DE3929822A1

DE3929822A1 - Vektor und seine verwendung

Info

Publication number: DE3929822A1
Application number: DE19893929822
Authority: DE
Inventors: Volker Buettcher; Andreas Ruehlmann; Friedrich Prof Dr Cramer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 1989-09-07
Filing date: 1989-09-07
Publication date: 1991-03-14

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vektor, seine Verwendung zur Klonierung, gezielten Veränderung, Sequenzierung oder/und Expression eines in seine multiple Klonierungsstelle insertierten Gens, seine Verwendung zur Herstellung einer Genbank oder Teilgenbank sowie einen Kit, enthaltend den Vektor und die benötigten Reagenzien, Puffer und Hilfsmittel zur Ausführung der Verwendungsmöglichkeiten.

Zur Expression von Fremdgenen ohne zusätzliche Aminosäuren wurden bereits verschiedene Vektoren konstruiert und verwendet. Die Expressionsrate dieser Vektoren wird normalerweise bei heterologer oder homologer Expression darin einligierter Gene von Parametern wie der Auswahl des Wirtsstammes, den Wachstumsbedingungen, Substrat- und Induktionsbedingungen für den Promotor abhängen. Ein weiterer Faktor, der Einfluß auf die Expressionsrate eines Gens ausübt, ist der Abstand seines Startcodons von der Ribosomen-Bindungsstelle (Shine/Dalgano-Sequenz); er muß für eine merkliche Expression des Gens zwischen 5 und 20 Nukleotide betragen. Da in den Fremdgenen nur selten in diesem Bereich eine geeignete Restriktionsschnittstelle zur Insertion des Fremdgens in die multiple Klonierungsstelle eines Vektors vorliegt, muß hier über aufwendige Verfahren der Abstand angepaßt werden. Die bisher bekannten Vektoren können außerdem praktisch nur für die Expression eines Gens verwendet werden, zur Durchführung von Einzelstrang-Sequenzierungen, beispielsweise nach der Sanger-Methode, muß das interessierende Genstück in einen einzelsträngigen Phagen umkloniert werden, auch die Durchführung von gezielten Basen-Substitutionen, -Deletionen und -Insertionen ist mit den bisher bekannten Expressionsvektoren nicht möglich, so daß jeweils die Mutation bzw. eine nachfolgende Sequenzierung erst nach Umklonieren in einzelsträngige DNA-Phagen stattfinden kann, eine spätere Expression wiederum erst nach Zurückklonieren in den Expressionsvektor.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Vektorsystem bereitzustellen, das die Eigenschaften eines starken Expressionsvektors mit den Vorteilen eines einzelsträngigen DNA-Phagen verbindet.

Gelöst wird die Aufgabe erfindungsgemäß durch einen Vektor, der aus einem zirkulären doppelsträngigen DNA-Molekül besteht und mindestens die folgenden Elemente enthält:

a) einen Replikationsursprung,
b) einen Promotor,
c) eine Ribosomen-Bindungsstelle,
d) eine multiple Klonierungsstelle, und
e) einen Replikationsursprung eines einzelsträngigen DNA-Phagen,

wobei die Elemente b) bis d) in Transkriptions-Richtung in der genannten Reihenfolge vorliegen.

Im erfindungsgemäßen Vektor, der aufgrund eines eigenen Replikationsursprungs in Wirtszellen sich selbsttätig vermehren kann, ist ein Promotor vorhanden, der in Zusammenwirkung mit der Ribosomen-Bindungsstelle die Expression eines in die multiple Klonierungsstelle insertierten Gens (in Form des authentischen Gens, der c-DNA, eines synthetischen Gens o. ä.) kontrolliert. Das Vorhandensein eines Replikationsursprungs eines einzelsträngigen DNA-Phagen im erfindungsgemäßen Vektor ermöglicht es, durch Zugabe eines Helferphagen direkt einzelsträngige DNA des erfindungsgemäßen Vektors herzustellen, die dann zur gerichteten Mutagenese ebenso wie zur direkten Einzelstrang-Sequenzierung nach Sanger oder über andere Methoden, bei denen Einzelstrang-DNA benötigt wird, verwendet werden kann.

