neue Inhibitoren der Genexpression zu finden und ihre Wirkung zu testen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt die Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen. (1) ist die Expressionsrate des CAT-Gens ohne eine Anti-Sinn-RNA. (2) ist die Expressionsrate des CAT-Gens mit einer Anti-Sinn-RNA. (3) ist die Expressionsrate des CAT-Gens mit einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Herstellung von Expressions-Vektoren, die das Chloramphenicol acetyltransferase (CAT)-Gen in 5′ → 3′ bzw. 3′ → 5′ Richtung enthal ten

Das CAT-Gen wurde aus einem üblichen CAT-Vektor isoliert und in die "multiple cloning site" des Expressionsvektors pJ3Ω (vgl. Nucleic acids res. 18, (1990), 1068) inseriert. In einem Fall erfolgte die Insertion in 5′ → 3′ Richtung und es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-CAT erhalten. Im anderen Fall erfolgte die Insertion in 3′ → 5′ Richtung und es wurde der Expressionsvektor pJ3Ω-TAC erhalten.

Beispiel 2 Herstellung eines Expressionsvektors, der für eine (ds)RNAse kodiert

Aus einer üblichen genomischen Bibliothek von Schizosaccharomyces pombe wurde mittels einer PCR-Amplifikation das für eine (ds)RNAse kodierende Gen (pac1+) isoliert. Hierzu wurden Primer verwendet, die aus der bekannten Se quenz des Gens pac1+ (vgl. Datenbank: embl: S78982) abgeleitet worden waren. Das Gen pac1+ wurde in dem bekannten Vektor pBluescript kloniert und durch Sequenzierung bestätigt. Nach Umklonierung in den üblichen Expressions vektor pcDNA3 (InVitrogen) wurde der Expressionsvektor pcDNA3-pac1+ erhalten.

Beispiel 3 Steigerung der Wirkung von Anti-Sinn-RNA in Zellen

Ehrlich Ascites Tumorzellen (10⁷ Zellen/ml) wurden mit den Expressionsvektoren pJ3Ω-CAT, pJ3Ω-TAC und pcDNA3-pac1+ transfiziert (vgl. Tabelle 1). Die Transfektion wurde mittels Elektroporation (366 V/950 µF/Elektrodenabstand D = 4 mm) durchgeführt. 24 h nach Transfektion wurden die Zellen geerntet, lysiert und Aliquote mit radioaktiv markiertem Chloramphenicol inkubiert. Es wurde die Konversionsrate (in Ac-, Di-Ac-Chloramphenicol) nach DC durch Messung der Radioaktivität bestimmt.

Tabelle 1

Aus Fig. 1 geht hervor, daß durch Transfektion von pJ3Ω-TAC eine Hemmung der Expression von CAT erhalten wird (vgl. Fig. 1(2)). Diese wird erheblich gesteigert, wenn pJ3Ω-TAC und pcDNA3-pac1+ kotransfiziert werden (vgl. Fig. 1(3).

Somit wird deutlich, daß eine Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen durch die Expression einer (ds)RNAse erhalten werden kann.

Claims

1. Verfahren zur Wirkungssteigerung von Anti-Sinn-RNA in Zellen, umfas send die Expression einer (ds)RNAse in den die Anti-Sinn-RNA enthalten den Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen tierische Zellen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-Sinn-RNA durch einen Vektor kodiert ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die (ds)RNAse durch einen Vektor kodiert ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anti-Sinn-RNA und die (ds)RNAse durch den gleichen Vektor kodiert sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die (ds)RNAse durch das Genom der Zellen kodiert ist.

7. Zellen, die eine (ds)RNAse exprimieren.

8. Zellen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen tierische Zellen sind.

9. Kombination aus einer Anti-Sinn-RNA und einer (ds)RNAse, wobei beide durch einen oder mehrere Vektoren kodiert sind.