Der Vektor kann hierbei ein Plasmid, Cosmid, Shuttle-Vektor, oder ein anderes geeignetes doppelsträngiges DNA-Molekül sein. Diese Kombination eines starken Expressionsvektors mit dem Vorteil eines Einzelstrang produzierenden Phagen erlaubt eine einfache Anwendung der gerichteten Mutagenese (site directed mutagenesis) und erlaubt z. B. über die Anpassung des Abstandes Ribosomen-Bindungsstelle/Startcodon die Herstellung optimal exprimierender Klone.

Die multiple Klonierungsstelle des erfindungsgemäßen Vektors enthält eine Vielzahl von singulären Restrik tionsenzym-Erkennungssequenzen, so daß eine passende Insertionsstelle für möglichst viele Gene oder Genfragmente vorhanden ist.

Der erfindungsgemäße Vektor enthält in einer bevorzugten Ausführungsform einen starken und besonders bevorzugt einen starken, induzierbaren Promotor, insbesondere den λ-P_L-, den tac- oder den rac-Promotor.

Weiter enthält vorzugsweise die multiple Klonierungsstelle des erfindungsgemäßen Vektors Stopcodons für alle drei Leseraster. Dies verhindert, daß ein zu exprimierendes Gen über die multiple Klonierungsstelle hinaus translatiert wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die multiple Klonierungsstelle auch noch ein Startcodon an oder nahe an ihrem 5′-Ende. Dies erlaubt, Sequenzen (Gene) ohne eigenes Startcodon zu exprimieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die multiple Klonierungsstelle Replikationsschnittstellen in einer derartigen Anordnung zu dem Startcodon, daß insertierte Fremdgene in allen drei Leserastern exprimiert werden können. Bevorzugte erfindungsgemäß verwendbare multiple Klonierungsstellen ohne und mit Startcodon sind in Fig. 1 und Fig. 2 gezeigt. Die multiple Klonierungsstelle von Fig. 2 enthält singuläre Schnittstellen für 18 kommerziell erhältliche Restriktionsenzyme. Wenn das zu insertierende Gen kein Startcodon aufweist, werden eventuell am 3′-Ende des Gens vorhandene überstehende Enden durch Auffüllen oder Abbau von Einzelstrangbereichen glatt (blunt ended) gemacht und das glatte 3′-Ende kann dann in die ebenfalls aufgefüllte NcoI-Schnittstelle (Leseraster 0) in die mit T4-DNA-Polymerase behandelte KpnI-Schnittstelle (Leserahmen +1) oder in die aufgefüllte Asp 718-Schnittstelle (Leserahmen 1) einkloniert werden. Zur Klonierung von unbekannten Genen werden vorzugsweise die SmaI (XmaI), AvaI, BstII, SalI, EcoRV und ClaI-Schnittstellen verwendet. SmaI und EcoRV sind Restriktionsenzyme, die glatte Enden erzeugen, die Ligation mit anderen Fragmenten mit glatten Enden erlauben. Die ClaI-Schnittstelle erzeugt überstehende Enden, die kompatibel sind für: AccI, AhaII, AsuII, FspII, NarI (Erkennung von 6 Nukleotiden) und HinPI, ApaII, MaeII und TaqI (Erkennung von 4 Nukleotiden) (Mayer et al., Nucl. Acids Res. 9 (1981) 4833-4845). Die KpnI und die ApaI-Schnittstellen am Anfang der multiplen Klonierungsstelle und die NseI, SphI und PstI-Schnittstellen am Ende erlauben es, verschiedene Restriktionsenzyme zu wählen, um 3′-überstehende Enden für eine unidirektionelle Verkürzung (wie im folgenden beschrieben) zu erhalten.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält der Vektor den Replikationsursprung eines der Einzelstrang-produzierenden Phagen fl, M13 oder SP6. Besonders bevorzugt ist hierbei der Replikationsursprung (intergene Region) vom fl-Phagen, mit dessen Hilfe in Anwesenheit eines Helferphagen (z. B. M13K07; J. Vieira und J. Messing, Methods in Enzymol. 153 (1987) 3-11) Einzelstrang-DNA des Vektors mit dem insertierten Gen hergestellt werden kann. Mit der auf diese Weise erzeugten einzelsträngigen DNA wird dann nach an sich bekannten "gerichtete Mutagenese"-Methoden die gezielte Mutation vorgenommen (Deletion, Insertion, Substitution). In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthält der Vektor zusätzlich zu den Elementen a) bis e) eine oder mehrere Terminator-Sequenzen, insbesondere die T₁- und T₂-Sequenzen des rrnB-Operons.

Der erfindungsgemäße Vektor weist vorzugsweise eine Gesamtlänge von 3000 bis 4000 Basenpaaren auf. Diese relativ geringe Größe des Vektors ermöglicht es, auch große Gene oder Genfragmente (<3 kb) stabil zu insertieren.

Besonders bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind die Vektoren pMEX 5, DSM 5515, pMEX 6, DSM 5516, pMEX 7, DSM 5517 und pMEX 8, DSM 5518.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors zur Klonierung, gezielten Veränderung, Sequenzierung oder/und Expression von in seine multiple Klonierungsstelle insertierten Genen. Wie bereits vorstehend ausgeführt, ermöglicht die Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors auf einfache Weise durch Herstellung von Einzelstrang-DNA über den Replikationsursprung eines einzelsträngigen Phagen Nukleotide gezielt zu deletieren, insertieren oder/und auszutauschen und dadurch u. a. den Abstand zwischen Ribosomen-Bindungsstelle und dem Startcodon des Strukturgens zu optimieren. Mit dem erfindungsgemäßen Vektorsystem ist es nämlich auf einfache Weise ohne Umklonierung in die RF-Form eines Einzelstrang-Phagen möglich, einzelsträngige DNA in großer Ausbeute zu erhalten, was für eine effiziente gezielte Mutagenese erforderlich ist.

Weiter können mit dem erfindungsgemäßen Vektor nach Herstellung von Einzelstrang-DNA die Sequenzen sehr leicht über eine Sequenzierung nach an sich bekannten Methoden bestimmt werden. Hierbei können durchgeführte Veränderungen leicht kontrolliert werden, oder aber auch bisher unbekannte Sequenzen bestimmt werden. Schließlich ermöglicht es die Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors, Gene ohne eigenes Stopcodon (z. B. 3′-deletierte Gene) sowie auch in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Gene ohne eigenes Startcodon zu exprimieren. Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren durchführbare Expressions-Optimierung (durch Optimierung des Abstandes Ribosomen-Bindungsstelle/Startcodon) und die Möglichkeit der gerichteten Mutagenese in Verbindung mit nachfolgender Expression im gleichen Vektorsystem ohne Umklonierung ist ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich bietet die erfindungsgemäße multiple Klonierungsstelle die Möglichkeit der Durchführung von unidirektionalen Deletionen über einen ausgewählten Bereich. Das Problem bei Verkürzungen von Inserts besteht bisher darin, daß nach dem Linearisieren des Plasmids an beiden DNA-Strängen exonukleolytisch abgebaut wird (z. B. durch die Nuklease Bal31). Dies hat den entscheidenden Nachteil, daß auch ein Teil des Vektors abgebaut wird. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liegt daher in einer Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors, bei der man zur gezielten Verkürzung nur des 3′- oder des 5′-Endes des Gens den Vektor mit dem insertierten Gen in seiner multiplen Klonierungsstelle so mit einem Restriktionsenzym schneidet, daß an dem nicht zu verkürzenden Ende ein überhängendes 3′-Ende mit vier Nukleotiden verbleibt und das andere Ende mit ExoIII-Nuklease abbaut und den verbleibenden Einzelstrang mit einer Einzelstrang-abbauenden Nuklease, z. B. mit S1- oder Mung-Beau-Nuklease, entfernt.

Die Methode der unidiretionalen Verdauung mit ExoIII-Nuklease ist von Henikoff, Gene 28 (1984), 351-359 beschrieben. Die unidirektionalen Deletionen ermöglichen u. a. die Sequenzierung mit "Universal-Primern" (d. h. alle Sequenzierungen können mit den gleichen Primern durchgeführt werden), da bei den verkürzten Inserts der Vektoranteil (Zielsequenzen für den Primer) erhalten bleibt. Vom gesamten Gen können also nach Verkürzung des Inserts die verschiedenen Abschnitte zur gleichen Zeit sequenziert werden. Zusätzlich kann das terminal deletierte Gen - in Verbindung mit dem Promotor, der Ribosomen-Bindungsstelle, dem Startcodon und den Stopcodons in allen drei Leserastern - zur Expression von verkürzten Proteinen dienen und somit zur Bestimmung von aktiven Domänen gute Dienste leisten. Zur genauen Bestimmung des Ausmaßes der Deletion kann wiederum von den Deletionsmutanten direkt Einzelstrang-DNA produziert werden und mit einer Sequenzierung das Ergebnis verifiziert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwendet man zur Expression von Proteinen mit authentischer Aminosäuresequenz, bzw. von Proteinen mit einer oder mehrerer zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren einen Vektor, dessen multiple Klonierungsstelle ein Startcodon aufweist und insertiert das Gen mit Hilfe der Restriktionsschnittstelle der multiplen Klonierungsstelle entsprechend.

Eine weitere Verwendungsmöglichkeit eines erfindungsgemäßen Vektors liegt in der Herstellung einer Genbank oder Teilgenbank nach an sich bekannten Methoden.

Die wesentlichen Vorteile der erfindungsgemäßen Vektoren liegen in der Kombination von starkem induzierbarem Promotor in Verbindung mit einer multiplen Klonierungsstelle, vorzugsweise einer der erfindungsgemäßen multiplen Klonierungsstellen von Fig. 1 oder Fig. 2, und der Möglichkeit, Einzelstrang-DNA herzustellen. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind sowohl für Manipulationen zu Forschungen auf Protein-Ebene als auf DNA-Ebene ausgelegt und ermöglichen daher, fast alle momentan gängigen molekulargenetischen Methoden mit ein- und demselben Vektor ohne aufwendiges Umklonieren durchzuführen.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind daher auch Kits, d. h. vorgefertigte Packungen, enthaltend einen erfindungsgemäßen Vektor und alle für mindestens eine der erfindungsgemäßen Verwendungsmöglichkeiten nötigen Reagenzien, Puffer und andere Hilfsmittel, so daß der Käufer des Kits lediglich sein zu insertierendes Gen beibringen muß (und im Falle von Mutationen noch die entsprechenden Deoxyoligonukleotide) und sonst alles im Kit vorfindet um z. B. Einzelstrang-Bildung und gerichtete Mutagenese durchführen zu können. Vorzugsweise enthält der Kit dabei die Reagenzien etc. für alle mit dem erfindungsgemäßen Vektor durchführbaren Manipulationen, und vorzugsweise enthält er mindestens einen der Vektoren pMEX 5, pMEX 6, pMEX 7 oder pMEX 8.

Die folgenden Beispiele erläutern in Verbindung mit den Abbildungen die Erfindung weiter.

Fig. 1 und 2 zeigen hierbei erfindungsgemäß besonders bevorzugte multiple Klonierungsstellen,

Fig. 3 zeigt das Plasmid pKK223-3 und schematisch die Herstellung von pMEX 3 und pMEX 4 daraus,

Fig. 4 und Fig. 5 zeigen die Herstellung der Plasmide pMEX 5 und pMEX 7 bzw. pMEX 6 und pMEX 8,

Fig. 6 zeigt die Herstellung von pVB 38, und die

Fig. 7, 8, 9 und 10 zeigen die Plasmide pMEX 5, 6, 7 und 8.

Beispiel 1 Herstellung eines Einzelstrang produzierenden Expressionsvektors

Zur Herstellung von pMEX 3 und pMEX 4 wurde das Plasmid pKK223-3 (Pharmacia, Freiburg) mit dem Restriktionsenzym SphI verdaut und die 3′-überstehenden Enden mit T4-DNA-Polymerase aufgefüllt (Fig. 3). Nach Schneiden des Vektors mit PvuII wurde dieser mit Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert, um die Religation des Vektors zu verhindern. Die Fragmente wurden durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und das 3,079 kb SphI (mit glatten Enden)-PvuII-Fragment isoliert. Für die Isolierung der intergenen Region des Phagen f1 wurde das Plasmid pEMBL8+ (Dente et al., Nucl. Acids. Res. 11 (1983) 1645-1655) mit RsaI verdaut, die Fragmente durch Hydroxyethylcellulose-Gelelektrophorese (Perlman et al., Analytical Biochemistry 63 (1987) 247-254) getrennt und das 514 Basenpaar RsaI-Fragment wie beschrieben isoliert. Nach Ligation des 3079 bp SphI (mit glatten Enden s. o.)-PvuII-Fragments mit dem 514 bp RsaI-Fragment wurde die Mischung in E. coli TG1-Zellen transformiert und die Klone durch Restriktionsanalyse identifiziert. Das neue Plasmid, das die Herstellung des kodierenden Stranges in bezug auf den tac-Promotor als Einzelstrang-DNA bewirkt, wurde pMEX 4 genannt. Der andere hergestellte Vektor mit umgekehrter f1-Replikationsursprungs-Richtung wurde pMEX 3 genannt (Fig. 3).

Beispiel 2 Insertion einer neuen multiplen Klonierungsstelle zur Optimierung der Genexpression und Gendeletionen

Die Vektoren pMEX 3 und pMEX 4 wurden mit SalI und HindIII geschnitten. Jeder linearisierte Vektor wurde mit zwei miteinander über Basenpaarung verbundenen SalI- HindIII-Linker-Deoxyoligonukleotiden der Sequenz

5′-TCGACGATATCGATCTGCAGCATGCTGAATGAATG-3′

5′-AGCTTCATTCATTCAGCATGCTGCAGATCGATATCG-3′

ligiert. Die resultierenden Plasmide wurden pMEX 5 und pMEX 6 genannt (Fig. 4 und Fig. 5). Um die Verwendbarkeit der Vektoren zu erhöhen, wurde eine erweiterte multiple Klonierungsstelle mit Startcodon und Stopcodons in allen drei Leserastern insertiert. Der Vektor pMEX 4 wurde mit EcoRI und HindIII geschnitten und mit einem EcoRI-SalI (multiple Klonierungsstelle 1) und einem SalI-HindIII-Linker-Deoxyoligonukleotid (multiple Klonierungsstelle 2) ligiert (Fig. 2). Die DNA-Linker waren durch Basenpaarung miteinander von in jedem Fall zwei synthetisierten Deoxyoligonukleotiden hergestellt worden. Multi-cloning-Stelle 1 bestand aus Oligonukleotid

1-1(5′-AATTCCATGGGTACCAGGGCCCG GGTTACCG-3′),

und Oligonukleotid

1-2(5′-TCAGCGGTAACCCGGGCC CTGGTACCCATGG-3′),

das phosphoryliert war. Multiple Klonierungsstelle 2 bestand aus Oligonukleotiden

2-1(5′-TCGACGATATCGATG CATGCTGCAGTGAATGAATGA-3′),

das phosphoryliert war und Oligonukleotid

2-2(5′-AGCTTCATTCATTCACT GCAGCATGCATCGATATCG-3′).

Die DNA-Linker waren nur teilweise phosphoryliert, um die Herstellung von mehrfach ligierten Linker-DNA-Fragmenten zu verhindern. Nach Transformation in TG1-Zellen wurden die Klone auf LB-Platten selektioniert und durch Restriktionsanalyse mit SalI untersucht. Das resultierende Plasmid wurde pMEX 8 genannt. pMEX 7, wird durch Ligation des 2624 Basenpaar EcoRI-PvuII-Fragment von pMEX 3, das den f1-Replikationsursprung mit dem 1007 Basenpaar EcoRI-PvuII-Fragment aus pMEX 8, das wiederum die insertierte multi-cloning-Stelle (Fig. 2) enthielt, erhalten. Die PvuII-Schnittstelle liegt im bla-Gen. Nach Transformation der Ligationsmischung in TG1-Zellen zeigte sich, daß alle resultierenden Klone, auf LB-Platten, die mit Ampicillin supplementiert waren, positiv waren, aufgrund des PvuII-Schnitts im bla-Gen. Die richtige Konstruktion von pMEX 7 und pMEX 8 war durch Restriktionsanalyse bewiesen.

Beispiel 3 Insertion des vrs-Gens in pMEX 6

Die Quelle für das valyl-tRNA-Synthetasegen (vrsI) war pVB20 (Fig. 6). Die valyl-tRNA-Synthetase ist ein eukaryontisches Gen, 3315 bp lang und kodiert für die valyl-tRNA-Synthetase aus Saccharomyces cerevisiae (Jordana et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 7189-7194). Der Vektor pVB20, der das vrs-Gen enthielt, wurde mit BamHI geschnitten und das 3500 Basenpaar BamHI-Fragment isoliert und mit dem BamHI verdauten pMEX-Vektor ligiert, um pVB38 zu ergeben (Fig. 6).

Claims

1. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem zirkulären, doppelsträngigen DNA-Molekül besteht und mindestens die folgenden Elemente enthält:

wobei die Elemente b) bis d) in Transkriptionsrichtung in der genannten Reihenfolge vorliegen.

2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er einen starken und vorzugsweise auch induzierbaren Promotor, insbesondere den λ-P_L-, den tac- oder den rac-Promotor enthält.

3. Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die multiple Klonierungsstelle am 3′-translatierenden Ende Stopkodons für alle drei Leseraster und vorzugsweise auch ein Startcodon an ihrem 5′-Ende aufweist.

4. Vektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die multiple Klonierungsstelle Restriktionsschnittstellen aufweist, die die Klonierung von Fremdgenen in allen drei Leserastern erlaubt.

5. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er den Replikationsursprung eines der Phagen f1, M13 oder SP6 enthält.

6. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er zusätzlich eine Terminatorsequenz, insbesondere die T₁- und T₂-Sequenzen des rrnB-Proteins enthält.

7. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß seine Gesamtlänge 3000 bis 4000 bp beträgt.

8. pMEX 5, DSM 5515.

9. pMEX 6, DSM 5516.

10. pMEX 7, DSM 5517.

11. pMEX 8, DSM 5518.

12. Verwendung eines Vektors nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Klonierung, gezielten Veränderung, Sequenzierung oder/und Expression von in seine multiple Klonierungsstelle insertierten Genen.

13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur gezielten Veränderung mit Hilfe eines Helferphagen eine Einzelstrangkopie des Vektors erzeugt und darin durch gerichtete Mutagenese Deletionen, Insertionen oder Substitutionen einführt.

14. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Optimierung der Expression überschüssige Nukleotide zwischen der Ribosomen-Bindungsstelle und dem Startcodon des Gens durch gerichtete Mutagenese entfernt.

15. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Expression von Proteinen mit authentischer Aminosäuresequenz, bzw. von Proteinen mit einer oder mehreren zusätzlichen N-terminalen Aminosäuren einen Vektor verwendet, dessen multiple Klonierungsstelle Geninsertionen in allen 3 Leserastern erlaubt und das Gen mit Hilfe der Restriktionsschnittstellen seinem Leseraster entsprechend insertiert.

16. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur gezielten Verkürzung nur des 3′- oder des 5′-Endes des Gens den Vektor mit dem insertierten Gen in seiner multiplen Klonierungsstelle so mit einem Restriktionsenzym schneidet, daß an dem nicht zu verkürzenden Ende ein überhängendes 3′-Ende mit vier Nukleotiden verbleibt und den einen Strang des anderen Endes mit ExoIII-Nuklease abbaut und den dadurch verbleibenden Einzelstrang mit einer einzelsträngige DNA abbauenden Nuklease entfernt.

17. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Sequenzierung mit Hilfe eines Helferphagen eine Einzelstrangkopie des Vektors erzeugt und diesen nach an sich bekannten Methoden sequenziert.

18. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung einer Genbank oder Teil-Genbank.

19. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß er einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und die notwendigen Reagenzien, Puffer und Hilfsmittel für mindestens eine der Verwendungsmöglichkeiten Klonierung, gezielte Veränderung, Sequenzierung und Expression von in die multing-cloning-Stelle zu insertierenden Genen oder zur Herstellung einer Genbank oder Teil-Genbank enthält.

20. Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß er mindestens einen der Vektoren pMEX 5, pMEX 6, pMEX 7 oder pMEX 8 enthält.

21. Kit nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß er die Reagenzien, Puffer und Hilfsmittel für alle der genannten Verwendung enthält.